Name: Wprowadzenie do pasożytniczych os Drosophila i przeciwpasożytniczej odpowiedzi immunologicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Poznaj metody hodowli os pasożytniczych na larwach Drosophila melanogaster oraz techniki preparowania grasicy i tkanki tłuszczowej. Naucz się analizować odpowiedź immunologiczną gospodarza po infestacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni prof. Toddowi Schlenke za Trichopria drosophilae, prof. Tony'emu Ip za transgeniczne linie much oraz prof. Carlowi Hashimoto za przeciwciała anty-Spätzle. Dziękujemy obecnym i byłym członkom laboratorium za ich wkład w tę prezentację. Praca ta była finansowana z następujących grantów: NIH (S06 GM08168, RISE 41399-009 oraz G12-RR03060), USDA (NRI/USDA CSREES 2006-03817 oraz 2009-35302-05277) oraz PSC-CUNY.

<ol><li>Schlenke, T. A., Morales, J., Govind, S., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+infection+strategies+in+generalist+and+specialist+wasp+parasitoids+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Contrasting infection strategies in generalist and specialist wasp parasitoids of Drosophila melanogaster.</a> PLoS Pathog. 3, 1486-1501 (2007).</li>
<li>Chiu, H., Morales, J., Govind, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+immuno-electron+microscopy+localization+of+p40%2C+a+protein+component+of+immunosuppressive+virus-like+particles+from+Leptopilina+heterotoma%2C+a+virulent+parasitoid+wasp+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification and immuno-electron microscopy localization of p40, a protein component of immunosuppressive virus-like particles from Leptopilina heterotoma, a virulent parasitoid wasp of Drosophila.</a> J. Gen. Virol. 87, 461-470 (2006).</li>
<li>Gueguen, G., Rajwani, R., Paddibhatla, I., Morales, J., Govind, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VLPs+of+Leptopilina+boulardi+share+biogenesis+and+overall+stellate+morphology+with+VLPs+of+the+heterotoma+clade%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">VLPs of Leptopilina boulardi share biogenesis and overall stellate morphology with VLPs of the heterotoma clade.</a> Virus Res. 160, 159-165 (2011).</li>
<li>Paddibhatla, I., Lee, M. J., Kalamarz, M. E., Ferrarese, R., Govind, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+sumoylation+in+systemic+inflammation+and+immune+homeostasis+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Role for sumoylation in systemic inflammation and immune homeostasis in Drosophila larvae.</a> PLoS Pathog. 6, e1001234(2010).</li>
<li>Sorrentino, R. P., Carton, Y., Govind, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+immune+response+to+parasite+infection+in+the+Drosophila+lymph+gland+is+developmentally+regulated%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular immune response to parasite infection in the Drosophila lymph gland is developmentally regulated.</a> Dev. Biol. , 243-265 (2002).</li>
<li>Sorrentino, R. P., Melk, J. P., Govind, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+contributions+of+dorsal+group+and+JAK-Stat92E+pathway+genes+to+larval+hemocyte+concentration+and+the+egg+encapsulation+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of contributions of dorsal group and JAK-Stat92E pathway genes to larval hemocyte concentration and the egg encapsulation response in Drosophila.</a> Genetics. 166, 1343-1356 (2004).</li>
<li>Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+lymph+gland+as+a+developmental+model+of+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis.</a> Development. 132, 2521-2533 (2005).</li>
<li>Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+the+Drosophila+larval+hematopoietic+organ%2C+hemocyte+homeostasis+and+the+dedicated+cellular+immune+response+to+parasitism%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism.</a> Int. J. Dev. Biol. 54, 1117-1125 (2010).</li>
