Name: Śledzenie losu komórki E. coli po zakażeniu fagiem Lambda (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Poznaj metodę obserwacji losu komórek E. coli po zakażeniu fagiem Lambda przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia badanie dynamiki infekcji w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Michaelowi Feissowi i Jean Sippy za wskazówki dotyczące tworzenia i oczyszczania fagów. Dziękujemy Michaelowi Elowitzowi za udostępnienie oprogramowania do rozpoznawania komórek, Schnitzcell. Prace w laboratorium Goldinga są wspierane przez granty z National Institutes of Health (R01GM082837), National Science Foundation (082265, PFC: Center for the Physics of Living Cells), Welch Foundation (Grant Q-1759) oraz Human Frontier Science Program (RGY 70/2008).

<ol><li>Oppenheim, A. B., Kobiler, O., Stavans, J., Court, D. L., Adhya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switches+in+bacteriophage+lambda+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Switches in bacteriophage lambda development.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 409-429 (2005).</li>
<li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPtashne%2C+M+%22A+genetic+switch+%3A+phage+lambda+revisited%22">A genetic switch : phage lambda revisited</a>. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).</li>
<li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHendrix%2C+RW+%22Lambda+II%22">Lambda II</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1983).</li>
<li>Hershey, A. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHershey%2C+AD+%22The+Bacteriophage+lambda%22">The Bacteriophage lambda</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1971).</li>
<li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decision+making+at+a+subcellular+level+determines+the+outcome+of+bacteriophage+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decision making at a subcellular level determines the outcome of bacteriophage infection.</a> Cell. 141, 682-691 (2010).</li>
<li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+infection+is+targeted+to+cellular+poles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage infection is targeted to cellular poles.</a> Mol. Microbiol. , (2008).</li>
<li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. , John Wiley & Sons. (1994).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Fasman, G. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFasman%2C+GD+%22Practical+handbook+of+biochemistry+and+molecular+biology%22">Practical handbook of biochemistry and molecular biology</a>. , CRC press. (1989).</li>
<li>Kaiser, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+internal+structure+of+bacteriophage+lambda%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">On the internal structure of bacteriophage lambda.</a> J. Gen. Physiol. 49, 171-178 (1966).</li>
<li>Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+kinetic+analysis+of+the+bacteriophage+lambda+genetic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative kinetic analysis of the bacteriophage lambda genetic network.</a> Proc Natl Acad Sci. 102, 4470-4475 (2005).</li>
<li>Shaner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li>
<li>Personal communication with M. Feiss. , Forthcoming.</li>
<li>Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adsorption+of+coliphage+lambda+to+its+host%3A+effect+of+variations+in+the+surface+density+of+receptor+and+in+phage-receptor+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The adsorption of coliphage lambda to its host: effect of variations in the surface density of receptor and in phage-receptor affinity.</a> J. Mol. Biol. 103, 521-536 (1976).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Szczepy bakteryjne, fagi i plazmidy:
