Name: Implantacja wewnątrzczaszkowa z późniejszym bioluminescencyjnym obrazowaniem 3D in vivo glejaków myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Poznaj metodę implantacji wewnątrzczaszkowej glejaków GL261 u myszy C57BL/6 z wykorzystaniem bioluminescencyjnego obrazowania 3D in vivo. Technika umożliwia ilościowe śledzenie wzrostu guza w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować dr. Joshuę B. Rubinowi za hojność w udostępnieniu plazmidów dla systemu lentiwirusowego, a także Mahil Rao za pomocne sugestie dotyczące przygotowania komórek GL261-luc.
Dziękujemy organizacji Students Supporting Brain Tumor Research (SSBTR), fundacji The Barrow Neurological Foundation oraz fundacji The Wallace Foundation za ich hojne wsparcie.
Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustanowionymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) w St. Joseph's Hospital and Medical Center.

<ol><li>Candolfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology%3A+neuropathological+characterization+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> J Neurooncol. 85, 133-148 (2007).</li>
<li>Stafford, P., Abdelwahab, M. G., do, K. im, Preul, Y., Rho, M. C., M, J., Scheck, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ketogenic+diet+reverses+gene+expression+patterns+and+redudes+reactive+oxygen+species+levels+when+used+as+an+adjuvant+therapy+for+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">The ketogenic diet reverses gene expression patterns and redudes reactive oxygen species levels when used as an adjuvant therapy for glioma.</a> Nutr Metab. 7, (2010).</li>
<li>Caliper Life Sciences, Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Living+Image+Software+Version+4.0.+VivoVision+Systems%22">Living Image Software Version 4.0. VivoVision Systems</a>. , (2010).</li>
<li>Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 2nd Ed, Academic Press. (2001).</li>
<li>Jouanneau, E., Poujol, D., Gulia, S., Le, M. I., Blay, J. Y., Belin, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+are+essential+for+priming+but+inefficient+for+boosting+antitumour+immune+response+in+an+orthotopic+murine+glioma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells are essential for priming but inefficient for boosting antitumour immune response in an orthotopic murine glioma model.</a> Cancer Immunol Immunother. 55, 254-267 (2006).</li>
</ol>

Bezpłatny dostęp do tego artykułu jest sponsorowany przez Caliper Life Sciences.

Inokulum komórek wstrzyknięto na głębokość 2,6 mm od powierzchni mózgu po utworzeniu kieszeni o szerokości 0,4 mm. Aby zapewnić prawidłowe umieszczenie i głębokość wprowadzenia igły, można wykonać zdjęcie rentgenowskie przy użyciu ramienia C (C-Arm) lub podobnego urządzenia do wzmacniania obrazu rentgenowskiego; jest to jednak opcjonalne. Powikłania chirurgiczne mogą wystąpić, jeśli zwierzę nie zostanie odpowiednio zsedowane, co może prowadzić do jego ruchu podczas infuzji komórek. Może to spowodować wyciek mieszaniny komórek lub krwawienie z kanału wprowadzenia igły. Wyciek komórek prowadzi do ektopowego wzrostu komórek nowotworowych. Ważne jest również, aby nie przebić komory mózgu, co może się zdarzyć, jeśli otwór trepanacyjny zostanie wykonany przyśrodkowo od opisanych w protokole 2,3 mm 4. Prawidłowe umieszczenie igły oraz rozprzestrzenianie się komórek sprawdzono poprzez wstrzyknięcie myszy 2 µl błękitu metylenowego, a następnie wypreparowanie tkanki mózgowej w celu weryfikacji lokalizacji wstrzykniętego barwnika.
W niniejszym protokole zastosowano system obrazowania in vivo IVIS Spectrum oraz oprogramowanie Living Image (v 4.0) przeznaczone do pracy z tym urządzeniem (Caliper Life Sciences). Do uzyskania podobnych wyników można użyć każdego porównywalnego systemu obrazowania in vivo oraz narzędzi do analizy obrazu. Systemy te zapewniają pewne korzyści w porównaniu z tradycyjnym obrazowaniem rezonansem magnetycznym (MRI) w monitorowaniu wzrostu eksperymentalnego guza wewnątrzczaszkowego. Najbardziej oczywistą jest względna cena obu urządzeń – aparaty MRI do zwierząt są znacznie droższe i zazwyczaj wymagają usług wykwalifikowanego technika MRI. Obrazowanie in vivo, takie jak opisane tutaj, może być wykonywane przez użytkownika końcowego. Dane z bioluminescencji są ilościowe, podczas gdy kwantyfikacja danych MRI jest czasochłonna i w pewnym stopniu niedokładna. Ponadto obrazy MRI wykazują obrzęk i stan zapalny obok komórek nowotworowych, co może utrudniać oddzielenie guza od efektów leczenia. Z tych powodów uzyskanie dokładnych pomiarów objętościowych rosnącego guza może być wyzwaniem. Bioluminescencja wymaga ATP, zatem tylko żywe komórki nowotworowe przyczyniają się do danych o wielkości guza. Mimo to, MRI ma pewne zalety, jeśli urządzenie jest dostępne. Komórki nie muszą być znakowane markerem bioluminescencyjnym, aby były widoczne w MRI. Możliwość wizualizacji obrzęku okołoguźowego może być zaletą w niektórych protokołach eksperymentalnych. Atutem obu technologii jest to, że zastosowanie jednej nie wyklucza drugiej, dzięki czemu – przy dostępności obu technologii – badacz może uzyskać dane dotyczące zarówno wzrostu guza, jak i obecności obrzęku okołoguźowego oraz stanu zapalnego u tego samego zwierzęcia.

