Name: Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Poznaj ekstrakcję lipidów komórkowych z wykorzystaniem rozcieńczania stabilnych izotopów i chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas. Ta metoda umożliwia precyzyjną ilościową analizę metabolitów lipidowych w komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Większość obecnych metod bioanalitycznych dostępnych do pomiaru bioaktywnych lipidów nie jest tak obszerna, ponieważ nie obejmują chiralnej chromatografii normalnej fazy lub SID. Chiralna faza normalna LC ma kluczowe znaczenie dla oddzielenia enancjomerów i możliwości rozróżnienia metabolizmu, w którym pośredniczy enzym lub ROS. Zastosowanie SID zapewnia, że błąd ludzki lub komplikacje, które pojawiają się podczas ekstrakcji lub analizy, są brane pod uwagę podczas kwantyfikacji. Te dodane składniki wraz z ECAPCI-MRM sprawiają, że jest to najbardziej czuła, selektywna metoda dostępna do analizy bioaktywnych lipidów.

1. Mieszanki standardowe i wewnętrzne
<ol>
	<li>Przed ekstrakcją lipidów należy przygotować mieszaninę wzorcową (SM) i mieszankę wzorca wewnętrznego (ISM). Dla SM podniec równoważną objętość 1 μg każdego wzorca (łącznie 25) wymienionego w poniższej tabeli odczynników, używając skalibrowanej strzykawki, do kolby miarowej o pojemności 10 ml. Wysuszyć wzorce w atmosferze azotu i rozpuścić w 10 ml acetonitrylu (ACN). Końcowe stężenie wzorcowej mieszanki wyniesie 100 pg/μL. Podzielić na 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -80°C do momentu potrzeby.</li>
	<li>Z tej wzorcowej mieszaniny można wykonać 6 wzorcowych rozcieńczeń, co daje łącznie 7 wzorców kalibracyjnych (1 pg/ μL, 2 pg/ μL, 5 pg/ μL, 10 pg/ μL, 20 pg/ μL, 50 pg/ μL i 100 pg/ μL). Wzorce te należy przeprowadzać z każdą partią próbek przygotowanych w celu opracowania krzywej kalibracyjnej stosowanej w analizie ilościowej.</li>
	<li>Dla ISM, za pomocą skalibrowanej strzykawki podamy równoważną objętość 1 μg każdego IS (łącznie 14) wymienionego w poniższej tabeli odczynników do kolby miarowej o pojemności 10 ml i wysuszyć w atmosferze azotu. Rozpuść ISM w 10 ml ACN i podziel na 1 ml podwielokrotności. Końcowe stężenie ISM powinno wynosić 100 pg/μL. Współczynnik ISM jest wystarczający do przetworzenia 1000 próbek.</li>
	<li>Przechowuj SM i ISM w temperaturze -80°C.</li>
</ol>
2. Zbiór pożywek i lizat komórkowy
<ol>
	<li>Na każdą 10 cm płytkę przylegających komórek (~ 1 X 107) należy zebrać 3 ml pożywki w szklanej probówce wirówkowej o pojemności 10 ml. Następnie przemyj komórki 2 razy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Dodać 1 ml PBS do płytki, zeskrobać komórki z płytki i pipetować do drugiej szklanej probówki wirówkowej o pojemności 10 ml. W tym momencie komórki i pożywki mogą być przechowywane, jeśli procedura nie będzie w tym czasie kontynuowana. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80°C w przypadku długotrwałego przechowywania lub w temperaturze -20°C przez okres krótszy niż tydzień.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja lipidów z pożywki
<ol>
	<li>Wolne bioaktywne lipidy znajdują się w pożywkach komórkowych i można je łatwo wyekstrahować za pomocą jednoetapowej procedury ekstrakcji l-l. Do zebranych pożywek (2.1) dodać 10 μl ISM. W tym czasie 8 dodatkowych szklanych probówek wirówkowych o pojemności 10 ml powinno być oznaczonych #0-7 dla wzorców kalibracyjnych. Dodać 3 ml PBS do każdej z tych probówek, a następnie dodać 10 μl odpowiedniego SM do probówek 1-7 (1-7 z 1.1).</li>
	<li>Pozostawić ISM do zrównoważenia w każdym wzorcu kalibracyjnym i próbce przez 10 minut, a następnie dodać 5 ml eteru dietylowego. Próbki i wzorce kalibracyjne są następnie umieszczane w wytrząsarce na niskich obrotach przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po wstrząśnięciu wszystkie wzorce kalibracyjne i próbki są odwirowywane przy 1935 x g przez 10 minut. Następnie, za pomocą pipety Pasteura, przenieś górną fazę (organiczną) do nowej szklanej probówki wirówkowej o pojemności 10 ml i wysusz w azocie.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja lipidów z lizatu komórkowego
<ol>
	<li>Odwirowywać próbki komórek w szklanych probówkach wirówkowych o wymiarach 1935 x g przez 5 minut. Usunąć szwadron sklarowany nad osadem; dodać 2 ml PBS do każdej probówki i krótko przetrząsnąć. Pobrać 25 μl próbki w celu ilościowego określenia białka. Białko całkowite zostanie wykorzystane do normalizacji lizatu komórkowego.</li>
	<li>Następnie przenieś połowę mieszaniny lizatu/PBS do oddzielnej szklanej probówki wirówkowej o pojemności 10 ml. Do każdej próbki dodać dodatkowe 2 ml PBS wraz z 10 μl ISM. Postępować zgodnie z procesem ekstrakcji l-l opisanym dla pożywek w ppkt 3.2 i 3.3. Ta podwielokrotność zostanie wykorzystana do pomiaru wolnych lipidów w komórkach i uniknięcia alkalicznej degradacji lipidów, takich jak prostaglandyny. Podwielokrotność ta nie zostanie poddana krokom 4.3 i 4.4 opisanym poniżej.</li>
	<li>Pierwszy etap procesu ekstrakcji estryfikowanego lipidów l-l wymaga dodania 5 ml CHCl3/MeOH (2:1) do każdej z próbek. Próbki umieszcza się w wytrząsarce na niskich obrotach na 30 minut. Po wstrząśnięciu próbki odwirowuje się przy 1935 x g przez 10 minut. Następnie, za pomocą pipety Pasteura, przenieś dolną (organiczną) warstwę ekstrakcji l-l do nowej szklanej probówki wirówkowej o pojemności 10 ml i wysusz próbkę pod azotem.</li>
	<li>Estryfikowane lipidy muszą zostać zmydlone przed oznaczaniem ilościowym. Po wyschnięciu próbek dodaj 0,5 ml 0,4 N KOH w 80% MeOH do każdej probówki. Próbki są następnie inkubowane w temperaturze 60°C przez 1 godzinę. Po inkubacji dodać 2 ml PBS. Dostosuj pH do 6 za pomocą stężonego kwasu HCl (~30 μL). Dodać 10 μl ISM do każdej próbki. Pozostała część procedury jest taka sama, jak ekstrakcja lipidów z pożywki i może być stosowana w ppkt 3.2 i 3.3.</li>
	<li>Jeżeli ekstrakcje te są przeprowadzane równocześnie z próbkami pożywki, te same wzorce kalibracyjne mogą być użyte do opracowania krzywej kalibracyjnej; jednakże, jeśli próbki te są przeprowadzane w innym czasie, wzorce kalibracyjne muszą być również przetwarzane zgodnie z opisem w ppkt 3.1-3.3.</li>
</ol>
5. Derywatyzacja pentaferylobenzylbromku (PFB)
<ol>
