Name: Analizy morfometryczne przekrojów siatkówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Poznaj trzy metody morfometrycznej analizy siatkówki: pomiar grubości warstwy jądrowej wewnętrznej, kwantyfikację i pomiar wielkości komórek zwojowych siatkówki. Techniki te umożliwiają badanie chorób siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Prace nad badaniami nad okiem w tym laboratorium są wspierane przez American Health Assistant Foundation, Azalea (1972) Endowment Fund oraz HKU Small Project Fund (20097176185).

1. Narzędzia
Mikroskop, Nikon
Stereo Investigator, MBF Bioscience – MicroBrightField, Inc.
2. Przygotowanie
<ol>
 <li>Przed przystąpieniem do jakiejkolwiek analizy morfometrycznej każda próbka siatkówki jest cięta na skrawki o grubości 4 µm i poddawana barwieniu H&amp;E.</li>
 <li>Skrawki siatkówki dzieli się na 4 obszary: górny obszar obwodowy, górny obszar centralny, dolny obszar obwodowy oraz dolny obszar centralny.</li>
 <li>Po zdefiniowaniu obszarów wykonuje się obraz każdego z nich przy powiększeniu 10x40 za pomocą mikroskopu światła przechodzącego marki Nikon.</li>
 <li>W tym momencie można przystąpić do analizy morfometrii siatkówki.</li>
</ol>
3. Pomiar grubości INL
<ol>
 <li>W każdym regionie wykonano cztery pomiary grubości INL. Należy narysować cztery linie prostopadłe od linii bazowej konturu do zewnętrznej granicy INL.</li>
 <li>Uruchom oprogramowanie Stereo Investigator i wybierz obiektyw 40x z głównego paska narzędzi.</li>
 <li>W karcie „File” wybierz opcję „Image Open”. Wybierz obraz pożądanego obszaru siatkówki, który chcesz poddać analizie.</li>
 <li>Wybierz typ linii konturowej z listy rozwijanej na głównym pasku narzędzi i naciśnij przycisk „Auto Move”.</li>
 <li>Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie obrysowywania i wybierz opcję „Simple Click Tracing”.</li>
 <li>Narysuj linię konturową wzdłuż wewnętrznej granicy INL.</li>
 <li>Po zakończeniu rysowania kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie obrysowywania i wybierz „End Open Contour”.</li>
 <li>Wybierz marker na pasku narzędzi markerów i dodaj markery w punktach styku.</li>
 <li>Po dodaniu wszystkich markerów odznacz ikonę markera na pasku narzędzi markerów.</li>
 <li>Ustaw kursor w centrum jednego z markerów.</li>
</ol>
 <img src="/files/ftp_upload/3377/3377fig1.jpg" alt="Analiza równowagi statycznej; obraz mikroskopowy z kursorem; mapowanie struktury komórki; narzędzie badawcze." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1">
 <ol start="11">
 <li>Wybierz opcję „Quick Measure Angle” w zakładce „Tools”.</li>
 </ol>
 <img src="/files/ftp_upload/3377/3377fig2.jpg" alt="Interfejs mikroskopowy przedstawiający pomiar kąta w oprogramowaniu do analizy obrazów histologicznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2">
 <ol start="12">
 <li>Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie śledzenia i odznacz opcję „Continuous”.</li>
 <li>Zmierz kąt, klikając najpierw w centrum markera, który znajduje się obok markera wybranego jako koniec odcinka linii.</li>
</ol>
 <img src="/files/ftp_upload/3377/3377fig3.jpg" alt="Analiza histologiczna, obraz mikroskopowy, interfejs oprogramowania, pomiar komórek, patologia cyfrowa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3">
 <ol start="14">
 <li>Następnie przenieś kursor na środek odpowiedniego markera i kliknij ponownie.</li>
 <li>Przeciągnij linię pomocniczą do zewnętrznej granicy INL.</li>
 <li>Dostosuj kąt, aż zostanie osiągnięta wartość 90°.</li>
</ol>
 <img src="/files/ftp_upload/3377/3377fig4.jpg" alt="Analiza obrazów mikroskopowych, pomiar neuronów, Stereo Investigator, obliczanie stopni, narzędzie badawcze." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4">
 <ol start="17">
 <li>Kliknij lewym przyciskiem myszy w żądanym położeniu. Bezpośrednio po kliknięciu pojawi się okno dialogowe z pomiarem kąta.</li>
