Organotypowe kultury warstwowe embrionalnej brzusznej części śródmózgowia: system do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro
January 31st, 2012
Opisano metodę generowania organotypowych wycinków z mysiego embrionalnego śródmózgowia E12.5. Organotypowe kultury warstwowe mogą być używane do obserwacji zachowania neuronów dopaminergicznych lub innych neuronów brzusznego śródmózgowia.
Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie wycinków organotypowych z embrionalnego śródmózgowia neuronu E 12,5 w celu analizy rozwijających się neuronów dopaminergicznych. Osiąga się to poprzez uprzednią sekcję mózgu embrionalnego. Następnie mózg jest osadzony w aeros o niskiej temperaturze topnienia.
Trzecim krokiem jest podzielenie wycinków mózgu za pomocą wibratora. Ostatnim krokiem jest wybór odpowiedniego wycinka mózgu do hodowli i obrazowania poklatkowego. Ostatecznie obrazowanie poklatkowe i mikroskopia immunofluorescencyjna są wykorzystywane do pokazania wczesnych etapów neuronów dopaminergicznych, zachowań migracyjnych i różnicowania.
Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurorozwoju, takie jak podążanie za neuronami i zachowania migracyjne podczas rozwoju brzusznego mózgu. Na dzień przed sekcją należy przygotować jeden bufor X Krebs i pożywkę hodowlaną zgodnie z dołączonym rękopisem na około dwie godziny przed preparacją. Przygotuj 100 mililitrów 4% niskotopliwego aros w buforze Krebsa, podgrzewając roztwór w kuchence mikrofalowej, aż aros całkowicie się rozpuści.
Następnie umieść aros w łaźni wodnej o temperaturze 45 stopni Celsjusza. Następnie napełnij tacę buforową Vibram lodowatym buforem Krebsa. Włącz element chłodzący i utrzymuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnie zamocuj żyletkę w uchwycie ostrza. Przygotuj skalpel, cienki pędzel i mini perforowaną łyżkę do zbierania plastrów w obszarze wibratora w celu późniejszego pokrojenia. Następnie dodaj bufor Krebsa do sterylnych szalek Petriego i trzymaj je na lodzie.
W obszarze sekcji przygotuj trzy duże sterylne szalki Petriego do sekcji i dwie małe sterylne szalki Petriego do osadzenia pary małych nożyczek, dwóch par cienkich kleszczy, mini perforowanej łyżki, szklanej pipety pastwiskowej wypolerowanej z okrągłą zamkniętą końcówką i jednego litra buforu Krebsa na lodzie. Przetrzyj wszystkie narzędzia do rozwarstwiania 70% etanolem. Następnie dodaj pożywkę hodowlaną do dołków sześciodołkowej płytki i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.
Następnie dodaj 1,5 mililitra buforu Krebsa ze streptomycyną penicylinową do każdej studzienki innej sześciodołkowej płytki w sterylnych warunkach. Umieść wkładki z błony milikomórkowej w studzienkach. Umieść płytkę z sześcioma dołkami obok vibrato, aby plasterki mózgu mogły zostać przeniesione na membrany filtracyjne.
Natychmiast po podziale należy złożyć w ofierze ciężarną samicę myszy z zarodkami w stadium E 12,5 i usunąć macicę, podnosząc ją za pomocą kleszczy. Następnie użyj kolejnej pary kleszczy, aby oderwać mięśniówkę macicy od macicy. Następnie umieść macicę w lodowatym buforze Krebsa pod mikroskopem.
Użyj pary cienkich kleszczy, aby oddzielić mięśniową ścianę macicy, błonę rikera i worek z trzewnym żółtkiem od zarodka. Następnie wyjmij zarodki z macicy i przenieś zarodek na oddzielną szalkę Petriego ze sterylnym buforem Krebsa. Następnie odetnij głowę każdego z zarodków.
