Name: Wykorzystanie przystępnych cenowo matryc LED do fotostymulacji neuronów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Poznaj metodę fotostymulacji neuronów za pomocą przystępnych cenowo matryc LED w preparatach mózgu. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę aktywności neuronów nowo powstałych u dorosłych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez firmę ubezpieczeniową na życie „AG2R-La-Mondiale”, Ecole des Neurosciences de Paris (ENP), Agence Nationale de la Recherche „ANR-09-NEUR-004” w ramach „ERA-NET NEURON” programu FP7 Komisji Europejskiej oraz Fundację Pasteura. Sebastien Wagner otrzymał wsparcie z Fundacji Letten.

1. Kalibracja optyczna: Pomiar mocy diod LED
<ol>
	<li>Przymocuj matrycę LED do radiatora aktywnie chłodzonego wentylatorem, a następnie połącz ten zestaw LED/radiator z soczewką kolimującą.</li>
	<li>Zastąp lampę używaną w oświetleniu w jasnym polu zestawem LED/radiator/wentylator/soczewka. Aparaturę tę należy starannie ustawić tak, aby skolimowana wiązka LED biegła wzdłuż prostej ścieżki optycznej w stronę soczewki kondensora. Upewnij się, że radiator/wentylator jest prawidłowo uziemiony do wspólnej masy systemu.</li>
	<li>Zasilaj matrycę LED za pomocą zasilacza zdolnego do generowania szybkich, prostokątnych impulsów prądu. Zasilacz ten może być sterowany impulsem 5V TTL pochodzącym z generatora impulsów.</li>
	<li>Wycentruj skolimowaną wiązkę wzdłuż ścieżki świetlnej zdefiniowanej pomiędzy przysłoną pola a soczewką kondensora. W idealnym przypadku wiązka LED powinna lekko przekraczać obszar w pełni otwartej przysłony pola. Zazwyczaj silniej skolimowana wiązka LED wypełnia tę aperturę w mniejszym stopniu i generuje większą moc kosztem jednorodności. W naszej konfiguracji zwiększyliśmy jednorodność światła, wybierając soczewkę kolimującą, która rzutowała lekko powiększony obraz matrycy LED na jej płaszczyznę sprzężoną przy przysłonie kondensora.</li>
	<li>Uzyskaj oświetlenie Koehlera, ustawiając ostrość kondensora tak, aby obraz przysłony pola (przysłony położonej najbliżej źródła światła) był ogniskowany na komorze z plastrem (rys. 1). Cienki arkusz papieru do soczewek może służyć jako ekran projekcyjny do wizualizacji ogniskowanego obrazu przysłony pola na innych głębokościach.</li>
	<li>Wywierć w nieprzezroczystym materiale serię otworów zwanych pinholes o znanej średnicy. Umieść jeden z tych małych otworów nad sensorem optycznego watomierza. Umieść watomierz na stoliku z preparatem i wycentruj go nad ogniskowanym obrazem przysłony pola, przesuwając urządzenie do momentu uzyskania maksymalnego odczytu. Przymocuj watomierz w tej pozycji.</li>
	<li>W pełni otwórz wszystkie apertury (przysłonę apertury i przysłonę pola). Systematycznie przesuwaj przymocowaną komorę z plastrem/watomierz względem optycznej ścieżki światła i oblicz jednorodność mocy optycznej w obrębie obszaru oświetlonego. Sporządź wykres jednorodności dla swojego systemu. Jeśli mikroskop jest prawidłowo ustawiony z oświetleniem Koehlera wycentrowanym w ognisku obiektywu, maksymalna moc powinna znajdować się bezpośrednio pod obiektywem, a obszary poza tym ogniskiem powinny otrzymywać znaną ilość mocy zgodnie z wykresem jednorodności.</li>
	<li>Dla każdego rozmiaru otworu sporządź krzywą wzorcową mocy optycznej w funkcji powierzchni otworu. Regulując prąd wejściowy matrycy LED, wygeneruj tę krzywą dla wielu poziomów mocy, a z każdej krzywej oblicz moc na mm2. Jeśli matryca LED ma być używana do oświetlenia podczas patchingu, upewnij się, że wprowadziłeś elementy optyczne niezbędne do patchingu (kondensory, otwory pinhole i filtry), aby wiedzieć, ile światła jest transmitowane podczas oświetlenia patchingu.</li>
	<li>Odwracając watomierz w stronę obiektywu, oblicz natężenie oświetlenia przy 470nm po włączeniu lampy rtęciowej.</li>
	<li>Włóż żywy plaster do komory i ponownie sporządź krzywe wzorcowe, aby określić moc światła transmitowaną przez rozpraszającą tkankę mózgową.</li>
</ol>
2. Procedura krojenia i elektrofizjologia
Część A: Przygotowanie skrawków
<ol>
	<li>Zanurz mysz w narkozie (60 mg/kg ketaminy i 2 mg/kg ksylazyny), a następnie dokonaj dekapitacji. Wypreparuj mózg w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF, w mM: 124 NaCl, 3 KCl, 1,3 MgSO4, 26 NaHCO3, 1,25 NaHPO4, 20 glukozy, 2 CaCl2; ~310 mOsm, pH 7,4 podczas napowietrzania mieszaniną 95% O2 i 5% CO25,1), dbając o to, aby nie uszkodzić opuszek węchowych. Rozdziel obie półkule i umieść je na agarze tak, aby powierzchnia brzuszna była wyrównana z krawędzią (w przypadku przekrojów poziomych).</li>
	<li>Przyklej agar oraz powierzchnię grzbietową każdej półkuli kory do uchwytu wibratomu i powoli napełnij wannę lodowatym ACSF. Wykonuj przekroje od strony brzusznej o grubości 300 μm, przenosząc każdy przekrój do ogrzanego (34-36°C) i napowietrzonego ACSF, aby umożliwić im regenerację przez 30-45 minut.</li>