	<li>Do wysuszonych próbek i wzorców kalibracyjnych dodać 100 μl bezwodnego dichlorometanu (CH2Cl2), a następnie 100 μl 20% (v/v) N,N-diizopropyloetyloaminy w bezwodnym CH2Cl2 i na koniec 100 μl 20% (v/v) PFB w bezwodnym CH2Cl2. </li>
	<li>Po dodaniu odczynników do derywatyzacji, próbki są wirowane, inkubowane w temperaturze 60°C przez 1 godzinę i suszone w azocie. Próbki i wzorce kalibracyjne mogą być przechowywane w temperaturze -80°C, jeśli nie są analizowane natychmiast, lub w temperaturze -20°C przez okres do jednego tygodnia.</li>
</ol>
6. Stabilne rozcieńczanie izotopów Chiralna chromatografia cieczowa Wychwytywanie elektronów Ciśnienie atmosferyczne Jonizacja chemiczna Spektrometria mas (SID-LC-ECAPCI-MS) Analiza
<ol>
	<li>Wysuszone próbki i wzorce kalibracyjne rozpuszcza się w 100 μl heksanu/etanolu (97:3). Cała próbka może być następnie przeniesiona do fiolki HPLC z wkładką. Umieść próbki w schłodzonym autosamplerze (4°C) i utwórz listę próbek do analizy.</li>
	<li>Następnie należy skonfigurować metody HPLC i MS, korzystając z parametrów opisanych w Tabeli 1 i Tabeli 2 poniżej. Tabela 3 zawiera szczegółowe informacje o związkach, w tym energię przejścia i zderzenia MRM (CE) dla każdego lipidu, a także szacowany czas retencji z analizy Waters 2695/Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra. CE określa się poprzez dostrojenie każdego pojedynczego lipidu podczas opracowywania metody.</li>
	<li>Do normalnej separacji faz używana jest kolumna Chiralpak AD-H (4,6 X 250 mm, 5 μ) podgrzana do 30°C. Wyjściowa faza ruchoma składa się w 98% z heksanu i w 2% z metanolu/izopropanolu (1:1). Po rozdzieleniu HPLC metanol jest dodawany po kolumnie (0,75 ml / min), aby uniknąć osadzania się na igle Corona, co spowodowałoby zmniejszenie czułości. MS jest ustawiony w trybie jonów ujemnych za pomocą źródła APCI. Jeśli źródło musi zostać zmienione z ESI na APCI, pamiętaj o włożeniu igły Corona.</li>
	<li>Pierwszą próbką, którą należy przeprowadzić, jest zawsze ślepa próba heksanu. Pozwoli to zrównoważyć kolumnę, a także ujawni, czy na kolumnie znajdują się jakiekolwiek zanieczyszczenia, które mogą zakłócać wzorc kalibracji i analizę próbki.</li>
	<li>Następne serie próbek powinny być próbkami wzorcowymi kalibracyjnymi w kolejności 0-7 (rosnące stężenie SM). Wzorce te zostaną wykorzystane do stworzenia krzywej kalibracyjnej zawierającej stosunek powierzchni wzorcowej/powierzchni IS na osi y do stężenia lub masy wzorca na osi x. Z równania y = mx + b uzyskanego z tego wykresu, stosunek powierzchni próbki do powierzchni IS (y) można wykorzystać do określenia ilości lub stężenia próbki (nieznanej) (x).</li>
	<li>Ilość bioaktywnych lipidów znajdujących się w pożywce można znormalizować do całkowitej objętości pożywki, a ilość lipidów znajdujących się w lizacie komórkowym można znormalizować do całkowitej liczby komórek / płytki lub ilości całkowitego białka / płytki. W trakcie 4.1 protokołu należy podjąć środki w celu zapewnienia, że komórki są zliczane lub że białko jest oznaczane ilościowo.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki:
Chromatogramy na rysunku 1 są reprezentatywne dla docelowego profilu lipidomicznego. Pierwszy panel (rysunek 1A) przedstawia 13- i 9-HODE wraz z odpowiadającymi im 13- i 9-oksoODE, pochodzącymi z kwasu linolowego. Ponadto 15-oxoETE, utleniony metabolit 15-HETE jest również pokazany w drugim panelu. Dwa dolne panele pokazują 20-HETE i 20-HETE-IS, [2H6]-20-HETE. Rysunek 1B przedstawia separację i unikalne przejścia wyznaczone dla stereoizomerów HOTE, które wynikają z enzymatycznego utleniania AA lub ROS. Rysunek 1C przedstawia PGs, isoP i LTB4. Niektóre normy nie mają deuterowanego azotu inwazyjnego dostępnego na rynku; w związku z tym do kwantyfikacji stosuje się stabilizację obrazu, która jest podobna pod względem czasu przechowywania. Na przykład [2H8]-12(S)-HETE służy do ilościowego oznaczania gatunków 11-HETE i 8-HETE oprócz 12(R)-HETE i 12(S)-HETE.
Z reprezentatywnych chromatogramów widać, że istnieje niewielka zmiana w zachowaniu deuterowanego IS w porównaniu do nieoznakowanego wzorca. To przesunięcie do późniejszego czasu retencji jest wynikiem interakcji deuteru z kolumną normalnej fazy. Deuter jest bardziej polarny niż wodór; W związku z tym istnieje silniejsza interakcja z normalną fazą kolumny. Gdyby ta separacja odbywała się przy użyciu kolumny o odwróconej fazie, przesunięcie nastąpiłoby do wcześniejszego czasu retencji, ponieważ bardziej polarna część miałaby słabszą interakcję z odwróconą fazą.
<img src="/files/ftp_upload/3399/3399fig1.jpg" alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Rysunek ten jest reprezentatywnym przykładem ukierunkowanej analizy lipidomicznej. Rysunek 1A przedstawia chromatogramy jonów całkowitych (TIC) dla kilku utlenionych metabolitów LA i AA, w tym 13-oksoODE i 9-oksoODE w pierwszym panelu, 15-oksoETE w drugim panelu, 13-HODE i 9-HODE (panele 3 i 5) oraz 20-HETE (panel 7). HODEs i 20-HETE mają odpowiadający im deuterowany IS w poniższym panelu (4, 6 i 8). TIC na rysunku 2B pokazują separację i unikalne przejścia stereoizomerów HETE pochodzących z AA. Rysunek 2C przedstawia PG, isoP i LT. Energia zderzenia (CE), przejścia MRM i czas retencji (RT, min) zostały zoptymalizowane przy użyciu Waters 2695 LC sprzężonego z Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra i są wymienione w tabeli 3 dla każdego związku.
<obramowanie tabeli="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Czas (min)</td>
			<td>% A</td>
			<td>% B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>Rozdział 98</td>
			<td>cyfra arabska</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Rozdział 98</td>
			<td>cyfra arabska</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>96,4</td> pkt.
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>Rozdział 92</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Rozdział 27</td>
			<td>Rozdział 92</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdział 30</td>
			<td>50</td> Rozdział
			<td>50</td> Rozdział
		</tr>
		<tr>
			<td>38 Rozdział 38</td>
			<td>50</td> Rozdział
			<td>50</td> Rozdział
		</tr>
		<tr>
			<td>39 Rozdział 39</td>
			<td>Rozdział 98</td>
			<td>cyfra arabska</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdział 45</td>
			<td>Rozdział 98</td>
			<td>cyfra arabska</td>
		</tr>
	</tbody>

