Name: Radioterapia skojarzona w ortotopowym modelu guza mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Poznaj metodę implantacji komórek glejaka w mózgu myszy w celu oceny skuteczności radioterapii i chemioterapii. Model ortotopowy umożliwia badanie nowych terapii przeciwnowotworowych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te są finansowane z funduszy programu Intramural NIH.

I. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Komórki hoduje się do osiągnięcia konfluencji w pożywce DMEM z dodatkiem 10% FBS; jedna naczynie o powierzchni 225 cm² jest w około 80% konfluentne.3 kolba na każde 5 myszy przeznaczonych do implantacji.</li>
	<li>Odssać pożywkę z komórek; przemyć 10 ml PBS bez wapnia i magnezu. Odssać PBS z komórek.</li>
	<li>Poddać komórki trypsynizacji, używając 3 ml trypsyny, odczekać 10–15 min, a następnie zneutralizować trypsynę za pomocą 15 ml pożywki.</li>
	<li>Przenieś pipetą wszystkie komórki i medium do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Zawartość dwóch dużych kolb mieści się w jednej probówce stożkowej 50 ml.</li>
	<li>Wirować komórki przy 1600 obr./min przez 7 min w temperaturze 4 °C. Całkowicie odessać nadsącz. Resuspendować komórki w 10 ml zimnego PBS i wypłukać je, delikatnie pipetując w górę i w dół. Upewnić się, że osad komórkowy został jednorodnie wymieszany z PBS. Zawiesina powinna być mętna.</li>
	<li>W tym momencie wykonuje się liczenie komórek za pomocą licznika Coulter. Komórki są ponownie wirowane przy 1600 obr./min przez 7 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po 2nd odwirować komórki, odessać cały PBS i zawiesić ponownie w 1 ml PBS.</li>
	<li>Komórki wiruje się w 1 ml PBS przy 3000 obr./min przez 10 min w temperaturze 4 °C. PBS odsysa się, a następnie dodaje PBS w celu dostosowania stężenia końcowego do 1x106 na każde 5 μl dla komórek U87; inne linie komórkowe mogą wymagać innej liczby i stężenia komórek dla optymalnego wzrostu guza.</li>
	<li>Po uzyskaniu końcowej objętości i stężenia komórki są przechowywane w lodzie w probówce typu Eppendorf.</li>
</ol>
II. Ksenoprzeszczep
<ol class="ualpha">
	<li>Przygotowanie myszy
	<ol>
		<li>Myszy zostają poddane znieczuleniu za pomocą wstrzykniętej mieszaniny ketaminy/ksylazyny/soli fizjologicznej. Mieszanina zawiera 120 mg/kg ketaminy, 16 mg/kg Rompunu oraz sól fizjologiczną. Myszy są ważone indywidualnie i otrzymują dawkę 0,1 ml na każde 10 g masy ciała. Środek znieczulający jest podawany drogą IP za pomocą strzykawki 1 ml z igłą 26G. Osiągnięcie fazy uśpienia, w której nie występuje reakcja na ból, zajmuje około 15 min. Reakcję na ból u myszy można sprawdzić, ściskając opuszki łap.</li>
		<li>Po pełnym znieczuleniu myszy do oczu podaje się maść oczną, aby zapobiec ich wysuszeniu.</li>
		<li>Mysz zostaje umieszczona na podkładce aparatu stereotaktycznego, a przednie górne siekacze w notchu poprzeczki ustnej. Następnie podkładka jest mocowana w aparacie stereotaktycznym.</li>
		<li>Nad nosem myszy umieszcza się osłonę nosową, aby zapobiec ruchom głowy, a pręty uszne delikatnie wprowadza się do kanałów słuchowych myszy. Należy uważać, aby nie mocować zbyt ściśle ani osłony nosowej, ani prętów usznych, ponieważ może dojść do złamania czaszki i/lub utrudnienia oddychania u myszy.</li>
		<li>Należy upewnić się, że głowa myszy jest wypoziomowana; pomocne w tym procesie są znaczniki na aparacie stereotaktycznym.</li>