Szczep LE392 jest supF. Wybrano go w celu supresji mutacji Sam7 w genomie faga (szczegóły w Tabeli 1). W związku z tym indukowane lizogeny ostatecznie ulegną lizie i uwolnią cząstki fagowe, podobnie jak zainfekowane komórki, które wybrały ścieżkę lityczną. Komórki lizogenne hodowane są w temperaturze 30°C ze względu na obecność temperaturoczułego allelu cI857 w genomie faga. Po indukcji termicznej białka gpD-EYFP i gpD typu dzikiego są współekspresjonowane odpowiednio z genomu λLZ1 oraz plazmidu pPlate*D. W rezultacie kapsyd nowo powstałego faga λLZ2 zawiera mieszaninę białek gpD-EYFP i gpD. Ten mozaikowy fag jest stabilny strukturalnie i wystarczająco fluorescencyjny, aby umożliwić detekcję pojedynczych fagów5. pPRE-mCherry jest plazmidem reporterowym używanym do wykrywania wyboru ścieżki lizogennej. Promotor PRE jest aktywowany przez CII podczas ustanawiania lizogenii1,11. pPRE-mCherry5 został otrzymany z pE-gfp11 poprzez zastąpienie gfp przez mCherry12. Więcej szczegółów znajduje się w naszej wcześniejszej pracy5.
Parametry warunków hodowli:
Podczas indukcji lizogenów (Sekcja 1), łagodne wytrząsanie przy 180 rpm zapewnia dobrą wydajność wirusa13. Należy unikać stosowania glukozy w pożywce wzrostowej, ponieważ metabolizm glukozy generuje kwaśne produkty metaboliczne, a dojrzałe cząsteczki lambda są niestabilne przy niskim pH13. Dodatek MgSO4 ma na celu stabilizację kapsydu faga3. W przypadku fagów niosących typ dziki cI (zamiast cI857), lizogeny można indukować za pomocą Mitomycyny C, czynnika uszkadzającego DNA3. W kroku 1.3 inkubacja w 37°C zazwyczaj nie powinna przekraczać 90 minut. Wskazane jest sprawdzanie gęstości komórek za pomocą OD600 co 30 min. W przypadku dobrego lizatu wartość OD600 spada do około 0,2 lub mniej, a pozostała wartość OD600 wynika z obecności detrytusu komórkowego. Zbyt długa inkubacja może doprowadzić do niższej wydajności fagów, ponieważ nowo powstałe fagi mogą zacząć wstrzykiwać swoje DNA do detrytusu komórkowego. Aby uzyskać widoczne pasmo fagów (co najmniej 1 x 1011 cząsteczek faga) w krokach 2.11 i 2.13, należy wyhodować co najmniej 500 ml kultury w kroku 1.2. Dodatek 0,2% maltozy do pożywki wzrostowej w krokach 5.1 i 5.2 ma na celu indukcję ekspresji LamB, receptora dla adsorpcji faga lambda3,14. Zastosowanie 1000-krotnego zamiast 100-krotnego rozcieńczenia w kroku 5.2 ma na celu obniżenie poziomu tła mCherry z plazmidu reporterowego pPRE-mCherry. W kroku 5.5, w celu wyzwolenia wstrzykiwania DNA faga, wybrano temperaturę 35°C, aby uniknąć indukcji temperaturoczułego allelu cI857.
Oczyszczanie fagów:
Etapy oczyszczania fagów (Kroki 2.1 do 2.11) można zastąpić innymi protokołami oczyszczania5, jednak końcowa ultrawirówka w gradiencie równowagowym CsCl (Kroki 2.12 i 2.13) jest niezbędna. W Krokach 2.10 i 2.12 wymagane są rotory z wahadłowymi koszykami, aby zapewnić uzyskanie wyraźnych, widocznych prążków fagowych. Uzyskanie czystego stoku fagów może zająć nawet tydzień, dlatego konieczne jest monitorowanie miana fagów na poszczególnych etapach, aby upewnić się, że podczas kroków pośrednich nie wystąpiły żadne błędy.
Postępowanie z fagami:
Podczas wszystkich procedur oczyszczania opisanych w sekcji 2 krytyczne jest delikatne obchodzenie się z lizatem fagowym, aby uniknąć odrywania ogonków fagowych od głów fagów. Podczas infekcji komórek w sekcji 5 (np. kroki od 5.5 do 5.7) równie ważne jest unikanie odrywania cząstek fagów od zainfekowanej komórki. Należy zauważyć, że jeśli fag zostanie oderwany od zainfekowanej komórki po wstrzyknięciu swojego DNA, nastąpi tzw. „ciemna” infekcja, co oznacza, że w eksperymencie zostanie zaobserwowany efekt infekcji, ale nie sam infekujący fag. Aby zminimalizować tego typu problemy, podczas pracy z fagami lub mieszaniną fagów i komórek używamy końcówek do pipet o szerokim wylocie.
Testowanie DAPI:
Barwienie zapasu fagów barwnikiem DAPI (Sekcja 4) jest szybką i wydajną metodą sprawdzania czystości zapasu fagów. Może być ona również wykorzystana do badania ewentualnej degradacji istniejącego zapasu fagów w czasie. W przypadku czystego zapasu ko-lokalizacja sygnałów YFP i DAPI pod mikroskopem fluorescencyjnym powinna wynosić blisko 100%. Zazwyczaj obserwujemy, że mniej niż 1% plamek YFP nie zawiera DAPI (co reprezentuje kapsydy bez genomu wirusowego), co wskazuje, że cząstki te nie zapakowały pomyślnie wirusowego DNA lub wstrzyknęły już swoje DNA w innym miejscu. Mniej niż 1% plamek DAPI nie zawiera YFP (co odpowiada fagom niefluorescencyjnym). Jeśli tak nie jest, kroki od 2.12 do 2.14 muszą zostać powtórzone w celu ponownego oczyszczenia. Jeśli chodzi o parametry obrazowania, ustawienia mikroskopu w kroku 4.3 nie są tak krytyczne jak w Sekcji 5, ponieważ nie jest tutaj wymagane długotrwałe obrazowanie żywych komórek. Jednak utrzymanie tych samych ustawień mikroskopowych co w Sekcji 5 jest przydatne, jeśli chce się skalibrować intensywność fluorescencji pojedynczej cząstki faga. Jeśli płytka z agarozy PBS nie jest wystarczająco czysta lub użyto zbyt dużej ilości barwnika DAPI, niektóre plamki DAPI odpowiadające DNA fagów mogą być otoczone „halo”. W przypadku użycia zbyt małej ilości barwnika DAPI sygnał z kanału DAPI może być bardzo słaby.
System mikroskopowy:
Do obrazowania w Sekcji 6 używamy komercyjnego odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego (Eclipse TE2000-E, Nikon) z obiektywem 100x (Plan Fluo, apertura numeryczna 1,40, imersja olejowa) i standardowymi zestawami filtrów (Nikon). Źródłem światła fluorescencyjnego jest lampa łukowa z kontrolą natężenia światła. Następujące funkcje są sterowane komputerowo: pozycja x, y i z; migawki pola jasnego i fluorescencji; oraz wybór filtra fluorescencyjnego. Wymagana jest funkcja automatycznego ustawiania ostrości. W przeciwnym razie ostrość może łatwo ulec rozregulowaniu podczas rejestracji filmu time-lapse (trwającego zazwyczaj 4 godziny). Przydatna jest możliwość pozyskiwania obrazów z wielu pozycji (x,y) w każdym punkcie czasowym, co pozwala na równoległe śledzenie wielu zdarzeń infekcji. Zazwyczaj rejestrujemy 8 pozycji stolika w każdym filmie, śledząc do 100 zdarzeń infekcji. Stosowana przez nas kamera to chłodzona kamera CCD 512x512 z pikselami 16x16 μm i zakresem dynamicznym 16 bitów (Cascade512, Photometrics). Akwizycja jest wykonywana przy użyciu oprogramowania MetaMorph (Molecular Devices). Mikroskop powinien znajdować się w pomieszczeniu z kontrolowaną temperaturą; alternatywnie stolik mikroskopu powinien być otoczony komorą z kontrolowaną temperaturą.
Nabywanie obrazów: 
W przypadku obrazowania żywych komórek kluczowe jest unikanie zbędnej ekspozycji próbki, która mogłaby prowadzić do blaknięcia fluorescencji i fototoksyczności. Dlatego najlepiej jest najpierw scharakteryzować system, aby znaleźć optymalną ekspozycję na światło, która umożliwia detekcję fluorescencji, nie prowadząc jednocześnie do nadmiernego blaknięcia ani nie hamując wzrostu komórek. Aby uzyskać wysokiej jakości obraz fluorescencyjny, należy dostosować natężenie światła wzbudzenia, czas ekspozycji oraz wzmocnienie kamery. W krokach 6.2-6.3 wybrano 10 min odstępu między klatkami w celu zminimalizowania ekspozycji na światło. W każdej klatce wymagany jest tylko pojedynczy obraz w ostrości w kanale kontrastu fazowego (do rozpoznawania komórek) oraz w kanałach fluorescencyjnych (do określania losów komórek). Jednak w pierwszym punkcie czasowym konieczne jest wykonanie wielu obrazów w różnych pozycjach z w kanale YFP, aby uchwycić wszystkie fag i infekujące powierzchnię komórki. Czas ekspozycji YFP w początkowej klatce może również wymagać zwiększenia w porównaniu do czasu stosowanego w późniejszych klatkach filmu time-lapse.
Analiza obrazu:
Należy bardzo starannie policzyć cząsteczki fagów wokół powierzchni komórki w kroku 7.1. Jak wspomniano powyżej, w kroku 6.2 wykonujemy serię obrazów w osi z (z-stacks) w kanale YFP. Niemniej jednak, niektóre fluorescencyjne cząsteczki fagów mogą nadal pozostać poza ogniskową, co utrudnia ich zliczanie. Długość komórki w początkowym przedziale czasowym jest mierzona przy użyciu oprogramowania Metamorph. Długość komórki można mierzyć również za pomocą ImageJ lub innych narzędzi programistycznych. Ponadto bardzo przydatny w uzyskiwaniu takich informacji, jak zmiana fluorescencji w czasie wzdłuż linii komórkowych, może być automatyczny, autorski program w środowisku Matlab.

