Ukierunkowana samoorganizacja komórkowa w celu wytworzenia pierścieni tkankowych pochodzących z komórek do analizy biomechanicznej i inżynierii tkankowej
25 listopada 2011
Ten artykuł przedstawia wszechstronną metodę tworzenia pierścieni tkankowych pochodzących z komórek poprzez samoorganizację komórkową. Komórki mięśni gładkich osadzone w dołkach agarozy w kształcie pierścienia agregują się i kurczą, tworząc wytrzymałe trójwymiarowe (3D) tkanki w ciągu 7 dni. Pierścienie tkankowe w skali milimetrowej sprzyjają testom mechanicznym i służą jako elementy budulcowe do składania tkanek.
Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie trójwymiarowych konstruktów tkankowych z zagregowanych komórek i macierzy pochodzącej z komórek, które można wykorzystać do analizy funkcjonalnej. Osiąga się to poprzez pierwsze zmielenie formy z poliwęglanu w celu stworzenia okrągłodennych studzienek pierścieniowych. Następnie polidimetylo Sloane lub PDMS jest odlewany na formę poliwęglanową w celu stworzenia szablonu.
Następnie szablon PDMS jest używany do tworzenia studni aros. Ostatnim krokiem jest zasianie komórek w dołkach aros, aby umożliwić im agregację i tworzenie spójnych pierścieni tkankowych. Ostatecznie metoda ta może być wykorzystana do osiągnięcia samoorganizacji komórkowej i inżynierii tkankowej przy użyciu różnych typów komórek, a także umożliwia analizę udziału komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z komórek w strukturze i funkcji tkanki.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi podejściami inżynierii tkankowej jest to, że możemy generować konstrukty tkankowe całkowicie z komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej, którą wytwarzają szybciej niż wcześniej zgłaszano, oraz w formacie sprzyjającym analizie mechanicznej, Zacznij od zmielenia kawałka poliwęglanu o grubości pół cala, aby stworzyć 15 okrągłych studzienek pierścieniowych o średnicy środkowego słupka wynoszącej dwa milimetry. Wyczyść formę z poliwęglanu, aby usunąć wszelkie plastikowe zanieczyszczenia powstałe w procesie mielenia i pozostaw formę do wyschnięcia. Następnie wymieszaj PDMS w stosunku 10 do jednego utwardzacza bazowego, odgazuj roztwór, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza, a następnie wlej go do formy poliwęglanowej.
Następnie ponownie odgazuj mieszaninę na formie, aby usunąć wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza i utwardź PDMS w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez cztery godziny, podczas gdy PDMS utwardza się, rozpuść. 2% AROS w DMEM po utwardzeniu ostrożnie usuń szablon PDMS, powoli odrywając go od poliwęglanu, a następnie umyj PDMS wodą z mydłem i autoklawuj go wraz z roztworem DMEM AROS. Teraz umieść szablon PDMS w autoklawie na równej powierzchni i wypełnij go stopionym arosem, najpierw pipetując aros do każdej z środkowych form słupków, a następnie pipetując aros do przestrzeni wokół nich.
Pozwól aros zastygnąć przez około 15 minut. Następnie odwróć formę, aby uwolnić aros z PDMS. Wytnij nadmiar aros z okolic każdego z dołków, a następnie umieść jeden aros dobrze w każdym dołku na 12-dołkowej płytce. Teraz.
Dodaj pożywkę do hodowli komórkowych na zewnątrz dołka aros, nie zakrywając górnej części studzienki. Następnie umieść płytki w inkubatorze, aby umożliwić im zrównoważenie podczas przygotowywania komórek. Przy 90% zbiegu trypsyna, komórki mięśni gładkich aorty szczura i resus.
Zawieś komórki w stężeniu pięć razy 10 do sześciu komórek na mililitr. Następnie odpipetować 100 mikrolitrów zawieszonej zawiesiny komórek do każdej z równoważonych studzienek aros. Wykonując okrężne ruchy, aby nałożyć komórki na każdą z dołków.
Umieść płytki w inkubatorze, aby siedziały w spokoju przez 24 godziny. Wymieniaj pożywkę co dwa dni, zasysając pożywkę z okolic studzienki, a następnie ponownie napełniając każdą studzienkę, aż forma aros zostanie całkowicie zanurzona. A na zakończenie hodowli napełnij małą szalkę Petriego PBS.
Wyjmij każdy pierścień z formy aros, przesuwając go przez górną część środkowego słupka. Umieść pierścienie na szalkach Petriego z PBS Center, pierścieniu pod cyfrowym systemem obrazowania. Użyj oprogramowania do wykrywania krawędzi, aby zmierzyć grubość pierścienia w czterech pozycjach: na górze, na dole, po lewej i prawej stronie na jego obwodzie.
