Ukierunkowana samoorganizacja komórkowa w celu wytworzenia pierścieni tkankowych pochodzących z komórek do analizy biomechanicznej i inżynierii tkankowej
November 25th, 2011
Ten artykuł przedstawia wszechstronną metodę tworzenia pierścieni tkankowych pochodzących z komórek poprzez samoorganizację komórkową. Komórki mięśni gładkich osadzone w dołkach agarozy w kształcie pierścienia agregują się i kurczą, tworząc wytrzymałe trójwymiarowe (3D) tkanki w ciągu 7 dni. Pierścienie tkankowe w skali milimetrowej sprzyjają testom mechanicznym i służą jako elementy budulcowe do składania tkanek.
Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie trójwymiarowych konstruktów tkankowych z zagregowanych komórek i macierzy pochodzącej z komórek, które można wykorzystać do analizy funkcjonalnej. Osiąga się to poprzez pierwsze zmielenie formy z poliwęglanu w celu stworzenia okrągłodennych studzienek pierścieniowych. Następnie polidimetylo Sloane lub PDMS jest odlewany na formę poliwęglanową w celu stworzenia szablonu.
Następnie szablon PDMS jest używany do tworzenia studni aros. Ostatnim krokiem jest zasianie komórek w dołkach aros, aby umożliwić im agregację i tworzenie spójnych pierścieni tkankowych. Ostatecznie metoda ta może być wykorzystana do osiągnięcia samoorganizacji komórkowej i inżynierii tkankowej przy użyciu różnych typów komórek, a także umożliwia analizę udziału komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z komórek w strukturze i funkcji tkanki.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi podejściami inżynierii tkankowej jest to, że możemy generować konstrukty tkankowe całkowicie z komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej, którą wytwarzają szybciej niż wcześniej zgłaszano, oraz w formacie sprzyjającym analizie mechanicznej, Zacznij od zmielenia kawałka poliwęglanu o grubości pół cala, aby stworzyć 15 okrągłych studzienek pierścieniowych o średnicy środkowego słupka wynoszącej dwa milimetry. Wyczyść formę z poliwęglanu, aby usunąć wszelkie plastikowe zanieczyszczenia powstałe w procesie mielenia i pozostaw formę do wyschnięcia. Następnie wymieszaj PDMS w stosunku 10 do jednego utwardzacza bazowego, odgazuj roztwór, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza, a następnie wlej go do formy poliwęglanowej.
Następnie ponownie odgazuj mieszaninę na formie, aby usunąć wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza i utwardź PDMS w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez cztery godziny, podczas gdy PDMS utwardza się, rozpuść. 2% AROS w DMEM po utwardzeniu ostrożnie usuń szablon PDMS, powoli odrywając go od poliwęglanu, a następnie umyj PDMS wodą z mydłem i autoklawuj go wraz z roztworem DMEM AROS. Teraz umieść szablon PDMS w autoklawie na równej powierzchni i wypełnij go stopionym arosem, najpierw pipetując aros do każdej z środkowych form słupków, a następnie pipetując aros do przestrzeni wokół nich.
Pozwól aros zastygnąć przez około 15 minut. Następnie odwróć formę, aby uwolnić aros z PDMS. Wytnij nadmiar aros z okolic każdego z dołków, a następnie umieść jeden aros dobrze w każdym dołku na 12-dołkowej płytce. Teraz.
Dodaj pożywkę do hodowli komórkowych na zewnątrz dołka aros, nie zakrywając górnej części studzienki. Następnie umieść płytki w inkubatorze, aby umożliwić im zrównoważenie podczas przygotowywania komórek. Przy 90% zbiegu trypsyna, komórki mięśni gładkich aorty szczura i resus.
Zawieś komórki w stężeniu pięć razy 10 do sześciu komórek na mililitr. Następnie odpipetować 100 mikrolitrów zawieszonej zawiesiny komórek do każdej z równoważonych studzienek aros. Wykonując okrężne ruchy, aby nałożyć komórki na każdą z dołków.
Umieść płytki w inkubatorze, aby siedziały w spokoju przez 24 godziny. Wymieniaj pożywkę co dwa dni, zasysając pożywkę z okolic studzienki, a następnie ponownie napełniając każdą studzienkę, aż forma aros zostanie całkowicie zanurzona. A na zakończenie hodowli napełnij małą szalkę Petriego PBS.
Wyjmij każdy pierścień z formy aros, przesuwając go przez górną część środkowego słupka. Umieść pierścienie na szalkach Petriego z PBS Center, pierścieniu pod cyfrowym systemem obrazowania. Użyj oprogramowania do wykrywania krawędzi, aby zmierzyć grubość pierścienia w czterech pozycjach: na górze, na dole, po lewej i prawej stronie na jego obwodzie.
Do wykonywania jednoosiowej próby rozciągania. Zamontuj próbkę pierścienia na dwóch cienkich drucianych uchwytach. Wysuń uchwyty, aż do przyłożenia do pierścienia obciążenia rozrywającego wynoszącego pięć miliniutonów.
Następnie wprowadź pole przekroju poprzecznego obliczone na podstawie pomiarów grubości i zapisz długość miernika. Wstępnie przekręć pierścień osiem razy między obciążeniem rozrywającym a 50 kg paskalem. Naprężenie w tempie 10 milimetrów na minutę po ósmym cyklu wstępnym doprowadziło do awarii z prędkością 10 milimetrów na minutę.
Dla każdego pierścienia zmierz ostateczne naprężenie rozciągające i odkształcenie niszczące, a następnie oblicz maksymalny moduł stycznej na podstawie uzyskanych danych. Oprócz funkcjonalnych badań in vitro, te żywe pierścienie komórkowe mogą również łączyć się, tworząc rurki tkankowe. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przyciąć końce silikonowych rurek pod kątem, aby utworzyć skośne krawędzie, a następnie autoklawuj silikonowe rurki podczas autoklawowania.
Napełnij szalkę Petriego wysterylizowanymi mediami do przenoszenia niestandardowych silikonowych uchwytów probówek do szafki bezpieczeństwa biologicznego i umieść na pustej szalce Petriego. Następnie wyjmij pierścienie z dołków aros i umieść je na szalce Petriego wypełnionej pożywką. Umieść silikonowe rurki na tej samej szalce Petriego, aby zwilżyć je przed użyciem.
Za pomocą kleszczyków umieść końcówkę silikonowej rurki w środku pierścienia i delikatnie wsuń pierścień na silikonową rurkę. Wsuń pierścienie w kontakt ze sobą, delikatnie popychając je kolejno w obu kierunkach wzdłuż rurki. Po zamontowaniu pierścieni wyrównaj silikonowe rurki w uchwytach z poliwęglanu i skręć ze sobą obie części uchwytu.
Dodaj 55 mililitrów pożywki do szalki Petriego. Wymieniaj pożywkę co trzy dni na czas hodowli w celu usunięcia probówek tkankowych. Najpierw napełnij szalkę Petriego PBS.
Następnie zwolnij silikonowe rurki z uchwytu z poliwęglanu i za pomocą kleszczy zsuń rurki z silikonowej rurki do naczynia. Przy prawidłowym wykonaniu komórki osiadają na dnie studzienek aros i kurczą się w ciągu 24 godzin po usadzeniu, aby wytworzyć pierścień tkankowy wokół środkowego słupka w studni Agarro, jest to reprezentatywny wykres krzywej naprężenia i odkształcenia uzyskanej z jednoosiowej próby rozciągania dwumilimetrowego pierścienia tkankowego wygenerowanego z komórek mięśni gładkich szczura. Ostateczna wytrzymałość na rozciąganie, maksymalny moduł sprężystości przy rozciąganiu i wartości odkształcenia przy zniszczeniu są następnie wykorzystywane do porównania właściwości mechanicznych próbek pierścieni tkankowych hodowanych przy różnych parametrach hodowli.
Właściwości mechaniczne pierścieni tkankowych można kontrolować, zmieniając parametry hodowli, w tym liczbę miejsc w komórkach, długość hodowli, pożywkę hodowlaną i typ użytej komórki. Oprócz komórek mięśni gładkich szczura. Ludzkie pierwotne komórki mięśni gładkich tworzą pierścienie tkankowe o podobnej wytrzymałości na rozciąganie.
Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste również agregują się, tworząc pierścienie, ale nie były wystarczająco silne do testów mechanicznych. Nasz system umożliwia wytwarzanie inżynieryjnych konstruktów tkankowych w całości z komórek po prostu poprzez wysiewanie komórek do naszych niestandardowych dołków aros. Po obrobieniu początkowej formy z poliwęglanu możemy wykonać nieograniczoną liczbę szablonów PDMS, które następnie można wykorzystać do wykonania form, dzięki czemu nie jest wymagane żadne dodatkowe wyposażenie.
System jest wszechstronny w tym sensie, że wykorzystaliśmy wiele różnych typów komórek w systemie do tworzenia pierścieni tkankowych, a więc ten system może być potencjalnie wykorzystany zarówno do zastosowań w inżynierii tkankowej, jak i do badań in vitro nad wkładem komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej w strukturę i funkcję tkanek.
Przegląd
Ten artykuł opisuje wszechstronny sposób tworzenia pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego poprzez samoodbudowę komórek. Komórki mięśni gładkich agregują się i kurczą w dołkach agarozowych, tworząc trwałe trójwymiarowe (3D) tkanki nadające się do badań mechanicznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Inżynieria tkankowa
- Biologia komórki
- Badania mechaniczne
Tło
- 3D konstrukty tkankowe są niezbędne do analizy funkcjonalnej w badaniach biologicznych.
- Macierz pozakomórkowa pochodzenia komórkowego odgrywa kluczową rolę w strukturze i funkcji tkanki.
- Tradycyjne metody inżynierii tkankowej mogą nie pozwalać na szybkie generowanie konstrukcji.
- Techniki samoodbudowy mogą zwiększyć efektywność inżynierii tkankowej.
Cel badania
- Opracowanie metody tworzenia spójnych pierścieni tkankowych z zagregowanych komórek.
- Umożliwienie analizy wkładu komórek i macierzy pozakomórkowej w właściwości tkanki.
- Ułatwienie badań mechanicznych konstrukcji tkankowych.
Stosowane metody
- Frezowanie foremek poliwęglanowych w celu utworzenia pierścieniowych dołków.
- Wykorzystanie szablonów PDMS do formowania dołków agarozowych.
- Zasiewanie komórek mięśni gładkich do dołków agarozowych w celu agregowania.
- Przeprowadzanie badań mechanicznych na utworzonych pierścieniach tkankowych.
Główne wyniki
- Pierścienie tkankowe uformowały się w ciągu 7 dni i nadawały się do analizy mechanicznej.
- Metoda pozwala na generowanie konstrukcji tkankowych w całości z komórek i ich macierzy pozakomórkowej.
- Właściwości mechaniczne pierścieni tkankowych można kontrolować poprzez zmianę parametrów hodowli.
- Żywe pierścienie komórkowe mogą zlać się, tworząc rurki tkankowe do dalszych badań.
Wnioski
- Ta metoda zapewnia szybki i efektywny podejście do inżynierii tkankowej.
- Zwiększa rozumienie wkładu komórek w mechanikę tkanki.
- Technikę tę można dostosować do różnych typów komórek i zastosowań w badaniach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Directed cellular self-assembly enables rapid fabrication of 3D tissue rings composed entirely of cells and their extracellular matrix, providing a robust platform for biomechanical analysis and tissue engineering. This approach addresses the need for physiologically relevant, reproducible vascular tissue models in early discovery and preclinical research. The method supports predictive confidence in evaluating cellular and matrix contributions to tissue mechanics, informing risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cellular and matrix roles in tissue structure and function.
- Supports mechanistic de-risking by isolating cell-type and matrix effects on biomechanical properties.
- Facilitates functional target validation in disease-relevant tissue constructs.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible 3D tissue rings for quantitative mechanical testing.
- Enables assay development for evaluating tissue strength, elasticity, and failure thresholds.
- Supports scalable preparation of constructs for comparative compound or condition screening.
Translational & Preclinical Research
- Offers in vitro models for studying vascular tissue mechanics relevant to cardiovascular disease.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling direct measurement of tissue-level outputs.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of engineered tissue constructs.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of cellular and matrix contributions to tissue mechanics, supporting both early validation and downstream translational studies.
- Discovery Biology: Facilitates quantitative hypothesis testing of cell and matrix effects on tissue function.
- Screening: Delivers reproducible, assay-ready tissue constructs for mechanical property evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as ultimate tensile strength and modulus for condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models of vascular tissue engineering.
- Enterprise Reuse: Offers a versatile platform adaptable to multiple cell types and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in tissue engineering and mechanistic studies.
- Operational Value: Standardizes construct fabrication and mechanical testing workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust, quantitative tissue-level data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of tissue engineering and disease modeling programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, tissue engineering, and biomechanical analysis.
- Needs access to custom mold fabrication, PDMS casting, and mechanical testing instrumentation.
- Demands cross-team standardization of construct preparation and measurement protocols.
- Adaptable to various cell types, but mechanical test suitability may vary by cell source.
- Mechanical properties depend on culture parameters and may limit direct translation to all tissue types.