Tabela 1. Warunki gradientu HPLC dla chiralnego rozdzielania lipidomiki w fazie normalnej. Rozpuszczalnik A to 100% heksany, a rozpuszczalnik B to metanol/izopropanol (1:1).
<obramowanie tabeli="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametr spektrometrii mas</td>
			<td>ustawienie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>źródło</td>
			<td>APCI (Wirus APCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryb</td>
			<td>Jon ujemny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Długość metody</td>
			<td>Czas trwania: 40 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szerokość skanowania MRM</td>
			<td>0,002 m/z</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas skanowania MRM</td>
			<td>0,15 sekundy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szerokość piku MRM</td>
			<td>0,70 FWHM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soczewka tubusu</td>
			<td>164 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Źródło: CID</td>
			<td>10 eV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaz kolizyjny Q2</td>
			<td>1,5 jednostki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura waporyzatora</td>
			<td>450°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura kapilar</td>
			<td>250°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prąd rozładowania</td>
			<td>0 μA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciśnienie gazu w osłonie</td>
			<td>25 jednostek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciśnienie wymiatania jonów</td>
			<td>3 jednostki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomocnicze ciśnienie gazu</td>
			<td>5 jednostek</td>
		</tr>
	</tbody>

Tabela 2. Powyżej wymieniono zoptymalizowane parametry spektrometrii mas do pomiaru bioaktywnych lipidów. Parametry te pochodzą z Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.
<obramowanie tabeli="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>związek</td>
			<td>przejście</td>
			<td>CE (eV)</td>
			<td>Kąt względny (min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13-oksoodowy</td>
			<td>293,03 → 113,10</td>
			<td>21</td>
			<td>Pytanie 9,9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-oksoodowy</td>
			<td>293,03 → 113,10</td>
			<td>21</td>
			<td>Pytanie 17,9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-oksoETE</td>
			<td>317,05 → 113,18</td>
			<td>Rozdział 18</td>
			<td>Rozdział 8.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13(R)-HODE</td>
			<td>295,03 → 195,12</td>
			<td>Rozdział 18</td>
			<td>Rozdział 12,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13(S)-HODE</td>
			<td>295,03 → 195,12</td>
			<td>Rozdział 18</td>
			<td>Rozdział 14,8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-13(S)-HODE</td>
			<td>299,03 → 198,12</td>
			<td>Rozdział 18</td>
			<td>Norma 14,9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9(R)-HODE</td>
			<td>295,03 → 171,10</td>
			<td>Rozdział 18</td>
			<td>13,7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9(S)-HODE</td>
			<td>295,03 → 171,10</td>
			<td>Rozdział 18</td>
			<td>Rozdział 21,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-9(S)-HODE</td>
			<td>299,03 → 172,12</td>
			<td>Rozdział 18</td>
			<td>Rozdział 21,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-HEKTAROWY</td>
			<td>319,03 → 289,10</td>
			<td>Rozdział 18</td>
			<td>Rozdział 12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H6]-20-HETE</td>
			<td>325,03 → 295,10</td>
			<td>Rozdział 18</td>
			<td>Rozdział 12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(R)-HETE</td>
			<td>319,04 → 115,04</td>
			<td>16</td>
			<td>Rozdział 15,7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(S)-HETE</td>
			<td>319,04 → 115,04</td>
			<td>16</td>
			<td>Rozdział 16,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-5(S)-HETE</td>
			<td>327,04 → 116,04</td>
			<td>16</td>
			<td>Rozdział 16,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12(R)-HETE</td>
			<td>319,04 → 179,11</td>
			<td>14</td>
			<td>Pytanie 11,7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12(S)-HETE</td>
			<td>319,04 → 179,11</td>
			<td>14</td>
			<td>Rozdział 12.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-12(S)-HETE</td>
			<td>327,13 → 184,11</td>
			<td>14</td>
			<td>Rozdział 12,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15(R)-HETE</td>
			<td>319,04 → 219,12</td>
			<td>13</td>
			<td>Rozdział 12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15(S)-HETE</td>
			<td>319,04 → 219,12</td>
			<td>13</td>
			<td>Rozdział 15,9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-15(S)-HETE</td>
			<td>327,03 → 226,12</td>
			<td>13</td>
			<td>Rozdział 16.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(R)-HETE</td>
			<td>319,04 → 167,11</td>
			<td>16</td>
			<td>Rozdział 11.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(S)-HETE</td>
			<td>319,04 → 167,11</td>
			<td>16</td>
			<td>Rozdział 12,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8(R)-HETE</td>
			<td>319,04 → 155,09</td>
			<td>16</td>
			<td>Pytanie 11,7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8(S)-HETE</td>
			<td>319,04 → 155,09</td>
			<td>16</td>
			<td>Rozdział 12,6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zobacz materiał LTB4</td>
			<td>335,03 → 195,10</td>
			<td>Rozdział 18</td>
			<td>32,0</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>[2godz.4]-LTB4</td>
			<td>339,03 → 197,10</td>
			<td>Rozdział 18</td>
			<td>32,0</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>PGE2</td>
			<td>351,03 → 271,15</td>
			<td>Rozdział 18</td>
			<td>Dnia 31,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2godz.4]-PGE2</td>
			<td>355,03 → 275,15</td>
			<td>Rozdział 18</td>
			<td>Dnia 31,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zobacz materiał PGD2</td>
			<td>351,03 → 271,15</td>
			<td>25</td>
			<td>32,5</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGD2</td>
			<td>355,03 → 275,15</td>
			<td>25</td>
			<td>32,5</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>8-iso-PGE2</td>
			<td>351,03 → 271,15</td>
			<td>Rozdział 18</td>
			<td>37,4</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>11β-PGF2</td>
			<td>353,03 → 193,11</td>
			<td>25</td>
			<td>27,6</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-11β-PGF2</td>
			<td>357,03 → 197,11</td>
			<td>25</td>
			<td>27,6</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>PGF2α</td>
			<td>353,03 → 193,11</td>
			<td>25</td>
			<td>Pytanie 33,1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGF2α</td>
			<td>357,03 → 197,11</td>
			<td>25</td>
			<td>Pytanie 33,1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-iso-PGF2α</td>
			<td>353,03 → 193,11</td>
			<td>25</td>
			<td>34,4</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-8-iso-PGF 2α</td>
			<td>357,03 → 197,11</td>
			<td>25</td>
			<td>34,4</td> pkt.
		</tr>
	</tbody>