Do wykonywania jednoosiowej próby rozciągania. Zamontuj próbkę pierścienia na dwóch cienkich drucianych uchwytach. Wysuń uchwyty, aż do przyłożenia do pierścienia obciążenia rozrywającego wynoszącego pięć miliniutonów.
Następnie wprowadź pole przekroju poprzecznego obliczone na podstawie pomiarów grubości i zapisz długość miernika. Wstępnie przekręć pierścień osiem razy między obciążeniem rozrywającym a 50 kg paskalem. Naprężenie w tempie 10 milimetrów na minutę po ósmym cyklu wstępnym doprowadziło do awarii z prędkością 10 milimetrów na minutę.
Dla każdego pierścienia zmierz ostateczne naprężenie rozciągające i odkształcenie niszczące, a następnie oblicz maksymalny moduł stycznej na podstawie uzyskanych danych. Oprócz funkcjonalnych badań in vitro, te żywe pierścienie komórkowe mogą również łączyć się, tworząc rurki tkankowe. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przyciąć końce silikonowych rurek pod kątem, aby utworzyć skośne krawędzie, a następnie autoklawuj silikonowe rurki podczas autoklawowania.
Napełnij szalkę Petriego wysterylizowanymi mediami do przenoszenia niestandardowych silikonowych uchwytów probówek do szafki bezpieczeństwa biologicznego i umieść na pustej szalce Petriego. Następnie wyjmij pierścienie z dołków aros i umieść je na szalce Petriego wypełnionej pożywką. Umieść silikonowe rurki na tej samej szalce Petriego, aby zwilżyć je przed użyciem.
Za pomocą kleszczyków umieść końcówkę silikonowej rurki w środku pierścienia i delikatnie wsuń pierścień na silikonową rurkę. Wsuń pierścienie w kontakt ze sobą, delikatnie popychając je kolejno w obu kierunkach wzdłuż rurki. Po zamontowaniu pierścieni wyrównaj silikonowe rurki w uchwytach z poliwęglanu i skręć ze sobą obie części uchwytu.
Dodaj 55 mililitrów pożywki do szalki Petriego. Wymieniaj pożywkę co trzy dni na czas hodowli w celu usunięcia probówek tkankowych. Najpierw napełnij szalkę Petriego PBS.
Następnie zwolnij silikonowe rurki z uchwytu z poliwęglanu i za pomocą kleszczy zsuń rurki z silikonowej rurki do naczynia. Przy prawidłowym wykonaniu komórki osiadają na dnie studzienek aros i kurczą się w ciągu 24 godzin po usadzeniu, aby wytworzyć pierścień tkankowy wokół środkowego słupka w studni Agarro, jest to reprezentatywny wykres krzywej naprężenia i odkształcenia uzyskanej z jednoosiowej próby rozciągania dwumilimetrowego pierścienia tkankowego wygenerowanego z komórek mięśni gładkich szczura. Ostateczna wytrzymałość na rozciąganie, maksymalny moduł sprężystości przy rozciąganiu i wartości odkształcenia przy zniszczeniu są następnie wykorzystywane do porównania właściwości mechanicznych próbek pierścieni tkankowych hodowanych przy różnych parametrach hodowli.
Właściwości mechaniczne pierścieni tkankowych można kontrolować, zmieniając parametry hodowli, w tym liczbę miejsc w komórkach, długość hodowli, pożywkę hodowlaną i typ użytej komórki. Oprócz komórek mięśni gładkich szczura. Ludzkie pierwotne komórki mięśni gładkich tworzą pierścienie tkankowe o podobnej wytrzymałości na rozciąganie.
Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste również agregują się, tworząc pierścienie, ale nie były wystarczająco silne do testów mechanicznych. Nasz system umożliwia wytwarzanie inżynieryjnych konstruktów tkankowych w całości z komórek po prostu poprzez wysiewanie komórek do naszych niestandardowych dołków aros. Po obrobieniu początkowej formy z poliwęglanu możemy wykonać nieograniczoną liczbę szablonów PDMS, które następnie można wykorzystać do wykonania form, dzięki czemu nie jest wymagane żadne dodatkowe wyposażenie.
System jest wszechstronny w tym sensie, że wykorzystaliśmy wiele różnych typów komórek w systemie do tworzenia pierścieni tkankowych, a więc ten system może być potencjalnie wykorzystany zarówno do zastosowań w inżynierii tkankowej, jak i do badań in vitro nad wkładem komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej w strukturę i funkcję tkanek.
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono wszechstronną metodę tworzenia pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego poprzez samoorganizację komórkową. Komórki mięśni gładkich agregują i kurczą się w dołkach z agarozy, tworząc wytrzymałe tkanki trójwymiarowe (3D) odpowiednie do badań mechanicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa
- Biologia komórki
- Badania mechaniczne
Wstęp
- Konstrukcje tkankowe 3D są niezbędne do analizy funkcjonalnej w badaniach biologicznych.