</ol>
Część B: Pomiar progu wyzwalania potencjału czynnościowego metodą loose-patch
<ol start="3">
	<li>Po pozostawieniu plastrów w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie umieść plaster w komorze rejestracyjnej mikroskopu przy stałej perfuzji natlenionym ACSF. 
	Aby uniknąć nadmiernej stymulacji neuronów zakażonych ChR2, obecność EYFP-ChR2 można potwierdzić w trybie epifluorescencji (ryc. 2a)</li>
	<li>Wytwórz szklane elektrody za pomocą wyciągarki do pipet (Sutter P-97). Napełnij elektrodę ACSF. Po umieszczeniu w kąpieli ACSF rezystancja końcówki powinna wynosić od 7-10 MOhms.</li>
	<li>W oświetleniu fluorescencyjnym zlokalizuj w plastrze zdrowy neuron ChR2-EYFP o dojrzałej morfologii. Zlokalizuj również somę tego neuronu w optyce do patch-clampu.</li>
	<li>Podając lekkie nadciśnienie przez końcówkę elektrody, opuść elektrodę patch w kierunku zidentyfikowanego fluorescencyjnego neuronu. W momencie kontaktu z błoną szybko zwolnij nadciśnienie i zastosuj krótkie, niewielkie podciśnienie przez końcówkę. Pomiędzy błoną plazmatyczną a ściankami elektrody patch powinno wytworzyć się uszczelnienie gigaohmowe (giga-seal).</li>
	<li>Nawet jeśli nie powstanie giga-seal, jeżeli elektroda znajduje się wystarczająco blisko fluorescencyjnego neuronu, aktywność impulsacyjna powinna wywołać mierzalny lokalny potencjał polowy. Aktywuj ChR2 w tym neuronie, stosując błyski światła o różnych dawkach. Ponieważ dawka światła jest funkcją zarówno mocy LED, jak i czasu trwania, oblicz, ile światła jest niezbędne do wywołania potencjału czynnościowego przy różnych mocach i czasach trwania (ryc. 2b). Obserwuj również intensywność impulsowania podczas oświetlania lampą rtęciową.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki: 
W naszym mikroskopie (Olympus BX51WI) dioda LED znajduje się w jednej linii z dwiema przysłonami i soczewką kondensora, co pozwala zachować oryginalną drogę światła zamontowanej fabrycznie lampy łukowej. Poprzez zamknięcie zarówno przysłony polowej, jak i przysłony apertury, możemy uzyskać kontrast pola jasnego wystarczający do rejestracji patch-clamp (rys. 1b). Przy całkowicie otwartych przysłonach wystawiamy skrawek na maksymalną moc światła w celu aktywacji channelropsyny (rys. 1a). W naszym mikroskopie taka konfiguracja patchingu generuje gęstość światła o około trzy rzędy wielkości niższą niż maksymalna gęstość pełnego pola (4.1 μW/mm2 w porównaniu do 6.88 mW/mm2).
Obserwujemy silne znakowanie nowo powstałych w dorosłym organizmie neuronów ziarnistych i periglomerularnych opuszki węchowej kilka tygodni po infekcji lentiwirusowej migrujących neuroblastów w rostralnym strumieniu migracyjnym (ryc. 2a). Rejestracja metodą loose-patch z pojedynczej, nowo powstałej w dorosłym organizmie komórki ziarnistej wykazującej ekspresję ChR2-EYFP wskazuje, że stymulacja trwająca 5 ms przy maksymalnej mocy (6,88 mW/mm2) jest wystarczająca do wywołania potencjałów czynnościowych (ryc. 2b). Ponieważ poziom ekspresji różni się między komórkami, ilość światła przekraczająca próg generowania impulsu będzie zróżnicowana i powinna zostać opisana statystycznie dla każdego badanego typu komórek.
<img src="/files/ftp_upload/3379/3379fig1.jpg" alt="Schemat układu mikroskopowego przedstawiający drogę światła przez system soczewek do analizy optycznej i porównania." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Układ matrycy LED do pełnopolowej fotostymulacji i elektrofizjologii plastrów metodą patch-clamp. Aby aktywować channelrodozynę (ChR2), rzutujemy skolimowany promień przez otwarte przysłony tylne i optykę kondensora (a). Konfigurację tę można zmienić w optykę do patchowania o wysokim kontraście poprzez całkowite zamknięcie przysłony pola i modulację szerokości przysłony pola (b). Skróty: a. wentylator, b. radiator, c. matryca LED, d. soczewka kolimująca, e. lustro, f. przysłona pola, g. przysłona apertury, h. soczewka kondensora, i. stolik z próbką, j. obiektyw.
<img src="/files/ftp_upload/3379/3379fig2.jpg" alt="Obraz z mikroskopii konfokalnej, wyniki elektrofizjologiczne; odpowiedź neuronalna, analiza fluorescencji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Obraz poziomego skrawka cebulki węchowej o grubości 300μm do rejestracji patch-clamp i fotostymulacji całopolowej (a). Widoczne są zainfekowane lentiwirusowo komórki ziarniste powstałe w wieku dorosłym, wykazujące ekspresję ChR2-EYFP, promieniujące z centrum cebulki węchowej. Dawkę światła wymaganą do wywołania potencjałów czynnościowych można wyznaczyć, zwiększając czas trwania błysku diody LED (b). Próg dla tej komórki ziarnistej wynosił 5ms przy pełnej intensywności LED (2,43mW/mm2). Skala w (a) = 500μm, skala w (b) = 50ms.