Tabela 3. W poniższej tabeli wymieniono związki wykryte w chromatogramach jonów całkowitych na rysunku 1A-C. Druga kolumna zawiera przejście używane dla MRM/MS, trzecia kolumna zawiera energię zderzenia (CE, eV), a ostatnia kolumna zawiera czas retencji (RT, min). Parametry zostały zoptymalizowane przy użyciu modułu separacyjnego Waters 2695 sprzężonego z Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.</obramowanie></obramowanie></obramowanie>

<ol><li>Needleman, P., Turk, J., Jakschik, B. A., Morrison, A. R., Lefkowith, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arachidonic+acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Arachidonic acid metabolism.</a> Annu. Rev. Biochem. 55, 69-102 (1986).</li>
<li>Nikolaev, V., Reddanna, P., Whelan, J., Hildenbrandt, G., Reddy, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereochemical+nature+of+the+products+of+linoleic+acid+oxidation+catalyzed+by+lipoxygenases+from+potato+and+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Stereochemical nature of the products of linoleic acid oxidation catalyzed by lipoxygenases from potato and soybean.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 170, 491-496 (1990).</li>
<li>Panigrahy, D., Kaipainen, A., Greene, E. R., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450-derived+eicosanoids%3A+the+neglected+pathway+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Metastasis.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450-derived eicosanoids: the neglected pathway in cancer.</a> Cancer. Metastasis. Rev. 29, 723-735 (2010).</li>
<li>Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+eicosanoids%3A+role+of+prostaglandin+F%282alpha%29+and+F-isoprostanes+in+inflammation+and+oxidative+stress+related+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Bioactive eicosanoids: role of prostaglandin F(2alpha) and F-isoprostanes in inflammation and oxidative stress related pathology.</a> Mol. Cells. 30, 383-391 (2010).</li>
<li>Sanchez-Mejia, R. O., Mucke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+A2+and+arachidonic+acid+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Phospholipase A2 and arachidonic acid in Alzheimer's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1801, 784-790 (2010).</li>
<li>Hersberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+the+lipoxygenase+derived+lipid+mediators+in+atherosclerosis%3A+leukotrienes%2C+lipoxins+and+resolvins%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem.+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Potential role of the lipoxygenase derived lipid mediators in atherosclerosis: leukotrienes, lipoxins and resolvins.</a> Clin. Chem. Lab Med. 48, 1063-1073 (2010).</li>
<li>Allayee, H., Roth, N., Hodis, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+and+cardiovascular+disease%3A+implications+for+nutrigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nutrigenet.+Nutrigenomics%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids and cardiovascular disease: implications for nutrigenetics.</a> J. Nutrigenet. Nutrigenomics. 2, 140-148 (2009).</li>
<li>Capdevila, J. H., Falck, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+molecular+properties+of+the+cytochrome+P450+arachidonic+acid+monooxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Other+Lipid+Mediat%22%5BJournal%5D)">Biochemical and molecular properties of the cytochrome P450 arachidonic acid monooxygenases.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediat. , 68-69 (2002).</li>
<li>Ciccimaro, E., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+dilution+LC-MS+for+quantitative+biomarker+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis.</a> Bioanalysis. 2, 311-341 (2010).</li>
<li>Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron-capture+negative-ion+chemical+ionization+mass-spectrometry+of+lipid+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Electron-capture negative-ion chemical ionization mass-spectrometry of lipid mediators.</a> Methods in Enzymology. 187, 13-23 (1990).</li>
<li>Singh, G., Gutierrez, A., Xu, K., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+chromatography%2Felectron+capture+atmospheric+pressure+chemical+ionization%2Fmass+spectrometry%3A+analysis+of+pentafluorobenzyl+derivatives+of+biomolecules+and+drugs+in+the+attomole+range%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Liquid chromatography/electron capture atmospheric pressure chemical ionization/mass spectrometry: analysis of pentafluorobenzyl derivatives of biomolecules and drugs in the attomole range.</a> Analytical Chemistry. 72, 3007-3013 (2000).</li>
<li>Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlair%2C+IA+%22Encyclopedia+of+Mass+Spectrometry%22">Encyclopedia of Mass Spectrometry</a>. Capriol, R. M., Gross, M. L. , Elsevier. 283-307 (2005).</li>
<li>Lee, S. H., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+chiral+lipidomics+analysis+by+liquid+chromatography+electron+capture+atmospheric+pressure+chemical+ionization+mass+spectrometry+%28LC-ECAPCI%2FMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Targeted chiral lipidomics analysis by liquid chromatography electron capture atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry (LC-ECAPCI/MS).</a> Methods in Enzymology. 433, 159-174 (2007).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Standardy i wzorce wewnętrzne stosowane w tym protokole stanowią reprezentację ukierunkowanej metody lipidomicznej. Do analizy LC-MS użyto modułu separacyjnego Waters 2695 i Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra, a optymalne ustawienia parametrów można znaleźć w tabelach 1 i 2. Ponadto ten protokół ekstrakcji został zaprojektowany dla komórek przylegających, ale może być modyfikowany dla innych typów komórek, a także innych matryc biologicznych, w tym moczu, krwi i tkanek. Wiele wzorców lipido...

