Śledzenie losów komórek E. coli po infekcji fagiem lambda
14 października 2011
Niniejszy artykuł opisuje procedurę przygotowania znakowanej fluorescencyjnie wersji bakteriofaga lambda, zakażania bakterii E. coli, obserwowania efektów zakażenia pod mikroskopem oraz analizy wyników infekcji.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie mikroskopu fluorescencyjnego do śledzenia siarczanów w e coli w czasie rzeczywistym po infekcji fagiem lambda. Pracę należy rozpocząć od przygotowania surowego lizatu faga lambda. Następnie należy oczyścić fagi i zainfekować e coli fagiem lambda w probówce.
Nadal obserwuj losy komórek bakteryjnych pod mikroskopem. W rezultacie można w czasie rzeczywistym zaobserwować różne losy komórek e coli poprzez ekspresję różnych białek fluorescencyjnych związanych ze wzrostem lub śmiercią komórek. Zazwyczaj jednym z etapów weryfikacji tej metody jest stworzenie oczyszczonego i znakowanego zapasu FI.
Aby uniknąć agregacji podczas przygotowania i oczyszczania, należy również zoptymalizować parametry obrazowania pod mikroskopem, aby zapewnić prawidłowy wzrost komórek. Zaszczepić nocną kulturę E 3 92 Lambda LZ one PPL star D w pożywce LBM. Przy gęstości komórkowej OD 600 około 0,6 indukowany jest lygen w wytrząsarce z kąpielą wodną o temperaturze 42 °C.
Kontynuować inkubację w temperaturze 37°C aż do momentu widocznej lizy. Kultura stanie się klarowna. Następnie dodać 2% chloroformu i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie przenieś lizat fagowy do butelek o pojemności 250 mililitrów i odwiruj kulturę. Potem odzyskaj nadsącz zawierający cząsteczki fagów i przeprowadź drugą centryfugację w celu usunięcia widocznych zanieczyszczeń zgodnie ze standardowymi protokołami miareczkowania fagów. Zmierz stężenie fagów, a następnie oczyść fagi za pomocą gradientu chlorku cezu i sprawdź ich aktywność za pomocą DPI w celu przygotowania płytek aro.
Oczyść sześć szkiełek przedmiotowych 70% etanolem. Ułóż pięć szkiełek w sposób przedstawiony na schemacie i zabezpiecz je taśmą. Następnie wlej roztwór 1,5% aros w medium na zabezpieczone szkiełka.
Połóż ostatni szkiełko na wierzchu, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Połóż na górze obciążnik i pozostaw AROS do schłodzenia na około 30 minut. Usuń cztery szkiełka z boków i zapakuj blok szkiełek folią spożywczą.
Używając nocnej hodowli przekształconych bakterii jako inokulum, wyhoduj kulturę w pożywce LBMM, odwiruj jeden mililitr bakterii i resuspendu. Zawieś komórki w 20 µL lodowatej pożywki LBMM za pomocą szerokiego końcówki pipety.
Dodaj 20 µL oczyszczonego faga. Delikatnie wymieszaj i inkubuj najpierw na lodzie przez 30 minut, aby umożliwić adsorpcję fagów. Następnie inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 35 °C przez pięć minut.
Aby zainicjować wstrzyknięcie DNA faga, rozdziel agregaty komórkowe poprzez mieszanie. Rozcieńcz mieszaninę w stosunku 1:10 w pożywce LBMM. Następnie umieść ją na płytce LBM agro.
Na szkiełko zakrywkowe nanieś jeden mikrolitr mieszaniny faga i komórek. Po wchłonięciu delikatnie nałóż na wierzch kolejne szkiełko zakrywkowe. Rozpocznij od wykonania serii obrazów w kanale YFP dla pierwszego przedziału czasowego.
Wykonaj serię 15 obrazów w odstępach 200 nanometrów wzdłuż osi Z. Dodatkowo wykonaj pojedynczy obraz w ostrości, korzystając z kanału kontrastu fazowego oraz kanału m cherry. Następnie zarejestruj film time-lapse obrazujący losy komórki po infekcji.