<ol><li>Nissant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+promotes+synaptic+plasticity+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis promotes synaptic plasticity in the olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 12, 728-730 (2009).</li>
<li>Apicella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+Cells+in+Piriform+Cortex+Receive+Convergent+Input+from+Distinct+Olfactory+Bulb+Glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pyramidal Cells in Piriform Cortex Receive Convergent Input from Distinct Olfactory Bulb Glomeruli.</a> Journal of Neuroscience. 30, 14255-14260 (2010).</li>
<li>Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature. 8, 1263-1263 (2005).</li>
<li>Bardy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((where+new+inhibitory+neurons+release+neurotransmitters+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb.</a> The Journal of Neuroscience. 30, 17023-17034 (2010).</li>
<li>Grubb, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+of+the+first+synapse+in+olfaction%3A+development+and+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional maturation of the first synapse in olfaction: development and adult neurogenesis.</a> The Journal of neuroscience. 28, 2919-2932 (2008).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit-breakers%3A+optical+technologies+for+probing+neural+signals+and+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit-breakers: optical technologies for probing neural signals and systems.</a> Nature reviews. Neuroscience. 8, 577-581 (2007).</li>
<li>Grossman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-site+optical+excitation+using+ChR2+and+micro-LED+array%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neural+engineering%22%5BJournal%5D)">Multi-site optical excitation using ChR2 and micro-LED array.</a> Journal of neural engineering. 7, 16004-16004 (2010).</li>
<li>Dhawale, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-redundant+odor+coding+by+sister+mitral+cells+revealed+by+light+addressable+glomeruli+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Non-redundant odor coding by sister mitral cells revealed by light addressable glomeruli in the mouse.</a> Nature neuroscience. 13, 1404-1412 (2010).</li>
<li>Weick, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+control+of+transplantable+human+ESC-derived+neurons+via+optogenetic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Functional control of transplantable human ESC-derived neurons via optogenetic targeting.</a> Stem cells. 28, 2008-2016 (2010).</li>
<li>Toni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+born+in+the+adult+dentate+gyrus+form+functional+synapses+with+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurons born in the adult dentate gyrus form functional synapses with target cells.</a> Nature Neuroscience. 11, 901-907 (2008).</li>
<li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2+Localised+to+the+Axon+Initial+Segment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2 Localised to the Axon Initial Segment.</a> PLoS ONE. 5, e13761-e13761 Forthcoming.</li>
<li>Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+circuitry+mediating+reversible+and+bidirectional+control+of+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety.</a> Nature. 471, 358-362 (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W ostatnich latach nastąpił gwałtowny wzrost popularności narzędzi optogenetycznych w badaniach nad neuronauką6. W związku z tym coraz ważniejsze staje się obniżenie bariery wejścia dla laboratoriów pragnących rozpocząć korzystanie z tych nowych narzędzi. W niniejszej pracy opisujemy, jak przeprowadzić prostą i niskokosztową modernizację oraz kalibrację konwencjonalnego zestawu do techniki patch-clamp, aby umożliwić pełnopolową stymulację optyczną neuronów wykazujących ekspresję channelrhodopsyny. W szczególno...