<li>Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hematopoietic+stem+cell+and+its+niche%3A+a+comparative+view%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view.</a> Genes Dev. 21, 3044-3060 (2007).</li>
<li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 697-743 (2007).</li>
<li>Schlegel, A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+%22lower%22+organisms%3A+what+worms%2C+flies%2C+and+zebrafish+can+teach+us+about+human+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Lessons from "lower" organisms: what worms, flies, and zebrafish can teach us about human energy metabolism.</a> PLoS Genet. 3, e199(2007).</li>
<li>Ferrandon, D., Jung, A. C., Criqui, M., Lemaitre, B., Uttenweiler-Joseph, S., Michaut, L., Reichhart, J., Hoffmann, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drosomycin-GFP+reporter+transgene+reveals+a+local+immune+response+in+Drosophila+that+is+not+dependent+on+the+Toll+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A drosomycin-GFP reporter transgene reveals a local immune response in Drosophila that is not dependent on the Toll pathway.</a> EMBO J. 17, 1217-1227 (1998).</li>
<li>Bruckner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rorth, P., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PDGF%2FVEGF+receptor+controls+blood+cell+survival+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila.</a> Dev. Cell. 7, 73-84 (2004).</li>
<li>Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+hemocyte-specific+enhancer-reporter+transgenes+for+the+analysis+of+hematopoiesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila.</a> Genesis. 47, 771-774 (2009).</li>
<li>Tokusumi, T., Sorrentino, R. P., Russell, M., Ferrarese, R., Govind, S., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+lamellocyte+transcriptional+enhancer+located+within+the+misshapen+gene+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of a lamellocyte transcriptional enhancer located within the misshapen gene of Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 4, e6429(2009).</li>
<li>Morales, J., Chiu, H., Oo, T., Plaza, R., Hoskins, S., Govind, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+structure%2C+and+immune-suppressive+effects+of+virus-like+particles+of+a+Drosophila+parasitoid%2C+Leptopilina+victoriae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, structure, and immune-suppressive effects of virus-like particles of a Drosophila parasitoid, Leptopilina victoriae.</a> J. Insect Physiol. 51, 181-195 (2005).</li>
<li>Bettencourt, R., Asha, H., Dearolf, C., Ip, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolymph-dependent+and+-independent+responses+in+Drosophila+immune+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Hemolymph-dependent and -independent responses in Drosophila immune tissue.</a> J. Cell Biochem. 92, 849-863 (2004).</li>
<li>Melk, J. P., Govind, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+analysis+of+Ganaspis+xanthopoda%2C+a+larval+parasitoid+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental analysis of Ganaspis xanthopoda, a larval parasitoid of Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 202, 1885-1896 (1999).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Zainteresowanie osami pasożytniczymi Drosophila gwałtownie rośnie w miarę, jak techniki molekularne służące do sekwencjonowania całych genomów stają się wydajne i opłacalne. Jednak w porównaniu z wyjątkowo dobrze zbadanymi gospodarzami, wiele fascynujących aspektów biologii os pozostaje niejasnych. Obejmują one kwestie związane z zakresem gospodarzy, supresją odporności, superpasożytnictwem oraz zachowaniem. Celem niniejszej prezentacji było zademonstrowanie wpływu infekcji na tkanki odpornościowe muchy. Przedst...

