Name: Organotypowe kultury warstwowe embrionalnej brzusznej części śródmózgowia: system do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Poznaj metodę przygotowania organotypowych plastrów z embrionalnego śródmózgowia myszy E12.5 do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych. Technika ta umożliwia obserwację migracji i różnicowania neuronów metodą time-lapse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Martine Emond i Isabel Brachmann za pomoc w ustanowieniu systemu organotypowych hodowli plastrów oraz Wolfgangowi Hübnerowi i Liviu Gabrielowi Bodei za krytyczną lekturę manuskryptu. Chcielibyśmy podziękować Frankowi Costantiniemu za myszy reporterowe R26 oraz Cliffowi Tabinowi za myszy ShhCreER. Badanie to zostało sfinansowane z grantu badawczego Ministerstwa Nauki i Badań Nadrenii Północnej i Westfalii (Programm zur Förderung der Rückkehr des wissenschaftlichen Spitzennachwuchses aus dem Ausland).

Część tego protokołu została zmodyfikowana na podstawie pracy Daza et al., 207 7.
1. Przygotowania
<ol>
	<li>Można przygotować z jednodniowym wyprzedzeniem
	<ol>
		<li>Przygotować bufor Krebsa 1X (1,5 L): 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4:H2O, 1,2 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 1 mM glukozy, 25 mM NaHCO3; dostosować pH do 7,4. Sterylizować przez filtrowanie (pory 0,2 μm) i przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
		<li>Przygotować pożywkę hodowlaną (20 mL): 5 mL HBSS, 9 mL DMEM z wysoką zawartością glukozy, 850 μL 30% glukozy, 5 mL surowicy koni (25%). Dodać 20 μL 100X penicyliny/streptomycyny. Przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować przed rozpoczęciem sekcji
	<ol>
		<li>Przygotować 10 mL 4% agarozy niskotopliwej (agarozy LMP) w buforze Krebsa 1X: podgrzewać roztwór w kuchence mikrofalowej aż do całkowitego rozpuszczenia agarozy, a następnie umieścić agarozę w kąpieli wodnej o temperaturze 45°C.</li>
		<li>Napełnić tackę na bufor w wibratomie lodowatym buforem Krebsa 1X i uruchomić element chłodzący (utrzymać 4°C). Zamocować żyletkę w uchwycie i przygotować obszar roboczy wibratomu, zapewniając skalpel, cienki pędzel oraz miniaturową łyżeczkę perforowaną do pobierania skrawków. Przygotować sterylne szalki Petriego (35 x 10 mm) z buforem Krebsa 1X do zbierania skrawków. Przechowywać w lodzie.</li>
		<li>Przygotować obszar sekcji z sterylnymi szalkami Petriego (10 x 15 mm) do sekcji oraz mniejszymi sterylnymi szalkami Petriego (35 x 10 mm) do zatapiania, małymi nożyczkami, dwiema precyzyjnymi pincetami (Dumont 5), miniaturową łyżeczką perforowaną, szklaną pipetą Pasteura wypalaną z okrągłą zamkniętą końcówką oraz 1 L buforu Krebsa 1X w lodzie. Przetrzeć wszystkie narzędzia do sekcji 70% etanolem.</li>
		<li>Dodać pożywkę hodowlaną dołków płytki sześcio-dołkowej (1,5 mL/dołek) i umieścić ją w inkubatorze w temperaturze 37°C.</li>
		<li>Przygotować płytkę sześcio-dołkową z 1,5 mL/dołek sterylnego buforu Krebsa 1X oraz 15 μL penicyliny/streptomycyny (100X)/dołek. W warunkach sterylnych umieścić wkłady do hodowli komórkowych Millicell w dołkach. Postawić płytkę sześcio-dołkową obok wibratomu, aby skrawki mózgu można było przenieść na membrany filtrujące bezpośrednio po cięciu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Disekcja i zatapianie mózgów embrionalnych
<ol>
	<li>Zanurzyć ciężarną samicę myszy w narkozie przy użyciu izofluranu, a następnie uśmiercić zwierzę poprzez zwichnięcie stawów szyjnych (embriony powinny być w stadium E12.5). Wypreparować macicę myszy, wyciągając ją pęsetą. Za pomocą innej pęsety oddzielić mesometrium od macicy. Umieścić macicę w lodowatym buforze Krebsa 1X. Używając cienkiej pęsety, oddzielić ścianę mięśniową macicy, błonę Reicherta oraz wisceralny worek żółtkowy od embrionu. Wyjąć embriony z macicy. Umieścić wypreparowane embriony w osobnej szalce Petriego z jałowym buforem Krebsa 1X.</li>
	<li>Wypreparować mózg pod stereomikroskopem. Aby wypreparować mózg, należy najpierw odciąć głowę embrionu. Unieruchomić głowę, przebijając ją cienką pęsetą (na poziomie oczu). Używając drugiej pęsety, ostrożnie usunąć skórę i czaszkę. Za pomocą pęsety delikatnie wyjąć mózg i przenieść go do szalki Petriego z jałowym buforem Krebsa 1X. Bardzo ważne jest zachowanie integralności całego mózgu podczas preparacji, ponieważ uszkodzenia tkanki mózgowej spowodują problemy (takie jak szarpanie tkanki) podczas cięcia na wibrotomie.</li>
	<li>Przepłukać mózgi raz w 4 % agarozie o niskiej temperaturze topnienia (LMP). Osadzić 2-3 mózgi jednocześnie w świeżej 4 % agarozie LMP. Umieścić naczynia do osadzania na lodzie, dbając o ich jak największe wyrównanie. Użyć pipety Pasteura z wypaloną, okrągłą końcówką do podnoszenia mózgów, aż do momentu zastygnięcia dna agarozy. Mózgi powinny osiąść w płaskiej pozycji, równolegle do dna bloku agarozy.</li>
	<li>Po całkowitym zastygnięciu agarozy (po około 3 min), przyciąć agarozę wokół mózgów i przykleić blok agarozy do stolika z preparatem wibrotomu. Podczas przyklejania bloków należy upewnić się, że strona brzuszna mózgu jest równoległa do platformy, ponieważ mózgi powinny być cięte w horyzontalnej płaszczyźnie przekroju.</li>
</ol>
3. Przecinanie w wibrotomie
<ol>
	<li>Do pobierania przekrojów należy użyć żyletki. Aby uzyskać nieuszkodzone plastry, bardzo ważne jest utrzymanie temperatury 4°C podczas sekcjonowania.</li>
	<li>Należy wykonać poziome przekroje o grubości 30 μm przy częstotliwości 50 Hz, amplitudzie ostrza 1,1 mm i prędkości 25 mm/sec.</li>
