Name: Wykorzystanie genetyki odwrotnej do manipulowania genem NS wirusa gorączki doliny Rift szczepu MP-12 w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Poznaj technikę genetyki odwrotnej do generowania rekombinowanych szczepów wirusa gorączki doliny Rift MP-12 z mutacjami w białku NSs. Ta metoda umożliwia tworzenie kandydatów na szczepionki o zwiększonym bezpieczeństwie i immunogenności poprzez precyzyjne modyfikacje genomu wirusowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana z grantu nr 5 U54 AI057156-07 przyznanego przez Western Regional Center of Excellence (WRCE), grantu 1 R01 AI08764301-A1 z National Institute of Allergy and Infectious Diseases oraz funduszy wewnętrznych Sealy Center for Vaccine Development na University of Texas Medical Branch.

<ol><li>Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Vet.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+infectious+rift+valley+fever+virus+entirely+from+cDNA%2C+analysis+of+virus+lacking+the+NSs+gene%2C+and+expression+of+a+foreign+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene.</a> J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+I-mediated+expression+of+viral+RNA+for+the+rescue+of+infectious+virulent+and+avirulent+Rift+Valley+fever+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses.</a> Virology. 378, 377-384 (2008).</li>
<li>Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T7+RNA+polymerase-dependent+and+-independent+systems+for+cDNA-based+rescue+of+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus.</a> J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).</li>
<li>Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NSm+proteins+of+Rift+Valley+fever+virus+are+dispensable+for+maturation%2C+replication+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection.</a> Virology. 359, 459-465 (2007).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+Valley+fever+virus+blocks+interferon+production+by+inhibiting+host+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription.</a> J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).</li>
<li>May, N. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFIIH+transcription+factor%2C+a+target+for+the+Rift+Valley+hemorrhagic+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus.</a> Cell. 116, 541-550 (2004).</li>
<li>Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+protein+promotes+post-transcriptional+downregulation+of+protein+kinase+PKR+and+inhibits+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation.</a> PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).</li>
<li>Habjan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+valley+fever+virus+induces+the+specific+degradation+of+the+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).</li>
<li>Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+interferons+and+the+virus-host+relationship%3A+a+lesson+in+detente%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente.</a> Science. 312, 879-882 (2006).</li>
<li>Bon, A. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+i+interferons+potently+enhance+humoral+immunity+and+can+promote+isotype+switching+by+stimulating+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo.</a> Immunity. 14, 461-470 (2001).</li>
<li>Le Bon, A., Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+innate+and+adaptive+immunity+via+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Links between innate and adaptive immunity via type I interferon.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).</li>
<li>Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+as+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity+through+dendritic+cell+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation.</a> Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).</li>
<li>Ito, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+recovery+of+rabies+virus+from+cloned+cDNA+using+a+vaccinia+virus-free+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system.</a> Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).</li>
<li>Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+tripartite+RNA+genome+packaging+in+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).</li>
<li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+%28BRSV%29+from+cDNA%3A+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture%2C+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> J. Virol. 73, 251-259 (1999).</li>
<li>Diaz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homozygous+deletion+of+the+alpha-+and+beta+1-interferon+genes+in+human+leukemia+and+derived+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).</li>
<li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).</li>
<li>Constantinescu, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+signaling+specificity+of+the+IFNAR+chain+of+the+type+I+interferon+receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).</li>
<li>Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF%28HOS%29+ubiquitin+ligase+mediates+the+ligand-induced+down-regulation+of+the+interferon-alpha+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor.</a> EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).</li>
<li>Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+phlebovirus+expression+strategy+and+protein+glycosylation.+Virology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology.</a> 170, 505-510 (1989).</li>
<li>Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+use+of+recombinant+vaccinia+viruses+to+study+Phlebovirus+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression.</a> J. Virol. 62, 826-833 (1988).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Muller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clone+13%2C+a+naturally+attenuated+avirulent+isolate+of+Rift+Valley+fever+virus%2C+which+is+altered+in+the+small+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).</li>
<li>Le May, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SAP30+complex+inhibits+IFN-beta+expression+in+Rift+Valley+fever+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells.</a> PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).</li>
<li>Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+Protein+of+Rift+Valley+Fever+Virus+Promotes+Post-Translational+Downregulation+of+the+TFIIH+Subunit+p62%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62.</a> J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).</li>
<li>Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF+family+of+transcription+factors+as+regulators+of+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IRF family of transcription factors as regulators of host defense.</a> Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).</li>
<li>Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+viral+induction+of+distinct+interferon-alpha+genes+by+positive+feedback+through+interferon+regulatory+factor-7%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7.</a> EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+mRNA+is+transcribed+from+an+incoming+anti-viral-sense+S+RNA+segment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment.</a> J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).</li>
<li>Mims, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+Fever+virus+in+mice.+I.+General+features+of+the+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection.</a> Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).</li>
<li>Bouloy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+an+interferon-antagonistic+function+of+rift+valley+fever+virus+nonstructural+protein+NSs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs.</a> J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).</li>
<li>Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+lacking+NSm+proteins+retains+high+virulence+in+vivo+and+may+provide+a+model+of+human+delayed+onset+neurologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease.</a> Virology. 362, 10-15 (2007).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Systemy genetyki odwrotnej dla RVFV zostały opracowane przez kilka grup z wykorzystaniem promotora T72,4,5 lub promotora pol-I mysiego3 lub ludzkiego4. W niniejszej pracy opisujemy protokół generowania rekombinowanych szczepów RVFV MP-12 przy użyciu komórek BHK/T7-915, które stabilnie ekspresują polimerazę RNA T7. Efektywność odzyskiwania wirusa różniła się w zależności od stanu komórek BHK/T7-9, ilości plazmidów, liczby transfektowanych komórek i innych czynników. W celu uzysk...