<table><tbody><tr><td>Drożdże</td><td>Fisher Scientific</td><td>S80245-3</td><td>Aktywne suszenie</td></tr><tr><td>Pożywka dla much </td><td>Własnego wyrobu</td><td>Mąka kukurydziana, cukier</td><td>Standard</td></tr><tr><td>Miód</td><td>Dutch Gold</td><td>Ze sklepu</td><td>Koniczyna</td></tr><tr><td>Fiolki</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS514</td><td></td></tr><tr><td>Korek bawełniany/Korek piankowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-127-40A</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-15</td><td></td></tr><tr><td>płaska korytko sekcyjne Pyrex</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-930-382</td><td>9-dołkowa</td></tr><tr><td>Wstępnie oczyszczone szkiełka przedmiotowe </td><td>Fisher Scientific</td><td>7101</td><td>25,4 mm x 76,2 mm</td></tr><tr><td>Szkiełka podstawowe</td><td>Perła</td><td>D12544</td><td>22 x 50</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywki</td><td>Perła</td><td>G12544</td><td>22 x 60</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>J H Berge</td><td>71-5200-05</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta 100 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-4662</td><td>Styl nr 5</td></tr><tr><td>Butelka z atomizerem</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-409-22A</td><td>Fisherbrand</td></tr><tr><td>Kim Wipess</td><td>Fisher Scientific</td><td>34155</td><td>Kimberly Clark</td></tr><tr><td>Ręcznik papierowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisher X-101-C</td><td>1/8 x 13 1/8 cala</td></tr><tr><td>stereomikroskop Leica </td><td>Empire Imaging Systems, INC.</td><td>10446208</td><td>MZFLIII</td></tr><tr><td>Stereomikroskop Zeiss </td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1006-126</td><td>&quot;STEMI (zawał serca z uniesieniem odcinka ST)&quot; 1000 lub 2000-C</td></tr><tr><td>Źródło światła – oświetlacz LED z gęsim szyją</td><td>Fisher Scientific</td><td>12563501</td><td></td></tr><tr><td>Etap</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skanujący mikroskop konfokalny Zeiss Laser 510</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>815</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;1X roztwór soli buforowanej fosforanowo (PBS) </td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-21-030-CM Mediatech</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-17-5</td><td>99.5 %</td></tr><tr><td>Formaldehyd (37% m/m)</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-1</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33258</td><td>Sondy molekularne, Life Technologies</td><td>H-1398</td><td>0.2 &amp;#x03BC;g/ml wzbudzenie 352 nm; emisja 461 nm</td></tr><tr><td>Falloidyna z rodamyną</td><td>Sondy molekularne, Life Technologies</td><td>R415</td><td>200 j/ml (6,6 &amp;#x03BC;M) Pobudzenie 546 nm; Emisja 565 nm</td></tr><tr><td>faloidyna z Alexa Fluor 488 </td><td>Sondy molekularne, Life Technologies</td><td>A22289</td><td>Wzbudzenie 495 nm; Emisja 518 nm 300 jednostek/ml</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; zbiornik</td><td>TW Smith</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Spz</td><td>Podarunek dla dr. C. Hashimoto (Yale)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne osioł przeciwko królikowi sprzężone z TRITC, stężenie 1:50. </td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>Wykrywanie przy pobudzeniu 546 nm; emisji 565 nm</td></tr><tr><td>Środek przeciwblaknięciu </td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN10274790</td><td>0,08 mg galianu N-propylowego w 20 ml 50% glicerolu w 1X PBS</td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Szczepy os&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;silny&gt;Szczepy much&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L. victoriae&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;16&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;y w&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L. boulardi 17&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;UAS-GFP-Dorsal&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;17&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;*L. heterotoma*&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;SerpentHemoGal4&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L. heterotoma 14&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;MSNF9-moCherry&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;*Trichopria drosophilae* &lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;MSNF-GFP&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;*G. xanthopoda*&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;y w Serpent-Gal4 UAS GFP-Dorsal/Basc&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;4&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;y w ; Drosomycin-GFP/CyO y+&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;12&lt;/sup&gt;</td></tr></tbody></table>