	<li>Za pomocą cienkiego pędzla należy przesunąć plaster do miniaturowej dziurkowanej łyżki, aby zebrać przekroje mózgu i przenieść je do naczynia ze sterylnym, lodowatym buforem Krebsa 1X. Wybrać plaster zawierający tkankę brzusznej części śródmózwia (patrz Rysunek 1). W mózgu myszy w stadium E12.5 istnieje tylko jeden poziomy przekrój o grubości 30 μm, który zawiera tkankę brzusznej części śródmózwia, w tym neurony dopaminergiczne.</li>
</ol>
4. Hodowla skrawków tkankowych
Kroki 4.2-4.5 należy przeprowadzić w warunkach sterylnych.
<ol>
	<li>Przenieś skrawki mózgu na wkładkę z membraną do hodowli komórkowej Millicell w płytce sześciodołkowej zawierającej 1x bufor Krebsa (patrz punkt 1.2.5). Do przeniesienia skrawka użyj małej łyżki perforowanej (Fine Science Tools) oraz cienkiego pędzla. Na jednej membranie można umieścić do 3 skrawków.</li>
	<li>Przenieś membranę ze skrawkiem do płytki sześciodołkowej z pożywką hodowlaną (patrz punkt 1.2.5). Górna powierzchnia membrany nie powinna być zakryta pożywką. Skrawki mózgu otrzymują pożywkę od dołu, a dopływ powietrza od góry.</li>
	<li>Umieść płytkę sześciodołkową w inkubatorze z 5 % CO2 w temperaturze 37 °C. Bardzo ważne jest, aby skrawki zostały umieszczone w inkubatorze w ciągu 2 godzin od pierwszego etapu sekcji. Przedłużony czas przygotowania może skutkować niską przeżywalnością skrawków.</li>
	<li>Skrawki mogą być utrzymywane in vitro do 3 dni. W 2nd dniu wymień 50% pożywki hodowlanej.</li>
</ol>
5. Obrazowanie poklatkowe
<ol>
	<li>Pozostaw plastry w inkubatorze na 4-5 godzin w celu regeneracji przed rozpoczęciem obrazowania time-lapse.</li>
	<li>Do obrazowania time-lapse pozostaw plastry na wkładzie membranowym i przenieś wkład do 35 mm szalki Ibidi μ-dish (dno szalki wykonane jest z materiału o wysokiej jakości optycznej).</li>
	<li>Do szalki dodaj 1 mL pożywki hodowlanej oraz 1,5 μL kwasu askorbinowego (20 mM). Kwas askorbinowy chroni plastry przed fototoksycznością.</li>
	<li>Podczas obrazowania time-lapse inkubuj plastry w komorze środowiskowej w temperaturze 37 °C przy 5 % CO2.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1 przedstawia przygotowanie organotypowych hodowli plastrów z mózgu myszy w stadium E12.5. Rysunek 2 pokazuje poziome plastry organotypowe (ostre oraz po kilku dniach hodowli) pobrane z mózgu myszy w stadium E12.5. Dla porównania przedstawiono mrożone przekroje mózgu na równoważnych etapach rozwoju. Neurony dopaminergiczne śródmózgowia zwizualizowano za pomocą immunohistochemii przeciwko tyrozynowej hydroksylazie (TH). Neurony dopaminergiczne śródmózgowia wysyłają projekcje do obszarów docelowych w przedmózgowiu. Projekcje te zaczynają się tworzyć w stadium E12.5 i rozciągają się w stronę przedmózgowia w kolejnych dniach. Rozwój projekcji do przedmózgowia uznajemy za dobry wskaźnik prawidłowego rozwoju neuronów dopaminergicznych w hodowli. W plastrach poziomych neurony dopaminergiczne śródmózgowia wysyłają projekcje w kierunku ich właściwego obszaru docelowego w przedmózgowiu. Po 3 DIV (dniach in vitro) lub w przypadku uszkodzenia obszarów docelowych w przedmózgowiu, aberracyjne projekcje rozciągają się w stronę grzbietowej części śródmózgowia. Przykłady czołowych przekrojów śródmózgowia E12.5 przedstawiono na Rysunku 3. Neurony dopaminergiczne zwizualizowane za pomocą immunobarwienia na TH wysyłają aberracyjne projekcje do grzbietowej części śródmózgowia. Rysunek 4 przedstawia analizę komórek proliferujących, nekrotycznych i apoptycznych w organotypowych hodowlach plastrów. Immunobarwienie BrdU w celu wizualizacji komórek proliferujących wykazuje, że komórki proliferują w warunkach hodowli po 1 DIV. Proliferacja jest zmniejszona po 4 DIV. Po 3 DIV wiele komórek w brzusznej części śródmózgowia ulega nekrozie (barwienie jodkiem propidyny) i apoptozie (immunobarwienie na rozszczepioną kaspazę-3). Rysunek 5 pokazuje drogi migracji neuronów znakowanych YFP monitorowane w eksperymencie obrazowania time-lapse w ostrym plastrze.
<img alt="Schemat mapowania mózgu; metoda sekcjonowania wibratomie; przygotowanie hodowli plastrów; słowa kluczowe badań." src="/files/ftp_upload/3350/3350fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Schemat ilustrujący przygotowanie organotypowych kultur plastrów. 300 μm Poziome skrawki mózgu przygotowuje się poprzez sekcjonowanie mózgu w stadium E12.5 za pomocą wibratomu. (A) Schematyczny widok strzałkowy mózgu myszy w stadium E12.5. Wyznaczono poziomy sekcji. Obszar zawierający neurony dopaminergiczne zaznaczono kolorem różowym, projekcje wskazano kolorem niebieskim. (B) Schematy trzech skrawków, które można uzyskać w przekroju od grzbietowej do brzusznej części, zawierających zarówno przedmózgowie (Fb), jak i śródmózgowie (Mb). Należy zwrócić uwagę, że tylko jeden skrawek zawiera neurony dopaminergiczne (skrawku b). Odpowiedni skrawek można zidentyfikować na podstawie położenia komór oraz ciągłości tkanki śródmózgowia i przedmózgowia (strzałki, porównać sekcję b z sekcjami a i c). Obszar zawierający neurony dopaminergiczne zaznaczono kolorem różowym, obszar zawierający prekursory dopaminergiczne przedstawiono kolorem zielonym, niebieskie strzałki wskazują rozwijające się projekcje. (C) Skrawek zawierający neurony dopaminergiczne jest hodowany na wkładkach membranowych. Skróty: vMb, brzuszne śródmózgowie; dMb, grzbietowe śródmózgowie; Hyp, podwzgórze; Hb, rombencephalon.