<table><tbody><tr><td>Ketamina</td><td>Imalg&amp;#232;ne 1000</td><td></td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Rompun</td><td></td><td>2%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>&amp;amp;nbps;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaHPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Wytwornica pipet</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>P-97</td></tr><tr><td>Kapilary szklane</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC150T-10</td><td>1,5 mm O.D./1,17 mm I.D.</td></tr><tr><td>Matryca LED</td><td>Bridgelux</td><td>BXRA-C2000</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka kolimująca</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>LEDC1</td><td>średnica wiązki 40 mm</td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>A1W Electronik</td><td>HKO2800</td><td>2,8 A</td></tr><tr><td>Optyczny miernik mocy</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PM 100</td><td></td></tr><tr><td>Radiator</td><td>Thermaltake</td><td>A1838</td><td>Silent Boost K8</td></tr><tr><td>Wentylator</td><td>Thermaltake</td><td>A1838</td><td>Silent Boost K8</td></tr><tr><td>Wibratom</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie przystępnych cenowo mat led do fotostymulacji neuronów

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Standardowa elektrofizjologia preparatów skrawkowych pozwoliła badaczom na analizę poszczególnych komponentów obwodów neuronalnych poprzez rejestrację odpowiedzi elektrycznych pojedynczych komórek w odpowiedzi na manipulacje elektryczne lub farmakologiczne1,2. Dzięki opracowaniu metod optycznej kontroli genetycznie ukierunkowanych neuronów (optogenetyka), badacze dysponują obecnie bezprecedensowym poziomem kontroli nad konkretnymi grupami neuronów w standardowym preparacie skrawkowym. W szczególności światłoczuła kanałorodopsyna-2 (ChR2) umożliwia aktywację neuronów za pomocą światła3,4. Łącząc staranną kalibrację fotostymulacji ChR2 opartej na diodach LED ze standardową elektrofizjologią skrawków, jesteśmy w stanie z większą szczegółowością zbadać rolę interneuronów powstałych w wieku dorosłym w opuszce węchowej, która stanowi pierwszy centralny przekaźnik systemu węchowego. Wykorzystując ekspresję wirusową ChR2-YFP specyficznie w neuronach powstałych w wieku dorosłym, możemy selektywnie kontrolować młode neurony powstałe w wieku dorosłym w otoczeniu neuronów starszych i dojrzałych. Nasza kontrola optyczna wykorzystuje prosty i niedrogi system LED; pokazujemy, w jaki sposób system ten można skalibrować, aby określić ilość światła niezbędną do wywołania aktywności impulsowej w pojedynczych neuronach. W ten sposób krótkie błyski niebieskiego światła mogą zdalnie sterować wzorcem wyładowań nowo powstałych komórek transdukowanych ChR2.

Neurony powstałe w wieku dorosłym wykazujące ekspresję ChR2 mogą być manipulowane w preparatach elektrofizjologicznych w plastrach tkankowych w celu zbadania ich wkładu w funkcjonowanie węchowych obwodów neuronalnych.

Wykorzystanie przystępnych cenowo mat LED do fotostymulacji neuronów

Standardowa elektrofizjologia preparatów slice pozwoliła badaczom na analizę poszczególnych elementów obwodów neuronalnych poprzez rejestrację odpowiedzi elektrycznych pojedynczych ...