Przymocuj głowę, przekłuwając ją na wysokości oczu parą cienkich kleszczy. Użyj innej pary kleszczy, aby ostrożnie usunąć skórę i czaszkę. Następnie ostrożnie podnieś mózg do góry i przenieś go na szalkę Petriego ze sterylnym buforem Krebsa.
Następnie umyj mózgi w 4% arosach o niskiej temperaturze topnienia. Osadź dwa do trzech mózgów na raz w 4% świeżych arosach o niskiej temperaturze topnienia. Za pomocą pipety Pasteura z polerowaną ogniowo okrągłą końcówką.
Następnie ułóż naczynia do zatapiania na lodzie tak równomiernie, jak to możliwe. Następnie podnieś mózgi, aż spód aros zestali się, aby mózgi mogły osiąść równomiernie i być równoległe do dna bloku aros. Kiedy aros w pełni zastygnie, przytnij aros otaczający mózg.
Po tym kleju aros blokuje się na stoliku próbki wibratora. Podczas klejenia bloku upewnij się, że brzuszna strona mózgu jest równoległa do platformy. Przekroje poziome plastry o grubości 300 mikronów z częstotliwością 50 Hz, amplitudą ostrza 1,1 milimetra i prędkością 25 milimetrów na sekundę.
Zbierz plasterki mózgu za pomocą cienkiego pędzla, aby wepchnąć plasterek do mini perforowanej łyżki. Następnie przenieś je do naczynia ze sterylnym, lodowatym buforem Krebsa pod mikroskopem. Wybierz wycinek, który zawiera brzuszną tkankę śródmózgowia.
Na tym etapie użyj mini perforowanej łyżki i cienkiego pędzla, aby przenieść wycinki mózgu na wkładki z błony milikomórkowej na sześciodołkowej płytce z buforem Krebsa, która została przygotowana wcześniej. Następnie przenieś błony z plastrami na kolejne sześć. Dobrze płytkę z pożywką hodowlaną, utrzymuj górną część błon w suchości, aby plastry mózgu otrzymywały pożywkę od dołu i powietrze od góry.
Umieść plastry w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Bardzo ważne jest, aby plastry zostały umieszczone w inkubatorze w ciągu dwóch godzin po początkowym etapie sekcji. Plastry te można przechowywać in vitro przez trzy do czterech dni.
Po czterech do pięciu godzinach rekonwalescencji. Wycinki mogą być używane w obrazowaniu poklatkowym tuż przed obrazowaniem. Dodaj 1,5 mikrolitra, 200 milimolowego kwasu askorbinowego do naczynia, aby chronić plastry przed fototoksycznością.
Inkubuj plastry w komorze środowiskowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla podczas obrazowania poklatkowego. Oto ostry wycinek pokazujący normalną lokalizację neuronów dopaminergicznych w brzusznej części śródmózgowia, w której projekcje do przodomózgowia jeszcze się nie rozwinęły. Po jednym dniu w hodowli zaczynają tworzyć się wypustki na przodomózgowiu, jak wskazuje żółta strzałka.
Biały grot strzałki wskazuje położenie ciał komórek pokazanych w większym powiększeniu we wstawkach. Oto migracyjny korzeń neuronów oznaczonych YFP. W ostrym wycinku poziomym początkowe położenie komórek jest oznaczone czerwonym grotem strzałki.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować genotypowe wycinki z morskiego embrionalnego śródmózgowia E 12.5, aby uzyskać żywotne i nienaruszone plasterki. Ważne jest, aby dokładnie przeprowadzić sekcję mózgu embrionalnego, a po przekroju vibrato wybrać odpowiedni wycinek mózgu do hodowli i obrazowania poklatkowego.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę generowania kroków organotypowych z środkowego mózgu zarodkowego mysiego w 12.5 dniu rozwoju. Takie kultury są przydatne do obserwacji zachowania neuronów dopaminergicznych i innych neuronów środkowego mózgu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Techniki kultury komórek
Tło
- Kultury kroków organotypowych zapewniają platformę do badania zachowania neuronów.
- Neurony dopaminergiczne są kluczowe dla zrozumienia różnych chorób neurologicznych.
- Środkowy mózg zarodkowy jest kluczowym obszarem do badania rozwoju neuronów.
- Zdjęcia time-lapse pozwalają na obserwację procesów neuronowych w czasie rzeczywistym.
Cel badania
- Wygenerowanie kroków organotypowych do analizy rozwoju neuronów dopaminergicznych.
- Obserwacja migracji i różnicowania neuronów.
- Wykorzystanie zaawansowanych technik obrazowania do szczegółowej analizy.
Zastosowanie metod
- Rozcinanie mózgu zarodkowego.
- Zanurzenie mózgu w agarozy o niskiej temperaturze topnienia.
- Cięcie mózgu na kroki za pomocą wibratome.
- Wybór odpowiednich kroków do kultury i obrazowania.
Główne wyniki
- Udane wygenerowanie kroków organotypowych z 12.5 dnia środkowego mózgu.
- Obserwacja zachowania neuronów dopaminergicznych poprzez zdjęcia time-lapse.
- Wgląd w wzorce migracji i różnicowania neuronów.
- Zastosowanie mikroskopu immunofluorescencyjnego do wizualizacji cech neuronów.
Wnioski
- Metoda zapewnia cennym narzędzie do badania rozwoju neuronów środkowego mózgu.
- Zdjęcia time-lapse poprawiają zrozumienie dynamiki neuronów.
- Przyszłe badania mogą wykorzystywać tę metodologię do zbadania różnych aspektów neurorozwoju.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Organotypic slice cultures of embryonic ventral midbrain enable direct observation of dopaminergic neuronal development, supporting mechanistic de-risking and target validation in neurodevelopmental research. This system provides predictive confidence for early-stage discovery by allowing manipulation and real-time imaging of neuronal subpopulations relevant to disease. The approach bridges a critical gap between genetic models and functional phenotyping, informing portfolio decisions in CNS drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of dopaminergic neuron differentiation and migration in a controlled, manipulable system.
- Supports functional validation of genetic modifications using time-lapse imaging and fate mapping.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying developmental pathways in disease-relevant neuronal populations.
- Provides a platform for hypothesis-driven studies on ventral midbrain organization and neuronal clustering.
Screening & Assay Development
- Prepares validated organotypic cultures suitable for quantitative imaging-based assays.
- Enables reproducible assessment of neuronal behaviors across experimental conditions.
- Supports standardization of imaging outputs for downstream compound evaluation.
- Allows scalable adaptation for screening genetic or pharmacological perturbations affecting neuronal development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling dopaminergic neuron development implicated in neurodegenerative disorders.
- Provides continuity from genetic manipulation to phenotypic observation in preclinical models.
- Enables risk-adjusted advancement by linking developmental phenotypes to potential translational biomarkers.
- Supports predictive de-risking for CNS portfolio assets targeting developmental pathways.
Pipeline & Workflow Integration
This organotypic slice culture method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical phenotyping, particularly for CNS and neurodevelopmental programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on neuronal differentiation and migration mechanisms in the ventral midbrain.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for evaluating genetic or chemical interventions.
- Analytics: Enables time-lapse and immunofluorescence readouts to compare neuronal behaviors across conditions.
- Translational Research: Connects developmental phenotypes to disease-relevant neuronal populations for biomarker exploration.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse genetic backgrounds and experimental manipulations in CNS research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in dopaminergic neuron development studies.
- Operational Value: Standardizes culture and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking genetic manipulation to functional neuronal outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets and developmental pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic brain dissection and organotypic culture techniques.
- Demands access to advanced imaging infrastructure for time-lapse and immunofluorescence microscopy.
- Necessitates cross-team standardization of slice preparation and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different embryonic stages or brain regions.
- Viability and developmental fidelity depend on precise timing and handling during preparation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Preparation for Dissection
3:00
Embryonic Brain Preparation and Vibratome Sectioning
5:09
Slice Culture and Time-lapse Imaging
6:21
Results: Dopaminergic Neuronal Development in Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain
7:04
Conclusion