<img alt="Schematy hodowli organotypowych plastrów i skrawków mrożonych przedstawiają immunostaining TH dla projekcji neuronalnych." src="/files/ftp_upload/3350/3350fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Projekcje dopaminergicznych neuronów śródmózgowia w organotypowych kulturach skrawków są zależne od integralności przedmózgowia. Immunohistochemia tyrozynowej hydroksylazy (TH) w celu znakowania neuronów dopaminergicznych. (A) Skrawka świeża (0 DIV) pokazująca prawidłową lokalizację neuronów dopaminergicznych w brzusznej części śródmózgowia. Biała grot strzałki wskazuje obszar przedstawiony w większym powiększeniu na wstawce. Projekcje do przedmózgowia nie rozwinęły się jeszcze. Po 1 DIV zaczynają tworzyć się projekcje do przedmózgowia. W dniach 2-3 DIV projekcje rozszerzają się do przedmózgowia. Białe groty strzałek wskazują lokalizację ciał komórkowych przedstawionych w większym powiększeniu na wstawkach (biała ramka). Żółte strzałki wyróżniają prawidłowe projekcje w nienaruszonych skrawkach, pokazane w większym powiększeniu na wstawkach (żółta ramka). W skrawkach z uszkodzonym przedmózgowiem rozwijają się projekcje aberrantne. Czerwone strzałki wskazują aberrantne projekcje do grzbietowej części śródmózgowia, pokazane w większym powiększeniu na wstawkach (czerwona ramka). Uszkodzenie zaznaczono czerwonymi gwiazdkami. Po 3 DIV większość skrawków (n=5/7) wykazała aberrantne projekcje w kierunku grzbietowej części śródmózgowia. (B) Barwienie immunocytochemiczne TH na poziomych, mrożonych przekrojach mózgu na różnych etapach rozwoju, pokazujące rozwój projekcji dopaminergicznych. in vivoBiałe groty strzałek wskazują położenie ciał komórkowych przedstawionych w większym powiększeniu na wstawkach (biała ramka). Żółte strzałki wskazują położenie wypustek przedstawionych w większym powiększeniu na wstawkach (żółta ramka). Poziom przekrojów mrożonych dobrano tak, aby ściśle odpowiadał poziomowi organotypowych kultur plastrów. Należy zauważyć, że pojedynczy przekrój mrożony (12 μm) nie reprezentuje całego organotypowego skrawka (300 μm). W związku z tym projekcje widoczne w dniach E13,5 i E14,5 obserwowano na przekrojach 120 μm bardziej brzusznie niż przekrój zawierający ciała komórek (żółte gwiazdki).
<img alt="Schemat immunobarwienia TH; rozwój neuronów w 3 etapach DIV; mikroskopia fluorescencyjna." src="/files/ftp_upload/3350/3350fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Kultury cieni coronalnych śródmózgia barwione na tyrozynową hydroksylazę (TH) jako marker neuronów dopaminergicznych. (A-C) Przekroje po 1, 2 lub 3 dniach in vitro (DIV). Neurony dopaminergiczne rozwijają aberrantne projekcje w kierunku grzbietowej części śródmózgowia (czerwone strzałki). Grotami strzałek wskazano położenie ciał komórek dopaminergicznych.
<img alt="Proliferacja komórek, nekroza, apoptoza in vitro; barwienie BrdU, jodkiem propidialnym, na kaspazę ciętą, analiza." src="/files/ftp_upload/3350/3350fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Proliferacja i żywotność komórek w organotypowych kulturach skrawków śródmózgowia. (A) Komórki proliferujące znakowano poprzez dodanie BrdU (50 ng/mL, Sigma) do pożywki hodowlanej na 18 h. Następnie skrawki poddano immunobarwieniu na BrdU. Po 1 DIV komórki znakowane BrdU znajdują się w strefach komorowych (czerwone strzałki). Po 4 DIV komórki proliferujące są bardziej rozproszone, a wyraźna strefa komorowa nie jest już utrzymywana. (B) Komórki nekrotyczne znakowano poprzez dodanie jodku propidium (1μg/μL, Sigma) do pożywki hodowlanej na 2 godziny, a następnie wizualizowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Po 1 DIV brzuszna część śródmózgowia (vMb) nie wykazuje martwicy, jednak w grzbietowej części śródmózgowia oraz w przedmózgowiu widocznych jest wiele komórek znakowanych jodkiem propidyny. Po 3 DIV żywotność komórek w brzusznej części śródmózgowia spada. Pasek skali: 500 μm (C) Immunobarwienie na rozszczepioną kaspazę-3 w celu wizualizacji komórek apoptotycznych. W 1. lub 2. dobie in vitro (DIV) tylko nieliczne neurony dopaminergiczne (TH) wykazują apoptozę. Po 3. dobie DIV neurony dopaminergiczne zaczynają przechodzić apoptozę. Panele w środku i po prawej stronie to powiększenia obszarów zaznaczonych ramkami w panelach po lewej. Obrazy o większym powiększeniu są maksymalnymi projekcjami intensywności stosów z (z-stacks) składających się z 14–16 klatek. Obrazy wykonano co 0.5 μm z wykorzystaniem zestawu Zeiss Apotome.
<img alt="Schemat mikroskopii fluorescencyjnej YFP w ostrym skrawku mózgu E12.5; wizualizacja time-lapse." src="/files/ftp_upload/3350/3350fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5. Droga migracji neuronów znakowanych YFP w skrawku tkankowym. (A) Przekrój poziomy wykorzystany do obrazowania poklatkowego neuronów znakowanych YFP. Przekrój inkubowano przez 5 godzin przed obrazowaniem. Komórki znakowano przy użyciu indukowalnego systemu Cre/loxP.6. ShhCreER myszy 8 i ROSAloxP-STOP-loxP-EYFP myszy reporterowe 9 zastosowano. Rekombinacja allelu reporterowego ROSA (i ekspresja EYFP) jest indukowana w komórkach wykazujących ekspresję CreER (komórkach wykazujących ekspresję Shh), jednak wyłącznie po podaniu tamoksyfenu (Sigma). W niniejszym przykładzie tamoksyfen (3 mg/40 g masy ciała) podano ciężarnym myszom w dniu E8,5. Taki układ eksperymentalny prowadzi przede wszystkim do znakowania prekursorów neuronów dopaminergicznych oraz ich potomstwa w brzusznej części śródmózgowia.10,11 Skala: 500 μm(B) Śledzenie drogi migracji neuronów znakowanych YFP w skrawku tkanek uzyskany metodą ostrego cięcia. Obrazy time-lapse neuronów znakowanych YFP w ramach mapowania losów komórek pozyskiwano co 30 min przez łącznie 5 h 30 min przy użyciu mikroskopu Zeiss Axio-Observer (obiektyw EC PlnN 10x /0,3). Skrawki inkubowano w komorze środowiskowej (inkubator XLS1 Pecon) w 37 °C i dostarczono 5% CO22 podczas obrazowania. Początkową pozycję komórek oznaczono czerwonymi strzałkami; pozycje migracji oznaczono czerwonymi gwiazdkami.

