Wykorzystanie przystępnych cenowo matryc LED do fotostymulacji neuronów

Celem tej procedury jest przygotowanie i zdalna obsługa matryc LED do kontrolowania aktywności neuronalnej w wycinkach mózgu. Osiąga się to za pomocą wycinków in vitro od zwierząt z kanałem REDSIN dwóch neuronów eksprymujących oraz za pomocą matrycy LED w połączeniu z mikroskopem do aktywacji tych neuronów. Ten film pokazuje, jak skalibrować diodę LED i mikroskop, aby dostarczały znane natężenia światła do komory plastrów.

Dzięki tej konfiguracji progi aktywacji neuronów eksprymujących kanał drugi mogą być dokładnie mierzone w odpowiedzi na stymulację światłem poprzez stymulację szerokopolową neuronów eksprymujących opsynę kanału drugiego. Technika ta pozwala na tymczasową precyzyjną kontrolę optyczną dużej populacji neuronów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami optogenetycznymi, w tym tymi, które wykorzystują lasery lub metody oparte na migawkach, jest to, że jest bardzo tania i można ją łatwo dopasować do istniejącej lunety z zaciskiem krosowym.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurogenezy dorosłych, w tym w jaki sposób aktywność kształtuje integrację nowych neuronów w dorosłym mózgu. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapie lub diagnozy oparte na dorosłych nerwowych komórkach macierzystych, ponieważ oferuje precyzyjną kontrolę czasową nad aktywnością neuronów urodzonych u dorosłych, integrujących się z istniejącymi obwodami neuronalnymi. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat funkcjonalnych konsekwencji neurogenezy u dorosłych, można ją również przeprowadzić na dowolnym preparacie in vitro.

Zawieranie adopcji kanału wyrażającego neurony Zacznij od wybrania matrycy LED, która wytwarza swoją szczytową moc przy żądanej długości fali. Ponadto należy wybrać tablicę o maksymalnym prądzie znamionowym. Zintegruj matrycę LED z mikroskopem.

Zacznij od przymocowania matrycy LED do wentylatora zwanego radiatorem za pomocą pasty termicznej, aby zwiększyć skuteczność radiatora. Następnie wyjmij diodę LED o niskim poborze mocy z zespołu obiektywu i przymocuj diodę LED o większej mocy do obiektywu. Teraz wymień lampę Brightfield na zmontowane urządzenie LED i upewnij się, że wentylator jest bezpiecznie uziemiony do wspólnego uziemienia systemu.

Staranne rozmieszczenie matryc LED konieczne, aby upewnić się, że światło wywołane połączeniem jest zgodne z obiektywem. Cel. Osiągnij oświetlenie Kohlera, skupiając kondensor tak, aby obraz membrany polowej był skupiony na komorze warstwy i wyśrodkowany pod ścieżką optyczną obiektywu. Cienka tkanka papieru do soczewek może pomóc w ustawieniu ostrości obrazu tylnej przysłony na innych głębokościach.

Teraz wywierć otwory o znanych średnicach w nieprzezroczystym materiale, który może działać jako otwór dla miernika mocy. Umieść jeden z tych małych otworków nad czujnikiem miernika mocy optycznej. Następnie przymocuj miernik mocy do mikroskopu, aby ustawić ostrość kondensatora na otworku.

Ręcznie ustaw miernik mocy, aż da maksymalny odczyt. Zamocuj miernik mocy w tej pozycji. Jeśli maksimum miernika mocy znajduje się powyżej płaszczyzny przekroju, przywróć oświetlenie Kohlera na tej płaszczyźnie.

Następnie całkowicie otwórz wszystkie otwory. Systematycznie przesuwaj miernik mocy względem ścieżki światła optycznego za pomocą manipulatorów stolika. Po zakończeniu zmierz jednorodność mocy optycznej w oświetlanym obszarze, systematycznie wykonując odczyty mocy w siatce wokół maksymalnej mocy, która powinna leżeć pod ogniskiem obiektywu, Mikroskop jest prawidłowo ustawiony z chłodniejszym oświetleniem wyśrodkowanym na ognisku obiektywu, maksymalna moc matrycy powinna znajdować się w tym ognisku, obszary poza ogniskiem powinny teraz otrzymać znaną ilość mocy zgodnie z jednorodnością spisek.