wprowadzenie do os w pasożytach drosophila i odpowiedzi immunologicznej przeciwpasożytniczej

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Większość znanych gatunków os bleskotnic atakuje stadia larwalne lub poczwarki Drosophila. Podczas gdy Trichopria drosophilae infekują stadia poczwarki gospodarza (Rys. 1A-C), samice z rodzaju Leptopilina (Rys. 1D, 1F, 1G) oraz Ganaspis (Rys. 1E) atakują stadia larwalne. Wykorzystujemy te pasożyty do badania molekularnych podstaw biologicznego wyścigu zbrojeń. Pasożytnicze osy mają ogromną wartość jako środki biologicznej kontroli. Większość z nich przenosi czynniki wirulencji i inne elementy, które modyfikują fizjologię i odporność gospodarza. Analiza os Drosophila dostarcza wiedzy na temat tego, w jaki sposób interakcje specyficzne dla gatunków kształtują struktury genetyczne społeczności naturalnych. Badania te służą również jako model do zrozumienia fizjologii odporności gospodarzy oraz tego, w jaki sposób skoordynowane reakcje immunologiczne są przełamywane przez tę klasę pasożytów.
Kutikula larwy/poczwarki służy jako pierwsza linia obrony. Wykładzina jajowa osy jest ostrą, igłową strukturą, która efektywnie wprowadza jaja do hemocoel gospodarza. Po złożeniu jaj następuje reakcja gojenia rany w obrębie kutikuli (Ryc. 1C, groty strzał). Niektóre osy potrafią wprowadzić dwa lub więcej jaj do tego samego gospodarza, choć udaje się rozwinąć tylko jedno z nich. Nadmiarowe jaja lub rozwijające się larwy są eliminowane w procesie, który nie jest jeszcze w pełni zrozumiały. Z tego powodu osy te określa się mianem parazytoidów samotniczych.
W zależności od szczepu muchy i gatunku osy, jaja osy spotyka jeden z dwóch losów. Są one albo enkapsulowane, co blokuje ich rozwój (wykluwa się gospodarz; Ryc. 2 lewa); albo jajo osy wykluwa się, rozwija, przechodzi liniecie i przekształca się w dorosłego owada (wykluwa się osa; Ryc. 2 prawa). L. heterotoma jest jednym z najlepiej przebadanych gatunków os pasożytniczych z rodzaju Drosophila. Jest to „generalista”, co oznacza, że może wykorzystywać większość gatunków Drosophila jako gospodarzy1. L. heterotoma i L. victoriae są gatunkami siostrzanymi i produkują cząsteczki przypominające wirusy, które aktywnie zakłócają odpowiedź enkapsulacyjną2. W przeciwieństwie do L. heterotoma, L. boulardi jest pasożytem specjalistycznym, a zakres wykorzystywanych przez nią gatunków Drosophila jest stosunkowo ograniczony1. Szczepy L. boulardi również produkują cząsteczki przypominające wirusy3, choć znacząco różnią się zdolnością do skutecznego rozmnażania na D. melanogaster1. Niektóre z tych szczepów L. boulardi są trudne w hodowli na D. melanogaster1, ponieważ gospodarz często skutecznie enkapsuluje ich jaja. Dlatego w konkretnych protokołach eksperymentalnych istotna jest wiedza na temat obu partnerów.
Oprócz tkanek barierowych (kutykuli, jelita i tchawki), larwy Drosophila posiadają systemowe odpowiedzi immunologiczne komórkowe i humoralne, które wynikają odpowiednio z funkcji komórek krwi oraz ciała tłuszczowego. Składanie jaj przez L. boulardi aktywuje oba ramiona odpornościowe1,4. Komórki krwi znajdują się w krwiobiegu, w populacjach osiadłych pod segmentową kutykulą oraz w gruczole limfatycznym. Gruczół limfatyczny jest niewielkim organem krwiotwórczym znajdującym się na grzbietowej stronie larwy. Zgrupowania komórek krwiotwórczych, zwane płatami, są rozmieszczone segmentowo w parach wzdłuż naczynia grzbietowego, które biegnie wzdłuż osi przednio-tylnej zwierzęcia (Rys. 3A). Ciało tłuszczowe jest dużym, wielofunkcyjnym organem (Rys. 3B). Wydziela ono peptydy przeciwdrobnoustrojowe w odpowiedzi na infekcje mikrobiologiczne i metazoiczne.
Infekcja osy aktywuje sygnalizację immunologiczną (Ryc. 4)4. Na poziomie komórkowym wywołuje ona podziały i różnicowanie komórek krwi. W ramach samoobrony w hemocelu zainfekowanych zwierząt powstają agregaty i kapsuły (Ryc. 5)5,6. Aktywowane komórki krwi migrują w stronę jaja (lub larwy) osy i zaczynają tworzyć wokół niego kapsułę (Ryc. 5A-F). Niektóre komórki krwi agregują, tworząc guzki (Ryc. 5G-H). Dokładna analiza wykazuje, że infekcja osy indukuje rozproszenie obrzeży najbardziej przednich płatów gruczołu limfy (Ryc. 6C, D).
Przedstawiamy reprezentatywne dane dotyczące komponentów szlaku transdukcji sygnału Toll: Dorsal i Spätzle (Rys. 4,5,7), oraz jego celu Drosomycin (Rys. 6), aby zilustrować, w jaki sposób można badać specyficzne zmiany w gruczole limfy i hemoceli po infekcji osą. Opisane tutaj protokoły sekcji pozwalają również na wyizolowanie jaj os (lub rozwijających się stadiów os) z hemolimfy gospodarza (Rys. 8).