<table><tbody><tr><td>GL261-luc2 Bioware Ultra</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>GL261-luc2</td><td> </td></tr><tr><td>podłoże DMEM (Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium)</td><td>Invitrogen</td><td>10313039</td><td> </td></tr><tr><td>Geneticyna (G418)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11811-023</td><td> </td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td> </td></tr><tr><td>bufor fosforanowy (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td> </td></tr><tr><td>myszy C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr</td><td>National Cancer Institute</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>maść okulistyczna nawilżająca AKWA Tears</td><td>Akorn Inc</td><td>17478-062-35</td><td> </td></tr><tr><td>Ketaset (chlorowodorek ketaminy)</td><td>Wyeth Animal Health</td><td>11570775</td><td> </td></tr><tr><td>Sedazine (chlorowodorek ksylazyny)</td><td>Wyeth Animal Health</td><td>10031894</td><td> </td></tr><tr><td>stereotaktyczny instrument dla małych zwierząt</td><td>Kopf Instruments</td><td>900</td><td> </td></tr><tr><td>UltraMicroPump z kontrolerem SYS-Micro4</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td>W przypadku braku dostępności możliwe jest podawanie ręczne</td></tr><tr><td>strzykawka 10&amp;mu;l z igłą ściętą 26G</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SGE010RNS</td><td> </td></tr><tr><td>pinceta Adisona</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500092</td><td> </td></tr><tr><td>dyssektor Penfielda</td><td>Codman</td><td>65-1015</td><td> </td></tr><tr><td>igła Precision Glide 16g 1&amp;frac12;</td><td>BD Biosciences</td><td>305198</td><td> </td></tr><tr><td>uchwyt do skalpela chirurgicznego</td><td>BD Biosciences</td><td>371030</td><td> </td></tr><tr><td>główka skalpela nr 15</td><td>BD Biosciences</td><td>371315</td><td> </td></tr><tr><td>szew Vicryl 4-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td>VCP496G</td><td> </td></tr><tr><td>wosk kostny</td><td>Medline Industries</td><td>DYNJBW25</td><td> </td></tr><tr><td>gaziki nasączone jodopowidonomem</td><td>Medline Industries</td><td>MD93901</td><td> </td></tr><tr><td>sól potasowa D-lucyferyny</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>122796</td><td> </td></tr><tr><td>Forane (izofluran)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>1001936060</td><td> </td></tr><tr><td>mikroskop OPMI Pentero</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Wystarczy dowolny mikroskop chirurgiczny</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS Spectrum z opcjonalnym systemem anestezji</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td> </td></tr></tbody></table>

implantacja wewnątrzczaszkowa z następującym obrazowaniem bioluminescencyjnym 3d in vivo glejaków mysich

