Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

Metoda ma na celu dokładne ilościowe określenie bioaktywnych metabolitów lipidowych w komórkach poprzez połączenie rozcieńczania stabilnego izotopu, fazy cnor, chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, ciśnienia atmosferycznego, jonizacji chemicznej i spektrometrii mas. Zacznij od zebrania zarówno pożywki, jak i próbek komórek, a następnie dodaj ciężką mieszankę wzorców wewnętrznych znakowaną izotopami. Ekstrahuj bioaktywne lipidy rozpuszczalnikiem organicznym, a następnie wyprowadź bioaktywne lipidy za pomocą odczynnika do wychwytywania elektronów, przystąp do precyzyjnego ilościowego oznaczania bioaktywnych lipidów za pomocą chromatografii cieczowej.

Spektrometria mas poprzez analizę LCMS zarówno lizatu komórkowego, jak i wyników pożywek precyzyjnie określa stężenie docelowych bioaktywnych lipidów oraz poziomy poszczególnych ER Anant. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami, spektrometria mas i inne metody LCMS, jest to, że poszczególne osobniki i pylniki są dokładnie oznaczane ilościowo za pomocą samochodowej chromatografii normalnej fazy i stabilizowanego rozcieńczania izotopów. Uzyskane dane mogą dostarczyć cennych informacji na temat szlaków enzymatycznych funkcjonujących w komórce.

Na każdą 10-centymetrową płytkę przylegającego komórki zbierają trzy mililitry pożywki w 10-mililitrowej szklanej probówce wirówkowej. Następnie dwukrotnie umyj komórki PBS. Następnie dodaj jeden mililitr PBS, zeskrob komórki z płytki i przenieś próbkę do drugiej do 10-mililitrowej szklanej probówki wirówkowej.

Przygotuj osiem dodatkowych probówek z trzema mililitrami PBS do krzywej kalibracyjnej. Następnie do każdej probówki dodać 10 mikrolitrów odpowiedniego wzorca kalibracyjnego. Wyrównaj każdą próbkę testową z trzech mililitrów zebranych pożywek do hodowli komórkowych w celu ekstrakcji wolnych bioaktywnych lipidów.

Dodać 10 mikrolitrów wewnętrznej mieszanki wzorcowej do każdego wzorca kalibracyjnego i zrównoważyć próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby przetworzyć próbki w pięciu mililitrach eteru datylu i umieścić na wytrząsarce na 30 minut. Odwirować próbki i przenieść górną fazę organiczną do 10-mililitrowych szklanych probówek wirówkowych. Kontynuuj suszenie próbek pod azotem Najpierw zbierz zebrane próbki komórek przez odwirowanie i ponownie zawieś każdą paletę w dwóch mililitrach PBS przez Vortex Reserve 25 mikrolitrów każdej próbki do normalizacji lizatu komórkowego.

Teraz równo podziel każdy lizat na 10-mililitrowe szklane probówki wirówkowe. Dodaj dodatkowe dwa mililitry PBS i 10 mikrolitrów ISM do każdej próbki w celu zmierzenia wolnych lipidów komórkowych i uniknięcia alkalicznej degradacji lipidów, takich jak prostaglandyny, użyj jednego z duplikatów każdej próbki do przeprowadzenia ekstrakcji eterem dathyl, jak pokazano wcześniej. Aby wyekstrahować estryfikowane lipidy, dodaj pięć mililitrów mieszaniny metanolu chloroformu do każdej z pozostałych próbek.

Umieść na wytrząsarce na niskich obrotach na 30 minut, a następnie odwiruj przez 10 minut. Teraz zbierz dolną warstwę organiczną i wysusz próbki pod azotem, aby sify estryfikowane lipidy. Dodaj 0,5 mililitra 0,4 normalnego wodorotlenku potasu w 80% metanolu do każdej probówki.

Inkubować próbki w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie dodaj dwa mililitry PBS i dostosuj pH dwa sześć stężonym kwasem solnym. Na koniec dodaj 10 mikrolitrów ISM do każdej próbki i przystąp do ekstrakcji eterem dathyl do wysuszonych próbek i wzorców kalibracyjnych.

Dodaj odczynniki do derywatizacji w określonej kolejności. Następnie należy wirować próbki i inkubować w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę. Teraz wysusz próbki pod azotem przed przechowywaniem i analizą.

Metoda ta wykorzystuje kombinację rozcieńczania stabilnych izotopów, chii, chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, ciśnienia atmosferycznego, jonizacji chemicznej i analizy spektrometrii mas. Rozpuść próbki i wzorce kalibracyjne w 100 mikrolitrach etanolu heksanu i przenieś całe próbki do fiolek HPLC z wkładką, umieść próbki w schłodzonym próbniku automatycznym. Utwórz przykładową listę do analizy.

Następnie należy skonfigurować metody HPLC i MS, korzystając z parametrów opisanych w tabeli pierwszej i tabeli drugiej w dołączonym pisemnym protokole dla normalnej separacji faz. Pakiet chiralny, kolumna DH do 30 stopni Celsjusza, wstrzyknąć próbkę i rozpocząć bieg. Teraz ustaw MS w trybie jonów ujemnych za pomocą źródła A PCI.

Zacznij od ślepego półfabrykatu heksanu, aby zrównoważyć kolumnę. Następnie uruchom próbki wzorcowe do kalibracji w kolejności zwiększania stężenia SM. Kontynuować przetwarzanie próbek testowych pożywek hodowlanych po oddzieleniu HBLC.

Dodaj kolumnę z metanolem, aby uniknąć osadzania się na igle koronowej. Korzystanie z danych wygenerowanych na podstawie standardów. Utwórz krzywą kalibracyjną wykreślającą obszar próbki na osi Y, a standardowe stężenie na osi x wyprowadza równanie Y równa się MX plus B.

Na koniec należy określić stężenia bioaktywnych lipidów w próbce badanej dla komórki. Lizaty. Normalizuj te wartości, dzieląc określone stężenie bioaktywnego lipidu przez liczbę komórek na płytce lub całkowite białko znormalizowane w poprzednich krokach. Dane z monitorowania wielu reakcji wskazują na kilka kwasów linolowych i arachidonowych.

Utlenione metabolity. 13 i dziewięć, trzymają się wraz z odpowiadającymi im 13 i dziewięcioma Oxo ode pochodzą z kwasu linolowego. Ponadto, zgodnie z oczekiwaniami, metabolity ciepła kwasu arachidonowego i ich utlenione produkty są również obecne.

Istnieje niewielka zmiana w czasie retencji obniżonego standardu wewnętrznego w porównaniu z wzorcem nieoznakowanym. Co ważne, protokół ten oddziela również ciepło i pylstry oraz określa unikalne przejścia dla izomerów stereo, które mogą wynikać z enzymatycznego utleniania kwasu arachidonowego lub reakcji z reaktywnymi formami tlenu. Na przykład ten chromatogram pokazuje separację między izomerami stereo r i s wynoszącymi pięć.

Analiza lipidomiczna ciepła jest potężną techniką analizy wielu gatunków lipidów. Na przykład w tym eksperymencie oceniane i ilościowe określa prostaglandyny, izop seny i leukotrien B cztery. Oprócz ciepła spożywanego przez Oxo i hydroksylowanych metabolitów omega, metoda ta może być zoptymalizowana pod kątem ekstrakcji bioaktywnych lipidów z innych matryc biologicznych, takich jak osocze, mocz i tkanki.

W niektórych przypadkach bioaktywne lipidy były wykorzystywane jako biomarkery odpowiedzi na stres oksydacyjny.