<table><tbody><tr><td>Podłoże Minimum Essential Medium (MEM)-alpha </td><td>Invitrogen</td><td>32561037</td><td></td></tr><tr><td>Modyfikowane podłoże minimum essential medium według Dulbecco&amp;rsquo; </td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Modyfikowane podłoże Eagle'a (MEM 2x) </td><td>Invitrogen</td><td>11935046</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna </td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Higromycyna B </td><td>Cellgro</td><td>30-240-CR</td><td></td></tr><tr><td>Bulion tryptone-fosforanowy </td><td>MP Biomedicals</td><td>1682149</td><td></td></tr><tr><td>Agar Noble </td><td>VWR international</td><td>101170-362</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LT1 </td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR2300</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM </td><td>Invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Szczelna pokrywka przeciwaerozolowa </td><td>Eppendorf</td><td>C-2223-25</td><td></td></tr><tr><td>0.33% roztwór czerwieni neutralnej </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N2889-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Komórki MEF C57/WT</td><td>Invitrogen</td><td>mef-c57wt</td><td></td></tr><tr><td>Blastycydyna S</td><td>Invitrogen</td><td>Ant-bl-1</td><td></td></tr><tr><td>Zeocyna</td><td>Invitrogen</td><td>ant-zn-1</td><td></td></tr><tr><td>QUANTI-Blue</td><td>Invitrogen</td><td>rep-qb1</td><td></td></tr><tr><td>Komórki BHK/T7-9&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt; </td><td>Uniwersytet Gifu, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komórki Vero E6</td><td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie genetyki odwrotnej do manipulacji genem nss szczepu mp-12 wirusa gorączki doliny rift w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionki

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

Wirus gorączki doliny Rift (RVFV), który wywołuje u ludzi gorączkę krwotoczną, zaburzenia neurologiczne lub ślepotę, a u przeżuwaczy wysoką częstotliwość aborcji i wad rozwojowych płodów1, został sklasyfikowany jako czynnik selektywny overlap HHS/USDA oraz patogen grupy ryzyka 3. Należy on do rodzaju Phlebovirus z rodziny Bunyaviridae i jest jednym z najbardziej zjadliwych przedstawicieli tej rodziny. Od 2006 roku opracowano kilka systemów genetyki odwrotnej dla szczepu szczepionkowego RVFV MP-122,3, a także dla szczepów RVFV typu dzikiego 4-6, w tym ZH548 i ZH501. Szczep MP-12 (który jest patogenem grupy ryzyka 2 i nie jest czynnikiem selektywnym) jest silnie atenuowany dzięki kilku mutacjom w segmentach M i L, lecz nadal posiada zjadliwe RNA segmentu S3, które koduje funkcjonalny czynnik wirulencji, NSs. Wariant rMP12-C13type (C13type), posiadający 69% delecję w ramce odczytu ORF białka NSs, jest pozbawiony wszystkich znanych funkcji NSs, podczas gdy replikuje się w komórkach VeroE6 pozbawionych IFN typu I równie efektywnie jak MP-12. NSs indukuje zahamowanie transkrypcji gospodarza, w tym mRNA interferonu (IFN)-beta7,8, oraz promuje degradację kinazy białkowej zależnej od dwuniciowego RNA (PKR) na poziomie potranslacyjnym.9,10 Ekspresja IFN-beta jest regulowana transkrypcyjnie przez czynnik regulacyjny interferonu 3 (IRF-3), NF-kB oraz białko aktywacyjne-1 (AP-1), a wiązanie IFN-beta z receptorem IFN-alfa/beta (IFNAR) stymuluje transkrypcję genów IFN-alfa lub innych genów stymulowanych przez interferon (ISGs)11, co indukuje przeciwwirulentne działania gospodarza; tymczasem supresja transkrypcji gospodarza, w tym genu IFN-beta przez NSs, zapobiega nadekspresji tych ISGs w odpowiedzi na replikację wirusa, mimo że IRF-3, NF-kB i białko aktywacyjne-1 (AP-1) mogą być aktywowane przez RVFV7. . Zatem NSs jest doskonałym celem do dalszej atenuacji MP-12 oraz wzmocnienia wrodzonych odpowiedzi immunologicznych gospodarza poprzez zniesienie funkcji supresji IFN-beta. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół generowania rekombinowanego szczepu MP-12 kodującego zmutowane NSs i przedstawiamy przykład metody przesiewowej służącej do identyfikacji mutantów NSs pozbawionych zdolności do supresji syntezy mRNA IFN-beta. Poza kluczową rolą w odporności wrodzonej, IFN typu I jest ważny dla dojrzewania komórek dendrytycznych i indukcji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej12-14. W związku z tym mutanty NSs indukujące IFN typu I są dodatkowo atenuowane, a jednocześnie skuteczniej stymulują odpowiedzi immunologiczne gospodarza niż MP-12 typu dzikiego, co czyni je idealnymi kandydatami do strategii szczepień.

System genetyki odwrotnej dla szczepionkowego szczepu MP-12 wirusa gorączki Doliny Rift jest użytecznym narzędziem do tworzenia dodatkowych mutantów MP-12 o zwiększonej atenuacji i immunogenności. Opisujemy protokół generowania i charakteryzacji szczepów mutantów NSs.

Wykorzystanie genetyki odwrotnej do manipulacji genem NSs szczepu MP-12 wirusa gorączki doliny Rift w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionki

Wirus gorączki doliny Rift (RVFV), który u ludzi wywołuje gorączkę krwotoczną, zaburzenia neurologiczne lub ślepotę, a u zwierząt wysoką częstotliwość aborcji i obumarcia płodów...