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Mysi glejak 261 (GL261) jest uznawany za model in vivo, który odtwarza wiele cech ludzkiego glejaka wielopostaciowego (GBM). Linia komórkowa ta została pierwotnie indukowana poprzez wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie 3-metylcholantrenu u syngenicznej szczepu myszy C57BL/6 1; w związku z tym można wykorzystać immunologicznie kompetentne myszy C57BL/6. Chociaż w tym przypadku stosujemy GL261, poniższy protokół może zostać wykorzystany do implantacji i monitorowania każdego wewnątrzczaszkowego modelu guza u myszy. Komórki GL261 zostały zmodyfikowane tak, aby stabilnie eksprimować lucyferazę świetlikową (GL261-luc). Stworzyliśmy również linię komórkową GL261-luc2 o większej jasności poprzez stabilną transfekcję genu luc2 eksprimowanego z promotora CMV. W celu wyeliminowania tłumienia światła spowodowanego czarną skórą i futrem wykorzystano myszy C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr (wariant albinos C57BL/6) z National Cancer Institute, Frederick, MD. Dzięki zastosowaniu myszy C57BL/6 albinos możliwe jest obrazowanie in vivo przy użyciu systemu obrazowania in vivo IVIS Spectrum od dnia implantacji (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Linie komórkowe GL261-luc oraz GL261-luc2 wykazały takie samo zachowanie in vivo jak macierzyste komórki GL261. Do wspólnych cech histologicznych występujących w ludzkich GBM oraz w tym modelu mysim należą: martwica guza, pseudopalisady, neowaskularyzacja, naciekanie, nadkomórkowość oraz stan zapalny 1.
Przed implantacją zwierzęta znieczulono poprzez dostrychalne wstrzyknięcie ketaminy (50 mg/kg), ksylazyny (5 mg/kg) i buprenorfiny (0,05 mg/kg), umieszczono w aparacie stereotaktycznym i wykonano skalpelem nacięcie wzdłuż linii środkowej czaszki. Wykonano otwór trepanacyjny 0,1 mm za bregma i 2,3 mm na prawo od linii środkowej. Igłę wprowadzono na głębokość 3 mm, a następnie wycofano o 0,4 mm, do głębokości 2,6 mm. W ciągu 3 minut wstrzyknięto 2 μl komórek GL261-luc lub GL261-luc2 (107 komórek/ml). Otwór trepanacyjny zamknięto woskiem kostnym, a nacięcie zaszyto.
Po implantacji stereotaktycznej komórki bioluminescencyjne są wykrywalne od dnia implantacji, a guz można analizować przy użyciu funkcji rekonstrukcji obrazu 3D urządzenia IVIS Spectrum. Zwierzęta otrzymują podskórnie wstrzyknięte 150μg lucyferyny /kg masy ciała na 20 min przed obrazowaniem. Obciążenie guzem jest ilościowo określone na podstawie średniej bioluminescencji guza w czasie. Myszy z guzami były obserwowane codziennie w celu oceny stanu chorobowego i poddano je eutanazji w przypadku wystąpienia jednego lub więcej z następujących objawów: letargu, braku zdolności do poruszania się, zgarbionej postawy, braku pielęgnacji ciała, anoreksji prowadzącej do utraty &gt;10% masy ciała. Podczas sekcji zwłok guzy były widoczne u wszystkich zwierząt.

Dośródczaszkowa implantacja komórek GL261 u myszy C57BL/6 powoduje powstanie złośliwych glejaków, które odzwierciedlają wiele cech charakterystycznych dla ludzkiego wielopostaciowego glejakaa. Wykorzystaliśmy komórki GL261 stabilnie wykazujące ekspresję lucyferazy, co pozwoliło nam zastosować obrazowanie in vivo do śledzenia progresji guza. Przedstawiono procedurę chirurgiczną oraz trójwymiarowe obrazowanie in vivo.