		<li>W celu przygotowania myszy na głowie obficie nanosi się naprzemiennie alkohol i jodowid powidonu – łącznie 3 razy alkohol i 3 razy jod. Na koniec głowę przemywa się gazikiem nasączonym 70% alkoholem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura chirurgiczna
	<ol>
		<li>Wszystkie instrumenty wykorzystywane w procedurze powinny zostać wysterylizowane w autoklawie lub poprzez moczenie w 70% etanolu przed rozpoczęciem zabiegu.</li>
		<li>Na szczycie czaszki, za prawym okiem, wykonuje się nacięcie biegnące ukośnie w stronę lewej tylnej części czaszki. Nacięcie powinno mieć długość od 10 mm do 15 mm.</li>
		<li>Używając patyczka higienicznego, należy powoli rozsunąć brzegi nacięcia, aby odsłonić czaszkę, i usunąć błonę znajdującą się między czaszką a skórą. Patyczkiem higienicznym należy osuszać krew i monitorować, czy nie występuje nadmierne krwawienie.</li>
		<li>Odsłania się górną część czaszki, aby zlokalizować bregma. Używając końcówki strzykawki Hamiltona, ustawia się ją nad bregma. Prawidłowe miejsce wywiercenia otworu w czaszce znajduje się 2 mm na prawo i 1 mm przednio od bregma (rycina 2). Do zaznaczenia miejsca otworu używa się sterylnego pisaka filcowego dla chirurgów. Należy pamiętać, że otwór znajduje się blisko przedniej linii szwu.</li>
		<li>Następnie w zaznaczonej pozycji wywierca się w czaszce mały otwór, używając końcówki igły 22G w uchwycie lub wprowadzonej przez igłę 18G.</li>
		<li>Szklaną strzykawkę Hamiltona o pojemności 10 μl napełnia się 5 μl zawiesiny komórek. Strzykawka Hamiltona 10 μl jest wyposażona w przymocowaną tępo zakończoną igłę o rozmiarze od 30G do 33G. Przed nabraniem komórki należy je wymieszać, pipetując je lub używając strzykawki 1 ml z igłą 25G. Po napełnieniu strzykawki Hamiltona należy umieścić ją z powrotem w ramieniu aparatu, aby wyrównać ją z otworem w czaszce.</li>
		<li>Tępy koniec igły opuszcza się do powierzchni czaszki; gdy igła znajdzie się na poziomie czaszki, obniża się ją do głębokości 3 mm poniżej powierzchni czaszki.</li>
		<li>Po opuszczeniu igła powinna pozostać w tym miejscu przez 2 minuty, aby uniknąć poważnego urazu mózgu spowodowanego samym wprowadzeniem igły. Implantację komórek przeprowadza się z prędkością 1 μl na minutę przez łącznie 6-8 minut, uważając na ewentualny cofanie się cieczy. Po implantacji wszystkich komórek igłę pozostawia się w miejscu przez kolejne 2 minuty, aby umożliwić osadzenie się wszystkich komórek.</li>
		<li>Igłę wyjmuje się z mózgu, a otwór oczyszcza patyczkiem higienicznym. Następnie igłę i strzykawkę czyści się 50% acetonem, 100% EtOH oraz PBS, po 3 razy w każdym roztworze i w tej kolejności.</li>
		<li>Na tym etapie skórę na czaszce można zaszyć. Używając nici 5-0 PBS, zamyka się nacięcie za pomocą około 3 szwów.</li>
		<li>Mysz pozostawia się do wybudzenia na podkładce grzewczej, w razie potrzeby ponownie podając maść oczną. Mysz można przenieść do klatki, gdy zacznie samodzielnie wykazywać ruchy (np. podnoszenie głowy lub poruszanie barkami).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
III. Leczenie implantu IC za pomocą promieniowania i leków
<ol class="ualpha">
	<li>Naświetlanie
	<ol>
		<li>W zależności od linii komórkowej naświetlanie myszy może odbyć się od 5 do 7 dni po implantacji. W naszym oddziale do naświetlania wykorzystuje się aparat do radioterapii ortonapięciowej.</li>