Osy pasożytnicze stanowią główną grupę naturalnych wrogów wielu owadów, w tym Drosophila melanogaster. Przedstawimy techniki rozmnażania tych pasożytów w gatunkach Drosophila spp. oraz zademonstrujemy sposób analizy ich wpływu na tkanki odpornościowe larw Drosophila.

Wprowadzenie do os w pasożytach Drosophila i odpowiedzi immunologicznej przeciwpasożytniczej

Większość znanych gatunków błoniczek pasożytniczych atakuje stadia larwalne lub pupalne Drosophila. Podczas gdy Trichopria drosophilae infekują stadia pupalne gospodarza (Rys. ...

Ogólnym celem tej procedury jest przedstawienie sposobu utrzymywania hodowli os w pasożytniczych na gospodarzach z gatunku drosophila oraz metody preparowania gruczołów chłonnych i ciał tłuszczowych. Cel ten osiąga się poprzez hodowlę os na larwach drosophila. Następnie zwierzęta są preparowane w celu wyizolowania gruczołów chłonnych larwy, co obejmuje oddzielenie kutykuli oraz usunięcie ciał tłuszczowych i innych drobniejszych struktur, aby wyizolować gruczoły chłonne.Podobnie ciała tłuszczowe mogą zostać wyizolowane przy zastosowaniu analogicznej procedury z wykorzystaniem immunocytochemii i mikroskopii fluorescencyjnej. Ekspresja genów oraz zmiany specyficzne dla komórek są wizualizowane w tkankach odpornościowych. Po infekcji osą badamy unikalny system infekcji i odporności, który wykorzystuje gospodarza z gatunku drosophila oraz jego pasożytniczą osę.Nasze laboratorium jest jednym z niewielu, w którym utrzymywane są żywe kultury parazytoidów drozołowi. W związku z tym często prosi się nas o podzielenie się naszymi technikami. Parazytoidy są naturalnymi wrogami wielu owadów.Badane przez nas gatunki atakują stadia larwalne wielu gatunków drosofilid. W warunkach laboratoryjnych wykorzystujemy *Drosophila melanogaster*, aby zrozumieć, w jaki sposób układ odpornościowy owadów reaguje na atak pasożytniczych błonkówek. Ponadto chcemy odkryć strategie stosowane przez osy w celu przełamania mechanizmów obronnych gospodarza.Zazwyczaj osoby rozpoczynające naukę sekcji ciał tłuszczowych i gruczołów chłonnych napotykają trudności, ponieważ choć larwy oph są łatwe w hodowli, mają one dość niewielkie rozmiary i wymagane jest znaczne doświadczenie, aby rutynowo i z łatwością przeprowadzać sekcję tych narządów larwalnych. Po odkryciu, że konstytutywna aktywacja sygnalizacji NF kappa B prowadzi do autoimmunopodobnej enkapsulacji tkanek komórkowych, zainteresowaliśmy się tym, jak ta reakcja przebiega u mutantów oph fla. Postawiliśmy zatem hipotezę, że indukowana enkapsulacja jest jej naturalnym odpowiednikiem i opracowaliśmy standardowe protokoły, które zaprezentujemy. Teraz pokażę, jak przygotowywać i prowadzić hodule osy.Należy rozpocząć od przygotowania świeżej fiolki z pożywką dla much z niewielką ilością świeżo przygotowanej pasty drożdżowej. Do fiolki należy przenieść od 50 do 60 młodych much typu dzikiego w celu zniesienia jaj przez 48 godzin w temperaturze 24 °C. Po dwóch dniach składania jaj należy usunąć muchy z fiolki i dodać kroplę miodu do zatyczki.Na koniec zakręć fiolkę. Przed znieczuleniem osy zmniejsz przepływ dwutlenku węgla, ponieważ są one bardziej wrażliwe na ten gaz niż muchy. Po przygotowaniu do znieczulenia os wybierz od sześciu do ośmiu samic oraz od sześciu do ośmiu samców i umieść je w