Implantacja wewnątrzczaszkowa z następującym obrazowaniem bioluminescencyjnym 3D in vivo glejaków mysich

Mysia linia glejaka 261 (GL261) jest uznawana za system modelowy in vivo, który odzwierciedla wiele cech ludzkiego wielopostaciowego glejakaaestrogenu (GBM).

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie wewnątrzczaszkowego modelu glejaków, który można ilościowo monitorować w czasie za pomocą obrazowania in vivo. Osiąga się to poprzez uprzednie pozyskanie hodowanych komórek glejaka z lustrzanym luminescencją oraz przygotowanie zawiesiny komórkowej o stężeniu od 1 do 2 × 10⁷ komórek/ml. Drugim krokiem procedury jest stereotaktyczna implantacja pozyskanych komórek do prawego płata czołowego mózgu myszy.Następnie wykonuje się podskórny wtrysk Luciferian u zwierzęcia i generuje krzywą kinetyczną ekspresji Luciferian. Ostatnim krokiem procedury, z wykorzystaniem systemu obrazowania in vivo IVUS spectrum, jest seryjne obrazowanie zwierząt i monitorowanie wzrostu guza. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące wzrost komórek nowotworowych oraz lokalizację 3D guza dzięki sygnałowi bioluminescencyjnemu wykrywalnemu za pomocą systemu obrazowania in vivo IVUS spectrum.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak MRI, jest to, że obrazowanie bioluminescencyjne identyfikuje wyłącznie żywe komórki nowotworowe i nie wymaga obecności wyspecjalizowanego technika MRI. Pozwala to również na jednoczesne obrazowanie zwierząt w krótszym czasie. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuroonkologii, takie jak skuteczność nowych terapii guzów mózgu.In vivo, choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat guzów mózgu, może być ona również zastosowana do innych układów narządowych, takich jak nowotwory płuc, prostaty i wątroby. Aby przygotować się do tego zabiegu, należy pobrać co najmniej 3 µL zawiesiny komórek glejaka do strzykawki o objętości 10 µL i długości 50 mm z igłą ściętą o rozmiarze 26 G.Należy upewnić się, że komórki nie tworzą skupisk, w przeciwnym razie może być konieczne ponowne napełnienie strzykawki. Znieczuloną mysz umieszcza się w aparacie stereotaksycznym, a głowę myszy unieruchamia za pomocą zacisku do pyska, zgodnie z przedstawionym obrazkiem. Napełnioną strzykawkę umieszcza się w mikroinjektorze.Aby rozpocząć procedurę chirurgiczną, wykonaj nacięcie skóry, używając ostrza nr 15 i pęsety ząbkowanej. Wykonaj nacięcie o długości od 10 do 15 milimetrów między oczami zwierzęcia, kierując się w stronę uszu, aby odsłonić bgma. Należy upewnić się, że bgma została prawidłowo zidentyfikowana.Można go łatwo pomylić z obszarem zatoki położonym dystalnie względem bma. Za pomocą igły 16G o długości 1,5 cala wykonaj otwór trepanacyjny 0,1 mm za szwem czołowym i 2,3 mm na prawo od linii środkowej, wywierając lekki nacisk na igłę i obracając ją, aż do przebicia czaszki i odsłonięcia mózgu; następnie przesuń igłę wtryskową za pomocą mikroinjektora, aż znajdzie się ona tuż przy powierzchni mózgu. Z tej pozycji wprowadź igłę na głębokość 3 mm.Pozostaw igłę w miejscu przez trzy minuty. Następnie wycofaj igłę o 0,4 mm, tak aby całkowita głębokość wynosiła 2,6 mm poniżej powierzchni mózgu. Tworzy to niewielką przestrzeń, w którą zostaną wprowadzone komórki, aby zapewnić prawidłowe rozmieszczenie i głębokość.Obrazy rentgenowskie głębokości wprowadzenia igły można wykonać za pomocą ramienia C. Wprowadź zawiesinę