		<li>Do wizualizacji guza przed randomizacją można wykorzystać techniki obrazowania, takie jak BLI (obrazowanie bioluminescencyjne), MRI lub CT (ryc. 3A).</li>
		<li>Myszy anestezuje się wcześniej stosowanym koktajlem Ketamina/Xylazyna/sól fizjologiczna, a na oczy nakłada się maść okulistyczną.</li>
		<li>Myszy umieszcza się w specjalnie wykonanym uchwycie do naświetlania, który ma kształt koła, w którym głowy myszy są skierowane do środka. Ciała myszy są osłonięte przed promieniowaniem ołowiem.</li>
		<li>Leki można podawać przed lub po naświetlaniu różnymi drogami podania, tj. SQ, IP oraz IV.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
IV. Wyniki
Mysz powinna obudzić się po zabiegu w ciągu 45-60 minut od podania znieczulenia. Jeśli mysz ma trudności z wybudzeniem się po zabiegu, a od jego zakończenia minęło ponad 1½ h, istnieje ryzyko, że zwierzę nie odzyska przytomności, w związku z czym skuteczną alternatywą może być eutanazja. W przypadku wystąpienia nadmiernego krwawienia lub pęknięcia czaszki w dowolnym momencie trwania procedury zaleca się eutanazję. Jeśli wszystko przebiegło pomyślnie, w zależności od linii komórkowej, guz powinien zacząć się formować w ciągu 2-4 tygodni od wykonania zabiegu. W przypadku stosowania wewnątrzczaszkowych modeli ksenoprzeszczepów skuteczność terapeutyczną mierzy się zazwyczaj jako przeżywalność po implantacji5. Jednakże, ponieważ jest to model IC, objawy pojawią się przed śmiercią. Do fizycznych oznak, które mogą wystąpić u myszy, należą: zgarbiona postawa, utrata masy ciała oraz brak aktywności. Objawy neurologiczne mogą obejmować drgawki, przechylenie głowy i utratę równowagi. Rysunek 3B przedstawia barwienie HE guza w momencie śmierci zwierzęcia. Do oceny danych wykorzystuje się wykres Kaplana-Meiera (rysunek 4). Oblicza się liczbę dni przeżycia dla 50% osobników i porównuje ją z grupą kontrolną. Jeśli grupa otrzymująca terapię skojarzoną przeżyła dłużej niż suma ram z pojedynczym promieniowaniem i lekiem, uznaje się, że terapia skojarzona była skuteczna.
<img alt="Aparat do chirurgii stereotaktycznej służący do precyzyjnego celowania w mózgu w eksperymentach neurobiologicznych." src="/files/ftp_upload/3397/3397fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Sprzęt stereotaktyczny firmy Stoelting.
<img alt="Schemat anatomii czaszki z pomiarami wskazującymi położenie bregmy, z zaznaczoną strukturą czaszki." src="/files/ftp_upload/3397/3397fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat lokalizacji otworu wiertniczego w czaszce myszy.
<img alt="Obrazowanie bioluminescencyjne, zwierzę doświadczalne, dzień 10, skala intensywności, analiza badania naukowego." src="/files/ftp_upload/3397/3397fig3A.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 3A"> 
Rysunek 3A. Obrazowanie BLI po implantacji GBM.
<img alt="Przekrój histologiczny tkanki mózgu, obraz mikroskopowy, analiza struktury komórkowej." src="/files/ftp_upload/3397/3397fig3B.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 3B"> 
Rycina 3B. Barwienie H&amp;E guza GBM w momencie zgonu.
<img alt="Krzywa przeżywalności implantów IC z inhibitorem PARP; wykres liniowy przedstawiający efekty leczenia w czasie." src="/files/ftp_upload/3397/3397fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Wyniki implantów IC U87 po podaniu inhibitora PARP 7 dni po operacji.