<table><tbody><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527-10KU</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642-10MG</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>Bufor SM</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>S0249</td><td></td></tr><tr><td>NZYM</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>N2062</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3011-250G</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>Igła</td><td>BD Biosciences</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta do dializy</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>66333</td><td></td></tr><tr><td>Przedmiot szkiełko</td><td>Corning</td><td>2947-75x50</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-100</td><td></td></tr><tr><td>Probówka ultra-clear SW40Ti</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>344060</td><td></td></tr><tr><td>Probówka ultra-clear SW60Ti</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>344062</td><td></td></tr><tr><td>Rotor SW40Ti</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>331302</td><td></td></tr><tr><td>Rotor SW60Ti</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>335649</td><td></td></tr><tr><td>Refraktometr</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-947</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse TE2000-E</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 2.&lt;/strong&gt; Odczynniki i sprzęt.</td></tr></tbody></table>

Śledzenie losów komórek e. coli po infekcji fagiem lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

System składający się z bakteriofaga (faga) lambda oraz bakterii E. coli od dawna służy jako paradygmat określania losów komórki1,2. Po jednoczesnym zainfekowaniu komórki przez liczbę fagów wybierana jest jedna z dwóch ścieżek: lityczna (wirulentna) lub lizogenna (utajona)3,4. Niedawno opracowaliśmy metodę fluorescencyjnego znakowania pojedynczych fagów, co pozwoliło nam badać decyzję podejmowaną po infekcji w czasie rzeczywistym pod mikroskopem, na poziomie pojedynczych fagów i komórek5. W niniejszej pracy opisujemy pełną procedurę przeprowadzania eksperymentów z infekcją przedstawionych w naszej wcześniejszej pracy5. Obejmuje ona tworzenie fluorescencyjnych fagów, infekcję komórek, obrazowanie pod mikroskopem oraz analizę danych. Fluorescencyjny fag jest „hybrydą”, koekspresującą wersje białka kapsydu gpD typu dzikiego oraz fuzji z YFP. W pierwszej kolejności uzyskuje się surowy lizat fagowy poprzez indukcję lizogenu faga gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein), zawierającego plazmid ekspresujący gpD typu dzikiego. Następnie przeprowadza się szereg etapów oczyszczania, a po nich znakowanie DAPI i obrazowanie pod mikroskopem. Jest to wykonywane w celu zweryfikowania jednorodności, wydajności pakowania DNA, sygnału fluorescencji oraz stabilności strukturalnej zapasu fagów. Wstępna adsorpcja fagów do bakterii odbywa się w lodzie, a następnie następuje krótka inkubacja w 35°C w celu zainicjowania wstrzyknięcia wirusowego DNA6. Mieszaninę fagów i bakterii przenosi się następnie na powierzchnię cienkiej płytki z agarem odżywczym, przykrywa szkiełkiem podstawowym i obrazuje pod mikroskopem epifluorescencyjnym. Proces po infekcji jest śledzony przez 4 hr w odstępach 10 min. Śledzonych jest wiele pozycji sceny, tak aby w jednym eksperymencie można było prześledzić infekcje ok. 100 komórek. W każdej pozycji i punkcie czasowym obrazy są pozyskiwane w kanale kontrastowym oraz czerwonym i zielonym kanale fluorescencyjnym. Obraz kontrastowy jest wykorzystywany później do automatycznego rozpoznawania komórek, natomiast kanały fluorescencyjne służą do charakterystyki wyniku infekcji: produkcji nowych fluorescencyjnych fagów (zielony) z następującą po tym lizą komórki lub ekspresji czynników lizogennych (czerwony) z następującym po tym wznowieniem wzrostu i podziału komórki. Pozyskane filmy time-lapse są przetwarzane przy użyciu kombinacji metod manualnych i automatycznych. Analiza danych prowadzi do identyfikacji parametrów infekcji dla każdego zdarzenia infekcyjnego (np. liczby i pozycji infekujących fagów) oraz wyniku infekcji (liza/lizogenia). W razie potrzeby można wyekstrahować dodatkowe parametry.

