Name: Wytwarzanie mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Poznaj techniki wytwarzania mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych, w tym wielowarstwowych mikrokapsułek do enkapsulacji komórek i białek. Metoda ta znajduje zastosowanie w inżynierii tkankowej i potencjalnie w leczeniu cukrzycy typu 1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsze badanie było wspierane przez Departament Spraw Weteranów USA (Washington D.C.), granty 0852048, 0731201 oraz 0854430 z Narodowej Fundacji Nauki (Arlington, VA), a także grant RO1 DK080897 z Narodowych Instytutów Zdrowia (Bethesda, MD). Pan Khanna otrzymał wsparcie dzięki hojnej darowiźnie pana Edwarda Rossa i dr Moniki Moyi z Fundacji Billa i Melindy Gatesów (Seattle, WA).

Niniejszy protokół opisuje trzyetapową procedurę wytwarzania wielowarstwowych alginianowych mikrokulek (Rysunek 1). W pierwszej kolejności formowane są alginianowe mikrokulki (Rysunek 2A). Procedura ta została opisana w sekcji 1 poniżej. Na tym etapie do mikrokulek można dodać komórki lub białka, aby służyły one jako system dostarczania. Kolejny krok obejmuje tworzenie warstwy permselektywnej na mikrokulkach i został opisany w sekcji 2. Ostatnim etapem jest utworzenie dodatkowej warstwy alginianowej, opisane w sekcji 3. Warstwa ta tworzy się na zewnętrznej powierzchni kulek (Rysunek 2B) i może być wykorzystana do enkapsulacji oraz dostarczania cząsteczek terapeutycznych (Rysunek 2C>) w celu ukierunkowania odpowiedzi komórkowej na system po transplantacji.
1. Przygotowanie alginianowych mikrokulek
<ol>
 <li>Przygotuj 1,5% (w/v) roztwór alginianu LVM, rozpuszczając 15 gramów alginianu LVM w 1 mL roztworu alginianu warstwy wewnętrznej (bufor HEPES 25 mM, NaCl 118 mM, KCl 5,6 mM i MgCl2 2,5 mM w wodzie DI, z pH dostosowanym do 7,4). Mieszaj na wstrząsarce Vortex do całkowitego rozpuszczenia proszku alginianu i utworzenia klarownego, lepkiego roztworu. Uwaga: Niniejszy protokół opisuje warunki optymalne dla enkapsulacji wysepek w mikrokapsułkach alginianowych. 1 Stężenie i skład mikrosfer alginianowych można zmieniać w celu dostosowania właściwości do innych zastosowań (np. dostarczania leków, inżynierii tkankowej itp.). Uwaga: W przypadku enkapsulacji wysepek można je dodać do roztworu alginianu na tym etapie, przed załadowaniem do mikroenkapsulatora. </li>
 <li>Przygotuj roztwór sieciujący (CaCl2 22 mM w wodzie DI), rozpuszczając CaCl2 100 mM i bufor HEPES 10 mM w wodzie DI, a następnie dostosowując pH do 7,4. Uwaga: Zależnie od pożądanego charakteru żelowania alginianu, zamiast Ca2+ można zastosować inne kationy dwuwartościowe, takie jak Br2+, Sr2+ itp.</li>
 <li>Przygotuj dwukanałowy mikroenkapsulator alginianowy z osłoną powietrzną, mocując igłę G25 do strzykawki; dostosuj zawory po obu stronach, aby upewnić się, że igła znajduje się w centrum osłony powietrznej. Na tym etapie można użyć igieł o różnych rozmiarach, w zależności od pożątej wielkości mikrokulek alginianowych. 
 Krok ten można również przeprowadzić za pomocą zwykłej strzykawki, jeśli mikroenkapsulator jest niedostępny. Należy nalać roztwór alginianu do strzykawki i dobrać rozmiar igły na podstawie pożądanej wielkości mikrokulek. </li>
 <li>Umieść kolbę zawierającą 10 mL roztworu sieciującego bezpośrednio pod igłą. Wprowadź do roztworu mieszadło magnetyczne. </li>
 <li>Wtryskuj krople bezpośrednio do roztworu CaCl2, aby przeprowadzić sieciowanie alginianu i utworzyć mikrokulki. Inkubuj kulki w roztworze sieciującym przez co najmniej piętnaście minut przy ciągłym mieszaniu, aby utrwalić strukturę. </li>
 <li>Przenieś kulki do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL. Usuń pozostały roztwór i przeprowadź trzy przemycia 0,2% roztworem CaCl2 w soli fizjologicznej, po dwie minuty każde. </li>
</ol>
2. Powlekanie mikrokulek poli-L-ornityną
<ol>
 <li>Przygotuj 3 mL 0,1% (w/v) roztworu poli-L-ornityny (PLO) w soli fizjologicznej. Mieszaj roztwór na wortexie do całkowitego rozpuszczenia, aż powstanie klarowny roztwór. W tym kroku zamiast PLO można użyć poli-L-lizyny (PLL), co daje podobny poziom permselektywności. </li>
 <li>Przenieś alginianowe mikrokulki do roztworu PLO. Mieszaj na wortexie przez 30 minut, aby zapewnić PLO wystarczający czas na oddziaływanie z alginianem i utworzenie kompleksu polikationowo-polianionowego. Po 30 minutach wokół alginianowych mikrokulek powinna być wyraźnie widoczna biała powłoka. </li>
