Name: Produkcja i mianowanie rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Poznaj metodę produkcji i oczyszczania rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem (rAAV) przy użyciu chromatografii heparynowej. Technika ta umożliwia skuteczną dostawę transgenów do badań in vivo bez konieczności stosowania ultrawirówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Rysunek 1 przedstawia schemat podsumowujący poniższy protokół.
Uwaga dotycząca bezpieczeństwa: Wszystkie materiały, które miały kontakt ze zmontowanymi cząsteczkami wirusowymi, muszą zostać zdezynfekowane roztworem Virkon lub innym odpowiednim środkiem dezynfekującym.
1. Przygotowanie zapasów plazmidowego DNA (~ 2 dni)
<ol>
	<li>Wymagane są następujące plazmidy 1:
	<ul>
		<li>pRV1 – zawierający sekwencje Rep i Cap AAV2</li>
		<li>pH21 – zawierający sekwencje Rep i Cap AAV1</li>
		<li>pFdelta6 – pomocniczy plazmid adenowirusowy</li>
		<li>plazmid AAV zawierający rekombinującą kasetę ekspresyjną flankowaną sygnałami pakowania AAV2 (odwrócone powtórzenia końcowe, ITRs)</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Podczas gdy pFdelta6 należy hodować w kompetentnych komórkach Stbl2, aby zapobiec częściowym delecjom, pRV1 i pH21 można hodować w kompetentnych komórkach DH5alpha. Plazmidy AAV można hodować w komórkach Stbl2, jeśli w komórkach DH5alpha występują częściowe delecje.</li>
	<li>DNA plazmidowe powinno być wysokiej jakości i wolne od zanieczyszczeń RNA. Integralność plazmidów można sprawdzić za pomocą następujących trawień:
	<ul>
		<li>pRV1 – trawienie XbaI w celu uzyskania prążków 7,5 kb i 3,8 kb</li>
		<li>pH21 – trawienie EcoRI w celu uzyskania prążków 4,5 kb, 2,8 kb i 0,2 kb</li>
		<li>pFdelta6 – trawienie HindIII w celu uzyskania prążków 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2,3 kb i 1,5 kb</li>
	</ul>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie ludzkich komórek embrionalnej nerki 293 (Hek293) do transfekcji (2 - 3 dni)
<ol>
	<li>Przenieś komórki Hek293 z dwóch kolb o powierzchni 150 cm2 przy 80% konfluencji do pięciu naczyń hodowlanych Nunc o średnicy 15 cm. Przed transfekcją komórki powinny osiągnąć 70 - 80% konfluencji (około 48 godzin po wysianiu). Hoduj komórki w standardowej pożywce Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) z niską zawartością glukozy, zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej oraz 100 U/ml penicyliny / 100 μg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Na 3 godziny przed transfekcją usuń DMEM i zastąp go pożywką Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) zawierającą 5% płodowej surowicy cielęcej.</li>
</ol>
3. Transfekcja plazmidów wirusowych (~1 godzina na transfekcję, 3 dni na inkubację)
<ol>
	<li>Przygotuj następujące składniki dla jednej partii wirusa (5 płytek hodowlanych 15 cm):
	<ul>
		<li>62.5 μg plazmidu AAV</li>
		<li>125 μg pFdelta6</li>
		<li>31.25 μg pRV1</li>
		<li>31.25 μg pH21</li>
		<li>1650 μl 2.5 M CaCl2</li>
		<li>12 ml dH2O</li>
	</ul>
	</li>
	<li>W dygestorium do hodowli tkankowej klasy 2 przefiltruj sterylnie mieszaninę do transfekcji do probówki 50 ml.</li>
	<li>Podczas mieszania roztworu na wortexie szybko dodaj 13 ml 2 x soli HEPES (pH 7.05). Zamknij probówkę 50 ml i kontynuuj mieszanie na wortexie przez 15 sekund. Odstaw na 1 minutę i 45 sekund; powinien powstać drobny biały osad.</li>
	<li>Ostrożnie dodaj 5 ml roztworu do transfekcji do każdej płytki hodowlanej 15 cm. Zakręć płytkami w celu wymieszania i przełóż do inkubatora.</li>
	<li>16 godzin po transfekcji usuń pożywkę IMDM i zastąp ją pożywką DMEM.</li>
</ol>
4. Lizowanie komórek i pozyskiwanie rAAV (2 godziny)
<ol>
	<li>72 godziny po transfekcji usunąć medium z płytek hodowlanych i zutylizować. Wszystkie odpady należy poddać działaniu roztworu Virkon lub innego odpowiedniego środka dezynfekującego.</li>
	<li>Komórki delikatnie przemyć ciepłym 1x roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS; pH 7.4).</li>
	<li>Do każdej płytki dodać 25 ml ciepłego PBS i delikatnie zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek. Zawiesinę zebrać do probówek o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Komórki zwirować w celu otrzymania osadu przy 800 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Usunąć nadsącz i zawiesić osad w roztworze 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8.0, stosując 10 ml na każdą płytkę hodowlaną. Rozdzielić zawiesinę do dwóch probówek 50 ml.</li>
	<li>Przygotować świeży 10% roztwór deoksycholanu sodu w dH2O. Do każdej probówki dodać 1,25 ml tego roztworu, aby uzyskać stężenie końcowe 0,5%. Dodać nukleazę benzonazę do stężenia końcowego 50 jednostek na ml. Dokładnie wymieszać zawartość probówek.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Usunąć resztki komórkowe poprzez wirowanie przy 3000 x g przez 15 minut. Przenieść materiał do nowej probówki 50 ml, upewniając się, że wszystkie resztki komórkowe zostały usunięte, aby zapobiec zapchaniu kolumn z heparyną (patrz krok 5). Na tym etapie próbki można przechowywać w temperaturze -20°C przed kontynuacją procedury. Próbki przechowywane przez nas w temperaturze -20°C przez kilka tygodni nie wykazały spadku zakaźności.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie rAAV na kolumnie z heparyną (2 - 3 godziny)
<ol>
	<li>Przygotować kolumny HiTrap heparin, używając pompy perystaltycznej w taki sposób, aby roztwory przepływały przez kolumnę z prędkością 1 ml na minutę w krokach od 5.2 do 5.4. Ważne jest, aby dopilnować, by do kolumny heparynowej nie dostały się pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Równoważyć kolumnę za pomocą 10 ml 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0.</li>
	<li>Nanieść na kolumnę 50 ml roztworu wirusa i pozwolić mu przepłynąć.</li>