fiolce.Z jajami i larwami drozofili. Ostrożnie połóż fiolkę na boku, aż osy się obudzą. Następnie umieść fiolkę w inkubatorze w temperaturze 24 degrees Celsius.Niezaatakowani gospodarze gilo oraz gospodarze, którzy skutecznie się obronią, przepoczwarcą się w normalnym punkcie czasowym rozwoju. Mogą oni zostać usunięci przed wykluciem os. Osy zazwyczaj wykluwają się około 25 do 30 dnia, co pozwala przygotować osy na tym samym etapie rozwoju.Hoduj osy z jajami gospodarza złożonymi w okresie od dwóch do sześciu godzin, zamiast przez 48 godzin, aby zebrać zainfekowane larwy do sekcji tkanek odpornościowych lub pasożytów. Przenieś zawartość fiolek z muchami do małej szklanej lub plastikowej szalki Petriego. Następnie, korzystając z mikroskopu stereoskopowego i pęsety, ostrożnie wybierz od sześciu do 10 larw.Umieść larwy najpierw w dołku zawierającym 1x PBS, a następnie przenoś je sukcesywnie do wody, 70% etanolu i ponownie do 1x PBS. Celem tych etapów jest usunięcie z organizmów pożywki dla much oraz dokładne oczyszczenie i sterylizacja ich powierzchni. Na stole preparacyjnym mikroskopu stereoskopowego Zes 1000 umieść lightbox, który umożliwia przenikanie światła padającego przez próbkę.Za pomocą precyzyjnej pęsety wyjmij z PBS oczyszczoną larwę w stadium trzeciego wędrującego wzrostu. Umieść larwę na szkiełku przedmiotowym. Używając pęsety, ustaw zwierzę stroną brzuszna do góry.Przesunięto źródło światła w stronę przeciwną do próbki tak, aby organizm wydawał się przezroczysty, a organy wewnętrzne były widoczne. Podczas przenoszenia larw na szkiełko należy upewnić się, że nie ma nadmiaru PBS, ponieważ może to czasami utrudnić sekcję. Używając dwóch par pęset, należy przytrzymać zwierzę po obu stronach końca tylnego i delikatnie pociągnąć kutykulę, aby wywołać niewielkie, powierzchowne rozdarcia w kutykuli.Hemolimfa zawierająca hemocyty, jelito i ciała tłuszczowe zacznie wypływać z jamy ciała. W razie potrzeby hemolimfę można pobrać pipetą 10 µl w celu wykonania rozmazów, ostrożnie umieszczając obie pincety po lewej stronie zwierzęcia, tuż poniżej haczyków gębowych. Należy delikatnie przerwać kutykulę.Przesuń obie pęsety na prawą stronę zwierzęcia, tuż pod haczyki gębowe i ostrożnie wykonaj kolejne małe rozcięcie. Teraz, trzymając haczyki gębowe zwierzęcia, delikatnie odsuń kutykulę w kierunku końca tylnego zwierzęcia. W miarę odsuwania kutykuli odsłonią się ciało tłuszczowe mózgu, krążki imaginalne, gruczoły ślinowe i pęcherzyk nasienny.Odseparowana kutykula na końcu tylnym posiada naczynie grzbietowe z przytwierdzoną do niego gruczołem chłonnym. Gruczoł chłonny znajduje się pod mózgiem. Przetnij udowodnioną część komorową i odsuń ją od obszaru gruczołu chłonnego.Ostrożnie oddziel tłuszcz, ciało, jelito, ślinianki i inne struktury od gruczołu chłonnego. Należy uważać, aby nie oddzielić gruczołu chłonnego od gruczołu pierścieniowatego i naczynia grzbietowego znajdujących się za mózgiem. Umieść gruczoł chłonny płasko na szkiełku mikroskopowym i ostrożnie usuń wszystkie dodatkowe tkanki, aż cały gruczoł rozwinie się od płatów przednich do ostatniego zestawu komórek osierdziowych.Gruczoł jest teraz gotowy do utrwalenia i barwienia na stole sekcyjnym mikroskopu stereoskopowego Zes 1000. Ustaw pulpit świetlny, który umożliwi przechodzenie światła