Aby zminimalizować blaknięcie i fototoksyczność podczas rejestracji filmu time-lapse, należy wykonać pojedynczy obraz w pozycji Z dla każdego kanału w każdym punkcie czasowym, obrazując próbkę w kontraście fazowym oraz w kanałach YFP i M cherry w odstępach 10 minut przez około cztery godziny. Analizę obrazów należy rozpocząć od ręcznego przeliczenia fagów, zapisując jednocześnie ich lokalizację oraz długość komórki. W początkowym przedziale czasowym należy odnotować losy komórek: lityczne, lizogenne lub brak infekcji.
Należy również udokumentować czas lizy oraz wszelkie inne pożądane informacje poprzez odtworzenie filmu poklatkowego, a także wyodrębnić więcej informacji ilościowych, takich jak poziom fluorescencji w czasie w poszczególnych komórkach, wykorzystując zautomatyzowane algorytmy rozpoznawania komórek i śledzenia linii komórkowych. Zazwyczaj plaki fagów znakowanych fluorescencyjnie są znacznie mniejsze niż plaki typu dzikiego, a sygnały YFP i DAPI w przypadku pomyślnie oczyszczonego faga współlokalizują. Przedstawione dane łączą zestawy obrazów w kontraście fazowym oraz kanałach YFP i M cherry, a także odpowiadające im obrazy nałożone pochodzące z filmu poklatkowego.
Pojedyncze fagi są wyraźnie widoczne w początkowym przedziale czasowym. Tutaj widać dwie komórki, z których każda jest zainfekowana przez pojedynczego faga, oraz jedną komórkę zainfekowaną przez trzy fagi. Typowo na powierzchni komórki widoczna jest liczba fagów, podczas gdy inne fagi pozostają niezaabsorbowane.
Z czasem wynik infekcji staje się możliwy do rozróżnienia. Po 80 minutach dwie komórki zainfekowane pojedynczymi fagami weszły każda w ścieżkę lityczną. Dzięki wewnątrzkomórkowej produkcji nowych fagów, komórka zainfekowana trzema fagami weszła w ścieżkę lizogeniczną, objawiającą się produkcją m Cherry z pre-motora.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przygotować oczyszczony stok fagów do zakażania bakterii e co fagiem lambda oraz jak przeprowadzić obrazowanie cyklu życiowego pod mikroskopem w czasie rzeczywistym.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę przygotowania znakowanych fluorescencyjnie bakteriofagów lambda oraz ich infekcji E. coli, co pozwala na obserwację wyników infekcji w czasie rzeczywistym pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Wirusologia
- Mikroskopia fluorescencyjna
Wstęp
- Bakteriofag lambda jest organizmem modelowym do badania procesów infekcji wirusowych.
- Znakowanie fluorescencyjne umożliwia wizualizację oddziaływań fagów z komórkami gospodarza.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym pozwala poznać losy komórek bakteryjnych po infekcji.
- Zrozumienie tych oddziaływań może dostarczyć cennych informacji dla szerszych badań w dziedzinie wirusologii i mikrobiologii.
Cel badania
- Opracowanie protokołu obserwacji infekcji E. coli przez bakteriofaga lambda.
- Analiza losów komórek bakteryjnych podczas infekcji fagowej przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.
- Dokumentacja dynamiki infekcji fagowej w czasie rzeczywistym.
Zastosowane metody
- Przygotowanie surowego lizatu bakteriofaga lambda.
- Oczyszczanie cząsteczek faga za pomocą wirowania w gradiencie chlorku cezu.
- Zakażenie E. coli oczyszczonym fagiem i następujące po nim obrazowanie.
- Mikroskopia poklatkowa w celu monitorowania losów komórek bakteryjnych i dynamiki fagów.
Główne wyniki
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym ujawniło odmienne losy komórek: lityczne, lizogeniczne lub brak infekcji.
- Sygnały fluorescencyjne wskazały na pomyślną infekcję i replikację fagów.