Celem niniejszej procedury jest przygotowanie i zdalne sterowanie macierzami LED w celu kontrolowania aktywności neuronalnej w skrawkach mózgu. Jest to realizowane z wykorzystaniem skrawków in vitro od zwierząt z neuronami wykazującymi ekspresję kanału REDSIN two oraz macierzy LED współpracującej z mikroskopem w celu aktywacji tych neuronów. Niniejszy film opisuje sposób kalibracji diody LED i mikroskopu, aby dostarczyć znane natężenia światła do komory ze skrawkiem.Dzięki tej konfiguracji można precyzyjnie zmierzyć progi aktywacji neuronów wykazujących ekspresję kanału drugiego w odpowiedzi na stymulację światłem poprzez stymulację szerokopolową neuronów wykazujących ekspresję opsyny kanału drugiego. Technika ta umożliwia czasowo precyzyjną kontrolę optyczną dużej populacji neuronów. Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi metodami optogenetycznymi, w tym tymi wykorzystującymi lasery lub metody oparte na migawkach, jest jej niska cena oraz możliwość łatwego dostosowania do istniejącego mikroskopu do techniki patch clamp.Niniejsza metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurogenezy u osobników dorosłych, w tym na pytanie, w jaki sposób aktywność wpływa na integrację nowych neuronów w dorosłym mózgu. Zastosowania tej techniki obejmują terapie lub diagnostykę opartą na dorosłych neuralnych komórkach macierzystych, ponieważ oferuje ona precyzyjną kontrolę czasową nad aktywnością nowo powstałych neuronów integrujących się z istniejącymi obwodami neuronalnymi. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat funkcjonalnych następstw neurogenezy u osobników dorosłych, może być ona również stosowana w dowolnych preparatach in vitro.Zawierające neurony wykazujące adopcję kanałów. Rozpocznij od wyboru macierzy LED, która generuje moc szczytową przy pożądanej długości fali. Dodatkowo wybierz macierz o maksymalnym dopuszczalnym natężeniu prądu. Zintegruj macierz LED z mikroskopem.Zacznij od przymocowania matrycy LED do wentylatora pełniącego rolę radiatora, używając pasty termoprzewodzącej w celu zwiększenia efektywności radiatora. Następnie wyjmij fabryczną diodę LED o niskiej mocy z zespołu soczewki i zamocuj w jej miejsce diodę LED o wyższej mocy. Teraz zastąp lampę pola jasnego (Brightfield) zmontowanym zestawem LED, upewniając się, że wentylator jest bezpiecznie uziemiony do wspólnej szyny uziemiającej systemu.Wymagane jest dokładne ustawienie macierzy LED, aby upewnić się, że światło padające znajduje się w jednej linii z obiektywem. Celem jest uzyskanie oświetlenia Kohlera poprzez ustawienie ostrości kondensora w taki sposób, aby obraz przysłony polowej był ogniskowany na komorze z przekrojem i znajdował się w centrum optycznej ścieżki obiektywu. Cienka warstwa papieru soczewkowego może pomóc w ustawieniu ostrości obrazu apertury tylnej na innych głębokościach.Następnie należy wywiercić w nieprzezroczystym materiale otwory o znanych średnicach, które będą pełnić funkcję przysłony dla miernika mocy. Jeden z tych małych otworów należy umieścić nad czujnikiem optycznego miernika mocy. Następnie należy przymocować miernik mocy do mikroskopu, aby skupić kondensator na otworze.Ręcznie ustaw miernik mocy tak, aby wskazywał maksymalną wartość. Przymocuj miernik mocy w tej pozycji. Jeśli maksymalna wartość na mierniku mocy znajduje się powyżej płaszczyzny przekroju, ponownie ustaw oświetlenie Köhlera na wysokości tej płaszczyzny.Następnie całkowicie otwórz wszystkie apertury. Systematycznie przesuń miernik mocy względem optycznej drogi światła, korzystając z manipulatorów stolika. Po zakończeniu zmierz jednorodność mocy optycznej w obszarze oświetlenia, systematycznie odczytując wartości mocy w siatce wokół