	<li>Przemyć kolumnę za pomocą 20 ml 100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0.</li>
	<li>Używając strzykawki 5 ml, kontynuować płukanie kolumny za pomocą 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0, a następnie 1 ml 300 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0. Odciek należy odrzucić.</li>
	<li>Używając strzykawek 5 ml i delikatnego nacisku, eluować wirusa z kolumny, aplikując:
	<ul>
		<li>1.5 ml 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0</li>
		<li>3.0 ml 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0</li>
		<li>1.5 ml 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0</li>
		<li>Zebrać te frakcje do probówki wirówkowej 15 ml.</li>
	</ul>
	</li>
</ol>
6. Zagęszczanie i sterylna filtracja rAAV (1 godzina)
<ol>
	<li>Skoncentrować wektor, korzystając z jednostek filtracyjnych do wirowania Amicon ultra-4 z granicą odcięcia masy cząsteczkowej 100 000. Nanieść 4 ml eluatu z kolumny do koncentratora i wirować przy 2000 x g przez 2 minuty (w temperaturze pokojowej). Odrzucić filtrat, ponownie nanieść pozostały roztwór wirusa do koncentratora i powtórzyć wirowanie. Objętość stężonego roztworu powinna wynosić około 250 μl. Jeśli objętość stężonego roztworu jest znacznie większa, należy odrzucić filtrat i kontynuować wirowanie w odstępach jednominutowych, aż objętość wyniesie około 250 μl.</li>
	<li>Dodać 250 μl PBS do wirusa, aby uzyskać objętość końcową 500 μl, a następnie przenieść roztwór z koncentratora.</li>
	<li>Przefiltrować wektor przez filtr strzykawkowy o średnicy 13 mm i wielkości porów 0.2 μm. Wektor należy podzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -80°C do momentu użycia.</li>
</ol>
7. Oznaczanie miana zapasów wirusa (3 dni)
Wymaga to promotora aktywnego w komórkach Hek293, który steruje genem reporterowym lub produktem genowym wykrywalnym immunocytochemicznie. W przypadku tworzenia wektora niekompatybilnego z komórkami Hek293 można zastosować inne linie komórkowe lub pierwotne kultury komórkowe.
<ol>
	<li>Przygotować 18 szkiełek zakrywek pokrytych poli-L-lizyną lub 18 studzienek szkiełek komorowych Nunc, wysiewając komórki Hek293 tak, aby osiągnęły 40 - 50% konfluencji. Do miareczkowania wektorów rAAV zależnych od Cre należy użyć komórek Hek293 stabilnie eksponujących rekombinazę Cre 2.</li>
	<li>Każdą studzienkę zainfekować seryjnymi rozcieńczeniami wektora AAV (Rys. 2A). Użyć 3 studzienek na każde rozcieńczenie. Wirus dodajemy rutynowo bezpośrednio do każdej studzienki.</li>
	<li>Po 72 godzinach utrwalić komórki Hek293, dodając do medium równą objętość 4% paraformaldehydu (PFA) (uzyskując końcowe stężenie 2% PFA) na dziesięć minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć komórki trzykrotnie w PBS, wypłukać w dH2O i nałożyć szkiełko zakrywkę.</li>
	<li>Policzyć liczbę przetransdukowanych komórek w trzech studzienkach o najwyższym stopniu rozcieńczenia, w których nadal występują zainfekowane komórki, obliczyć ich średnią i pomnożyć przez czynnik rozcieńczenia, aby uzyskać liczbę jednostek zakaźnych na mikrolitr (Rys. 2B).</li>
</ol>
8. Przewidywane wyniki
Komórki Hek293 transdukowane wirusem kodującym ulepszone zielone białko fluorescencyjne (eGFP) przedstawiono na rysunku 2B. Zazwyczaj uzyskujemy stabilne miana na poziomie około 6 x 106 cząstek zakaźnych na mikrolitr. Wektorów tych rutynowo używamy do wstrzykiwań stereotaktycznych do mózgu dorosłych gryzoni. Stanowi to potężną technikę umożliwiającą regionowo specyficzną ekspresję genów 2. Aby połączyć tę specyficzność regionalną z selektywną ekspresją genów w konkretnych typach komórek, wstrzykujemy rAAV zależne od rekombinazy Cre do obszarów docelowych u myszy transgenicznych Cre 2. Rysunki 2C-E przedstawiają przykłady wstrzykiwań stereotaktycznych rAAV zależnych od Cre kodujących eGFP do różnych obszarów mózgu dorosłych myszy transgenicznych parvalbumin-Cre 3.
<img alt="Schemat transfekcji komórek HEK-293, etapy procesu produkcji wektora AAV, w tym oczyszczanie." src="/files/ftp_upload/3348/3348fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczny opis protokołu produkcji rAAV. 1.) Komórki Hek293 są wysiewane i hodowane do osiągnięcia 70 - 80% konfluencji. 2.) Plazmidy AAV i pomocnicze są przygotowywane i transfekowane do komórek Hek293. 3.) 16 godzin po transfekcji medium jest zmieniane z powrotem na DMEM, a komórki Hek293 są hodowane przez kolejne 56 godzin. 4.) Komórki Hek293 są zbierane i lizowane. Wektory rAAV są oddzielane od szczątków komórkowych poprzez wirowanie. 5.) Cząsteczki wirusowe są oczyszczane na kolumnach z hepariną przed zagęszczeniem i sterylizacją. 6.) Komórki Hek293 są hodowane na płytkach 24-dołkowych i infekowane seryjnymi rozcieńczeniami wektora AAV w celu określenia liczby jednostek zakaźnych.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna pokazująca przekroje mózgu szczura, hodowlę komórkową, schemat rozcieńczeń dla konfiguracji eksperymentu." src="/files/ftp_upload/3348/3348fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Miareczkowanie i aplikacja in vivo rAAV1/2. (A) Przygotowanie komórek Hek293 do pomiaru miana wirusa. Komórki Hek293 są transdukowane seryjnymi rozcieńczeniami rAAVs. C, kontrola niezainfekowana; N, 1 μl nierozcieńczonego roztworu wirusa. (B) Komórki Hek293 zainfekowane rAAVs wykazującymi ekspresję eGFP. (C-E) Ekspresja wirusowej eGFP jest ograniczona do neuronów wykazujących ekspresję Cre w różnych regionach docelowych u myszy transgenicznych parvalbumin-Cre po stereotaktycznym wstrzyknięciu Cre-aktywowanych rAAVs. Przykładowe obrazy pokazują immunoreaktywność GFP w (C) wzgórzu siateczkowatym i gałce bladej, (D) zakręcie zębatym oraz (E) obszarze CA1 hipokampa. DG, zakręt zębaty; RT, jądro siateczkowate wzgórza; GP, gałka blada. Paski skali: B, 500 μm; C, 100 μm; D, 100 μm; E, 500 μm.