 <li>Usuń roztwór PLO i przeprowadź trzy płukania 0,2% CaCl2 w soli fizjologicznej, po dwie minuty każde. </li>
</ol>
3. Tworzenie zewnętrznej warstwy alginianowej
<ol>
 <li>Przygotować roztwór alginianu o pożądanej koncentracji, który zostanie użyty do stworzenia warstwy zewnętrznej. Roztwór przygotowuje się zgodnie z opisem w punkcie (1.1) powyżej. Wielkość warstwy zewnętrznej zależy od składu i stężenia użytego alginianu (Rysunek 3).</li>
 <li>Przenieść mikrokulki alginianowe na sitko do komórek. Użyć chusteczki Kimwipe do wchłonięcia nadmiaru roztworu, aby maksymalnie osuszyć mikrokulki.</li>
 <li>Przenieść mikrokulki na powierzchnię Parafilmu. W razie potrzeby Parafilm można zastąpić innymi gładkimi powierzchniami, takimi jak szkło lub plastikowa szalka Petriego.</li>
 <li>Nanieść roztwór alginianu przygotowany w punkcie (3.1) na mikrokulki alginianowe. Objętość roztworu alginianu powinna całkowicie zakrywać mikrokulki. Pozostawić mikrokulki w roztworze alginianu na 45 minut.</li>
 <li>Za pomocą pipety usunąć nadmiar roztworu alginianu, który nie związał się z mikrokulkami.</li>
 <li>Przenieść mikrokulki do roztworu 22mM CaCl2. Powoduje to sieciowanie roztworu alginianu wokół mikrokulek, co prowadzi do powstania wyraźnej zewnętrznej warstwy alginianu.</li>
 <li>Przeprowadzić trzy przemycia 22 mM CaCl2 w soli fizjologicznej, po dwie minuty każde. Obserwacja mikrokulek pod mikroskopem powinna pozwolić na dostrzeżenie wyraźnej zewnętrznej warstwy alginianu uformowanej wokół rdzenia mikrokulki.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/3388/3388fig1.jpg" alt="Schemat procesu enkapsulacji w alginianie; sieciowanie chlorkiem wapnia, powlekanie poli-L-ornityną." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat procedury tworzenia wielowarstwowych alginianowych mikrokulek. Przedruk za zgodą Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95(2), 632-40 (2010).
 <img src="/files/ftp_upload/3388/3388fig2.jpg" alt="Obraz z mikroskopii porównujący morfologię komórek i fluorescencję w różnych warunkach." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. (A) i (B) przedstawiają obrazy alginianowych mikrokulek w kontraście fazowym. (A) pokazuje mikrokuleczkę po etapie syntezy (1.7), natomiast (B) ukazuje wyraźną zewnętrzną warstwę alginianu obecną po zakończeniu etapu (3.7). (C) przedstawia obraz FITC białka BSA znakowanego fluorescencyjnie, zamkniętego w zewnętrznej warstwie. Powielono za zgodą Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov;95(2), 632-40 (2010).
<img src="/files/ftp_upload/3388/3388fig3.jpg" alt="Wykres słupkowy przedstawiający skład zewnętrznej warstwy alginianu w stosunku do rozmiaru w mikronach dla LVM i LVG przy 1-1,5%." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Rozmiar zewnętrznej warstwy alginianu może być zmienny w zależności od składu i stężenia użytego alginianu. Nasze wyniki pokazują, że w przypadku alginianu LVM i LVG rozmiar zewnętrznej warstwy zwiększa się wraz ze wzrostem stężenia alginianu oraz że alginian LVG tworzy grubsze warstwy zewnętrzne niż alginian LVM przy równych stężeniach. Odtworzone za zgodą Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Lis; 95(2), 632-40 (2010).
 <img src="/files/ftp_upload/3388/3388fig4.jpg" alt="Kinetyka uwalniania FGF-1; wykresy; czas vs. uwalnianie skumulowane; analiza danych dla formulacji hydrożelu." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
 Rysunek 4. Uwalnianie FGF-1, angiogennego białka czynnika wzrostu, z zewnętrznej warstwy alginianu różniło się w zależności od zastosowanego stężenia alginianów LVM i LVG. (A) i (B) przedstawiają procent uwalniania, a (C) i (D) oznaczają odpowiadającą im masę uwolnionego FGF-1 w funkcji czasu dla różnych formulacji warstwy zewnętrznej. Dla wszystkich warunków zaobserwowano gwałtowne uwalnianie początkowe (burst release) w ciągu pierwszych 5 h (A i C) oraz ciągłe uwalnianie niskich dawek przez okres do 30 dni (B i D). Reprodukowano za zgodą Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95(2), 632-40 (2010). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3388/3388fig4large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.