padającego przez próbkę. Umieść oczyszczoną larwę w trzecim stadium rozwojowym na mikroskopie.Nalej 200 µL 1x XPBS. Odchyl źródło światła od próbki tak, aby organizm stał się przezroczysty i widoczne były narządy wewnętrzne. Używając pęsety, ustaw zwierzę tak, aby jego koniec przedni był skierowany od Ciebie.W kolejnym kroku należy zwrócić uwagę na rozmieszczenie pęset, aby upewnić się, że rozrywane jest tylko kutykula, bez dotykania organów wewnętrznych. Jedną pęsetą należy przytrzymać kutykulę larwy po lewej stronie otworu gębowego, a drugą pęsetą uchwycić kutykulę. Delikatnie rozedrzyj kutykulę po drugiej stronie, prowadząc rozcięcie w dół, aż do końca tylnego.Zatrzymaj się przed oddzieleniem kutykuli od ciała na końcu tylnym, a następnie bardzo delikatnie zacznij przesuwać przewód pokarmowy na jedną stronę. Delikatnie usuń krążki imaginalne mózgu oraz pierścień gruczołowy wraz z gruczołem chłonnym przebiegającym przez naczynie grzbietowe. Na koniec delikatnie usuń kutykulę po obu stronach ciała tłuszczowego.Nie usuwaj ślinianek, ponieważ po obu ich stronach znajdują się ciała tłuszczowe. Przed przystąpieniem do utrwalania i barwienia tkanki należy upewnić się, że PBS został usunięty. Prawidłowo wypreparowana próbka ciała tłuszczowego powinna zachować normalne kontakty międzykomórkowe i zawierać minimalną ilość kulek tłuszczowych wokół wypreparowanego fragmentu.Wpływ infestacji osami na ekspresję genów wizualizowano in vivo. Przy użyciu reportera GFP powiązanego z promotorem Theso Mycin u niezinfekowanych zwierząt kontrolnych nie stwierdzono ekspresji GFP. Natomiast sygnał GFP jest wyraźnie widoczny w cytoplazmie ciał tłuszczowych wyizolowanych z zwierząt zainfekowanych l Victoria.Węzły chłonne zostały wypreparowane, aby zwizualizować zmiany komórkowe indukowane w płatach przednich po zakażeniu szczepem El Victoria. Nowo zróżnicowane cyty znakowane GFP pod kontrolą zdeformowanego enhancera są widoczne na obwodzie płatów. W warunkach prawidłowych gruczoły otaczają płat w sposób ciągły.Jednakże integralność płatów przednich w tych gruczołach została naruszona, ponieważ błona podstawna była nieciągła po infekcji osami w tych samych preparatach. W rozmazach zaobserwowano komórki w hemolimfie. Niektóre limfocyty brały udział w tworzeniu torebki w celu zablokowania rozwoju pasożyta i wykrycia ekspresji betzel.Przeprowadzone sekcje gruczółów chłonnych. Gruczóły chłonne zostały zabarwione in vivo za pomocą poliklonalnych przeciwciał przeciwko schpeil. Po zakażeniu osą poziom schpeil w komórkach gruczółów chłonnych wzrósł w porównaniu z niezinfekowanymi kontrolami.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest przygotowanie hodowli przełyku w pożądanym wieku biologicznym. Należy obchodzić się z nimi delikatnie, aby manipulacje manualne nie wywołały reakcji immunologicznych. Po zakończeniu tej procedury można wykorzystać wypreparowane organy, ciało tłuszczowe oraz gruczoły chłonne do ekstrakcji RNA i białek przy użyciu wyizolowanego RNA lub białka.W celu zbadania ekspresji genów i białek możemy przeprowadzić analizę PCR lub Western. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób hodowli pasożytów na gospodarzach z gatunku drosophila oraz technikę sekcji tkanek odpornościowych do celów immunohistochemicznych i innych zastosowań.

