Protokół wykrywania i neutralizacji wolnych rodników w fazie gazowej w głównym nurcie dymu papierosowego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar ilości wolnych rodników w głównym nurcie dymu tytoniowego oraz ocena zdolności neutralizacji kilku przeciwutleniaczy. Jest to realizowane poprzez przygotowanie filtrów zawierających różne związki neutralizujące oraz filtrów kontrolnych bez związku neutralizującego. Następnie przeprowadzana jest symulacja palenia papierosów badawczych, w której dym przepływa przez roztwór do wychwytywania spinów.

Następnie wykorzystuje się rezonans spinowy elektronów, w skrócie ESR, do rejestracji widm uwięzionych rodników oraz próbek referencyjnych. Uzyskane widma ESR poddaje się rutynowej analizie w celu oddzielenia sygnału uwięzionych rodników w fazie gazowej od tła oraz ilościowego oznaczenia stężenia rodników przy użyciu próbki referencyjnej. Ostatecznie wyniki dostarczają informacji ilościowych o zawartości wolnych rodników w głównym strumieniu dymu tytoniowego oraz szacunków zdolności neutralizacji naturalnych przeciwutleniaczy za pomocą spektroskopii ESR z pułapkami spinowymi.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami analizy dymu tytoniowego, takimi jak chromatografia gazowa, jest to, że ESR wykazuje specyficzną czułość na wolne rodniki. Zastosowanie tej techniki może pomóc w ograniczeniu szkodliwych skutków dymu tytoniowego, ponieważ wolne rodniki stanowią główną grupę kancerogenów. Metoda ta pozwala na pogłębienie wiedzy na temat wolnych rodników w dymie tytoniowym, a może być również zastosowana w innych systemach, takich jak przemysłowe spaliny oraz smog. Narodowe Centrum Badań Biomedycznych w zakresie technologii elektronowego rezonansu spinowego, znane również jako cert, jest efektem naszego szerokiego doświadczenia w opracowywaniu nowoczesnej technologii ESR.

Dla badaczy zajmujących się elektronowym rezonansem spinowym oferujemy szeroki wachlarz usług skierowanych do nich oraz do społeczności biomedycznej. Nasze zaplecze jest regularnie udostępniane w celu wprowadzania przeciwutleniaczy do filtrów papierosowych. Najpierw rozpuścić przeciwutleniacze: pyknogenol oraz ekstrakt z winogron w 95% etanolu, a likopen rozpuścić w acetonie.

Dostosuj objętość rozpuszczalnika w zależności od rozpuszczalności przeciwutleniaczy. Następnie połącz rozpuszczone przeciwutleniacze z węglem aktywnym, mieszając w warunkach beztlenowych przez około 12 godzin. Warunki beztlenowe uzyskuje się poprzez przepuszczanie argonu przez mieszaninę podczas mieszania.

Po inkubacji przefiltruj roztwór i wysusz go w próżni. Następnie wprowadź przeciwutleniacze i węgiel do konwencjonalnego filtra octanowego, najpierw przecinając filtr na dwa kawałki. Umieść powlekone przeciwutleniacze roślinne pomiędzy dwoma kawałkami filtra, tworząc kanapkę z filtra z przeciwutleniaczami, a następnie włóż całość z powrotem do papierowego cylindra papierosa.

Przygotuj filtr kontrolny w taki sam sposób jak filtr przeciwutleniający, z wyjątkiem tego, że przed rozpoczęciem procedury doświadczalnej nie dodawaj przeciwutleniacza. Papierosy badawcze należy rozpakować i przechowywać w środowisku o stałej wilgotności, wykorzystując nasycony roztwór bromku sodu przez co najmniej dwa dni. Wyjmij cygara papierosowe zawierające tytoń i przymocuj je do połączonego filtra.