<ol><li>Klugmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+hippocampal+expression+of+short+and+long+Homer+1+proteins+differentially+affect+cognition+and+seizure+activity+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated hippocampal expression of short and long Homer 1 proteins differentially affect cognition and seizure activity in adult rats.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 28, 347-360 (2005).</li>
<li>Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-positive+CA1+interneurons+are+required+for+spatial+working+but+not+for+reference+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory.</a> Nature Neuroscience. 14, 297-299 (2011).</li>
<li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3, e159-e159 (2005).</li>
<li>Hauck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7, 419-425 (2003).</li>
<li>Halbert, C. L., Allen, J. M., Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+type+6+%28AAV6%29+vectors+mediate+efficient+transduction+of+airway+epithelial+cells+in+mouse+lungs+compared+to+that+of+AAV2+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus type 6 (AAV6) vectors mediate efficient transduction of airway epithelial cells in mouse lungs compared to that of AAV2 vectors.</a> Journal of Virology. 75, 6615-6615 (2001).</li>
<li>Blankinship, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+skeletal+muscle+using+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotype+6%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of skeletal muscle using vectors based on adeno-associated virus serotype 6.</a> Molecular Therapy. 10, 671-678 (2004).</li>
<li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+amino+acid+changes+can+influence+titer%2C+heparin+binding%2C+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80, 11393-11397 (2006).</li>
<li>Dong, J. Y., Fan, P. D., Frizzell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+packaging+capacity+of+recombinant+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Human+gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus.</a> Human gene therapy. 7, 2101-2112 (1996).</li>
<li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+serotype+1%2C+2%2C+and+5+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Methods. 1, 158-167 (2002).</li>
<li>Burova, E., Loffe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+purification+of+recombinant+adenoviral+and+adeno-associated+viral+vectors%3A+methods+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications.</a> Gene Therapy. 12, 5-17 (2005).</li>
<li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Therapy. 6, 973-985 (1999).</li>
<li>Bilbao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+gene+expression+from+in+utero+delivery+of+adenoviral-associated+vector+serotype+1%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Patterns of gene expression from in utero delivery of adenoviral-associated vector serotype 1.</a> Human Gene Therapy. 16, 678-684 (2005).</li>
<li>Pilpel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 182, 55-63 (2009).</li>
<li>Mastakov, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+injection+of+rAAV+with+mannitol+enhances+gene+expression+in+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain.</a> Molecular Therapy. 3, 225-232 (2001).</li>
<li>Fu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+2+vector%3A+global+distribution+and+broad+dispersion+of+AAV-mediated+transgene+expression+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Self-complementary adeno-associated virus serotype 2 vector: global distribution and broad dispersion of AAV-mediated transgene expression in mouse brain.</a> Molecular Therapy. 8, 911-917 (2003).</li>
<li>Ghosh, A., Yue, Y., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Transgene+Reconstitution+with+Hybrid+Dual+AAV+Vectors+Carrying+the+Minimized+Bridging+Sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient Transgene Reconstitution with Hybrid Dual AAV Vectors Carrying the Minimized Bridging Sequences.</a> Human Gene Therapy. 22, 77-83 (2011).</li>
<li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+AAV+vectors%3B+advances+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16, 1648-1656 (2008).</li>
<li>Georgiadis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+knockdown+of+peripherin-2+in+vivo+using+miRNA-based+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated knockdown of peripherin-2 in vivo using miRNA-based hairpins.</a> Gene Therapy. 17, 486-493 (2010).</li>
<li>Atasoy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> The Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li>
<li>Guggenhuber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+Vector-Mediated+Overexpression+of+CB1+Cannabinoid+Receptor+in+Pyramidal+Neurons+of+the+Hippocampus+Protects+against+Seizure-Induced+Excitoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">AAV Vector-Mediated Overexpression of CB1 Cannabinoid Receptor in Pyramidal Neurons of the Hippocampus Protects against Seizure-Induced Excitoxicity.</a> PLoS One. 5, e15707-e15707 (2010).</li>
<li>Lawlor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+delivery+and+selective+transduction+of+glial+cells+in+the+mammalian+brain+by+AAV+serotypes+isolated+from+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 1692-1702 (2009).</li>
<li>Chtarto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline-inducible+transgene+expression+mediated+by+a+single+AAV+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Tetracycline-inducible transgene expression mediated by a single AAV vector.</a> Gene Therapy. 10, 84-94 (2003).</li>