 <li>Naciśnij klawisz „Enter”, trzymając mysz w bezruchu.</li>
</ol>
 <img src="/files/ftp_upload/3377/3377fig5.jpg" alt="Analiza preparatów histologicznych przy użyciu oprogramowania do mikroskopii cyfrowej, przedstawiająca proces pomiarów stereologicznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5">
 <ol start="19">
 <li>Kliknij lewym przyciskiem myszy w oknie śledzenia, aby narysować linię od jednego końca do nowo wybranego końca.</li>
 <li>Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie śledzenia i wybierz opcję „End Open Contour”.</li>
</ol>
 <img src="/files/ftp_upload/3377/3377fig6.jpg" alt="Analiza obrazów mikroskopowych, oprogramowanie Stereo Investigator, ilustracja obrysowywania konturów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6">
 <ol start="21">
 <li>Narysuj pozostałe linie w różnych pozycjach w dokładnie taki sam sposób, jak opisano wcześniej.</li>
 <li>Po narysowaniu wszystkich linii wybierz tryb edycji (Editing mode) i odpowiednio zmień nazwy 4 segmentów linii.</li>
 <li>Cztery pomiary można uzyskać, naciskając przycisk „Contour Measurement”.</li>
 <li>Wybierz te 4 pomiary i wklej je do arkusza kalkulacyjnego, klikając „Copy to Clipboard”.</li>
 <li>Wybierz „Save As” w zakładce „File”. Dane obrysowania można zapisać jako plik danych.</li>
</ol>
4. Ilościowe określanie liczby RGC
<ol>
 <li>Wybierz opcję „Image Open” w karcie „File”. Wybierz obraz pożądanego obszaru siatkówki, który chcesz przeanalizować. </li>
 <li>Wybierz typ linii konturowej z listy rozwijanej na głównym pasku narzędzi. </li>
 <li> Narysuj linię konturową wzdłuż krawędzi warstwy włókien nerwowych (NFL). </li>
 <li>Zakończ obrysowanie za pomocą opcji „End Open Contour”. </li>
 <li>Na każdym końcu dodaj jeden marker na końcówce linii i drugi w pozycji blisko końcówki. </li>
 <li>Odznacz ikonę markera na pasku narzędzi markerów. </li>
 <li>Ustaw kursor w centrum markerów znajdujących się na końcówce. </li>
 <li>Wybierz „Quick Measure Angle” w karcie „Tools”. </li>
 <li>Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie obrysowywania i odznacz opcję „Continuous”. </li>
 <li>Dostosuj linie pomocnicze i zmierz kąt 90°. </li>
 <li>Po wyświetleniu okna dialogowego naciśnij klawisz „Enter”. </li>
 <li>Kliknij lewym przyciskiem myszy w oknie obrysowywania, aby nowa linia mogła zostać przedłużona prostopadle od końcówki. </li>
 <li>Narysuj kolejną nową linię w dokładnie ten sam sposób na drugim końcu. </li>
 <li>Powstają dwie granice, w obrębie których zlicza się liczbę RGC. </li>
 <li>Wybierz jedną granicę jako linię wykluczającą, przy której komórki stykające się z nią nie są liczone. </li>
 <li>Wybierz jeden typ markera i przypisz go do każdej żywej komórki. </li>
 <li>Wybierz inny typ markera dla komórek martwych. </li>
 <li> Liczba umieszczonych markerów każdego typu zostanie wyświetlona odpowiednio obok ikony markera na pasku narzędzi markerów. </li>
 <li> Wybierz tryb edycji i zaznacz linię bazową konturu. Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie obrysowywania i zmień nazwę linii. </li>
 <li> Długość linii bazowej konturu można uzyskać, naciskając przycisk „Contour Measurement”. </li>
 <li> Liczba komórek może następnie zostać wyrażona na mm długości. </li>
 <li> Wybierz „Save As” w karcie „File”. Obrys i dane markerów można zapisać jako plik danych. </li>
</ol>
 5. Pomiar rozmiaru komórki RGC
<ol>
 <li>Wybierz „Image Open” w karcie „File”. Wybierz obraz pożądanego obszaru siatkówki, który chcesz przeanalizować. </li>
 <li>Przybliż obraz żywej komórki i wybierz typ linii konturu z listy rozwijanej na głównym pasku narzędzi. </li>
 <li>Narysuj linię konturu wzdłuż obwodu komórki. </li>
 <li>Pod koniec rysowania kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie śledzenia i wybierz „End close contour”. </li>
 <li>Pole powierzchni komórki zostanie wyświetlone w polu Area w dialogowym oknie Contour Measurement. </li>
</ol>