komórkową w ciągu trzech minut, używając mikroinjektora ustawionego na objętość 2000 nanolitrów przy szybkości infuzji 667 NANOLITERS na minutę. Po infuzji pozostaw igłę w miejscu wprowadzenia przez dwie minuty, aby zapobiec wyciekowi z miejsca infuzji. Następnie powoli wycofaj igłę całkowicie.Po wyjęciu igły należy pokryć otwór trepanacyjny woskiem kostnym za pomocą rozczepnika Penfielda. Na koniec zaszyć nacięcie szwem Vicryl 4-0, upewniając się, że w skórze nie pozostały duże szczeliny. In vivo.Obrazowanie bioluminescencyjne wykonuje się za pomocą systemu obrazowania IVIS Spectrum. Uruchom oprogramowanie Living Image i zainicjuj system obrazowania IVIS Spectrum, klikając przycisk initialize IVIS system w prawym dolnym rogu panelu sterowania. Wybierz tryb obrazowania luminescencyjnego w lewym górnym rogu panelu sterowania, aby określić optymalny czas obrazowania bioluminescencyjnego.Po wstrzyknięciu lucyferazy zwierzęciu należy w pierwszej kolejności przeprowadzić badanie kinetyczne z zsedowanym zwierzęciem w komorze obrazującej. Pierwszy obraz należy wykonać około pięciu minut po iniekcji lucyferazy, aby wygenerować krzywą kinetyczną ekspresji lucyferazy. Należy utworzyć sekwencję obrazowania w odstępach trzyminutowych przez maksymalnie jedną godzinę.Kliknij przycisk konfiguracji sekwencji (sequence setup) w panelu sterowania. W panelu sterowania określ ustawienia dla pierwszego obrazu bioluminescencyjnego w sekwencji, zaczynając od średniego binningu i automatycznego czasu ekspozycji.W celu wyznaczenia optymalnej ekspozycji zaleca się zastosowanie czasu oczekiwania. W edytorze sekwencji należy wybrać przycisk opóźnienia i określić czas opóźnienia wynoszący trzy minuty pomiędzy każdą akwizycją. Po kliknięciu przycisku dodaj w edytorze sekwencji parametry akwizycji zostaną dodane do tabeli.Powtórz ten krok dla każdego obrazu w sekwencji po ustaleniu krzywej. Optymalny czas obrazowania można określić, wykreślając natężenie sygnału w funkcji czasu, aby uzyskać najsilniejszy i najdokładniejszy sygnał. Zwierzęta należy obrazować w czasie najwyższej liczby fotonów in vivo, co – jak pokazuje ta krzywa – następuje około 25 minut po wstrzyknięciu lucyferyny.Aby uzyskać obraz zwierzęcia doświadczalnego, należy wybrać opcję „auto” w ustawieniach czasu akwizycji. Pozwala to oprogramowaniu na ustalenie binowania oraz optymalnego czasu naświetlania obrazu. Pliki programu oraz późniejsze komentarze do obrazów należy zapisać w katalogu użytkownika na komputerze.Aby rozpocząć obrazowanie 3D, należy użyć kreatora obrazowania, aby wybrać sondę reporterową firefly. W oknie bioluminescencji należy wybrać opcję „dalej”, po czym na ekranie pojawi się sześć wybranych widm do pozyskania; należy wybrać sekwencję akwizycji, a obrazy zostaną wykonane zgodnie z odpowiednimi ustawieniami w zakładce topografii powierzchni. W palecie narzędzi należy zamaskować zdjęcie tak, aby dopasować je do obrysu zwierzęcia.Aby stworzyć zrekonstruowaną siatkę topografii powierzchni zwierzęcia, przejdź do karty rekonstrukcji DLI 3D na palecie narzędzi i wybierz odpowiednie akwizycje obrazów do rekonstrukcji sygnału. Upewnij się, że w właściwościach tkanki wybrano mięsień (muscle), a w widmie źródła – świetlika (firefly). Kliknij „reconstruct” w karcie analizy (analyze), po czym powinna pojawić się rekonstrukcja 3D powierzchni zwierzęcia oraz odpowiadająca jej rekonstrukcja źródła sygnału.Analiza