Niniejsza procedura służy do wytwarzania rekombinowanego wirusa gorączki doliny Rift szczepu MP 12 kodującego zmutowane białko NSS metodą genetyki odwrotnej i ma na celu charakterystykę fenotypów pod kątem opracowania szczepionki. W pierwszej kolejności, przy użyciu systemu transfekcji w komórkach Bhk T seven nine, które stabilnie ekspresują polimerazę RNA T seven, odzyskuje się mutanty rekombinowanego szczepu MP 12, a następnie namnaża się odzyskane mutanty rekombinowanego szczepu MP 12 w komórkach Vero E six i mianuje się namnożone mutanty MP 12 za pomocą metody plackowej. Ostatnim krokiem procedury jest badanie braku supresji interferonu alfa lub beta przez zmutowane białka NS.Ostatecznie wyniki te mogą ułatwić przygotowanie kandydackiej żywej atenuowanej szczepionki przeciwko gorączce doliny Rift za pomocą systemu genetyki odwrotnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wprowadzanie losowych mutacji do genomu wirusa za pomocą chemicznego azotu lub seryjnych pasaży, jest możliwość wprowadzenia określonej mutacji do genomu wirusa przy użyciu systemu genicznego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie szczepionek przeciwko gorączce doliny Rift, takie jak znaczenie głównego czynnika ence NSS w immunogenności kandydatów na szczepionki.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ wirus gorączki krwotocznej z Rift Valley, podobnie jak w przypadku form docelowych blokad i wymaganej wizualizacji blokad, wymaga zoptymalizowanej techniki. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, gdyż etapy odzyskiwania wirusa i hydratacji są trudne do opanowania, ponieważ szczegółowy protokół krok po kroku dla tej metody nie został opisany. W naczyniach o średnicy 6 cm należy umieścić komórki T79 z nerek młodych chomików, które stabilnie eksponują polimerazę RNA T7, a następnie umieścić je w inkubatorze przy konfluencji komórek na poziomie 70–80%. Należy wymienić medium na kompletne MEM alpha bez hygromycyny B. W ciągu godziny należy rozpocząć proces transfekcji w celu odzyskania wirusa gorączki krwotocznej z Rift Valley.Przygotuj jeden zestaw plazmidów kodujących wirusowe RNA genomowe do ekspresji pełnej długości wirusowego RNA oraz drugi zestaw kodujący otwarte ramki odczytu genów wirusowych do ekspresji białek wirusowych. Następnie dodaj 30 µL transit LT one do 385 µL Optum w probówce o pojemności 1,5 mL. Krótko wymieszaj na wortexie i inkubuj przez pięć minut.W temperaturze pokojowej powoli dodaj otrzymane liposomy do zestawów plazmidów o stężeniu 10 µg, mieszając delikatnie pipetą, a następnie inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej; kropla po kropli dodawaj mieszaninę do transfekcji do komórek bhk T seven nine i inkubuj przez 24 godziny. Zastąp nadpłyn hodowlany pełną pożywką MEM alpha i hoduj przez kolejne cztery dni. Zbierz nadpłyny z hodowli do probówki o pojemności 50 ml i usuń szczątki komórkowe poprzez wirowanie.Przenieś nadnadczyn do 5 ml krioprobek z nakrętką i przechowuj ten zapas wirusa P0 w temperaturze -80 °C, aby ułatwić dalsze eksperymenty. W celu namnożenia wirusa P0 w komórkach pozbawionych genów interferonu alfa i beta, wyhoduj kultury Vero E6 o 80% konfluencji w pełnym DMEM, wymień medium na rozcieńczonego wirusa P0 i inkubuj przez jedną godzinę.Usuń inokulum i hoduj w 10 mililitrach kompletnego DMEM przez trzy do czterech dni, aż pojawi się efekt cytopatyczny w komórkach Vero E6. Zbierz naddatek zgodnie z wcześniejszym opisem i oznacz próbki jako E6 P1. W płytkach 6-dołkowych hoduj komórki Vero E6 w kompletnym DMEM do osiągnięcia 80% konfluencji. Odessij medium z komórek Vero E6 i dodaj 400 mikrolitrów dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych preparatu wirusa E6 P1, a następnie inkubuj przez godzinę.W międzyczasie przygotuj dwie probówki o pojemności 15 ml do nałożenia agaru. Probówka A powinna zawierać 7 ml 1,2% noble agar w wodzie, a probówka B siedem ml 2x kompletnego MEM i 10% tripodose phosphate broth. Po 15 minutach w kąpieli wodnej przelej zawartość probówki B do probówki A i wymieszaj je za pomocą pipety. Zastąp inokulum wirusowe 2 ml na studzienkę mieszaniny probówek A i B w stosunku 1:1. Kontynuuj hodowlę komórek przez trzy do czterech dni.Przygotuj nakładkę z agaru, dodając 1,2% noble agar, dwukrotność pełnego medium MEM oraz czerwony neutralny do probówki A i B, a do trzeciej probówki oznaczonej jako czerwony neutralny dodaj odpowiedni odczynnik; umieść probówkę A w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C, a pozostałe dwie probówki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut. Następnie zmieszaj ze sobą 7 ml zawartości probówki A, 7 ml zawartości probówki B oraz 0,5 ml czerwonego neutralnego; rozdziel po 2 ml mieszaniny do każdego dołka płytki 6-dołkowej i inkubuj płytkę przez noc. Teraz określ liczbę jednostek tworzących płyciny na mililitr. Embrionalne fibroblasty myszy C57 typu dzikiego kodują wydzielaną embrionalną fosfatazę alkaliczną, której ekspresja jest indukowana przez NF kappa B oraz IRF 3 lub 7.W niniejszym badaniu analizujemy aktywność seep indukowaną przez odpowiedzi odpornościowe wrodzone. Niecałkowicie konfluencyjne komórki w płytkach 12-dołkowych zakażamy rekombinowanym szczepem MP 12 kodującym mutacje NS lub kontrolnym szczepem MP 12, a następnie inkubujemy przez jedną godzinę. Usuwamy inokulum, dodajemy jeden mililitr kompletnego DMEM na dołek i hodujemy przez 14 godzin. Pobieramy supernatanty z hodowli do analizy seep. Do każdego dołka płytki 96-dołkowej dodajemy 200 µL Quantum Blue oraz 50 µL każdej próbki, po czym zamykamy płytkę i inkubujemy w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.Zmierz gęstość optyczną (OD) przy 650 nanometrach za pomocą czytnika płytek. Wirus gorączki Rift Valley posiada tripartite genom RNA o orientacji negatywnej, składający się z segmentów S, M i L w porównaniu do NSS szczepu MP 12. Otwarta ramka odczytu typu C 13 jest skrócona o 69%. Zazwyczaj odwrotny system genetyczny generuje żywe rekombinowane wirusy MP 12 z mianami wyższymi niż 1 × 10⁶ PFU na mililitr wirusa typu C 13.Wersje pozbawione funkcji białka N tworzyły duże, mętne plakietki, podczas gdy MP 12 tworzyły przejaśnione plakietki o różnych rozmiarach w porównaniu do komórek kontrolnych (mock) 14 godzin po infekcji. Poziom seep w hodowli komórek C 57 typu dzikiego zainfekowanych szczepem MP 12 nie wzrósł.W przeciwieństwie do nadsączu, zakażenie typem C 13 indukuje zwiększony poziom seep w 14 godzin po zakażeniu; analizy northern blot z wykorzystaniem sondy RNA specyficznej dla mysiego mRNA ISG 56 potwierdzają upregulację mRNA ISG 56 w przypadku braku ekspresji NSS. Po przeprowadzeniu tej procedury, jako metoda podobna do immunizacji myszy i testowania przeciwciał neutralizujących, można badać kwestie takie jak immunogenność mutanta NSS. Technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się gorączką dolin do eksploracji funkcji genów niestrukturalnych w zainfekowanych komórkach i zwierzętach.Należy pamiętać, że praca z wirusami zakaźnymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego zawsze należy zachować środki ostrożności, aby uniknąć wdychania aerozoli. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak odzyskiwać i mianować rekombinowane szczepy MP 12 oraz jak przesiewać mutanty NSS pozbawione funkcji supresji interferonu alfa i beta.