Niniejszy artykuł opisuje procedurę przygotowania znakowanej fluorescencyjnie wersji bakteriofaga lambda, zakażania bakterii E. coli, obserwowania efektów zakażenia pod mikroskopem oraz analizy wyników infekcji.

Śledzenie losów komórek E. coli po infekcji fagiem lambda

Układ obejmujący bakteriofaga (faga) lambda oraz bakterię E. coli od dawna służy jako paradygmat determinacji losów komórki1,2. Po...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie mikroskopu fluorescencyjnego do śledzenia siarczanów w e coli w czasie rzeczywistym po infekcji fagiem lambda. Pracę należy rozpocząć od przygotowania surowego lizatu faga lambda. Następnie należy oczyścić fagi i zainfekować e coli fagiem lambda w probówce.Nadal obserwuj losy komórek bakteryjnych pod mikroskopem. W rezultacie można w czasie rzeczywistym zaobserwować różne losy komórek e coli poprzez ekspresję różnych białek fluorescencyjnych związanych ze wzrostem lub śmiercią komórek. Zazwyczaj jednym z etapów weryfikacji tej metody jest stworzenie oczyszczonego i znakowanego zapasu FI.Aby uniknąć agregacji podczas przygotowania i oczyszczania, należy również zoptymalizować parametry obrazowania pod mikroskopem, aby zapewnić prawidłowy wzrost komórek. Zaszczepić nocną kulturę E 3 92 Lambda LZ one PPL star D w pożywce LBM. Przy gęstości komórkowej OD 600 około 0,6 indukowany jest lygen w wytrząsarce z kąpielą wodną o temperaturze 42 °C.Kontynuować inkubację w temperaturze 37°C aż do momentu widocznej lizy. Kultura stanie się klarowna. Następnie dodać 2% chloroformu i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Następnie przenieś lizat fagowy do butelek o pojemności 250 mililitrów i odwiruj kulturę. Potem odzyskaj nadsącz zawierający cząsteczki fagów i przeprowadź drugą centryfugację w celu usunięcia widocznych zanieczyszczeń zgodnie ze standardowymi protokołami miareczkowania fagów. Zmierz stężenie fagów, a następnie oczyść fagi za pomocą gradientu chlorku cezu i sprawdź ich aktywność za pomocą DPI w celu przygotowania płytek aro.Oczyść sześć szkiełek przedmiotowych 70% etanolem. Ułóż pięć szkiełek w sposób przedstawiony na schemacie i zabezpiecz je taśmą. Następnie wlej roztwór 1,5% aros w medium na zabezpieczone szkiełka.Połóż ostatni szkiełko na wierzchu, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Połóż na górze obciążnik i pozostaw AROS do schłodzenia na około 30 minut. Usuń cztery szkiełka z boków i zapakuj blok szkiełek folią spożywczą.Używając nocnej hodowli przekształconych bakterii jako inokulum, wyhoduj kulturę w pożywce LBMM, odwiruj jeden mililitr bakterii i resuspendu. Zawieś komórki w 20 µL lodowatej pożywki LBMM za pomocą szerokiego końcówki pipety.Dodaj 20 µL oczyszczonego faga. Delikatnie wymieszaj i inkubuj najpierw na lodzie przez 30 minut, aby umożliwić adsorpcję fagów. Następnie inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 35 °C przez pięć minut.Aby zainicjować wstrzyknięcie DNA faga, rozdziel agregaty komórkowe poprzez mieszanie. Rozcieńcz mieszaninę w stosunku 1:10 w pożywce LBMM. Następnie umieść ją na płytce LBM agro.Na szkiełko