<ol><li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).</li>
<li>Martini, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. 136 (1), 41-41 (2009).</li>
<li>Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+neuronal+cell+migrations%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">Guiding neuronal cell migrations.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2), a001834-a001834 (2010).</li>
<li>Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trekking+across+the+brain%3A+the+journey+of+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Trekking across the brain: the journey of neuronal migration.</a> Cell. 128 (1), 29-29 (2007).</li>
<li>Smidt, M. P., Burbach, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+mesodiencephalic+dopaminergic+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 21-21 (2007).</li>
<li>Legue, E., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fate+mapping+using+site-specific+recombinases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic fate mapping using site-specific recombinases.</a> Methods. Enzymol. 477, 153-153 (2010).</li>
<li>Daza, R. A., Englund, C., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+of+embryonic+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture of embryonic brain tissue.</a> CSH Protoc. , (2007).</li>
<li>Harfe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+an+expansion-based+temporal+Shh+gradient+in+specifying+vertebrate+digit+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities.</a> Cell. 118 (4), 517-517 (2004).</li>
<li>Srinivas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Dev. Biol. 1, 4-4 (2001).</li>
<li>Joksimovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+separable+Shh+domains+in+the+midbrain+define+distinct+dopaminergic+progenitor+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally separable Shh domains in the midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (45), 19185-19185 (2009).</li>
<li>Blaess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal-spatial+changes+in+Sonic+Hedgehog+expression+and+signaling+reveal+different+potentials+of+ventral+mesencephalic+progenitors+to+populate+distinct+ventral+midbrain+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Temporal-spatial changes in Sonic Hedgehog expression and signaling reveal different potentials of ventral mesencephalic progenitors to populate distinct ventral midbrain nuclei.</a> Neural. Dev. 6 (1), 29-29 (2011).</li>
<li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biol. 3 (5), e159-e159 (2005).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Przedstawiona tutaj metoda organotypowej hodowli skrawków dostarcza systemu do krótkotrwałej analizy in vitro rozwijających się neuronów dopaminergicznych oraz ich dróg migracji i projekcji w embrionalnym brzusznej części śródmózwia. Stwierdziliśmy, że w protokole istnieje szereg krytycznych etapów, na które należy zwrócić szczególną uwagę, aby uzyskać skrawki umożliwiające prawidłowy rozwój neuronów dopaminergicznych brzusznej części śródmózwia. Najbardziej krytycznym etapem jest preparatyka mózgu embrionalnego...