using-reverse-genetics-to-manipulate-nss-gene-rift-valley-fever-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wykorzystanie odwrotnej genetyki do manipulacji genem NSs szczepu wirusa Rift Valley Fever MP-12 w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionki

Norowirusy są główną przyczyną gastroenteritis, jednak techniki molekularne służące do ich charakterystyki są wciąż stosunkowo nowe. W niniejszej pracy przedstawiamy dwa różne podejścia genetyki odwrotnej w celu efektywnego odzyskiwania norowirusa mysiego (MNV), jedynego przedstawiciela tego rodzaju, który może być propagowany w hodowlach komórkowych.

Odzyskiwanie zakaźnego norowirusa mysiego za pomocą genetyki odwrotnej

Ratowanie rekombinowanych arenawirusów ze sklonowanych cDNA, podejście określane jako genetyka odwrotna, pozwala badaczom badać rolę określonych produktów genowych wirusa, a także wkład ich różnych specyficznych domen i reszt, w wielu różnych aspektach biologii arenawirusa. Podobnie, techniki genetyki odwrotnej w zatwierdzonych przez FDA liniach komórkowych (Vero) do opracowywania szczepionek zapewniają nowe możliwości generowania skutecznych i bezpiecznych szczepionek do zwalczania ludzkich...