punktu maksymalnej mocy, który powinien znajdować się w ognisku obiektywu. Jeśli mikroskop jest prawidłowo ustawiony, a oświetlenie chłodziarki wycentrowane w ognisku obiektywu, maksymalna moc układu powinna znajdować się w tym ognisku; obszary poza ogniskiem powinny teraz otrzymywać znaną ilość mocy zgodnie z wykresem jednorodności.Następnie, mierząc maksymalną moc dla otworu każdego rozmiaru przy znanej średnicy użytego wiertła do wykonania każdego otworu, nanieś na wykres moc optyczną jako funkcję powierzchni otworu. Ponieważ wywiercone otwory nie są idealne, uśrednienie tych wartości pozwoli na uzyskanie dobrej oceny gęstości mocy optycznej. Matryca LED zostanie wykorzystana do wyrównywania optyki.Budując wykresy mocy i jednorodności, należy uwzględnić wszystkie elementy optyczne niezbędne do rejestracji potencjałów. Na przykład wiele mikroskopów posiada obrotowy ekran dyfuzyjny, którego użycie pozwala poprawić jednorodność kosztem mocy. Przygotuj skrawki tkanki mózgowej standardowymi metodami, a podczas 30–45 minutowej regeneracji skrawków w ogrzanym A CSF, przygotuj pipety do patch-clampu.Po regeneracji tkanek ostrożnie umieść przekrój w komorze rejestracyjnej mikroskopu, zapewniając stałą perfuzję natlenionym A CSF. Potwierdź obecność kanału EYFP redsin w dwóch kanałach za pomocą epi-fluorescencji pod oświetleniem fluorescencyjnym. Zlokalizuj w przekroju zdrowy neuron EYFP w kanale dwa o dojrzałej morfologii.Następnie zlokalizuj somę tego neuronu pod optyką do patch-clampu i wytwórz uszczelnienie gigaomowe między błoną plazmatyczną a ściankami elektrody patchowej. Jeśli elektroda jest wystarczająco blisko neuronu generującego potencjały czynnościowe, aktywność spontaniczna powinna wywołać mierzalny lokalny potencjał polowy nawet bez uszczelnienia gigaomowego. Teraz aktywuj kanały opsynowe w tym neuronie poprzez błyski światła o różnych dawkach; ponieważ dawka światła jest funkcją zarówno mocy diody LED, jak i czasu trwania impulsu, oblicz, ile światła jest niezbędne do wywołania potencjału czynnościowego przy różnych mocach i czasach trwania.Mikroskop Olympus BX 51 wi został skonfigurowany z diodą LED w linii z dwiema przysłonami i soczewką kondensatora. Odpowiedni kontrast w świetle przechodzącym do rejestracji patch clamp uzyskano poprzez zamknięcie zarówno diaphragm przysłony polowej, jak i diaphragm przysłony apertury. Wykreślono rozkład jednorodności natężenia światła LED w obszarze wokół pola widzenia obiektywu wskazanego przez przerywaną linię koła.Przy całkowicie otwartych przysłonach preparaty poddano działaniu maksymalnej mocy światła w celu aktywacji adoptiny w danym kanale. Ta konfiguracja generuje światło o trzy rzędy wielkości silniejsze niż konfiguracja stosowana do wizualizacji patch clamp. Szeroko zakrojone znakowanie nowo powstałych ziarnistych neuronów opuszki węchowej oraz neuronów periglomerularnych zaobserwowano cztery tygodnie po infekcji lentiwirusowej migrujących neuroblastów w rostralnym strumieniu migracyjnym.Rejestracje metodą loose patch z pojedynczego neuronu ziarnistego wykazującego ekspresję EYFP w kanale Adoptin wskazały, że w przypadku tego neuronu pięciomilisekundowa stymulacja przy maksymalnej mocy była wystarczająca do wywołania potencjałów czynnościowych. Po opanowaniu techniki tę można przeprowadzić w jedno popołudnie. Po wykonaniu tej procedury ważne jest, aby zawsze monitorować sprzęt i ustawienia pod kątem dryfu w czasie. Od momentu opracowania, tego typu techniki optogenetyczne utorowały drogę badaczom w dziedzinie neuronauki do eksploracji przekaźnictwa i integracji synaptycznej u szeregu organizmów modelowych, takich jak nicienie, muszki owocówki, myszy, a nawet naczelne.