an-introduction-to-parasitic-wasps-drosophila-antiparasite-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wprowadzenie do Os Pasożytniczych Drosophila i Odpowiedzi Immunologicznej Przeciw Pasożytom

Zakażenie bakterią Wolbachia u Drosophila

Fopius arisanus jest parasitoidem jaj i larw muszek owocówek z rodziny Tephritidae, który jest z sukcesem wykorzystywany w biologicznej kontroli tych istotnych tropikalnych szkodników. Opisujemy tutaj zoptymalizowany protokół hodowli F. arisanus na małą skalę z wykorzystaniem łatwo dostępnych materiałów.

Zoptymalizowany protokół hodowli Fopius arisanus, parasytoida much owocówek z rodziny Tephritidae

Aby zrozumieć związek między odpowiedzią immunologiczną a zachowaniem, opisujemy metodę pomiaru aktywności lokomotorycznej Drosophila podczas infekcji bakteryjnej, a także zdolność much do wywołania odpowiedzi immunologicznej poprzez monitorowanie przeżywalności, obciążenia bakteryjnego oraz aktywności w czasie rzeczywistym kluczowego regulatora odporności wrodzonej, NFκB.

Ilościowy pomiar odpowiedzi immunologicznej i snu u Drosophila

Drosophila melanogaster to wybitny organizm modelowy do badania wrodzonego układu odpornościowego oraz fizjologicznych konsekwencji infekcji i chorób. Protokół ten opisuje, w jaki sposób dostarczyć D. melanogaster solidne i ilościowo powtarzalne infekcje bakteryjne, a następnie jak zmierzyć nasilenie infekcji i określić ilościowo odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Ogólnoustrojowe infekcje bakteryjne i fenotypy obrony immunologicznej u Drosophila melanogaster

Ta metoda pokazuje, jak wizualizować inwazję patogenów na komórki owadów za pomocą trójwymiarowych (3D) modeli. Hemocyty larw Drosophila były zakażone patogenami wirusowymi lub bakteryjnymi, zarówno ex vivo, jak i in vivo. Zainfekowane hemocyty zostały następnie utrwalone i wybarwione w celu obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego, a następnie rekonstrukcji komórkowej 3D.

Ekstrakcja hemocytów z larw Drosophila melanogaster do infekcji mikrobiologicznej i analizy

Ten protokół opisuje metody doustnego wystawiania i zarażania muszki owocowej Drosophila melanogaster patogenami bakteryjnymi, a także mierzenia liczby zakaźnych bakterii wydalanych po infekcji jelitowej. Dalej opisujemy wpływ mutantów immunologicznych na przeżywalność much po zakażeniu bakteryjnym jamy ustnej.

Zakażenie bakteryjne jamy ustnej i wydalanie u Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje test fagocytozy in vivo u dorosłych Drosophila melanogaster w celu ilościowego określenia rozpoznawania fagocytów i usuwania infekcji mikrobiologicznych.

Ocena komórkowej odpowiedzi immunologicznej muszki owocowej, Drosophila melanogaster, przy użyciu testu fagocytozy in vivo

Dorosłe muchy Drosophila melanogaster były szeroko wykorzystywane jako organizmy modelowe do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wrodzonych odpowiedzi immunologicznych gospodarza i strategii infekcji mikrobiologicznej. Aby promować stadium larwy D. melanogaster jako dodatkowy lub alternatywny system modelowy, opisano technikę iniekcji larw.

Drosophila melanogaster (Drosophila melanogaster) Protokół wstrzyknięcia larw

Ganaspis brasiliensis - larwalny parazytoid Drosophila suzukii (globalny inwazyjny szkodnik upraw owocowych) - został zatwierdzony lub jest rozważany do wprowadzenia do Europy i Stanów Zjednoczonych w celu biologicznego zwalczania tego szkodnika. W tym artykule przedstawiono protokoły hodowli tego parazytoida zarówno na małą, jak i dużą skalę.

Metody hodowli parazytoida Ganaspis brasiliensis, obiecującego środka kontroli biologicznej inwazyjnej Drosophila suzukii

Celem tego protokołu jest ułatwienie analizy funkcjonalnej interakcji parazytoid-gospodarz w Asobara japonica i Drosophila melanogaster poprzez zoptymalizowane metody chowu, pojedynczy test infekcji jajorodności i wyciszenia genu z wykorzystaniem RNAi.

Protokoły efektywnego hodowania i analizy funkcjonalnej endoparazitoida Asobara japonica oraz jego żywiciela Drosophila melanogaster

Poznaj metody hodowli os pasożytniczych na larwach Drosophila melanogaster oraz techniki preparowania grasicy i tkanki tłuszczowej. Naucz się analizować odpowiedź immunologiczną gospodarza po infestacji.

Wprowadzenie do os w pasożytach Drosophila i odpowiedzi immunologicznej przeciwpasożytniczej

Przeglądaj więcej filmów