Generowanie rekombinowanego arenawirusa do opracowania szczepionki w komórkach Vero zatwierdzonych przez FDA

Wirus rzekomego pomoru drobiu (NDV) był intensywnie badany w ciągu ostatnich kilku lat w celu opracowania nowych wektorów do szczepień i terapii, między innymi. Badania te były możliwe dzięki technikom ratowania rekombinowanego wirusa z cDNA, takim jak te, które tutaj opisujemy.

Ratowanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu z cDNA

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Wirus krowianki (VV) jest szeroko stosowany w badaniach biomedycznych i poprawie zdrowia ludzkiego. W tym artykule opisano prostą, bardzo wydajną metodę edycji genomu VV przy użyciu systemu CRISPR-Cas9.

Proste i skuteczne podejście do konstruowania zmutowanych wektorów wirusa krowianki

Informujemy o użyciu sztucznej strategii ekspresji małego RNA w celu opracowania niewadliwego systemu dostarczania rekombinowanego densowirusa Aedes aegypti (AaeDV) in vivo. Opisano szczegółową procedurę budowy, pakowania i analizy ilościowej wektorów rAaeDV, a także infekcji larwalnej.

Zastosowanie rekombinowanego densowirusa komarów jako wektora dostarczania genów do analizy funkcjonalnej genów w larwach komarów

Herpeswirus indyków (HVT) jest szeroko stosowany jako platforma wektorowa do generowania rekombinowanych szczepionek przeciwko wielu chorobom ptaków. W artykule opisano proste i szybkie podejście do wytwarzania rekombinowanych szczepionek wektorowych HVT przy użyciu zintegrowanego systemu NHEJ-CRISPR/Cas9 i Cre-Lox.

Generowanie rekombinowanych wektorów herpeswirusa ptasiego z edycją genów CRISPR/Cas9

Opisujemy metodę generowania i amplifikacji genetycznie modyfikowanych syncytialnych wirusów oddechowych (RSV) oraz zoptymalizowany test płytki nazębnej dla RSV. Ilustrujemy ten protokół, tworząc dwa rekombinowane wirusy, które odpowiednio umożliwiają ilościowe określenie replikacji RSV i analizę na żywo ciał inkluzyjnych RSV i dynamiki granulek związanych z ciałami inkluzyjnymi.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

Generowanie rekombinowanych rotawirusów z plazmidowego DNA dostarcza niezbędnego narzędzia do badania replikacji i patogenezy rotawirusów oraz rozwoju wektorów ekspresyjnych rotawirusów i szczepionek. W niniejszym artykule opisano uproszczone podejście genetyki odwrotnej do generowania rekombinowanych rotawirusów, w tym szczepów eksprymujących fluorescencyjne białka reporterowe.

Uproszczona metoda genetyki odwrotnej do odzyskiwania rekombinowanych rotawirusów wykazujących ekspresję białek reporterowych

To jest metoda generowania "bezbliznowatych" rekombinowanych wirusów krowianki przy użyciu wyboru zakresu gospodarzy i wizualnej identyfikacji rekombinowanych wirusów.

Szybkie, bezproblemowe generowanie rekombinowanych pokswirusów przy użyciu zakresu gospodarzy i selekcji wizualnej

Protokół opisuje metodę wprowadzania kontrolowanej różnorodności genetycznej w genomie wirusa zapalenia wątroby typu C poprzez połączenie pełnej długości syntezy zmutowanego RNA za pomocą podatnego na błędy PCR i genetyki odwrotnej. Metoda ta stanowi model selekcji fenotypu i może być stosowana do 10 kb długich genomów wirusa RNA o dodatnim sensie.

Genetyka odwrotna w celu inżynierii wariantów wirusa RNA o pozytywnym wyczuwaniu

Poznaj technikę genetyki odwrotnej do generowania rekombinowanych szczepów wirusa gorączki doliny Rift MP-12 z mutacjami w białku NSs. Ta metoda umożliwia tworzenie kandydatów na szczepionki o zwiększonym bezpieczeństwie i immunogenności poprzez precyzyjne modyfikacje genomu wirusowego.

Wykorzystanie genetyki odwrotnej do manipulowania genem NS wirusa gorączki doliny Rift szczepu MP-12 w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionek (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie genetyki odwrotnej do manipulacji genem NSs szczepu MP-12 wirusa gorączki doliny Rift w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionki

Przeglądaj więcej filmów