<li>Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+humoral+immune+response+to+the+tetracycline+%28Tet%29+activator+in+rats+injected+intracranially+with+Tet-off+rAAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lack of humoral immune response to the tetracycline (Tet) activator in rats injected intracranially with Tet-off rAAV vectors.</a> Gene Therapy. 17, 616-625 (2010).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Wektory rAAV stają się coraz bardziej wartościowe w badaniach in vivo na zwierzętach. W niniejszym materiale opisaliśmy prosty i niedrogi protokół produkcji rAAV, który może ułatwić powszechne zastosowanie tego użytecznego wektora, eliminując kosztowne zlecanie produkcji wirusów firmom zewnętrznym. Protokół (oparty na referencji 1) opisuje produkcję chimerycznych wektorów rAAV1/2 zawierających białka kapsydu obu serotypów rodzicielskich w równych proporcjach 4. Oczyszczanie wektorów rAAV poprzez wiązanie do kolumn z heparyną opiera się na ekspresji białek kapsydu AAV2, ale może być łączone z serotypami innymi niż opisany tutaj AAV1. Dodatkowo zgłoszono, że AAV6 wiąże się z heparyną, choć z mniejszym powinowactwem, i potencjalnie mógłby być oczyszczany za pomocą kolumn z heparyną przy użyciu tej procedury 5,6. Należy jednak zauważyć, że inne serotypy będą wymagały różnych stężeń NaCl do elucji z kolumny z heparyną 5,7.
Wykazano, że optymalny rozmiar pakowania genomów rAAV mieści się w przedziale od 4,1 do 4,9 kb, przy czym powyżej 5,2 kb następuje gwałtowny spadek wydajności pakowania 8. Limit ten można uznać za największą wadę systemu rAAV, ponieważ specyficzna dla typu komórek regulacja ekspresji transgenu jest zazwyczaj osiągana za pomocą dużych elementów cis-działających, których nie można pomieścić w małych cząsteczkach AAV. Aby zapobiec otrzymywaniu partii o niskim mianie, takich jak te wynikające z prób pakowania genów o rozmiarze bliskim limitowi pakowania AAV, łączymy oddzielne partie wirusa skoncentrowane do 250 μl w jedną partię o objętości 500 μl, zamiast dodawać PBS, jak opisano w kroku 6.3. Niezawodną transdukcję specyficzną dla typu komórek można osiągnąć poprzez połączenie myszy z driverem Cre i warunkowych kaset rAAV (patrz poniżej), aby uniknąć przekraczania limitu pakowania.
Należy zauważyć, że choć niniejszy protokół ma na celu dostarczenie łatwych do naśladowania instrukcji dotyczących produkcji rAAV o wysokim mianie, wymaga on obecności fragmentów białka kapsydu AAV2 w celu oczyszczania za pomocą chromatografii powinowactwa do heparyny. Serotypy inne niż AAV2 muszą być oczyszczane przy użyciu alternatywnych procedur 9. Jedną z zalet oczyszczania na kolumnie z heparyną jest przekonanie, że pozwala ono na otrzymanie wektorów AAV o większej zakaźności niż te otrzymane z użyciem gradientu chlorku cezu 10. Metoda ta ma jednak również pewne wady. Na przykład w oczyszczonym stoku wirusowym mogą znajdować się inne białka wiążące heparynę. Choć tropizm wektorów oczyszczonych heparyną może być zależny od miana wektora10, nasze podejście do specyficznego celowania w neurony pobudzające20 lub hamujące (Rys. 2) wykorzystuje aktywację ekspresji transgenu zapośredniczoną przez AAV indukowaną przez Cre i jest niezależne od miana. Alternatywą dla oczyszczania na kolumnie z heparyną jest zastosowanie gradientu gęstości jodiksanolu, który pozwala uzyskać wyższe miano wirusa i czystszą preparację niż w przypadku użycia gradientu chlorku cezu 10. Metodę tę można również połączyć z oczyszczaniem na kolumnie z heparyną, aby otrzymać wektor o czystości przekraczającej 99% 11. W związku z tym poszczególne grupy badawcze powinny starannie rozważyć, która metoda oczyszczania wirusów jest najlepsza dla ich konkretnej aplikacji końcowej.
Najczęstszym problemem związanym z tym protokołem jest niski miano wirusa. W naszym doświadczeniu wynika to zazwyczaj z niskiej wydajności transfekcji lub błędów podczas elucji wirusa z kolumn z heparyną. Wszystkie materiały do transfekcji powinny osiągnąć temperaturę pokojową przed rozpoczęciem procesu, a w każdym laboratorium należy przeprowadzić transfekcje testowe w celu znalezienia optymalnych warunków. Inne metody transfekcji, takie jak zastosowanie lipofektaminy, są bardzo wydajne, ale mogą być nadmiernie kosztowne. Ponadto stężenie i pH roztworów elucyjnych do kolumn z heparyną są krytyczne dla całkowitej elucji wirionów z kolumn bez ich uszkadzania. Kolejnym istotnym punktem jest to, że komórki opakowujące muszą dobrze przylegać do powierzchni naczyń hodowlanych. Jeśli komórki odkleją się na jakimkolwiek etapie procedury, zaleca się przerwanie eksperymentu i rozmrożenie nowej fiolki z komórkami.
Przestrzenną i czasową kontrolę ekspresji transgenu u gryzoni można łatwo osiągnąć poprzez precyzyjne celowanie anatomiczne oraz dobór stadium rozwojowego zwierzęcia. Wykazano, że efektywny transfer genów za pomocą AAV jest możliwy in utero 12,13. W dorosłym mózgu obszar zainfekowany cząsteczkami rAAV po wstrzyknięciu stereotaktycznym może być dostosowany od bardzo małych, ukierunkowanych regionów do znacznie większych obszarów, nie tylko poprzez zmiany miana wirusa, ale także poprzez modyfikację parametrów wstrzykiwania. Obejmują one objętość i prędkość wstrzykiwań oraz dodatek poliolu mannitolu do zawiesiny wirusowej 14. Mannitol może być również stosowany w celu zwiększenia infekcji różnych tkanek po systemowym wstrzyknięciu rAAV 15.
Pojemność pakowania rAAV (około 4,7 kb) jest prawdopodobnie najbardziej ograniczającym czynnikiem pod względem genów, które mogą być eksprymowane z tych wektorów wirusowych. Jednakże niedawne badania wykazały, że można to częściowo obejść poprzez podział większych genów lub kaset ekspresyjnych na oddzielne wektory rAAV i wprowadzenie sekwencji mostkującej, która inicjuje ekspresję genu w momencie, gdy wiriony zainfekują tę samą komórkę. 16Poziomy ekspresji genów przenoszonych przez wektory rAAV można również znacznie zwiększyć, stosując samouzupełniające się wektory rAAV. 17Stereotaktyczne wstrzykiwanie wektorów rAAV stanowi szybką, niedrogą i skuteczną metodę indukcji ekspresji genów w sposób regionowo specyficzny. W połączeniu z 2nd strategie generowania interferencji RNA 18 Wektory rAAV mogą być również wykorzystywane do regionowo swoistego wyciszania genów. rAAV można łączyć z myszami transgenicznymi Cre lub promotorami swoistymi dla danego typu komórek, aby uzyskać ekspresję genów swoistą dla konkretnego obwodu i typu komórek, co umożliwia manipulacje genetyczne o wysokiej rozdzielczości przestrzennej. 2,19-21podczas gdy wyposażenie rAAV-ów np. w system tet zapewnia kontrolę czasową nad wirusową ekspresją genów 22,23Przykłady te ilustrują ogromny potencjał kombinatoryczny tych wektorów i pozwalają przewidywać gwałtowny wzrost liczby badań opartych na rAAV w nadchodzących latach.