zakrywkowe nanieś jeden mikrolitr mieszaniny faga i komórek. Po wchłonięciu delikatnie nałóż na wierzch kolejne szkiełko zakrywkowe. Rozpocznij od wykonania serii obrazów w kanale YFP dla pierwszego przedziału czasowego.Wykonaj serię 15 obrazów w odstępach 200 nanometrów wzdłuż osi Z. Dodatkowo wykonaj pojedynczy obraz w ostrości, korzystając z kanału kontrastu fazowego oraz kanału m cherry. Następnie zarejestruj film time-lapse obrazujący losy komórki po infekcji.Aby zminimalizować blaknięcie i fototoksyczność podczas rejestracji filmu time-lapse, należy wykonać pojedynczy obraz w pozycji Z dla każdego kanału w każdym punkcie czasowym, obrazując próbkę w kontraście fazowym oraz w kanałach YFP i M cherry w odstępach 10 minut przez około cztery godziny. Analizę obrazów należy rozpocząć od ręcznego przeliczenia fagów, zapisując jednocześnie ich lokalizację oraz długość komórki. W początkowym przedziale czasowym należy odnotować losy komórek: lityczne, lizogenne lub brak infekcji.Należy również udokumentować czas lizy oraz wszelkie inne pożądane informacje poprzez odtworzenie filmu poklatkowego, a także wyodrębnić więcej informacji ilościowych, takich jak poziom fluorescencji w czasie w poszczególnych komórkach, wykorzystując zautomatyzowane algorytmy rozpoznawania komórek i śledzenia linii komórkowych. Zazwyczaj plaki fagów znakowanych fluorescencyjnie są znacznie mniejsze niż plaki typu dzikiego, a sygnały YFP i DAPI w przypadku pomyślnie oczyszczonego faga współlokalizują. Przedstawione dane łączą zestawy obrazów w kontraście fazowym oraz kanałach YFP i M cherry, a także odpowiadające im obrazy nałożone pochodzące z filmu poklatkowego.Pojedyncze fagi są wyraźnie widoczne w początkowym przedziale czasowym. Tutaj widać dwie komórki, z których każda jest zainfekowana przez pojedynczego faga, oraz jedną komórkę zainfekowaną przez trzy fagi. Typowo na powierzchni komórki widoczna jest liczba fagów, podczas gdy inne fagi pozostają niezaabsorbowane.Z czasem wynik infekcji staje się możliwy do rozróżnienia. Po 80 minutach dwie komórki zainfekowane pojedynczymi fagami weszły każda w ścieżkę lityczną. Dzięki wewnątrzkomórkowej produkcji nowych fagów, komórka zainfekowana trzema fagami weszła w ścieżkę lizogeniczną, objawiającą się produkcją m Cherry z pre-motora.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przygotować oczyszczony stok fagów do zakażania bakterii e co fagiem lambda oraz jak przeprowadzić obrazowanie cyklu życiowego pod mikroskopem w czasie rzeczywistym.

following-cell-fate-in-e-coli-after-infection-by-phage-lambda

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Śledzenie losu komórki w E. coli po infekcji bakteriofagiem Lambda

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

Nowa generacja bezkomórkowych platform transkrypcyjno-translacyjnych została zaprojektowana do budowy systemów biochemicznych in vitro poprzez wykonywanie obwodów genowych. W tym artykule opisujemy, w jaki sposób bakteriofagi, takie jak MS2, ΦΧ174 i T7, są syntetyzowane z ich genomu przy użyciu systemu TXTL wolnego od komórek E. coli.