<ol><li>Bleau, A. M., Holland, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+the+mouse+genome+to+hunt+human+alternations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Trapping the mouse genome to hunt human alternations.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7737-7738 (2007).</li>
<li>McGrady, B. J., McCormick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+intracranial+invasion%3A+morphological+observations+on+central+nervous+system+invasion+by+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">A murine model of intracranial invasion: morphological observations on central nervous system invasion by melanoma cells.</a> Clin. Exp. Metastasis. 10, 387-393 (1992).</li>
<li>Fei, X., Zhang, Q., Dong, J., Diao, y, Wang, Z., Li, R., Wu, Z., Wang, A., Lan, Q., Zhang, S., Huang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+clinically+relevant+orthotopic+xenograft+mouse+model+of+metastatic+lung+cancer+and+glioblastoma+through+surgical+tumor+tissues+injection+with+trocar%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Development of clinically relevant orthotopic xenograft mouse model of metastatic lung cancer and glioblastoma through surgical tumor tissues injection with trocar.</a> Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 29, 84-84 (2010).</li>
<li>Fujita, M., Zhu, X., Sasaki, K., Ueda, R., Low, K., Pollack, I., Okada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+STAT3+Promotes+the+Efficacy+of+Adoptive+Transfer+Therapy+Using+Type-1+CTLs+by+Modulation+of+the+Immunological+Microenvironment+in+a+Murine+Intracranial+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of STAT3 Promotes the Efficacy of Adoptive Transfer Therapy Using Type-1 CTLs by Modulation of the Immunological Microenvironment in a Murine Intracranial Glioma.</a> J. Immunol. 180, 2089-2098 (2008).</li>
<li>Candolfi, M., Curtin, J. F., Nichols, W. S., Muhammad, A. K. M. . G., King, G., Pluhar, G. D., McNiel, G. E., Ohlfest, E. A., Freese, J. R., Moore, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology%3A+neuropathlogical+characterization+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathlogical characterization and tumor progression.</a> J. Neurooncol. 85, 133-148 (2007).</li>
<li>Kaye, A., Morstyn, G., Gardner, I., Pyke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+xenograft+glioma+model+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a xenograft glioma model in mouse brain.</a> Cancer Research. 46, 1367-1373 (1986).</li>
<li>Zhao, Y., Xiao, A., diPierro, C., Carpenter, J., Abdel-Fattah, R., Redpath, G., Lopez, M., Hussaini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Extensive+Invasive+Intracranial+Human+Glioblastoma+Xenograft+Model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">An Extensive Invasive Intracranial Human Glioblastoma Xenograft Model.</a> American Journal of Pathology. 176, 3032-3049 (2010).</li>
<li>Learn, C., Grossi, P., Schmittling, R., Xie, W., Mitchell, D., Karikari, I., Wei, Z., Dressman, H., Sampson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Analysis+of+Intracranial+Tumors+in+a+Murine+Model+of+Glioma+Demonstrate+a+Shift+in+Gene+Expression+in+Response+to+Host+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Genetic Analysis of Intracranial Tumors in a Murine Model of Glioma Demonstrate a Shift in Gene Expression in Response to Host Immunity.</a> J. Neuroimmunol. 182, 63-72 (2007).</li>
<li>Martens, T., Laabs, Y., Günther, H., Kemming, D., Zhu, Z., Witte, L., Hagel, C., Westphal, M., Lamszus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Glioblastoma+Growth+in+a+Highly+Invasive+Nude+Mouse+Model+Can+Be+Achieved+by+Targeting+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+but+not+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-2%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Glioblastoma Growth in a Highly Invasive Nude Mouse Model Can Be Achieved by Targeting Epidermal Growth Factor Receptor but not Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2.</a> Clin. Cancer Res. 14, 5447-5458 (2008).</li>
<li>Purow, B., Schiff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+genetics+of+glioblastoma%3A+are+we+reaching+critical+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Advances in the genetics of glioblastoma: are we reaching critical mass.</a> Nat. Rev. Neurol. 5, 419-426 (2009).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Złośliwe glejaki, takie jak wielopostaciowy glejak obrastały, stanowią najczęstsze pierwotne guzy mózgu i wiążą się z niekorzystnym rokowaniem4. Przeżywalność pacjentów z GBM pozostaje praktycznie niezmieniona w ciągu ostatniej dekady (tj. 9-12 miesięcy po diagnozie), mimo postępów w chirurgii, radioterapii i chemioterapii5. Cechy odpowiedniego modelu do badania leczenia glejaków powinny obejmować powtarzalną lokalizację guza i wzrost komórek w formie względnie dyskretnego nowotworu; komórki powinny...