<table><tbody><tr><td>Wirówki membranowe Amicon Ultra</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC810024</td><td>100,000 MWCO</td></tr><tr><td>Nukleaza Benzonase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka DMEM (Dulbeco&amp;rsquo;s modified Eagle medium)</td><td>Invitrogen</td><td>10567014</td><td>Uzupełnić o 10% FCS oraz 10 units/ml penicyliny/100 &amp;#x03BC;g/ml streptomycyny</td></tr><tr><td>Komórki Hek293</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1573</td><td>Stosować przy pasażu poniżej 30</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna z buforem HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Kolumienka HiTrap Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54836</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Iscove&amp;rsquo;s modified Dulbecco&amp;rsquo;s medium</td><td>Invitrogen</td><td>12440-053</td><td>Uzupełnić o 5% FCS</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5670</td><td>Przygotować świeży roztwór dla każdej partii</td></tr><tr><td>Szkła hodowlane 15 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>157150</td><td></td></tr><tr><td>Komórki kompetentne Stbl2</td><td>Invitrogen</td><td>10268-019</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Virkon</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9821357</td><td>Pozostawić do dezynfekcji na noc przed wylaniem do odpływu</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Specyficzne odczynniki wymagane do protokołu</td></tr></tbody></table>

produkcja i miareczkowanie rekombinowanych wektorów wirusowych opartych na wirusie towarzyszącym adenowirusom (aav)