<ol><li>Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Methyl-D-Aspartate+%28NMDA%29%C3%A2%E2%82%AC%E2%80%9CInduced+Apoptosis+in+Rat+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">N-Methyl-D-Aspartate (NMDA)â€“Induced Apoptosis in Rat Retina.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40, 2391-2397 (1999).</li>
<li>Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+caspases+after+ischemia-reperfusion+injury+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and caspases after ischemia-reperfusion injury in rat retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 967-975 (1999).</li>
<li>Luo, X. G., Chiu, K., Lau, H. S., Lee, V. W. H., Yung, K. K. L., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Selective+Vulnerability+of+Retinal+Ganglion+Cells+in+Rat+Chronic+Ocular+Hypertension+Model+at+Early+Phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The Selective Vulnerability of Retinal Ganglion Cells in Rat Chronic Ocular Hypertension Model at Early Phase.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (8), 1143-1151 (2009).</li>
<li>Han, Y. S., Chung, I. Y., Park, J. M., Yu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+citicoline+on+retinal+cell+damage+induced+by+kainic+acid+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of citicoline on retinal cell damage induced by kainic acid in rats.</a> Korean J. Ophthalmol. 19, 219-226 (2005).</li>
<li>Hernandez, M., Urcola, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+neuroprotection+in+a+rat+model+of+glaucoma+following+brimonidine%2C+latanoprost+or+combined+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell neuroprotection in a rat model of glaucoma following brimonidine, latanoprost or combined treatments.</a> Exp. Eye Res. 86, 798-806 (2008).</li>
<li>Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+Lycium+barbarum+Lynn+on+protecting+retinal+ganglion+cells+in+an+ocular+hypertension+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma.</a> Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

1. Jak uzyskać dokładniejszy pomiar grubości?
Obraz można powiększyć, klikając przycisk „Zoom in”, a następnie klikając lewym przyciskiem myszy w oknie kreślenia. Granica INL jest wyraźnie widoczna. Jeśli koniec linii nie znajduje się na zewnętrznej granicy INL, można ją skorygować w trybie edycji (Editing mode). Po wybraniu odpowiedniej linii należy kliknąć prawym przyciskiem myszy w oknie kreślenia i wybrać opcję „Insert Point in Selected Contour”. Punkt może zostać dodany na zewnętrznej grani...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3377">Morphometric Analyses of Retinal Sections</a>. There was an error with an author's name.

Erratum: Morphometric Analyses of Retinal Sections

<table><tbody><tr><td>Stereowy investigator</td><td></td><td>Mikroskopia w jasnym polu</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td>Olympus Corporation</td><td>BX51</td></tr></tbody></table>