- Ilościowa analiza poziomów fluorescencji dostarczyła informacji o stanie zdrowia komórek.
- Wyniki infekcji różniły się w zależności od liczby fagów infekujących poszczególne komórki.
Wnioski
- Opracowana metoda umożliwia szczegółową obserwację infekcji fagowej w E. coli.
- Mikroskopia fluorescencyjna jest skutecznym narzędziem do badania dynamiki wirusowej w czasie rzeczywistym.
- Uzyskane informacje mogą przyczynić się do zrozumienia biologii fagów oraz oddziaływań bakteryjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Śledzenie w czasie rzeczywistym losów komórek E. coli po infekcji fagiem lambda dostarcza wysokorozdzielczego modelu do analizy binarnych decyzji dotyczących losu komórki, co bezpośrednio wspiera walidację celów i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w systemach mikrobiologicznych. Podejście to umożliwia ilościową analizę wyników infekcji na poziomie pojedynczych komórek, zwiększając pewność prognostyczną w krytycznych punktach wczesnego odkrywania i przesiewu. Metodologia ta jest szeroko istotna dla zespołów biofarmaceutycznych dążących do zrozumienia interakcji gospodarz-patogen oraz optymalizacji translacyjnych systemów modelowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrycia i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią obserwację decyzji dotyczących losów komórek na poziomie pojedynczej komórki, co pozwala na wyjaśnienie ścieżek mechanistycznych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez rozróżnianie wyników litycznych i lizogennych w czasie rzeczywistym.
- Ułatwia redukcję ryzyka biologicznego poprzez kwantyfikację parametrów i wyników infekcji w wielu zdarzeniach.
- Zwiększa pewność prognostyczną w badaniu szlaków sygnałowych i wyborze modelu.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane odczyty oparte na fluorescencji dla późniejszych etapów procesów przesiewowych.
- Standaryzuje warunki testu w celu uzyskania powtarzalnych pomiarów efektów infekcji.
- Umożliwia wysokotreściową, ilościową analizę losów komórek w celu przesiewania związków chemicznych lub genetycznego.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy dzięki zautomatyzowanym potokom obrazowania i analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wskaźniki efektów zakażenia z modelami systemowymi istotnymi dla przebiegu choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Dostarcza ilościowych biomarkerów stanu zakażenia do badań walidacyjnych w fazie przedklinicznej.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o ocenę ryzyka poprzez powiązanie wglądów mechanistycznych z wynikami fenotypowymi.
- Wspiera predykcyjne ograniczanie ryzyka w portfelach badawczych dotyczących drobnoustrojów oraz interakcji gospodarz-patogen.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje etapy od wczesnego odkrywania, poprzez przesiewanie, aż po walidację w modelach przedklinicznych, umożliwiając płynny przepływ danych i podejmowanie decyzji w całym kontinuum badań i rozwoju (B+R).
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez śledzenie losów infekcji z rozdzielczością pojedynczej komórki.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki niezbędne do opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Dostarcza pomiary wysokotreściowe oraz wyniki statystyczne do porównywania warunków infekcji.
- Badania translacyjne: Stanowi pomost między etapem odkryć a walidacją przedkliniczną, korelując wyniki infekcji z istotnością systemu modelowego.
- Wykorzystanie przedsiębiorstwa: Oferuje wielokrotnego użytku platformę obrazowania i analizy do zróżnicowanych badań mikrobiologicznych oraz interakcji gospodarz-patogen.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w analizie losów komórek.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów infekcji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową dzięki dostarczaniu solidnych danych ilościowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów związanych z mikrobami i infekcjami.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej i ilościowej analizy obrazu.
- Wymaga dostępu do zautomatyzowanych platform obrazowania oraz narzędzi do analizy komputerowej.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów infekcji i przetwarzania danych pomiędzy zespołami.
- Możliżna jest konieczność adaptacji metody dla różnych szczepów bakteryjnych lub systemów fagowych.
- Podczas obrazowania w trybie time-lapse należy kontrolować fotoblaknięcie i fototoksyczność.