<ol><li>Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+Poly-L-+Ornithine-coated+alginate+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Characteristics of Poly-L- Ornithine-coated alginate microcapsules.</a> Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).</li>
<li>Yamagiwa, K., Kozawa, T., Ohkawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+alginate+composition+and+gelling+conditions+on+diffusional+and+mechanical+properties+of+calcium-alginate+gel+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Eng.+Jpn%22%5BJournal%5D)">Effects of alginate composition and gelling conditions on diffusional and mechanical properties of calcium-alginate gel beads.</a> J. Chem. Eng. Jpn. 28, 462-467 (1995).</li>
<li>Amsden, B., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+characteristics+of+calcium+alginate+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Diffusion characteristics of calcium alginate gels.</a> Biotechnol. Bioeng. 65, 605-610 (1999).</li>
<li>Uriel, S., Brey, E. M., Greisler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+low+levels+of+fibroblast+growth+factor-1+promote+persistent+microvascular+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Sustained low levels of fibroblast growth factor-1 promote persistent microvascular network formation.</a> Am. J. Surg. 192, 604-609 (2006).</li>
<li>Moya, M. L., Lucas, S., Francis-Sedlak, M., Liu, X., Garfinkel, M. R., Huang, J. J., Cheng, M. H., Opara, E. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+delivery+of+FGF-1+increases+vascular+density+in+comparison+to+bolus+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Sustained delivery of FGF-1 increases vascular density in comparison to bolus administration.</a> Microvasc. Res. 78, 142-147 (2009).</li>
<li>Moya, M. L., Cheng, M. H., Huang, J. J., Francis-Sedlak, M. E., Kao, S. W., Opara, E. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+FGF-1+loaded+alginate+microbeads+on+neovascularization+and+adipogenesis+in+a+vascular+pedicle+model+of+adipose+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of FGF-1 loaded alginate microbeads on neovascularization and adipogenesis in a vascular pedicle model of adipose tissue engineering.</a> Biomaterials. 31, 2816-2826 (2010).</li>
<li>Khanna, O., Moya, M. L., Greisler, H. P., Opara, E. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayered+Microcapsules+for+the+Sustained-Release+of+Angiogenic+Proteins+From+Encapsulated+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Multilayered Microcapsules for the Sustained-Release of Angiogenic Proteins From Encapsulated Cells.</a> Am. J. Surg. 200, 655-658 (2010).</li>
<li>Khanna, O., Moya, M. L., Opara, E. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+multilayered+alginate+microcapsules+for+the+sustained-release+of+fibroblast+growth+factor-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis of multilayered alginate microcapsules for the sustained-release of fibroblast growth factor-1.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 95, 632-640 (2010).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Alginian jest naturalnym, kwasowym polisacharydem ekstrahowanym z alg, składającym się z jednostek kwasu 1,4'-β-D-mannuronowego (M) oraz kwasu α-L-guluronowego (G) 2,3. Prosta żelacja zachodzi, gdy kationy dwuwartościowe, takie jak Ca2+, Sr2+ lub Ba2+, oddziałują z monomerami G, tworząc mostki jonowe między sąsiednimi łańcuchami alginianu. Mikrokule alginianowe były wykorzystywane do dostarczania różnych białek, w tym czynnika wzrostu fibroblastów-1 (FGF-1), czynnika wzrostu ne...