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

W ostatnich latach rekombinowane wektory adeno-zależne (AAV) stały się coraz bardziej cenne w badaniach in vivo na zwierzętach, a obecnie są również testowane w ludzkich badaniach klinicznych. AAV typu dzikiego jest niepatogennym członkiem rodziny parvoviridae i z natury wykazuje deficyt replikacyjny. Szeroki profil transdukcji, niska odpowiedź immunologiczna, a także silna i trwałe ekspresja transgenu uzyskiwana dzięki tym wektorom sprawiły, że stały się one popularnym i wszechstronnym narzędziem do dostarczania genów in vitro oraz in vivo. rAAV można w łatwy i tani sposób wytwarzać w laboratorium i, w oparciu o ich korzystny profil bezpieczeństwa, są one zazwyczaj klasyfikowane jako niskie ryzyko. W niniejszej pracy opisujemy metodę produkcji i miareczkowania chimerycznych rAAV zawierających białka kapsydu zarówno AAV1, jak i AAV2. Zastosowanie tych tzw. wektorów chimerycznych łączy zalety obu serotypów rodzicielskich, takie jak wysokie miana zapasów (AAV1) i oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa (AAV2). Serotypy AAV są najlepiej przebadanymi spośród wszystkich serotypów AAV i indywidualnie wykazują szeroki wzorzec zakaźności. Opisane tutaj wektory chimeryczne powinny posiadać właściwości infekcyjne AAV1 i AAV2, a zatem można oczekiwać, że zainfekują one szeroki zakres tkanek, w tym między innymi neurony, mięśnie szkieletowe, trzustkę i nerki. Opisana metoda wykorzystuje oczyszczanie na kolumnie z heparyną, która – jak się uważa – pozwala na uzyskanie wyższego miana wirusa i czystszego preparatu wirusowego niż inne metody oczyszczania, takie jak wirowanie w gradiencie chlorku cezu. Dodatkowo opisujemy, w jaki sposób wektory te można szybko i łatwo miareczkować, aby uzyskać dokładny odczyt liczby wytworzonych cząstek zakaźnych.

Wektory rekombinowanego wirusa towarzyszącego adenowirusom (rAAVs) stają się coraz bardziej cenne w badaniach in vivo na zwierzętach. Opisujemy, w jaki sposób rAAVs mogą być produkowane w laboratorium oraz jak można oznaczać miano tych wektorów, aby uzyskać dokładny odczyt liczby wyprodukowanych cząstek zakaźnych.

Produkcja i miareczkowanie rekombinowanych wektorów wirusowych opartych na wirusie towarzyszącym adenowirusom (AAV)

W ostatnich latach rekombinowane wektory wirusów towarzyszących adenowirusom (AAV) stają się coraz bardziej wartościowe w badaniach in vivo na zwierzętach i są obecnie ...

Celem niniejszej procedury jest wytworzenie rekombinowanych wirusów towarzyszących adenowirusom lub rAAV w celu efektywnej dostawy transgenu in vitro lub in vivo. Osiąga się to poprzez transfekcję komórek HEK 293 plazmidami DNA kodującymi transgen oraz geny wirusowe. Następnie przetransfekowane komórki są zdrapywane i lizowane w celu zbioru zmontowanych cząsteczek rAAV.Następnie rekombinowane AAV są oczyszczane z lizatu komórkowego za pomocą oczyszczania na kolumnie z heparyną. Końcowym etapem jest zagęszczenie zapasów wirusa. Ostatecznie wyniki wykazują silną i trwałą ekspresję transgenu indukowaną przez wirusa w badaniu z wykorzystaniem mikroskopii immunofluorescencyjnej.W tym momencie wektory RA AAV są gotowe do zastosowań in vitro lub in vivo. Główną zaletą zastosowania naszej techniki w porównaniu z innymi metodami oczyszczania, takimi jak oczyszczanie w gradiencie chlorku cezu, jest brak konieczności użycia ultracentryfugi lub toksycznych materiałów. Uzyskujemy również większą ilość czystych wektorów wirusowych.Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu należy przygotować wysokiej jakości plazmidy oraz zapasy DNA i sprawdzić ich integralność zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Aby rozpocząć, należy przenieść komórki HEC 2 9 3 z dwóch kolb o powierzchni 150 cm² i 80% konfluencji do pięciu naczyń hodowlanych o średnicy 15 cm. Komórki należy hodować w standardowej pożywce DMEM z niską zawartością glukozy i 10% płodowej surowicy cielęcej. Około 48 godzin po wysianiu, w dniu transfekcji, komórki powinny osiągnąć 70–80% konfluencji na trzy godziny przed przeprowadzeniem transfekcji.Usunąć DMEM i zastąpić go schłodzoną na lodzie zmodyfikowaną pożywką do komórek CHO lub IMDM zawierającą 5% płatkowego surowicy cielęcej. Przygotować mieszaninę do transfekcji dla pojedynczej partii wirusa zgodnie z opisem w protokole pisemnym. W komorze do hodowli tkanek klasy drugiej przefiltrować sterylnie mieszaninę do transfekcji do probówki o pojemności 50 ml, a następnie, podczas mieszania w wirówce typu vortex, szybko dodać 13 ml dwukrotnego roztworu soli fizjologicznej w buforze HEPES.Zamknąć probówkę o pojemności 50 ml pokrywką i kontynuować mieszanie w wortexie przez 15 sekund. Odstawić na jedną minutę i 45 sekund. Powinien powstać biały osad. Ostrożnie dodać pięć ml roztworu do transfekcji do każdej 15 cm szalki hodowlanej.Po inkubacji przez 16 godzin delikatnie zakręć płytkami, aby wymieszać zawartość. Usuń pożywkę IMDM, zastąp ją pożywką DMEM i kontynuuj inkubację komórek. W celu zebrania rAAV.Usunąć medium z płytek hodowlanych. 72 godziny po transfekcji odpady należy zawsze zutylizować, traktując je roztworem Vercon lub innym odpowiednim środkiem dezynfekcyjnym. Delikatnie przemyć komórki ciepłym roztworem fosforanowego buforu solnego (PBS) jeden raz.Do każdej płytki dodać 25 ml ciepłego PBS i delikatnie zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek. Po zebraniu zawiesiny do probówek o pojemności 50 ml, odwirować komórki z prędkością 800 ×g przez 10 minut. Odrzucić nadosad i resuspender osad.W 10 mililitrach 150 milimolarnego buforu chlorku sodu na każdą płytkę do hodowli tkanek, podziel zawiesinę do dwóch probówek o pojemności 50 mililitrów. Następnie podlej komórki świeżo przygotowanym 10% roztworem deodoroksycholanu sodu. Potem dodaj nukleazę benzoilowaną w celu usunięcia kwasów nukleinowych.Po dokładnym wymieszaniu probówek inkubowano je w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Po inkubacji usunięto szczątki komórkowe poprzez wirowanie przy 3000 ×g przez 15 minut. Nadnadkład przeniesiono do nowej probówki o pojemności 50 ml, upewniając się, że wszystkie szczątki komórkowe zostały usunięte, aby zapobiec blokowaniu heparyny.Kolumny do oczyszczania rAAV. Należy nalać 10 mL buforu chlorku sodu do strzykawki i przygotować kolumny Heparin HighTrap, korzystając z pompy perystaltycznej w taki sposób, aby roztwory przepływały przez kolumnę z prędkością 1 mL/min. Ważne jest, aby dopilnować, by do kolumny heparinowej nie dostały się pęcherzyki powietrza.Równoważyć kolumnę przy użyciu 10 mililitrów buforu chlorku sodu o stężeniu 150 milimolar. Nałożyć na kolumnę 50 mililitrów roztworu wirusa i pozwolić roztworowi przepłynąć. Następnie przemyć kolumnę 20 mililitrami buforu chlorku sodu o stężeniu 100 milimolar.Używając strzykawki o pojemności 5 ml. Należy kontynuować płukanie kolumny 1 ml buforu chlorku sodu o stężeniu 20 mM, a następnie 1 ml buforu o stężeniu 300 mM. Odciek należy odrzucić.Używając strzykawek o pojemności 5 ml i przykładając delikatny nacisk, eluuj wirusa z kolumny, stosując zwiększające się stężenia buforów elucyjnych. Eluat zbierz do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Skoncentruj wektor, korzystając z jednostek filtracyjnych do wirowania AmCon Ultra 4 z progiem odcięcia masy cząsteczkowej 100 000 Da.Nalej cztery mililitry eluatu z kolumny do koncentratora i wiruj przy 2000 ×g przez dwie minuty. Po powtórzeniu wirowania objętość stężonego roztworu powinna wynosić około 250 µL. Odrzuć filtrat i ponownie umieść pozostały roztwór wirusa w koncentratorze.Dodaj 250 µL PBS do wirusa, aby uzyskać końcową objętość 500 µL, i wyjmij próbkę z koncentratora. W ostatnim kroku przefiltruj wektor przez filtr strzykawkowy o średnicy 13 mm i porach 0,2 µm, aby oczyścić zapas wirusa. Przygotuj 18 szklanych kratek przykrywkowych pokrytych poli-L-lizyną, wysiewając komórki HEC 2 9 3 tak, aby osiągnęły 40-50% konfluencji do miareczkowania Cree-zależnych R AAVs.Należy użyć komórek HEC 2 9 3 stabilnie eksponujących rekombinazę Cree. Każdy dołek należy zainfekować seryjnymi rozcieńczeniami wektora RAAV, zgodnie z opisem w protokole pisemnym, wykorzystując trzy dołki na każde rozcieńczenie. Po 72 godzinach inkubacji należy utrwalić komórki HEC 2 9 3, dodając do medium równą objętość 4% formaldehydu na 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć komórki trzykrotnie w PBS i raz w wodzie destylowanej. Następnie, przy użyciu medium montażowego, należy przenieść szkiełka nakrywkowe na szkiełka przedmiotowe.Odwróć komórkę stroną do dołu. Policz liczbę komórek w rowkach z trzech studni o najwyższym czynniku rozcieńczenia, które nadal zawierają zainfekowane komórki. Oblicz średnią z tych wartości i pomnóż przez czynnik rozcieńczenia, aby uzyskać liczbę jednostek zakaźnych na mikrolitr. Przedstawiono komórki HEC 2 9 3 transdukowane wirusem kodującym wzmocnione zielone białko fluorescencyjne.Zazwyczaj uzyskuje się spójne miana na poziomie około 6 × 10⁶ cząstek zakaźnych na µL. Przedstawiono tutaj przykłady wstrzyknięć stereotaktycznych zależnych od Cre rAAV kodujących zielone białko fluorescencyjne do różnych obszarów mózgu dorosłych myszy transgenicznych Cre par albumin. Ekspresja wirusowego zielonego białka fluorescencyjnego jest ograniczona do neuronów wykazujących ekspresję Cre w różnych obszarach docelowych.W tym przykładzie wykazano immunoreaktywność białka fluorescencyjnego GFP w prążkowanym jądrze wzgórza, gałce bladawej, zakręcie zębatym oraz w obszarze CA1 hipokampa. Po opanowaniu tej techniki, proces produkcji wirusa zajmuje od siedmiu do ośmiu dni, a oznaczenie miana trzy dni, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury.

production-and-titering-of-recombinant-adeno-associated-viral-vectors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Produkcja i oznaczanie tytru wirusowych wektorów adeno-asocjowanych rekombinantowych

Przedstawiono protokół generowania wektorów adenowirusowych o dużej pojemności, pozbawionych wszystkich sekwencji kodujących wirusy. Klonowanie transgenów zawartych w genomie wektora opiera się na endonukleazach naprowadzających. Amplifikacja wirusa w komórkach produkcyjnych hodowanych jako komórki adherentne i w zawiesinie opiera się na wirusie pomocniczym dostarczającym geny wirusowe w trans.

Klonowanie i produkcja na dużą skalę wektorów adenowirusowych o dużej pojemności na bazie ludzkiego adenowirusa typu 5

Tutaj opisujemy efektywną i powtarzalną strategię produkcji, mianowania i kontroli jakości partii wektorów wirusowych związanych z adeno. Pozwala na uzyskanie preparatu wektorowego o wysokim mianie (≥1 x10 13 genomów wektorowych/ml) i wysokiej czystości, gotowego do użycia in vitro lub in vivo.

Produkcja, oczyszczanie i kontrola jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji na dużą skalę wektorów AAV klasy badawczej przy użyciu przylegających komórek HEK 293 hodowanych w stosach komórkowych i oczyszczania metodą chromatografii powinowactwa. Protokół ten konsekwentnie daje &gt;1 x 1013 genomów wektorowych/ml, zapewniając ilości wektorów odpowiednie dla badań na dużych zwierzętach.

Produkcja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w stosach komórkowych do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych

W tym protokole, wektor AAV2 jest wytwarzany przez kokulturację komórek owadów Spodoptera frugiperda (Sf9) z białkiem zielonej fluorescencji (GFP) wirusa bakulowirusa (BV)-AAV2-AAV2 lub genem terapeutycznym oraz komórkami Sf9 zakażonymi BV-AAV2-rep-cap w hodowli zawiesinowej. Cząsteczki AAV są uwalniane z komórek za pomocą detergentu, klarowane, oczyszczane za pomocą chromatografii kolumnowej powinowactwa i zagęszczane przez filtrację o przepływie stycznym.

Opracowanie procesu produkcji i oczyszczania wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV)2 przy użyciu systemu hodowli komórek bakulowirusa i owadów

Rekombinowany wirus związany z adenowirusem (rAAV) jest szeroko stosowany do klinicznego i przedklinicznego dostarczania genów. Niedocenianym zastosowaniem rAAV jest silna transdukcja hodowanych komórek bez konieczności oczyszczania. Dla badaczy, którzy są nowicjuszami w rAAV, udostępniamy protokół klonowania kaset transgenowych, produkcji prymitywnych wektorów i transdukcji kultur komórkowych.

Ekspresja transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Wirus związany z adenowirusem jest wytwarzany w hodowli komórek zawiesinowych i oczyszczany przez wirowanie w gradiacji gęstości podwójnego jodixanolu. Uwzględniono kroki mające na celu zwiększenie całkowitej wydajności wirusa, zmniejszenie ryzyka wytrącania się wirusa i dalszą koncentrację końcowego produktu wirusowego. Oczekiwane końcowe miana osiągają10-12 cząstek wirusa/ml i nadają się do przedklinicznego stosowania in vivo.

Produkcja kultur zawiesinowych i oczyszczanie wirusa związanego z adenowirusem za pomocą wirowania w gradicynacji gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo

Tutaj prezentowany jest protokół produkcji zawiesiny HEK293 oparty na komórkach AAV, co skutkuje zmniejszeniem czasu i pracy potrzebnej do produkcji wektorów przy użyciu komponentów, które są dostępne do celów badawczych od komercyjnych dostawców.

Produkcja wysokowydajnych partii wektorów związanych z adeno przy użyciu komórek zawiesinowych HEK293

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Wraz z rozwojem terapii genowej, rośnie zapotrzebowanie na innowacyjne metody, które mogą sprostać tym wyzwaniom. Zaprezentowano tu unikalną metodę, która usprawnia proces generowania wysokowydajnych i czystych wektorów AAV z wykorzystaniem platformy fabryki komórek, spełniającej standardy jakości dla badań in vivo.

Uproszczona i ustandaryzowana procedura generowania wysokiej jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem o wysokim mianie z wykorzystaniem platformy Cell Factory

Precyzyjna kwantyfikacja kopii genomu wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jest kluczowa, ale standardowy protokół nie został jeszcze ustalony. Protokół ten opisuje zwalidowaną metodę przygotowania oczyszczonych próbek AAV i przeprowadzenia cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (dd_PCR) w celu wiarygodnego ilościowego określenia miana genomu wirusa.

Kwantyfikacja genomów wirusów związanych z adenowirusami w oczyszczonych próbkach wektorów za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Poznaj metodę produkcji i oczyszczania rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem (rAAV) przy użyciu chromatografii heparynowej. Technika ta umożliwia skuteczną dostawę transgenów do badań in vivo bez konieczności stosowania ultrawirówki.

Produkcja i miareczkowanie rekombinowanych wektorów wirusowych opartych na wirusie towarzyszącym adenowirusom (AAV)

Przeglądaj więcej filmów