danych może rozpocząć się po przejęciu i zapisaniu obrazu; należy uzyskać dostęp do pliku programu, klikając przycisk przeglądaj i wybierając odpowiedni plik. Informacje o obrazie znajdują się w zakładce widok informacji o obrazie. Ilościowo określ intensywność sygnału, wybierając przycisk narzędzi ROI lub obszaru zainteresowania.Upewnij się, że obraz jest analizowany w trybie fotonowym, wybierając opcję photon. Na liście rozwijanej w lewym górnym rogu panelu sterowania obrazem wybierz przycisk ROI pomiarowego z rozwijanej listy typów, a następnie wybierz interesujący kształt ROI. Dostępne opcje to koło, kwadrat lub siatka.Ustaw położenie ROI, przeciągając zaznaczenie kształtu ROI do obszaru zawierającego sygnał bioluminescencyjny. Należy upewnić się, że zaznaczono wszystkie obszary o wysokiej intensywności na nabytym obrazie. Na koniec kliknij przycisk pomiaru, aby obliczyć intensywność sygnału w ROI.Wyświetla się etykieta ROI. Skuteczna implantacja komórek jest widoczna, gdy implantowane komórki są wykrywalne za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego w dniu operacji, niezależnie od tego, czy komórki zostały przetransfekowane genem luck czy luck two. Wykres ten śledzi wzrost komórek nowotworowych GL 2 6 1 luck u myszy albinos C 57 black six; bioluminescencję mierzono co trzy dni i przedstawiono jako liczbę fotonów in vivo w funkcji dni po implantacji.Fotografie przedstawiają bioluminescencję w różnych punktach czasowych. Kolorystyka wskazuje na poziom bioluminescencji, która jest relatywna do liczby komórek nowotworowych. Zwierzęta są uśmiercane w przypadku wystąpienia objawów choroby lub pogorszenia stanu dobrostanu.Choć nie jest to standardowy element tych analiz, mózg można wypreparować, a następnie miejscowo podać lucyferazę, aby uzyskać obraz ex vivo. Należy to zrobić natychmiast po uśmierceniu zwierzęcia, ponieważ reakcja bioluminescencyjna wymaga ATP. Ten wykres porównuje liczbę fotonów uzyskanych z guzów powstałych z komórek GL 2 6 1 luc w stosunku do komórek GL 2 6 1 L two. Wyniki uzyskane ze średniej z pięciu zwierząt wykazują, że gen L two zapewnia wyższy poziom bioluminescencji.Kolejna rycina przedstawia wiele widoków trójwymiarowej rekonstrukcji wewnątrzczaszkowej implantacji komórek GL 2 6 1 L, zarejestrowanej wspólnie ze szkieletem i mózgiem myszy. Przeprowadzono również porównanie kinetyki wstrzyknięć podskórnych i doszpaniowych; trzy minuty po wstrzyknięciu Luciferyn mysz została poddana sedacji, a obrazowanie wykonywano co trzy minuty przez godzinę, a następnie co sześć minut, aby wygenerować krzywą kinetyczną bioluminescencji. Jak pokazano tutaj, podskórna droga podania Luciferyny (oznaczona kolorem czerwonym) jest lepsza niż wstrzyknięcie doszpaniowe (oznaczone kolorem czarnym), a optymalny czas obrazowania zwierząt przypada na około 25 minut po wstrzyknięciu Luciferyny.Po opanowaniu techniki, prawidłowo wykonany zabieg chirurgiczny może zająć godzinę. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody badawcze, takie jak MRI lub obrazowanie fluorescencyjne, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania. Przykładowo, można sprawdzić, czy wokół guza występuje obrzęk lub jakie inne zmiany molekularne bądź biochemiczne zachodzą w obrębie guza i wokół niego.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzić implantację wewnątrzczaszkową oraz obrazowanie 3D in vivo komórek glejaka mysiego.