<table><tbody><tr><td>Alginian Pronova Ultrapure LVG</td><td>Nova-Matrix</td><td>4200006</td><td>Dostępnych jest wiele formulacji alginianu. Wybór alginianu wpływa na końcowe właściwości mikrokulek, w tym na ich rozmiar, właściwości mechaniczne oraz transport. Stosowany skład powinien zostać zoptymalizowany pod kątem konkretnego zastosowania. </td></tr><tr><td>Alginian Pronova Ultrapure LVM</td><td>Nova-Matrix</td><td>4200206</td><td>Dostępnych jest wiele formulacji alginianu. Wybór alginianu wpływa na końcowe właściwości mikrokulek, w tym na ich rozmiar, właściwości mechaniczne oraz transport. Stosowany skład powinien zostać zoptymalizowany pod kątem konkretnego zastosowania. </td></tr><tr><td>Hydrochlorowodorek poli-L-ornityny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2533</td><td> </td></tr></tbody></table>

wytwarzanie mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Materiały na bazie alginianu zyskały znaczną uwagę w zastosowaniach biomedycznych ze względu na swoją hydrofilową naturę, biokompatybilność i architekturę fizyczną. Zastosowania obejmują enkapsulację komórek, dostarczanie leków, hodowlę komórek macierzystych oraz rusztowania do inżynierii tkankowej. W rzeczywistości obecnie prowadzone są badania kliniczne, w których wyspy trzustkowe są enkapsulowane w mikrokulkach alginianowych powlekanych PLO jako metoda leczenia cukrzycy typu I. Jednak ze względu na niską przeżywalność po transplantacji, do osiągnięcia skuteczności wymagana jest duża liczba wysp. Zdolność do lokalnej stymulacji tworzenia sieci mikro naczyniowej wokół enkapsulowanych komórek może zwiększyć ich żywotność poprzez poprawę transportu tlenu, glukozy i innych niezbędnych składników odżywczych. Czynnik wzrostu fibroblastów-1 (FGF-1) jest naturalnie występującym czynnikiem wzrostu, który jest w stanie stymulować tworzenie naczyń krwionośnych i poprawiać poziom tlenu w tkankach niedokrwiennych. Skuteczność FGF-1 jest zwiększona, gdy jest on dostarczany w sposób przedłużony, a nie w formie pojedynczej, dużej dawki bolusa. Lokalna, długoterminowa uwalnianie czynników wzrostu z systemów enkapsulacji wysp mogłoby stymulować wzrost naczyń krwionośnych bezpośrednio w kierunku przeszczepionych komórek, potencjalnie poprawiając funkcjonalne wyniki przeszczepu. W niniejszym artykule przedstawiamy procedury przygotowania mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych. Dodatkowo opisujemy opracowaną przez nas metodę generowania wielowarstwowych mikrokulek alginianowych. Komórki mogą zostać zamknięte w wewnętrznym rdzeniu alginianowym, a białka angiogenne w zewnętrznej warstwie alginianowej. Uwalnianie białek z tej zewnętrznej warstwy stymulowałoby tworzenie lokalnych sieci mikro naczyniowych bezpośrednio w kierunku przeszczepionych wysp.