<table><tbody><tr><td>5-okso-6E,8Z,11Z,14Z-eikozatetraenoic-6,8,9,11,12,14,15-d7 kwas</td><td>Cayman Chemical</td><td>334250</td><td>[2H7]-5-ox&#8211;TE</td></tr><tr><td>5S-hydroksy-6E,8Z,11Z,14Z-eikozatetraenowy-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 Kwas</td><td>Cayman Chemical</td><td>334230</td><td>[2H8]-5(S)-HETE Wewnętrzny standard</td></tr><tr><td>12S-hydroksy-5Z,8Z,10E,14Z-eikozatetraenowy-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>334570</td><td>[2H8]-12(S)-HETE</td></tr><tr><td>15S-hydroxy-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8</td><td>acid Cayman Chemical</td><td>334720</td><td>[2H8]-15(S)-HETE Wzorzec wewnętrzny</td></tr><tr><td>20-hydroksy-5Z,8Z,11Z,14Z-eikozatetraenowy-16,16,17,17,18,18-d6</td><td>Kwas Cayman Chemical</td><td>390030</td><td>[2H6]-20-HETE Wzorzec wewnętrzny</td></tr><tr><td>9S-hydroksy-10E,12Z-oktadecadienoik-9,10,12,13-d4</td><td>Cayman Chemical</td><td>338410</td><td>[2H4]-9(S)-HODE Wewnętrzny standard</td></tr><tr><td>Kwas 13S-hydroksy-9Z,11E-oktadecadienoi-9,10,12,13-d4</td><td>Cayman Chemical</td><td>338610</td><td>[2H4]-13(S)-HODE 9</td></tr><tr>&<td>alpha;,11&alpha;,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>316010</td><td>[2H4]-PGF2&alpha; Wzorzec wewnętrzny</td></tr><tr><td>9&alfa;,11&alfa;,15S-trihydroksy-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>316350</td><td>[2H4]-8-iso-PGF2a Wzorzec wewnętrzny</td></tr>9<tr><td>&alpha;,11&#946;.,15S-trihydroksy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 Kwas</td><td>Cayman Chemical</td><td>10008989</td><td>[2H4]-11&#946;-PGF2 Wzorzec wewnętrzny</td></tr><tr><td>9&alfa;,15S-dihydroksy-11-okso-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>312010</td><td>[2H4]-PGD2 Wzorzec wewnętrzny</td></tr><tr><td>9-oxo-11&alpha;,15S-dihydroksy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>314010</td><td>[2H4]-PGE2 Wzorzec wewnętrzny</td></tr><tr><td>5S,12R-dihydroksy-6Z,8E,10E,14Z-eikozatetraen-6,7,14,15-d4 Kwas</td><td>Cayman Chemical</td><td>320110</td><td>[2H4]-LTB4 Wzorzec wewnętrzny</td></tr><tr><td>9&alfa;,11,15S-trihydroksy-tromba-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 Kwas</td><td>Cayman Chemical</td><td>319030</td><td>[2H4]-TxB2 Wzorzec wewnętrzny</td></tr><tr><td>Kwas 5-okso-6E,8Z,11Z,14Z-eikozatetraenowy</td><td>Kajman Chemiczny</td><td>34250</td><td>5-ox&#8211;TE Standardowy</td></tr><tr><td>12-okso-5Z,8Z,10E,14Z-eikozatetraenowy Kwas</td><td>Cayman Chemical</td><td>34580</td><td>12-ox&#8211;TE Standard</td></tr><tr><td>15-oxo-5Z, Kwas 8Z,11Z,13E-eikozatetraenowy</td><td>Cayman Chemical</td><td>34730</td><td>15-ox&#8211;TE Standard</td></tr><tr><td>5R-hydroksy-6E,8Z,11Z,14Z-eikozatetraenowy Kwas</td><td>Cayman Chemical</td><td>34225</td><td>5(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>5S-hydroksy-6E,8Z,11Z,14Z-eikozatetraenowy Kwas</td><td>Cayman Chemical</td><td>34230</td><td>5(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>8R-hydroksy-5Z,9E,11Z, Kwas 14Z-eikozatetraenowy</td><td>Cayman Chemical</td><td>34350</td><td>8(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>8S-hydroksy-5Z,9E,11Z,14Z-kwas eikozatetraenowy</td><td>Cayman Chemical</td><td>34360</td><td>8(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>11R-hydroksy-5Z,8Z,12E,14Z-eikozatetraenowy Kwas</td><td>Cayman Chemical</td><td>34505</td><td>11(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>11S-hydroksy-5Z,8Z,12E, Kwas 14Z-eikozatetraenowy</td><td>Cayman Chemical</td><td>34510</td><td>11(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>12R-hydroksy-5Z,8Z,10E,14Z-eikozatetraenowy Kwas</td><td>Cayman Chemical</td><td>34560</td><td>12(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>12S-hydroksy-5Z,8Z,10E,14Z-eikozatetraenowy Kwas</td><td>Cayman Chemical</td><td>34570</td><td>12(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>15R-hydroksy-5Z,8Z,11Z, Kwas 13E-eikozatetraenowy</td><td>Cayman Chemical</td><td>34710</td><td>15(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>15S-hydroksy-5Z,8Z,11Z,13E-eikozatetraenowy</td><td>Cayman Chemical</td><td>34720</td><td>15(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>20-hydroksy-5Z,8Z,11Z,14Z-eikozatetraenowy Kwas</td><td>Cayman Chemical</td><td>90030</td><td>20-HETE Standard</td></tr><tr><td>9R-hydroksy-10E,12Z-oktadekadienowy kwas</td><td>Cayman Chemical</td><td>38405</td><td>9(R)-HODE Standard</td></tr><tr><td>9S-hydroksy-10E,12Z-oktadekadienowy kwas</td><td>Cayman Chemical</td><td>38410</td><td>9(S)-HODE Standard</td></tr><tr><td>13R-hydroksy-9Z,11E-oktadekadienowy kwas</td><td>Cayman Chemical</td><td>38605</td><td>13(R)-HODE Standard</td></tr><tr><td>13S-hydroksy-9Z,11E-oktadekadienowy kwas</td><td>Cayman Chemical</td><td>38610</td><td>13(S)-HODE Standard</td></tr><tr><td>9&alfa;,11&alfa;,15S-trihydroksy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic Kwas</td><td>Cayman Chemical</td><td>16010</td><td>PGF2&alfa; Standardowy</td></tr><tr><td>9&alfa;,11&alfa;,15S-trihydroksy-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic Kwas</td><td>Kajman Chemiczny</td><td>16350</td><td>8-iso-PGF2&alfa; Standardowy</td></tr><tr><td>9&alfa;,11&#946;,15S-trihydroksy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic</td><td>acid Cayman Chemical</td><td>16520</td><td>11&#946;-PGF2 Standard</td></tr><tr><td>9&alfa;,15S-dihydroksy-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>12010</td><td>PGD2 Standard</td></tr><tr><td>9-oxo-11&alpha;,15S-dihydroksy-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>14350</td><td>8-iso-PGE2 Standard</td></tr><tr><td>9-okso-11&alfa;,15S-dihydroksy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic</td><td>Cayman Chemical</td><td>14010</td><td>PGE2 Norma</td></tr><tr><td>5S,12R-dihydroksy-6Z,8E,10E,14Z-eikozatetraenowy Kwas</td><td>Cayman Chemical</td><td>20110</td><td>LTB4 Norma</td></tr><tr><td>Kwas 9&alfa;,11,15S-trihydroksytromba-5Z,13E-dien-1-oic</td><td>Cayman Chemical</td><td>19030</td><td>TxB2 Standardowa</td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>GIBCO, firmy Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>346136</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Acros Organics</td><td>61030-1000</td><td>bezwodny</td></tr><tr><td>N,N-diizopropyloetyloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387649</td><td></td></tr><tr><td>Bromek pentafonylobenzylu</td><td>Kwas solny Sigma-Aldrich</td><td>101052</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Fluka</td><td>00650</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H303-4</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A464-4</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td>Fisher Scientific</td><td>W7-4</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Szklane probówki wirówkowe</td><td>Kimble Chase</td><td>73785-10</td><td>Zakrętki</td></tr><tr><td>fenolowe</td><td>Kimble Chase</td><td>73802-13415</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Chiralcel ADH</td><td>Chiral Technologies</td><td>19325</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki HPLC</td><td>Wody</td><td>60000751CV</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki HPLC</td><td>Wody</td><td>WAT094171</td><td></td></tr></tbody></table>

ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Metabolizm kwasów tłuszczowych, takich jak kwas arachidonowy (AA) i kwas linolowy (LA), powoduje powstawanie utlenionych bioaktywnych lipidów, w tym licznych stereoizomerów1,2. Metabolity te mogą powstawać z wolnych lub estryfikowanych kwasów tłuszczowych. Wiele z tych utlenionych metabolitów ma aktywność biologiczną i jest związanych z różnymi chorobami, w tym chorobami sercowo-naczyniowymi i neurodegeneracyjnymi, astmą i rakiem3-7. Utlenione bioaktywne lipidy mogą być tworzone enzymatycznie lub przez reaktywne formy tlenu (ROS). Enzymy metabolizujące kwasy tłuszczowe obejmują cyklooksygenazę (COX), lipooksygenazę (LO) i cytochromy P450 (CYPs)1,8. Metabolizm enzymatyczny powoduje tworzenie enancjoselektywne, podczas gdy utlenianie ROS powoduje racemiczne tworzenie produktów.
Chociaż ten protokół skupia się głównie na analizie bioaktywnych metabolitów pochodzących z AA- i niektórych LA, można go łatwo zastosować do metabolitów innych kwasów tłuszczowych. Bioaktywne lipidy są ekstrahowane z lizatu komórkowego lub pożywki za pomocą ekstrakcji ciecz-ciecz (L-L). Na początku procesu ekstrakcji l-l dodaje się wewnętrzne wzorce stabilnych izotopów w celu uwzględnienia błędów podczas przygotowywania próbki. Rozcieńczenie izotopu stabilnego (SID) uwzględnia również wszelkie różnice, takie jak tłumienie jonów, które mogą wystąpić metabolitów podczas analizy spektrometrii mas (MS)9. Po ekstrakcji, w celu zwiększenia czułości wykrywania, stosuje się derywatyzację odczynnikiem do wychwytywania elektronów (EC), bromkiem pentafluorylobenzylu (PFB)10,11. Monitorowanie reakcji wielokrotnych (MRM) stosuje się w celu zwiększenia selektywności analizy MS. Przed analizą stwardnienia rozsianego lipidy są rozdzielane za pomocą chiralnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w fazie normalnej. Warunki HPLC są zoptymalizowane w celu oddzielenia enancjomerów i różnych stereoizomerów monitorowanych lipidów12. Ta specyficzna metoda LC-MS monitoruje prostaglandyny (PG), izoprostany (isoP), kwasy hydroksyeikozatetraenowe (HETE), kwasy hydroksyoktadekadienowe (HODE), kwasy oksoeikozatetraenowe (oxoETE) i kwasy oksooktadekadienowe (oxoODE); jednak parametry HPLC i MS można zoptymalizować tak, aby zawierały dowolne metabolity kwasów tłuszczowych13.
Większość obecnie dostępnych metod bioanalitycznych nie uwzględnia oddzielnej kwantyfikacji enancjomerów. Jest to niezwykle ważne przy próbie wywnioskowania, czy metabolity zostały utworzone enzymatycznie, czy przez ROS. Dodatkowo, proporcje enancjomerów mogą dostarczyć dowodów na specyficzny enzymatyczny szlak powstawania. Zastosowanie SID pozwala na dokładne określenie ilościowe metabolitów i uwzględnia wszelkie straty próbki podczas przygotowania, a także różnice występujące podczas jonizacji. Użycie odczynnika do wychwytywania elektronów PFB zwiększa czułość detekcji o dwa rzędy wielkości w porównaniu z konwencjonalnymi metodami APCI. Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda, jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym SID-LC-EC, APCI-MRM/MS, jest jedną z najbardziej czułych, selektywnych i dokładnych metod oznaczania ilościowego bioaktywnych lipidów.