Synteza zakaźnych bakteriofagów w bezkomórkowym systemie ekspresji opartym na E. coli

Tutaj prezentujemy protokół użycia istniejących wcześniej konstruktów delecji kasety oporności na antybiotyki jako podstawy do tworzenia mutantów delecyjnych w innych szczepach E. coli. Takie mutacje delecji mogą być mobilizowane i wprowadzane do odpowiedniego locus szczepu biorcy za pomocą transdukcji bakteriofaga P1.

Wytwarzanie delecji genów w Escherichia coli przez transdukcję P1 z kasetami oporności na antybiotyki podlegającymi akcyzie

Opisujemy zarówno testy infekcji in vitro, jak i in vivo, które mogą być użyte do analizy aktywności czynników kodujących gospodarza.

Wykorzystanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmowym

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Tutaj opisujemy użycie metody obrazowania pojedynczych cząsteczek, Zasłon DNA, do badania biofizycznego mechanizmu gromadzenia się kondensatów EWS-FLI1 na DNA.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek kondensatów EWS-FLI1 składających się na DNA

Bakteriofagi (fagi), wirusy infekujące bakterie, są integralnym składnikiem mikrobiomu jelitowego. Chociaż ci symbiotyczni mieszkańcy napędzają sprawność bakterii i dynamikę populacji, niewiele wiadomo o tym, jak wpływają na homeostazę i choroby jelit. W tym protokole bada się izolowane fagi T4 w modelu mysim, które można dostosować do innych par-bakteria.

Interakcja bakteriofaga T4 i E. coli w jelicie myszy: prototypowy model do badania dynamiki gospodarz-bakteriofag in vivo

W niniejszej pracy opisujemy nową metodę monitorowania pobierania i transportu prionów przez komórki odpornościowe bezpośrednio po inokulacji doprzewnowej, polegającą na oczyszczaniu i znakowaniu fluorescencyjnym zagregowanych prętów prionowych z zakażonego materiału mózgowego, a następnie śledzeniu ich pobierania i przemieszczania się z miejsca wstrzyknięcia oraz charakteryzacji komórek pośredniczących w tych zdarzeniach.

Monitorowanie przemieszczania się komórek odpornościowych do fluorescencyjnych pręcików prionowych w godzinach po zakażeniu drogą dosytrychialną

Członkowie rodzaju Burkholderia są patogenami o znaczeniu klinicznym.  Opisujemy metodę całkowitej ekstrakcji białek bakteryjnych, wykorzystującą mechaniczne rozerwanie i elektroforezę żelową 2D do późniejszej analizy proteomicznej.

Metody ekstrakcji białka całkowitego i elektroforezy żelowej 2D dla gatunków Burkholderia

Metoda jest opisana z wizualnym akompaniamentem do przeprowadzania skalowalnych, wysokoprzepustowych selekcji z kombinatorycznych bibliotek syntetycznych przeciwciał wyświetlanych przez fagi przeciwko setkom antygenów jednocześnie. Stosując to równoległe podejście, wyizolowaliśmy fragmenty przeciwciał, które wykazują wysokie powinowactwo i swoistość dla różnych antygenów, które są funkcjonalne w standardowych testach immunologicznych.

Skalowalny wybór przeciwciał syntetycznych o wysokiej przepustowości z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych przez fagi

Poznaj metodę obserwacji losu komórek E. coli po zakażeniu fagiem Lambda przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia badanie dynamiki infekcji w czasie rzeczywistym.

Śledzenie losów komórek E. coli po infekcji fagiem lambda

Przeglądaj więcej filmów