W następnych sekcjach przedstawiamy procedury przygotowania mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych. W szczególności ilustrujemy technikę tworzenia wielowarstwowych mikrosfer alginianowych w celu jednoczesnej enkapsulacji komórek i białek jako potencjalnej metody leczenia cukrzycy typu 1.

Wytwarzanie mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych

Materiały na bazie alginianu zyskały znaczną uwagę w zastosowaniach biomedycznych ze względu na ich hydrofilową naturę, biozgodność oraz ...

Nazywam się Goldie Ana i jestem studentką studiów licencjackich pracującą w laboratorium dr. Erica Brasa w Illinois Institute of Technology. W tej prezentacji wideo opiszę techniki wykorzystania alginianowych mikrokulek w inżynierii biomedycznej, a konkretnie w dziedzinie inżynierii komórkowej i tkankowej. Wszystkie opisane tutaj prace zostały wykonane we współpracy z laboratorium dr. Emmanuela OPA w Wake Forest Institute for Regenerative Medicine.Przedstawię techniki wytwarzania mikrokulek alginianowych przeznaczonych zarówno do dostarczania leków, jak i enkapsulacji komórek. Na koniec zaprezentuję nowatorską procedurę opracowaną w naszym laboratorium, służącą do wytwarzania wielowarstwowych mikrokapsułek alginianowych, które mogą być wykorzystywane w podwójnym celu: do enkapsulacji komórek oraz białek. Alginian składa się z reszt kwasu beta-D-guluronowego i kwasu alfa-L-manuronianowego w zmiennych sekwencjach.Roztwór alginianów sieciuje, tworząc żel w obecności kationu wielowartościowego, takiego jak najczęściej stosowany jon wapnia Ca²⁺. Badacze analizowali wykorzystanie alginianowych mikrokulek do enkapsulacji komórek i białek. Właściwości hydrożeli alginianowych mogą być modyfikowane w zależności od warunków syntezy, co pozwala na uzyskanie odmiennych parametrów, które mogą służyć na przykład do regulacji kinetyki uwalniania.Mikrokulki alginianowe są stosowane w wielu szeroko zakrojonych zastosowaniach, w tym do enkapsulacji białek, dostarczania leków, enkapsulacji komórek, a także jako składnik w naukach o żywności, na przykład w gastronomii molekularnej. Pracę rozpoczynamy od przygotowania roztworu alginianu do warstwy wewnętrznej. Do wody dejonizowanej należy dodać 25 millimolar HEPS, 118 millimolar chlorku sodu, 5,6 millimolar chlorku potasu oraz 2,5 millimolar chlorku magnezu, a następnie dokładnie wstrząsnąć, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki zostały rozpuszczone.Dostosuj pH do wartości 7.4, co odpowiada warunkom fizjologicznym. Odważ odpowiednią ilość proszku, aby uzyskać pożądane stężenie, a następnie przenieś go do przygotowanego roztworu przeciwalergenicznego. Umieść roztwór na mieszalniku wiertakowym (vortexie) do czasu całkowitego rozpuszczenia proszku, aż powstanie przejrzysty, lepki roztwór.Przygotuj roztwór sieciujący, dodając do dejonizowanej wody 10 milimolowy bufor HEIS oraz 100 milimolowy chlorek wapnia. Dokładnie wymieszaj roztwór i dostosuj jego pH do wartości 7,4. Odmierz 10 mililitrów roztworu sieciującego do zlewki.Przenieś alginian do strzykawki wyposażonej w igłę o pożądanym rozmiarze. Umieść igłę prostopadle do roztworu sieciującego i powoli wypuszczaj krople do roztworu, umożliwiając formowanie się sferycznych kulek. W celu wytworzenia dużej objętości mikrokulek o jednolitym rozmiarze można wykorzystać dwukanałowy system mikroenkapsulacji.Napełnij strzykawkę roztworem alginianu i otwórz zawór osłonki powietrznej, a następnie zawór osłonki alginianowej, umożliwiając wstrzykiwanie kropel do kolby zawierającej roztwór sieciujący. Pozostaw kuleczki do inkubacji w roztworze przez 15 minut. Mikrokuleczki należy przemyć trzykrotnie roztworem 22 mM.Mikrokapsułki z chlorku wapnia i soli fizjologicznej były szeroko badane pod kątem enkapsulacji komórek. Na przykład jedna z proponowanych metod leczenia cukrzycy typu pierwszego polega na przeszczepieniu powiek dawcy do organizmu pacjenta w celu zapobiegania odrzuceniu komórek autologicznych. Jednak pacjenci muszą przyjmować leki immunosupresyjne, które upośledzają ich układ odpornościowy.Kapsułkowanie wysp alginicznych wewnątrz bin. Materiał taki jak alginian może wyeliminować konieczność stosowania leków immunosupresyjnych. Powłoka z poli-L-ornityny (PLO) naniesiona wokół mikrodoz alginianowych służyłaby jako membrana półprzepuszczalna.Wokół powłoki z PLO nanosi się cienką monowarstwę alginianu, co pomaga ograniczyć odpowiedź zapalną. Dodatnio naładowany PLO oddziałuje z alginianem, w wyniku czego wokół kuleczki powstaje powłoka pełniąca funkcję membrany selektywnej. Następnie wokół powłoki z PLO tworzy się monowarstwę alginianu, aby zamaskować jego ładunek dodatni i ograniczyć odpowiedź zapalną.Po transplantacji przygotuj 0,1% roztwór poli-L-ornityny, rozpuszczając PLO w soli fizjologicznej. Dodaj roztwór PLO do alginianowych mikrokulek i umieść je na wstrząsaczu wortex na 30 minut, aby zapewnić odpowiedni czas interakcji mikrokulek alginianowych z roztworem PLO. Usuń otaczający płyn i przeprowadź trzy płukania po dwie minuty każde, używając 22 milimolowego chlorku wapnia w roztworze soli fizjologicznej.Dodaj roztwór alginianu do mikrokulek powlekanych PLO i umieść je w wstrząsarce wirowej na pięć minut. Przeprowadź trzy przemycia po dwie minuty każde, używając 0,9% roztworu soli fizjologicznej, aby usunąć niezwiązany alginian. Po zakończeniu przemywania można przechowywać kulki w roztworze chlorku wapnia.Jednym z ograniczeń komórkowych jest fakt, że wiele komórek obumiera z powodu braku utrwalonego ukrwienia, które dostarczałoby tlen, glukozę i inne niezbędne składniki odżywcze po transplantacji. Angiogeneza, czyli wzrost naczyń krwionośnych z istniejących już naczyń, może być stymulowana poprzez podawanie terapeutycznych białek angiogennych, takich jak czynnik wzrostu fibroblastów 1 lub FGF1, lub czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego lub VEGF. Nasz zespół badawczy wykazał wcześniej, że stały, niski poziom uwalniania FGF1 sprzyja stabilnej waskularyzacji w porównaniu z wysoką dawką bolusową. Opracowaliśmy nową procedurę tworzenia wielowarstwowych mikrokulek alginianowych, w której zamiast