intracranial-implantation-with-subsequent-3d-vivo-bioluminescent

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wszczepienie czaszkowe z kolejnym 3D in vivo badaniem bioluminescencyjnym guzów mózgu u myszy

Ksenoprzeszczepy ludzkich guzów mózgu zmodyfikowane lucyferazą mogą być tworzone wewnątrzczaszkowo u myszy atymicznych, z późniejszym monitorowaniem wzrostu guza i odpowiedzi na terapię za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. W połączeniu z analizą przeżywalności, monitorowanie bioluminescencyjne stanowi niezbędne narzędzie badawcze w badaniach przedklinicznych terapii rozważanych w leczeniu guzów mózgu.

Tworzenie wewnątrzczaszkowych ksenograftów guzów mózgu z późniejszą analizą wzrostu guza i odpowiedzi na terapię z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego

Obrazowanie bioluminescencyjne aktywności czynnika indukowanego hipoksją-1α jest stosowane do monitorowania rozwoju hipoksji guza wewnątrzczaszkowego w mysim modelu przerzutów raka piersi do mózgu.

In vivo obrazowanie bioluminescencyjne dynamiki niedotlenienia guza w przerzutach raka piersi do mózgu w modelu mysim

Opisujemy zintegrowaną metodę precyzyjnej implantacji stereotaktycznej ludzkich komórek wielopostaciowego glejaka do mózgów myszy nago oraz następującego po niej seryjnego obrazowania in vivo w celu monitorowania wzrostu i odpowiedzi na leczenie powstałych ksenograftów.

Stereotaktyczna implantacja wewnątrzczaszkowa i obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ksenoprzeszczepów guzów w mysim modelu glioblastoma multiforme

Źródło: Clark, A.J., et al. Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia obrazowanie bioluminescencyjne w celu śledzenia progresji glejaka w immunokompetentnym modelu myszy, przy użyciu komórek nowotworowych eksprymujących lucyferazy i lucyferyny do nieinwazyjnego ilościowego określenia wzrostu guza.

Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego mysiego modelu glejaka

Ustaliliśmy korowy model glejaka ortotopowego u myszy do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej, który podsumowuje ograniczenia biofizyczne, które normalnie występują podczas wzrostu guza. Przewlekłe szklane okienko zastępujące czaszkę nad guzem umożliwia śledzenie postępu guza w czasie za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej

Komórki glejaka GL261 dostarczają użytecznego immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie właściwych technik monitorowania wzrostu guza wewnątrzczaszkowego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo oraz zweryfikowanie użyteczności komórek GL261 zmodyfikowanych lucyferazą do badania immunologii guza i podejść immunoterapeutycznych w leczeniu glejaka.

Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka

Fluorescencyjna tomografia molekularna do obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Opisujemy intraparenchymalne przeszczepienie ludzkich nerwowych komórek progenitorowych transdukowanych podwójnym wektorem reporterowym wyrażającym lucyferazy-zielone białko fluorescencyjne (GFP) w mózgu myszy. Po przeszczepie sygnał lucyferazy jest wielokrotnie mierzony za pomocą bioluminescencji in vivo i przeszczepionych komórek wykazujących ekspresję GFP, identyfikowanych w sekcjach mózgu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Prezentujemy nowatorskie podejście do dwufotonowej mikroskopii dostarczania przez nowotwór znakowanych fluorescencyjnie nanocząstek tlenku żelaza do glejaka w modelu mysim.

Dwufotonowa mikroskopia przyżyteczna glejaka w modelu mysim

Celem tego protokołu jest dostarczenie badaczom wysoce powtarzalnej techniki implantacji czaszkowych.

Steryotatyczna wewnątrzczaszkowa implantacja linii komórek xenotransplantatu pochodzenia pacjenckiego z glioblastomu u myszy

Poznaj metodę implantacji wewnątrzczaszkowej glejaków GL261 u myszy C57BL/6 z wykorzystaniem bioluminescencyjnego obrazowania 3D in vivo. Technika umożliwia ilościowe śledzenie wzrostu guza w czasie rzeczywistym.

Implantacja wewnątrzczaszkowa z następującym obrazowaniem bioluminescencyjnym 3D in vivo glejaków mysich

Przeglądaj więcej filmów