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabela specyficznych odczynników i sprzętu</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-250</td><td></td></tr><tr><td>Surowica konia</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (4,5g/L Glc., z L-Gln, Na Pyr, NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna 100x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-20</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td>przygotować roztwór stokowy 200mM i przechowywać w -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Agaroza LMP UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>15517-022</td><td></td></tr><tr><td>Wkładniki Millicel</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG50</td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;-szalka 35 mm, niska</td><td>Ibidi</td><td>80136</td><td></td></tr><tr><td>Wibratom</td><td>Microm International</td><td>HM 650V</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Plano GmbH</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Klej Histoacryl</td><td>BRAU9381104</td><td>Braun Aesculap</td><td></td></tr><tr><td>Łyżka perforowana o średnicy 15 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370 -18</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta 5 Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252 - 30</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Przeciwciała użyte do immunobarwień:</td></tr><tr><td>Królicze anty-tyrozynowa hydroksylaza</td><td>EMD Millipore</td><td>AB152</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Mysie anty-tyrozynowa hydroksylaza</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB318</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Mysie anty-BrdU</td><td>BD Biosciences</td><td>555627</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Królicze anty-rozszczepiona kaspaza 3</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9661</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Osiołkowe anty-królicze IgG-Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Osiołkowe anty-mysie IgG-Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-165-150</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr></tbody></table>

organotypowe hodowle plastrów embrionalnego brzusznego śródmózgowia: system do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Mysz jest doskonałym organizmem modelowym do badania rozwoju mózgu ssaków ze względu na obfitość danych molekularnych i genetycznych. Jednak rozwijający się mózg myszy nie nadaje się do łatwych manipulacji i obrazowania in vivo, ponieważ embrion myszy jest niedostępny i nieprzezroczysty. W związku z tym w badaniach rozwoju mózgu myszy in vitro szeroko stosuje się organotypowe hodowle plastrów mózgu embrionalnego. Manipulacje ex vivo lub wykorzystanie myszy transgenicznych pozwalają na modyfikację ekspresji genów, dzięki czemu subpopulacje komórek neuronalnych lub glejowych mogą być znakowane białkami fluorescencyjnymi. Zachowanie oznakowanych komórek można następnie obserwować za pomocą obrazowania poklatkowego (time-lapse). Obrazowanie poklatkowe okazało się szczególnie skuteczne w badaniu zachowań komórkowych leżących u podstaw rozwoju kory mózgowiej na późnych etapach embrionalnych 1-2. Systemy organotypowych hodowli plastrów embrionalnych w regionach mózgu poza przedmózowiem są mniej rozwinięte. W związku z tym bogactwo danych z obrazowania poklatkowego opisujących migrację komórek neuronalnych ogranicza się do przedmózowia 3,4. Wciąż nie wiadomo, czy zasady odkryte dla grzbietowej części mózgu obowiązują również w obszarach brzusznych. W brzusznej części mózgu neurony są zorganizowane w skupiska neuronalne, a nie w warstwy, i często muszą przebyć skomplikowane trajektorie migracyjne, aby dotrzeć do swojej docelowej pozycji. Brzuszna część śródmózowia jest nie tylko dobrym systemem modelowym dla rozwoju brzusznej części mózgu, ale zawiera również populacje neuronalne, takie jak neurony dopaminergiczne, które mają znaczenie w procesach chorobowych. Podczas gdy funkcje i degeneracja neuronów dopaminergicznych były szczegółowo badane w mózgu dorosłym i starzejącym się, niewiele wiadomo o zachowaniu tych neuronów podczas fazy ich różnicowania i migracji 5. Opisujemy tutaj tworzenie hodowli plastrów z brzusznej części śródmózowia myszy w 12,5 dniu embrionalnym (E12.5). Hodowle te są potencjalnie odpowiednie do monitorowania rozwoju neuronów dopaminergicznych przez kilka dni in vitro. Podkreślamy krytyczne kroki w przygotowywaniu plastrów mózgu na tych wczesnych etapach rozwoju embrionalnego i omawiamy warunki niezbędne do utrzymania prawidłowego rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro. Przedstawiamy również wyniki eksperymentów z obrazowania poklatkowego. W eksperymentach tych prekursory brzusznej części śródmózowia (w tym prekursory dopaminergiczne) oraz ich potomstwo zostały oznakowane w sposób mozaikowy przy użyciu indukowalnego systemu mapowania linii komórkowych opartego na systemie Cre/loxP 6.

Opisano metodę przygotowania organotypowych skrawków z embrionalnego śródmózgowia myszy w stadium E12.5. Organotypowe hodowle skrawków mogą być wykorzystywane do obserwacji zachowania neuronów dopaminergicznych lub innych neuronów z brzusznej części śródmózgowia.

Organotypowe hodowle plastrów embrionalnego brzusznego śródmózgowia: system do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro

Mysz jest doskonałym organizmem modelowym do badania rozwoju mózgu ssaków ze względu na obfitość danych molekularnych i genetycznych. Jednakże, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie organotypowych skrawków z embrionalnego śródmózgowia w stadium E 12.5 do analizy rozwijających się neuronów dopaminergicznych. W tym celu w pierwszej kolejności przeprowadza się wycinek mózgu embrionalnego. Następnie mózg jest zatapiany w niskotopliwym aerosie.Trzecim krokiem jest wykonanie przekrojów plastrów mózgu przy użyciu vibrotomu. Ostatnim etapem jest wybór odpowiedniego plastra mózgu do hodowli i obrazowania time-lapse. Ostatecznie obrazowanie time-lapse oraz mikroskopia immunofluorescencyjna są wykorzystywane do ukazania wczesnych etapów rozwoju neuronów dopaminergicznych, ich zachowania migracyjnego oraz różnicowania.Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurorozwoju, takie jak śledzenie neuronów i ich zachowań migracyjnych podczas rozwoju brzusznej części mózgu. Na jeden dzień przed sekcją należy przygotować bufor Krebsa 1X oraz pożywkę hodowlaną, zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym manuskrypcie, około dwóch godzin przed sekcją. Przygotuj 100 mililitrów 4% agarozy niskotopliwej w buforze Krebsa, podgrzewając roztwór w kuchence mikrofalowej do momentu całkowitego rozpuszczenia agarozy.Następnie umieść aros w kąpieli wodnej o temperaturze 45 °C. Kolejno napełnij tackę buforową Vibram lodowatym buforem Krebsa. Włącz element chłodzący i utrzymuj temperaturę na poziomie czterech stopni Celsjusza.Następnie zamocuj żyletkę w uchwycie do ostrza. Przygotuj skalpel, cienki pędzelek oraz miniaturową łyżkę z dziurkami do wyławiania plastrów z obszaru wibratora w celu ich późniejszego cięcia. Następnie wlej bufor Krebsa do sterylnych szalek Petriego i przechowuj je w lodzie.W obszarze sekcji przygotuj trzy duże sterylne szalki Petriego do sekcji i dwie małe sterylne szalki Petriego do zatapiania, parę małych nożyczek, dwie pary precyzyjnych pincet, miniaturową łyżeczkę perforowaną, szklaną pipetę Pasteura polerowaną ogniowo z okrągłą zamkniętą końcówką oraz jeden litr buforu Krebsa w lodzie. Przetrzyj wszystkie narzędzia do sekcji 70% etanolem. Następnie dodaj pożywkę hodowlaną do dołków płytki 6-dołkowej i inkubuj ją w temperaturze 37°C przez dwie godziny.Następnie, w warunkach sterylnych, należy dodać 1,5 milliliters buforu Krebsa z penicyliną i streptomycyną do każdej studni kolejnej płytki sześciodołkowej. W studniach należy umieścić wkładki z membranami Milli Cell. Płytkę sześciodołkową należy ustawić obok wibratomu, tak aby możliwe było przeniesienie skrawków mózgu na membrany filtracyjne.Bezpośrednio po wykonaniu przekrojów uśmierć ciężarną samicę myszy z embrionami w stadium E 12.5 i usuń macicę, podnosząc ją pęsetą. Następnie za pomocą drugiej pęsety oddziel mięsień macicy od trzonu macicy. Po tym kroku umieść macicę pod mikroskopem w schłodzonym na lodzie buforze Krebsa.Używając precyzyjnej pęsety, oddziel ścianę mięśniową macicy, błonę Rikera oraz wisceralny worek żółtkowy od zarodka. Następnie wyjmij zarodki z macicy i przenieś je do oddzielnej szalki Petriego z jałowym buforem Krebsa. Następnie odetnij głowę każdego z zarodków.Ustabilizuj głowę, przebijając ją na wysokości oczu za pomocą precyzyjnej pęsety. Używając drugiej pęsety, ostrożnie usuń skórę oraz czaszkę. Następnie delikatnie unieś mózg i przenieś go do szalki Petriego z jałowym buforem Krebsa.Następnie przemyć mózgi w 4% low melting point agarose. Osadzić dwa lub trzy mózgi jednocześnie w 4% świeżym low melting point agarose. Użyć do tego pipety Pasteura z wypłukaną ogniem okrągłą końcówką.Następnie umieść naczynia do zatapiania na lodzie, starając się rozmieścić je jak najrównomierniej. Potem unieś mózgi, aż dno aros stężeje, tak aby mózgi mogły osiaść równomiernie i równolegle do dna bloku aros. Gdy aros całkowicie stężeje, przytnij aros otaczający mózgi.Następnie przyklej blok do stolika preparatowego wibrotomu. Podczas przyklejania bloku upewnij się, że strona brzuszna mózgu jest równoległa do platformy. Wykonaj poziome przekroje o grubości 300 micron przy częstotliwości 50 hertz, amplitudzie ostrza 1,1 milimetra i prędkości 25 milimetrów na sekundę.Zbierz plastry mózgu, używając cienkiego pędzla do przesunięcia plastra na mini dziurkowaną łyżeczkę. Następnie przenieś je pod mikroskopem do naczynia z jałowym, lodowatym buforem Krebsa. Wybierz plaster zawierający tkankę brzusznej części śródmózgowia.Na tym etapie należy użyć małej łyżki z otworami oraz cienkiego pędzla, aby przenieść skrawki mózgu na wkładki z błony mili cell w płytce 6-dołkowej zawierającej wcześniej przygotowany bufor Krebsa. Następnie należy przenieść membrany ze skrawkami do innej płytki 6-dołkowej z pożywką hodowlaną, dbając o to, aby góra membran pozostała sucha, tak aby skrawki mózgu otrzymywały pożywkę od dołu, a od góry miały dostęp do powietrza.Umieść plasterki w inkubatorze z 5% carbon dioxide w temperaturze 37 degrees Celsius. Bardzo ważne jest, aby plasterki zostały umieszczone w inkubatorze w ciągu dwóch godzin po początkowym etapie dysekcji. Plasterki te mogą być utrzymywane in vitro przez okres od trzech do czterech dni.Po czterech do pięciu godzinach regeneracji plastry można wykorzystać do obrazowania poklatkowego bezpośrednio przed rozpoczęciem procedury. Do naczynia należy dodać 1,5 µl kwasu askorbinowego o stężeniu 200 mM, aby chronić plastry przed fototoksycznością.Inkubuj skrawki w komorze środowiskowej w temperaturze 37°C przy 5% dwutlenku węgla podczas obrazowania time-lapse. Oto świeży skrawk przedstawiający prawidłowe rozmieszczenie neuronów dopaminergicznych w brzusznej części śródmózwia, w którym projekcje do przedmózgowia nie rozwinęły się jeszcze. Po jednym dniu hodowli zaczynają formować się projekcje do przedmózgowia, co wskazano żółtą strzałką.Białe groty strzałek wskazują położenie ciał komórkowych przedstawionych w większym powiększeniu na wstawkach. Tutaj widoczna jest droga migracji neuronów znakowanych YFP. Na ostrym przekroju poziomym początkowe położenie komórek zaznaczono czerwonym grotem strzałki.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przygotować skrawki genotypowe z zarodkowego śródmózgowia morskiego w stadium E 12.5, aby uzyskać żywotne i nieuszkodzone skrawki. Ważne jest, aby ostrożnie przeprowadzić sekcję zarodkowego mózgu, a po cięciu w wibratomie wybrać odpowiedni skrawka mózgu do hodowli i obrazowania w trybie TimeLapse.

organotypic-slice-cultures-embryonic-ventral-midbrain-system-to-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Organotypowe kultury skosów embrionalnej brzusznej części śródmózgowia: System do badania rozwoju dopaminergicznych neuronów in vitro

Organotypowe hodowle skrawków embrionalnego mózgu gryzoni są szeroko stosowane w badaniach nad rozwojem mózgu. Choć systemy in vivo często oferują pewne korzyści, ...

Organotypowa hodowla plastrów mózgu szczura w 18. dniu embrionalnym (E18)

Pierwotne dysocjowane hodowle komórek dopaminergicznych śródmózgowia umożliwiają badanie charakterystyki presynaptycznej neuronów dopaminergicznych. Mogą one być wykorzystywane do monitorowania w czasie rzeczywistym kinetyki uwalniania dopaminy oraz poziomów białek/mRNA regulatorów egzocytozy dopaminy. W niniejszym materiale przedstawiamy sposób przygotowania tych hodowli z noworodków gryzoni.

Pierwotne dysocjowane hodowle komórek dopaminergicznych śródmózgowia z noworodków gryzoni

Przedstawiamy metodę przygotowania organotypowych skrawków embrionów myszy w połowie okresu gestacji do hodowli i obrazowania time-lapse wzrostu nerwów obwodowych.

Organotypowa hodowla skrawków embrionów myszy wykazujących ekspresję GFP do obrazowania w czasie rzeczywistym wzrostu nerwów obwodowych

W celu przeprowadzenia szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgu opisujemy metody obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów koekspresujących inhibicyjne RNA (RNAi) i GFP w zarodkowej korze mysiej. Protokół ten nadaje się do badania różnych aspektów neurorozwoju, takich jak neurogeneza, migracja neuronów oraz morfogeneza neuronów, w tym wzrost dendrytów i aksonów.

Metody badania morfogenezy neuronalnej: Elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy

W celu oceny funkcji i regulacji genów podczas rozwoju dopaminergicznych neuronów śródmózgowia opisujemy metodę obejmującą elektroporację in ovo konstruktów plazmidowego DNA do embrionalnych progenitorów dopaminergicznych neuronów brzusznej części śródmózgowia kurczaka. Technika ta może być wykorzystana do uzyskania wydajnej ekspresji genów zainteresowania w celu zbadania różnych aspektów rozwoju śródmózgowia i różnicowania neuronów dopaminergicznych.

In ovo elektroporacja śródmózgowia kurczaka w celu badania funkcji genów w rozwoju neuronów dopaminergicznych

Ten film przedstawia metodę hodowli neuronów dopaminergicznych z embrionalnej tkanki mózgowej myszy. Proces ten obejmuje leczenie śródmózgowia enzymem proteolitycznym, odłączenie komórek i wyhodowanie ich na pokrytych polimerem szkiełkach nakrywkowych w pożywce bogatej w składniki odżywcze z antybiotykami dla ich wzrostu i długoterminowej żywotności.

Hodowla i utrzymanie neuronów dopaminergicznych z embrionalnej tkanki mózgowej myszy

Wideo pokazuje proces izolacji i hodowli neuronów dopaminowych ze śródmózgowia embrionów myszy. Izolowane brzuszne dno śródmózgowia jest dysocjowane za pomocą enzymów. Powstałe neurony dopaminowe są zbierane i przenoszone do mikrowysp wewnątrz płytek wielodołkowych. Komórki są inkubowane z pożywką neuronów dopaminowych, aby utrzymać komórki w dużej gęstości wewnątrz mikrowysp.

Izolacja i hodowla pierwotnych embrionalnych neuronów dopaminowych śródmózgowia myszy

Opisano technikę badania komórek NG2 i oligodendrocytów za pomocą systemu hodowli plasterkowej w przodomózgowiu i móżdżku.  Metoda ta pozwala na badanie dynamiki proliferacji i różnicowania komórek w obrębie linii oligodendrocytów, w której można łatwo manipulować środowiskiem zewnątrzkomórkowym przy zachowaniu cytoarchitektury tkanek.

Organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji

Tutaj opisujemy technikę badania neurogenezy poporodowej hipokampa za pomocą techniki organotypowej hodowli plastrów. Metoda ta pozwala na manipulację neurogenezą dorosłych w warunkach in vitro i pozwala na bezpośrednie zastosowanie środków farmakologicznych do hodowanego hipokampa.

Organotypowe kultury warstwowe do badań neurogenezy poporodowej

Przyczyny degeneracji neuronów dopaminergicznych śródmózgowia podczas choroby Parkinsona nie są w pełni zrozumiałe. Systemy hodowli komórkowych stanowią niezbędne narzędzie do badania właściwości neurofizjologicznych tych neuronów. Poniżej przedstawiamy zoptymalizowany protokół, który może być wykorzystany do modelowania neurodegeneracji in vitro.

Izolacja, hodowla i długotrwałe utrzymanie pierwotnych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych z embrionalnych mózgów gryzoni

Test ex vivo pozwala na obrazowanie przerostu nerwu okoruchowego w czasie rzeczywistym. Plastry są generowane przez osadzenie zarodków E10.5 IslMN:GFP w agarozie, krojenie na wibratomie i wzrost w inkubatorze typu stage-top. Rolę szlaków naprowadzania aksonów ocenia się poprzez dodanie inhibitorów do pożywki hodowlanej.

Hodowla plastrów okulomotorycznych ex vivo od embrionalnych myszy z ekspresją GFP do obrazowania poklatkowego wzrostu nerwu okoruchowego

Poznaj metodę przygotowania organotypowych plastrów z embrionalnego śródmózgowia myszy E12.5 do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych. Technika ta umożliwia obserwację migracji i różnicowania neuronów metodą time-lapse.

Organotypowe kultury warstwowe embrionalnej brzusznej części śródmózgowia: system do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Organotypowe hodowle plastrów embrionalnego brzusznego śródmózgowia: system do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro

Przeglądaj więcej filmów