tradycyjnie stosowanej cienkiej monowarstwy zastosowano znaczną zewnętrzną warstwę alginianową.Nasz system dostarczania leków służy do podwójnego celu: enkapsulacji komórek oraz białek, gdzie na przykład s może być zamknięte w rdzeniu wewnętrznym, a białka angiogenne, takie jak FGF one, w zewnętrznym regionie alginianowym. Uwalnianie białek terapeutycznych spowodowałoby powstanie nowych naczyń krwionośnych w obrębie miejsc przeszczepu, zwiększając tym samym żywotność komórek wysepek. Wielowarstwowe mikrokulki alginianowe służą do podwójnego celu: enkapsulacji komórek oraz białek.Wokół powłoki PLO tworzony jest obszerny zewnętrzny region alginianowy zamiast konwencjonalnie stosowanej monowarstwy, który może służyć jako obszar do enkapsulacji białek. Uwalnianie białek terapeutycznych z zewnętrznego regionu alginianowego miałoby na celu wywołanie angiogenezy w kierunku miejsca przeszczepu. Teoretycznie zapewniłoby to drożne ukrwienie dostarczające niezbędnych składników odżywczych do enkapsulowanych komórek, zwiększając tym samym ich żywotność.Procedura wytwarzania wielowarstwowych mikrokulek alginianowych jest podobna do omówionej wcześniej. Syntetyzowane są mikrokule alginianowe zawierające komórki, a następnie tworzona jest powłoka PLO. Jednak w ostatnim kroku warstwa zewnętrzna powstaje poprzez sieciowanie alginianu w roztworze chlorku wapnia zamiast w soli fizjologicznej.Aby stworzyć wielowarstwowe mikrokulki ginnet, należy rozpocząć od przeniesienia mikrokulek powlekanych PLO zawieszonych w roztworze na sito komórkowe, aby odsiać nadmiar cieczy. Następnie przenieść kulki na płaską powierzchnię, taką jak pergamin lub szalka Petriego, nanieść na wierzch mikrokulek roztwór alergenu zewnętrznego i inkubować przez 45 minut. Po tym czasie usunąć nadmiar roztworu alergenu zewnętrznego za pomocą pipety i przenieść mikrokulki do roztworu chlorku wapnia, sieciując alginian w celu utworzenia warstwy zewnętrznej. Przeprowadzić trzy przemycia, każde po dwie minuty.Zastosowano panel z roztworem chlorku wapnia o stężeniu 2 mM oraz roztworem soli fizjologicznej. Na zdjęciu A przedstawiono powierzchnię mikrokulki alginianowej, która kontrastuje z panelem B, na którym widoczna jest obszerna zewnętrzna warstwa alergenu. Panel C przedstawia obraz wielowarstwowej mikrokulki alginianowej z białkiem znakowanym fluorescencyjnie, zamkniętym w warstwie zewnętrznej.Wielkość zewnętrznej warstwy alginianu może być różna w zależności od składu i stężenia zastosowanego alginianu, co wpływa na profil uwalniania FGF1 z wielowarstwowych mikrokulek alginianowych. Parametry te mogą być modyfikowane w zależności od warunków zastosowanych do syntezy warstwy zewnętrznej. Wszystkie warunki zapewniają gwałtowne uwalnianie w ciągu pierwszych czterech godzin, przy jednoczesnym kontynuowaniu uwalniania FGF1 przez okres do 30 dni.Długotrwałe uwalnianie FGF1 wykazuje potencjał do stymulowania trwałej waskularyzacji, co służyłoby zwiększeniu żywotności inkapsulowanych komórek. Tym kończymy naszą prezentację. Mamy nadzieję, że była ona dla Państwa informatywna.