Ten protokół pokaże ekstrakcję i analizę wolnych i estryfikowanych bioaktywnych kwasów tłuszczowych z komórek. Kwasy tłuszczowe są dokładnie oznaczane ilościowo za pomocą rozcieńczania stabilnych izotopów, chiralnej chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, atmosferycznej jonizacji chemicznej, wielokrotnego monitorowania spektrometrii mas (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Metoda ma na celu dokładne ilościowe określenie bioaktywnych metabolitów lipidowych w komórkach poprzez połączenie rozcieńczania stabilnego izotopu, fazy cnor, chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, ciśnienia atmosferycznego, jonizacji chemicznej i spektrometrii mas. Zacznij od zebrania zarówno pożywki, jak i próbek komórek, a następnie dodaj ciężką mieszankę wzorców wewnętrznych znakowaną izotopami. Ekstrahuj bioaktywne lipidy rozpuszczalnikiem organicznym, a następnie wyprowadź bioaktywne lipidy za pomocą odczynnika do wychwytywania elektronów, przystąp do precyzyjnego ilościowego oznaczania bioaktywnych lipidów za pomocą chromatografii cieczowej.Spektrometria mas poprzez analizę LCMS zarówno lizatu komórkowego, jak i wyników pożywek precyzyjnie określa stężenie docelowych bioaktywnych lipidów oraz poziomy poszczególnych ER Anant. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami, spektrometria mas i inne metody LCMS, jest to, że poszczególne osobniki i pylniki są dokładnie oznaczane ilościowo za pomocą samochodowej chromatografii normalnej fazy i stabilizowanego rozcieńczania izotopów. Uzyskane dane mogą dostarczyć cennych informacji na temat szlaków enzymatycznych funkcjonujących w komórce.Na każdą 10-centymetrową płytkę przylegającego komórki zbierają trzy mililitry pożywki w 10-mililitrowej szklanej probówce wirówkowej. Następnie dwukrotnie umyj komórki PBS. Następnie dodaj jeden mililitr PBS, zeskrob komórki z płytki i przenieś próbkę do drugiej do 10-mililitrowej szklanej probówki wirówkowej.Przygotuj osiem dodatkowych probówek z trzema mililitrami PBS do krzywej kalibracyjnej. Następnie do każdej probówki dodać 10 mikrolitrów odpowiedniego wzorca kalibracyjnego. Wyrównaj każdą próbkę testową z trzech mililitrów zebranych pożywek do hodowli komórkowych w celu ekstrakcji wolnych bioaktywnych lipidów.Dodać 10 mikrolitrów wewnętrznej mieszanki wzorcowej do każdego wzorca kalibracyjnego i zrównoważyć próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby przetworzyć próbki w pięciu mililitrach eteru datylu i umieścić na wytrząsarce na 30 minut. Odwirować próbki i przenieść górną fazę organiczną do 10-mililitrowych szklanych probówek wirówkowych. Kontynuuj suszenie próbek pod azotem Najpierw zbierz zebrane próbki komórek przez odwirowanie i ponownie zawieś każdą paletę w dwóch mililitrach PBS przez Vortex Reserve 25 mikrolitrów każdej próbki do normalizacji lizatu komórkowego.Teraz równo podziel każdy lizat na 10-mililitrowe szklane probówki wirówkowe. Dodaj dodatkowe dwa mililitry PBS i 10 mikrolitrów ISM do każdej próbki w celu zmierzenia wolnych lipidów komórkowych i uniknięcia alkalicznej degradacji lipidów, takich jak prostaglandyny, użyj jednego z duplikatów każdej próbki do przeprowadzenia ekstrakcji eterem dathyl, jak pokazano wcześniej. Aby wyekstrahować estryfikowane lipidy, dodaj pięć mililitrów mieszaniny metanolu chloroformu do każdej z pozostałych próbek.Umieść na wytrząsarce na niskich obrotach na 30 minut, a następnie odwiruj przez 10 minut. Teraz zbierz dolną warstwę organiczną i wysusz próbki pod azotem, aby sify estryfikowane lipidy. Dodaj 0,5 mililitra 0,4 normalnego wodorotlenku potasu w 80% metanolu do każdej probówki.Inkubować próbki w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie dodaj dwa mililitry PBS i dostosuj pH dwa sześć stężonym kwasem solnym. Na koniec dodaj 10 mikrolitrów ISM do każdej próbki i przystąp do ekstrakcji eterem dathyl do wysuszonych próbek i wzorców kalibracyjnych.Dodaj odczynniki do derywatizacji w określonej kolejności. Następnie należy wirować próbki i inkubować w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę. Teraz wysusz próbki pod azotem przed przechowywaniem i analizą.Metoda ta wykorzystuje kombinację rozcieńczania stabilnych izotopów, chii, chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, ciśnienia atmosferycznego, jonizacji chemicznej i analizy spektrometrii mas. Rozpuść próbki i wzorce kalibracyjne w 100 mikrolitrach etanolu heksanu i przenieś całe próbki do fiolek HPLC z wkładką, umieść próbki w schłodzonym próbniku automatycznym. Utwórz przykładową listę do analizy.Następnie należy skonfigurować metody HPLC i MS, korzystając z parametrów opisanych w tabeli pierwszej i tabeli drugiej w dołączonym pisemnym protokole dla normalnej separacji faz. Pakiet chiralny, kolumna DH do 30 stopni Celsjusza, wstrzyknąć próbkę i rozpocząć bieg. Teraz ustaw MS w trybie jonów ujemnych za pomocą źródła A PCI.Zacznij od ślepego półfabrykatu heksanu, aby zrównoważyć kolumnę. Następnie uruchom próbki wzorcowe do kalibracji w kolejności zwiększania stężenia SM. Kontynuować przetwarzanie próbek testowych pożywek hodowlanych po oddzieleniu HBLC.Dodaj kolumnę z metanolem, aby uniknąć osadzania się na igle koronowej. Korzystanie z danych wygenerowanych na podstawie standardów. Utwórz krzywą kalibracyjną wykreślającą obszar próbki na osi Y, a standardowe stężenie na osi x wyprowadza równanie Y równa się MX plus B.Na koniec należy określić stężenia bioaktywnych lipidów w próbce badanej dla komórki. Lizaty. Normalizuj te wartości, dzieląc określone stężenie bioaktywnego lipidu przez liczbę komórek na płytce lub całkowite białko znormalizowane w poprzednich krokach. Dane z monitorowania wielu reakcji wskazują na kilka kwasów linolowych i arachidonowych.Utlenione metabolity. 13 i dziewięć, trzymają się wraz z odpowiadającymi im 13 i dziewięcioma Oxo ode pochodzą z kwasu linolowego. Ponadto, zgodnie z oczekiwaniami, metabolity ciepła kwasu arachidonowego i ich utlenione produkty są również obecne.Istnieje niewielka zmiana w czasie retencji obniżonego standardu wewnętrznego w porównaniu z wzorcem nieoznakowanym. Co ważne, protokół ten oddziela również ciepło i pylstry oraz określa unikalne przejścia dla izomerów stereo, które mogą wynikać z enzymatycznego utleniania kwasu arachidonowego lub reakcji z reaktywnymi formami tlenu. Na przykład ten chromatogram pokazuje separację między izomerami stereo r i s wynoszącymi pięć.Analiza lipidomiczna ciepła jest potężną techniką analizy wielu gatunków lipidów. Na przykład w tym eksperymencie oceniane i ilościowe określa prostaglandyny, izop seny i leukotrien B cztery. Oprócz ciepła spożywanego przez Oxo i hydroksylowanych metabolitów omega, metoda ta może być zoptymalizowana pod kątem ekstrakcji bioaktywnych lipidów z innych matryc biologicznych, takich jak osocze, mocz i tkanki.W niektórych przypadkach bioaktywne lipidy były wykorzystywane jako biomarkery odpowiedzi na stres oksydacyjny.