- Macierz pozakomórkowa pochodzenia komórkowego odgrywa kluczową rolę w strukturze i funkcji tkanek.
- Tradycyjne metody inżynierii tkankowej mogą nie pozwalać na szybkie generowanie konstruktów.
- Techniki samooorganizacji mogą zwiększyć efektywność inżynierii tkankowej.
Cel badania
- Opracowanie metody tworzenia spójnych pierścieni tkankowych z agregatów komórkowych.
- Umożliwienie analizy wpływu komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej na właściwości tkanki.
- Ułatwienie testowania mechanicznego konstruktów tkankowych.
Zastosowane metody
- Frezowanie form z poliwęglanu w celu utworzenia studzienek pierścieniowych.
- Wykorzystanie szablonów z PDMS do formowania studzienek z agarozy.
- Wysiewanie komórek mięśni gładkich do studzienek z agarozy w celu ich agregacji.
- Przeprowadzanie testów mechanicznych utworzonych pierścieni tkankowych.
Główne wyniki
- Pierścienie tkankowe uformowały się w ciągu 7 dni i były odpowiednie do analizy mechanicznej.
- Metoda ta umożliwia generowanie konstruktów tkankowych w całości z komórek i ich macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Właściwości mechaniczne pierścieni tkankowych można kontrolować poprzez zmianę parametrów hodowli.
- Żywe pierścienie komórkowe mogą ulegać fuzji, tworząc rurki tkankowe do dalszych badań.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia szybkie i wydajne podejście do inżynierii tkankowej.
- Umożliwia ona lepsze zrozumienie wkładu komórek w mechanikę tkanek.
- Technikę tę można dostosować do różnych typów komórek oraz zastosowań badawczych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Kierowana samoorganizacja komórkowa umożliwia szybką produkcję trójwymiarowych pierścieni tkankowych składających się wyłącznie z komórek i ich macierzy zewnątrzkomórkowej, co stanowi solidną platformę do analiz biomechanicznych i inżynierii tkankowej. Podejście to odpowiada na zapotrzebowanie na fizjologicznie istotne i powtarzalne modele tkanek naczyniowych we wczesnych etapach odkrywania leków oraz w badaniach przedklinicznych. Metoda ta zwiększa pewność predykcyjną w ocenie wpływu komórek i macierzy na mechanikę tkanek, co pozwala na podejmowanie decyzji portfelowych z uwzględnieniem ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę roli komórek i macierzy w strukturze i funkcji tkanki.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolowanie wpływu typu komórek i macierzy na właściwości biomechaniczne.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu w konstruktach tkankowych istotnych dla danej choroby.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia standaryzowane, powtarzalne trójwymiarowe pierścienie tkankowe do ilościowych testów mechanicznych.
- Umożliwia opracowanie analiz do oceny wytrzymałości, elastyczności i progów uszkodzenia tkanek.
- Wspiera skalowalną preparację konstruktów do porównawczego przesiewu związków lub warunków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Oferuje modele in vitro do badania mechaniki tkanki naczyniowej w kontekście chorób sercowo-naczyniowych.
- Jest zgodny z translacyjnymi strategiami biomarkerów, umożliwiając bezpośredni pomiar wyników na poziomie tkanki.
- Zapewnia ciągłość procesu od fazy odkryć po przedkliniczną walidację inżynieryjnych konstruktów tkankowych.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie hipotez dotyczących wpływu komórek i macierzy na mechanikę tkanek, co wspiera zarówno wczesną walidację, jak i późniejsze badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia ilościowe testowanie hipotez dotyczących wpływu komórek i macierzy na funkcje tkanek.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, gotowych do analizy konstruktów tkankowych do oceny właściwości mechanicznych.
- Analityka: Zapewnia wyniki ilościowe, takie jak wytrzymałość na rozciąganie i moduł Younga, w celu porównania różnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z modelami przedklinicznymi w inżynierii tkankowej naczyń krwionośnych.
- Uniwersalne zastosowania: Oferuje wszechstronną platformę możliwą do adaptacji do wielu typów komórek i warunków doświadczalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w inżynierii tkankowej i badaniach mechanistycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procesy wytwarzania konstruktów oraz przepływy pracy w testach mechanicznych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu poprzez dostarczanie wiarygodnych, ilościowych danych na poziomie tkankowym.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów inżynierii tkankowej i modelowania chorób z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek, inżynierii tkankowej i analizie biomechanicznej.
- Wymaga dostępu do aparatury do wytwarzania niestandardowych form, odlewania PDMS oraz instrumentacji do testów mechanicznych.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji protokołów przygotowania i pomiaru konstruktów.
- Metoda jest dostosowalna do różnych typów komórek, jednak przydatność testów mechanicznych może różnić się w zależności od źródła komórek.
- Właściwości mechaniczne zależą od parametrów hodowli, co może ograniczać bezpośrednią translację na wszystkie typy tkanek.