generation-of-alginate-microspheres-for-biomedical-applications

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Generowanie mikrokul przestrzennych alginanu do zastosowań biomedycznych

Ustaliliśmy metodę kapsułkowania pluripotencjalnych komórek macierzystych (komórek PS) w kapsułkach hydrożelowych alginianowych za pomocą dyszy współosiowej.  Zapobiega to nadmiernej agregacji komórek i ogranicza naprężenia ścinające doświadczane przez komórki w hodowli zawiesinowej.  Technika ta ma zastosowanie do masowej produkcji komórek PS, a także do badań nad niszą komórek macierzystych.

Enkapsulacja alginianowa pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą dyszy współosiowej

Przygotowano rusztowanie do wstrzykiwań inżynierii tkankowej składające się z mikrocząsteczek poli(N-izopropylacrylamidu)-siarczanu chondroityny (PNIPAAm-g-CS)-zawierającego poli(N-izopropylacrylamid). W tym badaniu analizowana jest siła adhezji, właściwości pęcznienia i biokompatybilność in vitro. Opracowane tutaj techniki charakterystyki mogą mieć zastosowanie do innych systemów termożelowania.

Synteza termożelujących kompozytów siarczanowych poli(N-izopropylacyloamidu)-grafto-chondroityny z mikrocząstkami alginianowymi dla inżynierii tkankowej

Samoorganizujące się kompleksy polielektrolitowe (PEC) wykonane z heparyny i protaminy zostały osadzone na kulkach alginianowych, aby uwięzić i regulować uwalnianie osteogennych czynników wzrostu. Ta strategia dostarczania umożliwia 20-krotne zmniejszenie dawki BMP-2 w zastosowaniach związanych z usztywnieniem kręgosłupa. Niniejszy artykuł ilustruje korzyści płynące z zastosowania PEC i jego wytwarzanie.

Kompleks polielektrolitowy do dostarczania osteogennego czynnika wzrostu w domenie wiążącej heparynę

Inżynieria i analiza tkanek nośnych z heterogenicznymi populacjami komórek nadal stanowią wyzwanie. W tym miejscu opisujemy metodę tworzenia dwuwarstwowych krążków hydrożelu alginianowego jako platformy do wspólnej hodowli różnych populacji komórek w ramach jednego konstruktu.

Warstwowe konstrukty alginianowe: platforma do wspólnej hodowli heterogenicznych populacji komórek

Ten film i rękopis opisują metodę opartą na emulsji do kapsułkowania komórek ssaków w kulkach alginianowych od 0,5% do 10%, które mogą być produkowane w dużych partiach za pomocą prostego mieszanego naczynia. Zamknięte w kapsułkach komórki mogą być hodowane in vitro lub przeszczepiane do zastosowań w terapii komórkowej.

Enkapsulacja komórek ssaków w kulkach alginianowych za pomocą prostego naczynia z mieszadłem

Ten protokół ilustruje metodę enkapsulacji komórek poprzez szybkie fizyczne żelowanie alginianu w celu unieruchomienia komórek. Uzyskane mikrogranulki umożliwiają kontrolowane i trwałe wydzielanie β amyloidu w czasie i mogą być wykorzystywane do badania skutków wydzielania β amyloidu w modelach in vitro i in vivo.

Wytwarzanie mikrogranulek alginianu wydzielających β amyloid do wykorzystania w modelowaniu choroby Alzheimera

Przedstawiona tutaj jest metoda biodruku 3D żelatyny metakryloilo.

Protokoły biodruku 3D biotuszy na bazie żelatyny i hydrożelu metakryloylowego

Prezentowana tutaj jest łagodna technika druku 3D napędzana zmiennymi siłami lepko-inercyjnymi, aby umożliwić budowę mikronośników hydrożelowych. Dysze domowej roboty oferują elastyczność, umożliwiając łatwą wymianę dla różnych materiałów i średnic. Można uzyskać mikronośniki wiążące komórki o średnicy 50-500 μm i pobrać je do dalszej hodowli.

Druk 3D mikronośników hydrożelowych in vitro metodą natryskiwania naprzemienną siłą lepko-inepunktualną

Obecny protokół opisuje wytwarzanie wysoce otwartych porowatych mikrosfer (HOPM) na bazie poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) za pomocą opartej na pojedynczej emulsji technologii mikroprzepływowej. Mikrosfery te mają potencjalne zastosowania w inżynierii tkankowej i badaniach przesiewowych leków.

Wytwarzanie wysoce otwartych porowatych mikrosfer (HOPM) za pomocą technologii mikroprzepływowej

Protokół opisuje przygotowanie mikrosfer alginianu sodu usieciowanych różnymi jonami metali za pomocą urządzenia mikroprzepływowego do projektowania nośników leków. Zbadano również właściwości przeciwdrobnoustrojowe i powolne uwalnianie tych mikrosfer przez leki.

Otrzymywanie usieciowanych mikrosfer alginianu sodu z różnymi jonami metali z wykorzystaniem technologii elektrorozpylania mikroprzepływowego

Poznaj techniki wytwarzania mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych, w tym wielowarstwowych mikrokapsułek do enkapsulacji komórek i białek. Metoda ta znajduje zastosowanie w inżynierii tkankowej i potencjalnie w leczeniu cukrzycy typu 1.

Wytwarzanie mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych

Przeglądaj więcej filmów