cellular-lipid-extraction-for-targeted-stable-isotope-dilution-liquid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiono dwie techniki izolowania kropelek lipidów komórkowych z 1) komórek drożdży i 2) ludzkich łożysk. Centralnym elementem obu procedur jest wirowanie w gradionym gradimencie gęstości, w którym powstałą pływającą warstwę zawierającą kropelki można łatwo zwizualizować za pomocą oka, wyekstrahować i określić ilościowo za pomocą analizy Western Blot w celu uzyskania czystości.

Izolacja kropelek lipidów komórkowych: dwie techniki oczyszczania, zaczynając od komórek drożdży i ludzkich łożysk

Fosfoinozydy to lipidy sygnalizacyjne, których względna obfitość szybko zmienia się w odpowiedzi na różne bodźce. W artykule opisano metodę pomiaru obfitości fosfoinozytydów poprzez metaboliczne znakowanie komórek 3 H-mio-inozytolem, a następnie ekstrakcję i deacylację. Wyekstrahowane glicero-inozytydy są następnie rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i oznaczane ilościowo przez scyntylację przepływową.

Znakowanie radioaktywne i oznaczanie ilościowe poziomów komórkowych fosfoinozytydów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z przepływem

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Przedstawiono protokół kompleksowej ekstrakcji lipidów, metabolitów i białek z tkanek biologicznych przy użyciu jednej próbki.

Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia i kwalifikacji każdego gatunku sfingomieliny za pomocą monitorowania wielu reakcji i trybu MS/MS/MS, odpowiednio.

Ilościowa i jakościowa metoda oznaczania sfingomieliny metodą LC-MS przy użyciu dwóch stabilnych izotopowo znakowanych gatunków sfingomieliny

Ten artykuł przedstawia modułowy protokół dla lipidomiki tkankowej i transkryptomiki oraz lipidomiki osocza w mysich modelach chorób neurologicznych ukierunkowanych na lipidy leżące u podstaw stanu zapalnego i aktywności neuronalnej, lipidy błonowe, dalsze przekaźniki oraz enzymy/receptory kodujące mRNA leżące u podstaw funkcji lipidów. Przedstawiono procedury pobierania próbek, przetwarzania próbek, ekstrakcji i kwantyfikacji.

Lipidomika i transkryptomika w chorobach neurologicznych

Ta metoda dostarcza ram do badania inkorporacji egzogennych kwasów tłuszczowych z kompleksowych źródeł gospodarza do błon bakteryjnych, szczególnie Staphylococcus aureus. Aby to osiągnąć, opisano protokoły wzbogacania cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego i późniejszego profilowania fosfolipidów bakteryjnych za pomocą spektrometrii mas.

Izolacja cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego w celu zbadania włączenia kwasów tłuszczowych patogenów bakteryjnych do fosfolipidów błonowych

Prezentujemy protokół wykorzystujący chromatografię cieczową w połączeniu z tandemową spektrometrią mas do identyfikacji i ilościowego oznaczania głównych lipidów komórkowych u Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda ilościowej oceny głównych klas lipidów w komórce drożdży jest wszechstronna, solidna i czuła.

Analiza ilościowa lipidomu komórkowego Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Tutaj przedstawiono protokół metabolicznego znakowania drożdży kwasem 14C-octowym, który jest sprzężony z chromatografią cienkowarstwową w celu oddzielenia obojętnych lipidów.

Analiza neutralnej syntezy lipidów w Saccharomyces cerevisiae za pomocą znakowania metabolicznego i chromatografii cienkowarstwowej

Przedstawiona tutaj jest metoda badania struktur lipidowych poprzez znakowanie stabilnych izotopów przy użyciu czasu ich retencji, mobilności i fragmentacji.

Śledzenie lipidów de novo przy użyciu znakowania stabilnych izotopów LC-TIMS-TOF MS/MS

Opisujemy metodę użycia cyklodekstryny do pośredniczenia w wymianie między lipidami błony komórkowej a lipidami egzogennymi. Technikę tę można połączyć z eksperymentami badającymi białka transbłonowe, które zachowują się inaczej w środowiskach podobnych do tratw lipidowych niż w środowiskach niepodobnych do tratwy.

Test wymiany lipidów w żywych komórkach

Poznaj ekstrakcję lipidów komórkowych z wykorzystaniem rozcieńczania stabilnych izotopów i chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas. Ta metoda umożliwia precyzyjną ilościową analizę metabolitów lipidowych w komórkach.

Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal

Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów