Organotypowe hodowle plastrów embrionalnego brzusznego śródmózgowia: system do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie organotypowych skrawków z embrionalnego śródmózgowia w wieku E 12.5 w celu analizy rozwijających się neuronów dopaminergicznych. Cel ten osiąga się poprzez wstępne wypreparowanie embrionalnego mózgu, a następnie zatopienie go w niskotopliwym agarose.

Trzecim krokiem jest wykonanie przekrojów plastrów mózgu przy użyciu wibratomu. Ostatnim etapem jest wybór odpowiedniego plastra mózgu do hodowli i obrazowania time-lapse. W końcowej fazie wykorzystuje się obrazowanie time-lapse oraz mikroskopię immunofluorescencyjną, aby ukazać wczesne etapy rozwoju neuronów dopaminergicznych, ich zachowanie migracyjne oraz różnicowanie.

Niniejsza metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju układu nerwowego, takie jak śledzenie neuronów i zachowań migracyjnych podczas rozwoju brzusznej części mózgu. Na dzień przed sekcją należy przygotować bufor Krebsa 1× oraz pożywkę hodowlaną zgodnie z towarzyszącym manuskryptem na około dwie godziny przed sekcją. Przygotuj 100 ml 4% agarozy niskotopliwej w buforze Krebsa, podgrzewając roztwór w kuchence mikrofalowej aż do całkowitego rozpuszczenia agarozy.

Następnie umieść arosy w łaźni wodnej o temperaturze 45°C. Potem wypełnij tackę buforową Vibram lodowatym buforem Krebsa. Włącz element chłodzący i utrzymuj go w temperaturze 4°C.

Następnie zamocuj żyletkę w uchwycie do ostrzy. Przygotuj skalpel, cienki pędzel oraz miniaturową łyżeczkę z perforacjami do wyjmowania plastrów z obszaru wibrującego w celu ich późniejszego cięcia. Następnie do sterylnych szalek Petri dodaj bufor Krebsa i przechowuj je w lądzie.

W obszarze sekcji przygotuj trzy duże sterylne szalki Petriego do sekcji i dwie małe sterylne szalki Petriego do zatapiania, parę małych nożyczek, dwie pary precyzyjnych pęset, mini łyżeczkę perforowaną, szklaną pipetę pasterską wypalaną z okrągłą zamkniętą końcówką oraz jeden litr buforu Krebsa w lodzie. Wszystkie narzędzia do sekcji przemyj 70% ethanolem. Następnie dodaj pożywkę hodowlaną do dołków płytki 6-dołkowej i inkubuj ją w temperaturze 37 °C przez dwie godziny.

Następnie, w warunkach sterylnych, dodaj 1,5 mililitra buforu Krebsa z penicyliną i streptomycyną do każdego dołka drugiej płytki sześcio-dołkowej. W dołkach umieść wkłady z błonami Millicel. Ustaw płytkę sześcio-dołkową obok wibratomu, aby umożliwić przeniesienie skrawków mózgu na membrany filtracyjne.

Bezpośrednio po sekcji uśmierć ciężarną myszkę z embrionami w stadium E 12.5 i usuń macicę, podnosząc ją pęsetą. Następnie za pomocą drugiej pęsety oddziel mięsień macicy od trzonu macicy. Po tym etapie umieść macicę w lodowatym buforze Krebsa pod mikroskopem.

Za pomocą precyzyjnej pęsety oddziel ścianę mięśniową macicy, błonę Rikera oraz pęcherzyk żółtkowy od zarodka. Następnie wyjmij zarodki z macicy i przenieś je do oddzielnej płytki Petriego z jałowym buforem Krebsa. W kolejnym kroku odetnij głowę każdego z zarodków.

Ustabilizuj głowę, przebijając ją na wysokości oczu za pomocą pęsety precyzyjnej. Używając drugiej pęsety, ostrożnie usuń skórę i czaszkę. Następnie delikatnie unieś mózg i przenieś go do szalki Petriego z jałowym buforem Krebsa.

Następnie przemyć mózgi w 4% niskotopliwym agarozie. Zatopić od dwóch do trzech mózgów jednocześnie w 4% świeżej, niskotopliwej agarozie, używając pipety Pasteura z wypaloną, okrągłą końcówką.

Następnie umieść naczynia do zatapiania na lodzie, starając się, aby stały poziomo. Potem delikatnie unosząc mózgi, poczekaj, aż dno arosów stężeje, tak aby tkanka mogła równomiernie osiąść i znajdować się równolegle do dna bloku arosów. Gdy aros całkowicie stężeje, przytnij go wokół mózgów.

Następnie przyklej blok do stolika preparatowego wibratomu. Podczas przyklejania bloku upewnij się, że strona brzuszna mózgu jest równoległa do platformy. Wykonaj poziome przekroje o grubości 300 micron przy częstotliwości 50 hertz, amplitudzie ostrza 1,1 milimetrów i prędkości 25 milimetrów na sekundę.

Zebrać plastry mózgu, przesuwając każdy z nich za pomocą cienkiego pędzla do miniaturowej łyżki z perforacją. Następnie, pod mikroskopem, przenieść je do naczynia z jałowym, lodowatym buforem Krebsa. Wybrać plaster zawierający tkankę brzusznej części śródmózgowia.

Na tym etapie należy użyć małej łyżki perforowanej oraz cienkiego pędzla, aby przenieść plastry mózgu na wkładki z membraną typu milli w płytce sześciodołkowej z wcześniej przygotowanym buforem Krebsa. Następnie należy przenieść membrany z plastrami do drugiej płytki sześciodołkowej z pożywką hodowlaną, dbając o to, aby góra membran pozostała sucha, tak aby plastry mózgu otrzymywały pożywkę od dołu i powietrze od góry.

Umieść plastry w inkubatorze z 5% carbon dioxide w temperaturze 37 degrees Celsius. Bardzo ważne jest, aby plastry zostały umieszczone w inkubatorze w ciągu dwóch godzin po początkowym etapie sekcji. Plastry te mogą być utrzymywane in vitro przez trzy do czterech dni.

Po czterech do pięciu godzinach regeneracji preparaty można wykorzystać do obrazowania poklatkowego bezpośrednio przed rozpoczęciem pomiarów. Do naczynia należy dodać 1,5 µL kwasu askorbinowego o stężeniu 200 mM, aby chronić skrawki przed fototoksycznością.

Inkubuj skrawki w komorze środowiskowej w temperaturze 37°C przy 5% dwutlenku węgla podczas obrazowania time-lapse. Przedstawiony jest świeży skrawek pokazujący normalną lokalizację neuronów dopaminergicznych w brzusznej części śródmózgowia, w którym projekcje do przedmózgowia nie rozwinęły się jeszcze. Po jednym dniu hodowli zaczynają tworzyć się projekcje do przedmózgowia, co wskazuje żółta strzałka.

Białe groty strzałek wskazują położenie ciał komórkowych przedstawionych w większym powiększeniu na wstawkach. Tutaj ukazano szlak migracji neuronów znakowanych YFP. Na ostrym przekroju poziomym początkowa pozycja komórek jest zaznaczona czerwonym grotem strzałki.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat przygotowania przekrojów genotypowych z embrionalnego śródmózgowia morskiego zwierzęcia w stadium E 12.5, aby uzyskać żywe i nieuszkodzone plastry. Ważne jest, aby starannie przeprowadzić sekcję embrionalnego mózgu, a po cięciu w wibratomie wybrać odpowiedni przekrój mózgu do hodowli i obrazowania Time-Lapse.