using-affordable-led-arrays-for-photo-stimulation-of-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Korzystanie z przystępnych cenowo tablic LED do stymulacji fotonowo neuronów

Neurony powstałe w wieku dorosłym w opalfaktorycznej cebulce mogą być kontrolowane optogenetycznie poprzez wstrzyknięcie lentiwirusa wykazującego ekspresję Channelrhodopsin2 do przedniego strumienia migracyjnego oraz przewlekłą fotostymulację za pomocą wszczepionej miniaturowej diody LED.

Selektywna transdukcja wirusowa neuronów węchowych pochodzenia dorosłego w celu chronicznej optogenetycznej stymulacji in vivo

Ten film demonstruje procedurę analizy połączeń synaptycznych między przyśrodkową korą przedczołową (mPFC) a neuronami ciała migdałowatego za pomocą ostrych wycinków mózgu ciała migdałowatego od myszy. Neurony mPFC u tych myszy wyrażają rodopsynę kanałową połączoną z białkiem fluorescencyjnym. Rodopsyny kanałowe ułatwiają napływ jonów i generowanie potencjału czynnościowego w neuronach mPFC po aktywacji światłem. W konsekwencji neurony mPFC uwalniają neuroprzekaźniki, które wiążą się z...

Wizualizacja i mapowanie ścieżek neuronalnych w wycinku mózgu ciała migdałowatego

Niedawny rozwój narzędzi neuronauki, które łączą genetykę i optykę, określany jako "optogenetyka", umożliwia kontrolę nad aktywnością obwodów neuronowych z niespotykanym dotąd poziomem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół integracji zapisu in vivo z manipulacją optogenetyczną genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów przedczołowych korowych i podkostnych neuronów piramidowych.

Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo

Tutaj opisujemy naszą strategię uzyskiwania stabilnych, dobrze izolowanych pojedynczych nagrań jednostkowych ze zidentyfikowanych interneuronów hamujących w znieczulonej korze myszy. Neurony wyrażające ChR2 są identyfikowane na podstawie ich reakcji na niebieskie światło. Metoda wykorzystuje standardowy zewnątrzkomórkowy sprzęt rejestrujący i służy jako niedroga alternatywa dla obrazowania wapnia lub wizualnie sterowanego łatania.

Przewodnik po jednojednostkowym zapisie in vivo z optogenetycznie zidentyfikowanych korowych interneuronów hamujących

Opisano protokół generowania systemu kokulturowego składającego się z neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), pierwotnych neuronów korowych i astrocytów. Ten system kohodowli umożliwia wykrycie powstawania kontaktów i obwodów synaptycznych między nowymi neuronami pochodzącymi z iPSC a istniejącymi wcześniej neuronami korowymi wykazującymi ekspresję rodopsyny kanałowej-2.

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

Opisano metodę stymulacji aktywności elektrycznej kultur komórkowych in vitro za pomocą światła widzialnego, opartą na użyciu organicznych polimerów półprzewodnikowych.

Optyczna kontrola aktywności elektrycznej żywych komórek za pomocą sprzężonych polimerów

Tutaj przedstawiono procedurę selektywnej aktywacji białka neuronalnego za pomocą krótkiego impulsu światła poprzez genetyczne kodowanie fotoreaktywnego nienaturalnego aminokwasu do docelowego białka neuronalnego wyrażanego w neuronach w hodowli lub in vivo.

Optyczna kontrola białka neuronalnego za pomocą genetycznie kodowanego nienaturalnego aminokwasu w neuronach

W sercu, zdarzenia molekularne koordynują funkcję elektryczną i kurczliwą narządu. Zaprezentowany tu zestaw technik mikroskopii fluorescencyjnej pola lokalnego umożliwia rejestrację zmiennych komórkowych w nienaruszonych sercach. Identyfikacja mechanizmów definiujących czynność serca ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, jak serce działa w sytuacjach patologicznych.

Mikroskopia fluorescencyjna w polu lokalnym: obrazowanie sygnałów komórkowych w nienaruszonych sercach

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać eksperymenty optogenetyczne w celu kontrolowania ekspresji genów za pomocą światła czerwonego i dalekiego czerwonego przy użyciu PhyB i PIF3. W zestawie znajdują się instrukcje krok po kroku, jak zbudować prosty i elastyczny system oświetlenia, który umożliwia kontrolę ekspresji genów lub innej optogenetyki za pomocą komputera.

Budowa prostego i wszechstronnego systemu oświetlenia do eksperymentów optogenetycznych

Tutaj prezentujemy metodę wytwarzania systemu optycznego ze światłowodami do dostarczania światła i matrycą elektrod do rejestracji neuronowej. Eksperymenty in vivo na transgenicznych myszach z ekspresją rodopsyny-2 pokazują wykonalność systemu do jednoczesnej stymulacji optogenetycznej i zapisu elektrofizjologicznego.

Matryca optrodowa do jednoczesnej modulacji optogenetycznej i elektrycznego zapisu neuronowego

Ostatnie osiągnięcia w badaniach nad bólem podkreślają potencjał fotoneuromodulacji z wykorzystaniem zielonych diod elektroluminescencyjnych (GLED) jako metody leczenia niefarmakologicznego. GLED moduluje szlaki bólowe, oferując skuteczną ulgę w bólu. Niniejszy artykuł ma na celu standaryzację i udoskonalenie protokołów ekspozycji na GLED, poprawę spójności między badaniami i postęp w klinicznym zastosowaniu tej terapii.

Optymalizacja technik fotoneuromodulacji w celu oceny roli diod elektroluminescencyjnych w leczeniu bólu

Poznaj metodę fotostymulacji neuronów za pomocą przystępnych cenowo matryc LED w preparatach mózgu. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę aktywności neuronów nowo powstałych u dorosłych.

Wykorzystanie przystępnych cenowo mat LED do fotostymulacji neuronów

Przeglądaj więcej filmów