radioterapia skojarzona w ortotopowym modelu guza mózgu u myszy

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) to najczęstsze i najbardziej agresywne pierwotne guzy mózgu u dorosłych1. W ostatnich latach dokonano znacznych postępów w zrozumieniu mechanizmów inwazji nowotworowej, a bezpośrednia inokulacja wewnątrzczaszkowa guza daje możliwość obserwacji procesu inwazji w fizjologicznie odpowiednim środowisku2. Jeśli chodzi o ludzkie guzy mózgu, obecnie dostępne modele ortotopowe są tworzone albo poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie zawiesiny komórek, albo poprzez implantację litego fragmentu guza za pomocą skomplikowanej procedury kraniotomii3. W naszej technice pobieramy komórki z hodowli tkankowej, aby stworzyć zawiesinę komórkową służącą do bezpośredniej implantacji do mózgu. Czas trwania operacji wynosi około 30 minut, a ponieważ mysz musi znajdować się w stałej płaszczyźnie chirurgicznej, stosuje się anestetyk do wstrzykiwań. Myszy umieszcza się w aparacie stereotaktycznym firmy Stoetling (rycina 1). Po oczyszczeniu i przygotowaniu pola operacyjnego wykonuje się nacięcie, a następnie lokalizuje punkt bregma, aby wyznaczyć miejsce kraniotomii. Miejsce kraniotomii znajduje się 2 mm na prawo i 1 mm rostralnie od punktu bregma. Głębokość wynosi 3 mm od powierzchni czaszki, a komórki wstrzykuje się w tempie 2 μl co 2 minuty. Skórę zszywa się nicią 5-0 PDS, a mysz pozostawia do wybudzenia na podgrzewaczce. Z naszego doświadczenia wynika, że w zależności od linii komórkowej leczenie może rozpocząć się od 7 do 10 dni po operacji. Podawanie leków zależy od składu leku. W przypadku radioterapii myszy są znieczulane i umieszczane w specjalnie wykonanym uchwycie. Ołów osłania ciało myszy, eksponując jedynie jej mózg. Badanie tumorigenazy oraz ocena nowych terapii GBM wymagają dokładnych i powtarzalnych zwierzęcych modeli guzów mózgu. Dlatego stosujemy ten ortotopowy model mózgu do badania interakcji między mikrośrodowiskiem mózgu a guzem oraz do testowania skuteczności różnych środków terapeutycznych z zastosowaniem radioterapii i bez niej.

Celem niniejszego artykułu jest opis zastosowania ortotopowego modelu glejaka wielopostaciowego w badaniach nad chemoradioterapią. Artykuł ten obejmuje procesy przetwarzania komórek, implantację oraz radioterapię myszy z wykorzystaniem modelu wewnątrzczaszkowego.

Radioterapia skojarzona w ortotopowym modelu guza mózgu u myszy

Glioblastoma multiforme (GBM), czyli wielopostaciowy glejak obręczykowaty, to najczęstsze i najbardziej agresywne pierwotne guzy mózgu u osób dorosłych1. W ostatnich latach dokonano znacznych postępów w...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opisanie, zaprezentowanie i leczenie komórek glejaka wielopostaciowego wszczepionych wewnątrzczaszkowo do mózgu myszy. Jest to realizowane poprzez wstępne przygotowanie komórek, a następnie ich implantację do mózgu myszy. Po zabiegu chirurgicznym w mózgu rozwija się guz, który może być poddawany badaniom z zastosowaniem różnych metod leczenia.Ostatecznie krzywa przeżywalności może wykazać, czy zastosowane leczenie było skuteczne. Znaczenie tej techniki rozciąga się na terapię glejaka wielopostaciowego, ponieważ może ona stanowić skuteczniejszy sposób testowania nowych metod leczenia, takich jak leki i radioterapia, w porównaniu do hodowli tkankowych. Należy rozpocząć od wyhodowania odpowiednich komórek, np. komórek U 87, do 80% konfluencji. W pożywce DMEM z 10% FBS jedna kolba o pojemności 225 cm³ dostarczy wystarczającej liczby komórek do implantacji u pięciu myszy; należy odessać pożywkę z komórek, a następnie krótko przemyć komórki 10 ml PBS bez wapnia i magnezu, delikatnie kołysząc kolbą.Po odessaniu roztworu płuczącego, inkubuj komórki z trypsyną przez 10 do 15 minut, a następnie zneutralizuj trypsynę za pomocą 15 ml pożywki. Przenieś teraz wszystkie komórki wraz z pożywką do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Zawartość dwóch kolb z komórkami zmieści się w jednej probówce.Odwirować komórki przy 1600 RPM przez siedem minut i całkowicie usunąć nadsącz za pomocą aspiratora. Resuspender osad w 10 mililitrach zimnego PBS i wypłukać komórki, delikatnie pipetując je w górę i w dół w roztworze, aż powstanie jednorodna, mętna zawiesina. Po pomiarze koncentracji komórek za pomocą licznika kultur, powtórzyć płukanie w PBS w celu zapewnienia optymalnego wzrostu guza.Dostosuj końcowe stężenie komórek U 87 do poziomu 200 000 komórek na mikrolitr. Inne linie komórkowe mogą wymagać innego stężenia dla zapewnienia optymalnego wzrostu guza. Po przygotowaniu komórek do iniekcji, należy przechowywać je w lodzie i przystąpić do przygotowania zwierzęcia.Rozpocznij przygotowanie myszy poprzez podanie znieczulenia myszom biorcom. Po około 15 minutach sprawdź za pomocą ucisku palca u nogi, czy myszy nie reagują na ból. Po znieczuleniu nałóż na oczy maść, aby zapobiec ich wysychaniu.Następnie umieść mysz na podkładce do aparatu stereotaksycznego. Zaczep zęby w wycięciu poprzeczki szczękowej. Następnie zamocuj podkładkę w aparacie.Aby unieruchomić głowę, załóż myszy osłonę nosa, a następnie delikatnie wprowadź pręty uszne do kanałów słuchowych. Nie dokręcaj żadnego z tych prętów zbyt mocno, ponieważ może dojść do złamania czaszki lub uduszenia myszy. Na tym etapie sprawdź, czy głowa znajduje się w poziomie.Ostatnim etapem przygotowania jest naprzemienne przemywanie głowy alkoholem i jodyną po trzy razy, a następnie końcowe, czwarte zastosowanie alkoholu. Operację implantacji należy rozpocząć od nacięcia zaczynającego się za prawym okiem i biegnącego ukośnie w stronę lewej tylnej części czaszki. Nacięcie powinno mieć długość od 10 do 15 milimetrów.Za pomocą aplikatora watnego powoli rozszerzyć nacięcie, aby odsłonić czaszkę, usunąć błonę znajdującą się między czaszką a skórą oraz osuszyć wszelką krew lub obszary nadmiernego krwawienia. Następnie zlokalizować bgma i za pomocą markera z filcową końcówką wyznaczyć miejsce nad nim, aby ustawić w tym punkcie szklaną strzykawkę Hamiltona o pojemności 10 µL. Postawić znak 2 mm na prawo i 1 mm przed bgma, w pobliżu przedniej linii szwu.Teraz należy wyjąć strzykawkę i wywiercić niewielki otwór w czaszce w zaznaczonej pozycji. Wiertło ma rozmiar igły 22 G. Pozwól, aby wiertło samo prowadziło proces wiercenia w czaszce.Dodatkowy nacisk nie jest wymagany. Używając strzykawki z igłą o rozmiarze od 30 do 33 G, nabierz pięć µL dobrze wymieszanej zawiesiny komórek, a następnie ponownie przymocuj strzykawkę do ramienia. Ustaw igłę w linii z otworem w czaszce i opuść ją na powierzchnię czaszki.Obniż igłę o trzy milimetry i odczekaj dwie minuty. Ta przerwa zmniejsza ryzyko urazu. Powoli naciśnij tłok, aby zaimplantować komórki z prędkością około 1 µL na minutę.Należy starannie unikać cofania płynu po zaimplantowaniu ostatnich komórek. Igłę należy pozostawić w miejscu przez kolejne dwie minuty, aby wszystkie komórki mogły osiąść. Po tym czasie należy delikatnie wycofać igłę z mózgu i starannie oczyścić otwór za pomocą patyczka bawełnianego.Teraz, używając nici PBS 5-0, zamknij nacięcie, wykonując około trzech szwów. Umieść mysz na podgrzewaczką i w razie potrzeby ponownie nałóż maść do oczu.Gdy mysz podniesie głowę lub poruszy barkami, należy przenieść ją z powrotem do klatki domowej. Od momentu podania znieczulenia procedura ta trwa od 30 do 60 minut. Jeśli mysz nie wykaże aktywności po 90 minutach, może to oznaczać brak możliwości wybudzenia, w takim przypadku skuteczną alternatywą może być eutanazja.Ponadto, w przypadku wystąpienia nadmiernego krwawienia lub pęknięcia czaszki w dowolnym momencie procedury, zaleca się eutanazję. W zależności od linii komórkowej, naświetlanie myszy może odbyć się od pięciu do siedmiu dni po implantacji. Przykładowo, do radioterapii można wykorzystać aparat do radioterapii ortowoltażowej.Przed losowym przydzieleniem myszy do grup eksperymentalnych należy zastosować techniki obrazowania, takie jak B-L-I-M-R-I lub tomografia komputerowa (CT), aby zwizualizować guz. Po implantacji komórek guzy zazwyczaj formowały się w ciągu od dwóch do czterech tygodni, w zależności od linii komórkowej. Po śmierci zwierząt wykonano barwienie tkanek mózgu w celu zbadania guza.Ważnym elementem oceny skuteczności leczenia jest wykreślenie krzywej przeżycia Kaplana-Meiera. Pozwala ona na porównanie średniego czasu przeżycia po wstrzyknięciu u zwierząt, które poddano leczeniu farmakologicznemu, radioterapii lub terapii łączonej. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaniom w dziedzinie onkologii w zakresie eksploracji terapii guzów mózgu u myszy.

combination-radiotherapy-in-an-orthotopic-mouse-brain-tumor-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Radioterapia skojarzona w ortotopowym modelu guza mózgu myszy

Pacjenci z guzami mózgu rutynowo poddawani są radioterapii czaszki, a choć metoda ta jest korzystna, często prowadzi do wyniszczających zaburzeń poznawczych. Ten poważny, nierozwiązany problem nie ma obecnie żadnego klinicznego lekarstwa, co skłoniło nas do podjęcia wysiłków w celu opracowania terapii opartych na komórkach macierzystych w celu przywrócenia funkcji poznawczych upośledzonych przez promieniowanie.

Strategie transplantacji komórek macierzystych w celu przywrócenia funkcji poznawczych upośledzonych przez radioterapię czaszki

Opisujemy zintegrowaną metodę precyzyjnej implantacji stereotaktycznej ludzkich komórek wielopostaciowego glejaka do mózgów myszy nago oraz następującego po niej seryjnego obrazowania in vivo w celu monitorowania wzrostu i odpowiedzi na leczenie powstałych ksenograftów.

Stereotaktyczna implantacja wewnątrzczaszkowa i obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ksenoprzeszczepów guzów w mysim modelu glioblastoma multiforme

Film demonstruje technikę ortotopowej inokulacji raka piersi na modelu mysim. Technika ta zapewnia wysoki wskaźnik nowotworzenia przy mniejszej zmienności wielkości i kształtu guza w porównaniu z wstrzyknięciem podskórnym lub niechirurgicznym.

Wstrzyknięcie ortotopowe: wszczepianie komórek rakowych specyficznych tkankowo dorosłej myszy

Ten film demonstruje wszczepianie komórek nowotworowych do mózgu myszy poprzez wykonanie iniekcji wewnątrzczaszkowej.