Teraz zmierz maksymalną moc dla każdego rozmiaru otworka, znając średnicę wiertła użytego do wykreślenia mocy optycznej każdego otworka w funkcji powierzchni otworka. Ponieważ wywiercone otwory nie są idealne, uśrednienie tych wartości pozwoli dobrze oszacować gęstość mocy optycznej. Matryca LED będzie używana do łatania optyki.

Upewnij się, że bierzesz pod uwagę wszystkie elementy optyczne potrzebne do łatania podczas tworzenia wykresu potęgi i wykresu jednorodności. Na przykład wiele mikroskopów ma odchylany ekran dyfuzora, którego można użyć, aby poświęcić moc na rzecz jednorodności. Przygotuj wycinki tkanki mózgowej przy użyciu standardowych metod i pozwalając plasterkom zregenerować się przez 30 do 45 minut w podgrzanym płynie mózgowo-rdzeniowym, przejdź i wykonaj pipety z plastrem.

Gdy tkanki zregenerują się, delikatnie umieść plasterek w komorze rejestracyjnej mikroskopu pod stałą perfuzją natlenionego płynu mózgowo-rdzeniowego A. Potwierdź obecność czerwieni kanału EYFP w dwóch kanałach za pomocą epi fluorescencji w oświetleniu fluorescencyjnym. Zlokalizuj w plasterku zdrowy kanał dwa neurony EYFP o dojrzałej morfologii.

Następnie zlokalizuj tę somę neuronu pod optyką łatającą i wytwórz giga omowe uszczelnienie między błoną plazmatyczną a ściankami elektrody łatki. Jeśli elektroda jest wystarczająco blisko neuronu impulsowego, spontaniczna aktywność powinna wytworzyć mierzalny potencjał pola lokalnego nawet bez uszczelki gigaomowej. Teraz aktywuj kanał przyjmuje dwa w tym neuronie, różnymi dawkami światła, ponieważ dawki światła są funkcją zarówno mocy LED, jak i czasu trwania, obliczają, ile światła jest potrzebne do wywołania potencjału czynnościowego przy wielu mocach i czasie trwania.

Mikroskop Olympus BX 51 wi został skonfigurowany z liniową diodą LED z dwiema przysłonami i soczewką kondensatora. Wystarczający kontrast jasnego pola do zapisu patch clamp uzyskano poprzez zamknięcie zarówno przysłony polowej, jak i przysłony apertury. Wykres jednorodności natężenia światła LED został skonstruowany w obszarze wokół pola widzenia obiektywu wskazywanego przez przerywane kółko.

Przy całkowicie otwartych wszystkich membranach, fragmentatory zostały wystawione na działanie maksymalnej mocy światła w celu aktywacji kanału. Taka konfiguracja wytwarza światło o trzy rzędy wielkości mocniejsze niż konfiguracja używana do wizualizacji zacisku krosowego. Powszechne znakowanie ziarnistości opuszki węchowej urodzonej u dorosłych osób i neuronów w kłębuszkach nerkowych zaobserwowano cztery tygodnie po zakażeniu lentiwirusowym migrującego neuroblastu w rostralnym strumieniu migracyjnym.

Luźne nagrania plastrów z jednego kanału Adoptin dwa EYFP eksprymujące ziarniste komórki wskazały, że dla tego neuronu pięciomilisekundowa stymulacja o maksymalnej mocy była wystarczająca, aby wywołać skoki. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego popołudnia. Ważne jest, aby pamiętać po tej procedurze, aby zawsze monitorować swój sprzęt i ustawienia pod kątem dryfu w czasie Od czasu ich opracowania, takie techniki optogenetyczne utorowały drogę naukowcom w dziedzinie neuronauki do badania transmisji synaptycznej i integracji w wielu organizmach modelowych, takich jak robaki, muchy, myszy, a nawet naczelne.