analizy morfometryczne przekrojów siatkówki

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Analizy morfometryczne przekrojów siatkówki są wykorzystywane w badaniu chorób siatkówki. Na przykład stwierdzono znaczną utratę komórek neuronalnych w warstwie komórek zwojowych siatkówki (RGCL) w modelach szczurzych z ekscytotoksycznością indukowaną N-metylo-D-asparaginianem (NMDA)1, urazami niedokrwienno-reperfozyjnymi siatkówki2 oraz jaskrą3. Zmniejszenie grubości warstwy wewnętrznej splotowej (INL) i warstwy splotowej wewnętrznej (IPL) zostało odwrócone dzięki leczeniu cytykoliną w oczach szczurów poddanych ekscytotoksyczności glutaminianowej wywołanej kwasem kianowym4. Zmiany gęstości RGC oraz rozmiarów somy zaobserwowano przy różnych terapiach farmakologicznych w oczach z podwyższonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym3,5,6. Zatem posiadanie obiektywnych metod analizy morfometrii siatkówki może mieć duże znaczenie w ocenie patologii siatkówki oraz skuteczności strategii terapeutycznych.
Struktura siatkówki jest wielowarstwowa i występuje w niej kilka różnych rodzajów neuronów. Parametry morfometryczne siatkówki, takie jak liczba komórek, ich wielkość i grubość poszczególnych warstw, są bardziej złożone niż w systemach hodowli komórkowych. Wcześniej parametry te można było wykrywać przy użyciu innych komercyjnych programów do obrazowania. Otrzymywane wartości miały zazwyczaj charakter względny, a ich zamiana na wartości bezwzględne wymagała dalszych precyzyjnych obliczeń. Ponadto obrysowywanie wielkości i morfologii komórek mogło nie być wystarczająco dokładne i czułe dla analizy statystycznej, szczególnie w modelu przewlekłego jaskry. Pomiary zastosowane w niniejszym protokole zapewniają bardziej precyzyjną i prostą metodę. Bezwzględna długość linii oraz wielkość komórek mogą być raportowane bezpośrednio i łatwo kopiowane do innych plików. Na przykład obrysowaliśmy krawędzie najbardziej wewnętrznych i zewnętrznych jąder w warstwie INL, tworząc linię, a następnie użyliśmy oprogramowania do wykreślenia kąta 90 stopni w celu pomiaru grubości. Bez pomocy oprogramowania linia mogłaby być skośna, a zmiany grubości siatkówki mogłyby nie być powtarzalne między poszczególnymi obserwatorami. Dodatkowo można określić liczbę i gęstość RGCs. Niniejszy protokół skutecznie zmniejsza zmienność w ilościowym określaniu cech siatkówki oraz zwiększa czułość w wykrywaniu minimalnych zmian.
	W niniejszym materiale wideo zaprezentowano trzy rodzaje analiz morfometrycznych przekrojów siatkówki. Obejmują one pomiar grubości INL, kwantyfikację liczby RGC oraz pomiar bezwzględnej wielkości RGC. Te trzy analizy są przeprowadzane przy użyciu oprogramowania Stereo Investigator (MBF Bioscience — MicroBrightField, Inc.). Technika ta stanowi prostą, a zarazem naukową platformę do przeprowadzania analiz morfometrycznych.

Niniejszy film prezentuje trzy rodzaje analiz morfometrycznych siatkówki, obejmujące pomiar grubości wewnętrznej warstwy jądrowej, określenie liczby komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz pomiar wielkości RGCs. Technika ta może stanowić prostą, a zarazem naukową platformę do przeprowadzania analiz morfometrycznych.

Analizy morfometryczne przekrojów siatkówki

Analizy morfometryczne przekrojów siatkówki stosowano w badaniu chorób siatkówki. Przykładowo, stwierdzono istotną utratę komórek neuronalnych w ...

Witajcie, nazywam się Regina i pracuję w laboratorium chorób neurodegeneracyjnych w Katedrze Anatomii na Uniwersytecie w Hongkongu. Dzisiaj pokażę Państwu, jak przeprowadzić analizę progresji przekrojów siatkówki. Zanim przejdziemy do analizy, przekroje próbek siatkówki zostały przygotowane w czterech grupach i poddane barwieniu H&amp;E.Następnie sesję siatkówki podzielono na cztery obszary. Są to: górny obszar obwodowy, górny obszar centralny, dolny obszar centralny oraz dolny obszar obwodowy. Po zdefiniowaniu obszarów, obraz każdego z nich został wykonany przy powiększeniu 10x40 przy użyciu mikroskopu z jasnym polem marki decor.Jesteśmy teraz gotowi do analizy informacji morfologicznych siatkówki. W tej sesji zostanie zaprezentowany sposób pomiaru grubości warstwy ziarnistej wewnętrznej siatkówki. Otwórz oprogramowanie o nazwie thorough investigator.Wybierz 40 typów, a następnie z głównego paska narzędzi wybierz opcję otwierania obrazu. W karcie plik wybierz obraz pożądanego obszaru siatkówki, który chcesz przeanalizować. Z menu rozwijanego na głównym pasku narzędzi wybierz typ linii konturowej.Upewnij się, że funkcja automatycznego przesuwania jest włączona. Możesz powiększyć obraz,

morphometric-analyses-of-retinal-sections

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Nieludzkie naczelne są istotnym gatunkiem translacyjnym dla naszego zrozumienia rozwoju i starzenia się. Organizacja anatomiczna siatkówki naczelnych może dostarczyć ważnych informacji na temat stanów prawidłowych i patologicznych u ludzi.

Brama do mózgu: sekcja oka naczelnych

Siatkówka wykazuje wyraźne podobieństwa do mózgu, a zatem stanowi unikalne okno do nieinwazyjnego badania układu naczyniowego i struktury neuronalnej w mózgu. Protokół ten opisuje metodę badania demencji przy użyciu technik obrazowania siatkówki. Ta metoda może potencjalnie pomóc w diagnozie i ocenie ryzyka demencji.

Wykorzystanie obrazowania siatkówki do badania demencji

Ludzka siatkówka składa się z funkcjonalnie i molekularnie odrębnych regionów, w tym dołka, plamki żółtej i siatkówki obwodowej. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą biopsje stemplowe i ręczne usuwanie warstw tkanek z ludzkiego oka w celu wypreparowania i zebrania tych odrębnych obszarów siatkówki do dalszej analizy proteomicznej.

Rozwarstwienie ludzkiej siatkówki i naczyniówki RPE w celu analizy proteomicznej

Tutaj opisujemy użycie optycznej koherentnej tomografii spektralnej (SD-OCT) do wizualizacji struktur siatkówki i oka in vivo w modelach zwyrodnienia siatkówki, jaskry, retinopatii cukrzycowej i krótkowzroczności.

Strukturalne oceny in vivo chorób oczu w modelach gryzoni przy użyciu optycznej koherentnej tomografii

Ten artykuł opisuje dobrze sprawdzony i powtarzalny test barwienia lektyny dla całego preparatu siatkówki Mount oraz protokoły wymagane do ilościowego pomiaru parametrów naczyniowych często zmienianych w retinopatiach proliferacyjnych i nieproliferacyjnych.

Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi

Tutaj opisujemy technikę obrazowania in vivo wykorzystującą optyczną koherentną tomografię ułatwiającą diagnozę i ilościowy pomiar retinopatii u myszy.

Zastosowanie optycznej koherentnej tomografii do mysiego modelu retinopatii

Opisujemy metodę skutecznego oddzielania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od siatkówki w ludzkich oczach i generowania całych płaskich komórek RPE/naczyniówki do analiz histologicznych i morfometrycznych RPE.

Wydajne i spójne generowanie płaskich nabłonków barwnikowych siatkówki/naczyniówki z ludzkich oczu do analizy histologicznej

Modele myszy mogą być użytecznymi narzędziami do badania biologii nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Ustalono, że u myszy może rozwinąć się szereg patologii RPE. W tym miejscu opisujemy protokół fenotypowania w celu wyjaśnienia i ilościowego określenia patologii RPE u myszy za pomocą światła, elektronów transmisyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Protokół oceny i ilościowego określenia patologii barwnikowego nabłonka siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem

Ten rękopis przedstawia protokół histologicznego przygotowania preparatów z gałek ocznych gryzoni. Dzięki proponowanej metodzie wewnętrzną siatkówkę można łatwo zobrazować i ocenić pod mikroskopem świetlnym. Procedura jest przedstawiona dla gałek ocznych myszy i szczurów.

Przygotowanie i analiza preparatów histologicznych gałek ocznych szczurów i myszy w celu oceny siatkówki

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Poznaj trzy metody morfometrycznej analizy siatkówki: pomiar grubości warstwy jądrowej wewnętrznej, kwantyfikację i pomiar wielkości komórek zwojowych siatkówki. Techniki te umożliwiają badanie chorób siatkówki.

Analizy morfometryczne przekrojów siatkówki

Przeglądaj więcej filmów