Wewnątrzczaszkowy model ortotopowy: procedura wszczepienia komórek rakowych do mózgu myszy

W przeszłości, napromienianie małych zwierząt było zazwyczaj wykonywane bez możliwości celowania w dobrze zdefiniowaną objętość guza. Celem było naśladowanie leczenia glejaka u ludzi u szczurów. Korzystając z platformy do napromieniania małych zwierząt, przeprowadziliśmy konforemne napromienianie 3D pod kontrolą MRI ze zwiększeniem podobjętości na podstawie PET w warunkach przedklinicznych.

Napromienianie pod kontrolą PET i MRI szczurzego modelu glejaka przy użyciu mikropromiennika

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i stereotaktycznego podawania allogenicznych ludzkich limfocytów u myszy z niedoborem odporności z ortotopowymi ludzkimi pierwotnymi guzami mózgu. Badanie to dostarcza dowodów na słuszność koncepcji zarówno wykonalności, jak i skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii komórkowych dostarczanych do mózgu.

Stereotaktyczny transfer adoptywny cytotoksycznych komórek odpornościowych w mysich modelach ortotopowego ludzkiego glejaka wielopostaciowego ksenoprzeszczepów

Badania nad strategiami leczenia pluripotencjalnych potworniaków pochodzących z komórek macierzystych są ważne dla klinicznego przełożenia terapii komórkami macierzystymi. W tym miejscu opisujemy protokół, aby najpierw wygenerować potworniaki pochodzące z komórek macierzystych u myszy, a następnie selektywnie celować i leczyć te nowotwory in vivo za pomocą napromieniacza dla małych zwierząt.

Celowane i selektywne leczenie pluripotencjalnych potworniaków pochodzących z komórek macierzystych z wykorzystaniem promieniowania wiązki zewnętrznej w modelu małego zwierzęcia

Modelowanie przerzutów wewnątrzczaszkowych do mózgu jest skomplikowane przez niemożność monitorowania wielkości guza i odpowiedzi na leczenie za pomocą precyzyjnych i szybkich metod. Przedstawiona metodologia łączy iniekcję guza śródczaszkowego z analizą rezonansu magnetycznego, która w połączeniu zapewnia precyzyjne i spójne iniekcje, ulepszone monitorowanie zwierząt i dokładne pomiary objętości guza.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez iniekcję wewnątrzczaszkową i rezonans magnetyczny

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia przedklinicznej radioterapii opartej na pozytonowej tomografii emisyjnej w modelu glejaka szczurzego przy użyciu opracowanych przez nas algorytmów w celu optymalizacji dokładności i wydajności.

Radioterapia oparta na pozytonowej tomografii emisyjnej w modelu szczura glejaka przy użyciu platformy badawczej promieniowania małych zwierząt

Tutaj opisujemy przedkliniczny ortotopowy model myszy dla GBM, stworzony przez wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie komórek pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych guzów myszy. Model ten wykazuje cechy charakterystyczne dla GBM u ludzi. W przypadku badań translacyjnych guz mózgu myszy jest śledzony za pomocą rezonansu magnetycznego in vivo i histopatologii.

Translacyjne modele ortotopowe glejaka wielopostaciowego

Opracowanie ortotopowych modeli guzów mózgu u dzieci wymaga skrupulatnej precyzji, przy użyciu urządzenia stereotaktycznego do precyzyjnego wszczepiania komórek nowotworowych. Przedstawiona tutaj metodologia przedstawia etapy związane z przygotowaniem komórek guza mózgu, wykonywaniem iniekcji wewnątrzczaszkowych i wdrażaniem systemu monitorowania pooperacyjnego w celu oceny wszczepienia guza mózgu.

Opracowanie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów dla guzów mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego

Poznaj metodę implantacji komórek glejaka w mózgu myszy w celu oceny skuteczności radioterapii i chemioterapii. Model ortotopowy umożliwia badanie nowych terapii przeciwnowotworowych in vivo.

Radioterapia skojarzona w ortotopowym modelu guza mózgu u myszy

Przeglądaj więcej filmów