Przeprowadź symulację palenia do rutynowej analizy w temperaturze otoczenia, używając jednoportowego urządzenia do palenia, które składa się z aspiratora wodnego lub pompy próżniowej/kompresora powietrza połączonego z układem do pułapkowania spinowego poprzez trójnik z jednym otwartym końcem. Użyj przepływomierza, aby sprawdzić przepływ gazu i ustaw go na około 2,2 standard cubic feet per hour, regulując zawór umieszczony pomiędzy pompą a odpowietrznikiem. Zapal badane papierosy, stosując intensywną objętość zaciągnięcia wynoszącą 35 mililitrów przez czas dwóch sekund, powtarzając czynność co 60 sekund.

Otwarty koniec urządzenia do palenia powinien zostać zatkany podczas wykonywania zaciągnięć i pozostawiony otwarty pomiędzy nimi. Gdy koniec jest odblokowany, przez papierosa przedostaje się niewielki strumień powietrza, co odpowiada warunkom pomiędzy zaciągnięciami. Należy wykonać 10 intensywnych zaciągnięć dla każdego papierosa, zbierając wolne rodniki w fazie gazowej poprzez przepuszczanie głównego strumienia dymu papierosowego przez wkład filtra Cambridge, a następnie wprowadzając go do roztworu pułapkującego spiny.

Pułapka z ciekłym azotem usuwa parę wodną z głównego strumienia dymu, jednak nie wpływa w istotny sposób na rodniki w fazie gazowej. Po ostatnim zaciągnięciu przenieś alikwot roztworu pułapkującego z bąbelkowania do szklanej probówki z próbką o długości około 10 cali i średnicy wewnętrznej trzech milimetrów. Ponieważ tlen poszerza widma ESR i obniża czułość metody, odgazuj roztwór z tlenu metodą zamrażania-pompowania-odmrażania, najpierw zanurzając probówkę w ciekłym azocie, następnie odsysając roztwór pompą olejową, a następnie odmrażając roztwór w atmosferze argonu.

Powtórz tę metodę zamrażania, pompowania i rozmrażania kilka razy. Następnie zapieczętuj probówkę w próżni. Probówka jest teraz gotowa.

W celu przeprowadzenia dalszych pomiarów ESR, zarejestruj widma ESR w paśmie X na spektrometrze Bruker EMX przy częstotliwości 9,34 gigahertza. W warunkach standardowych zapoznaj się z pisanym protokołem w celu ustalenia typowych ustawień spektrometru. W przypadku tych eksperymentów wykonaj 25 akumulacji ESR, co zazwyczaj zajmuje około 20 minut.

Chociaż addukty pułapek spinowych są stosunkowo stabilne w warunkach eksperymentalnych po 12 godzinach, natężenie sygnałów ESR w roztworze benzenu spadło pięciokrotnie. Aby określić stężenie adduktu pułapkującego, należy zintegrować początkowe widmo ESR pierwszej pochodnej. Otrzymane widmo absorpcyjne wykazuje szerokie tło singletowe, co najprawdopodobniej wynika z obecności produktów w postaci sadzy i smoły zawartych w dymie.

Po odjęciu tego tła, zintegruj oddzielony triplet adduktu pułapkującego. Powtórz tę czynność, aby wyznaczyć stężenie wolnych rodników. Wartości podwójnych całek dla roztworu pułapkowania spinów porównuje się z wartościami dla roztworu rodnika nitroksylowego TEMPO o znanym stężeniu z eksperymentu zaprezentowanego tutaj, a także z dodatkowymi obliczeniami zawartymi w protokole pisemnym.

Uzyskano stężenie wolnych rodników w fazie gazowej głównego strumienia dymu papierosowego wynoszące około 7,1 × 10⁻⁹ M. Na tej podstawie ustalono, że całkowita liczba rodników wychwyconych z fazy gazowej całego papierosa wynosi około 1,5 × 10¹⁵. Podczas tego eksperymentu wstępne pomiary wykazały słabe sygnały ESR oraz niską powtarzalność ze względu na obecność wilgoci w strumieniu dymu.

Aby rozwiązać ten problem, do urządzenia do symulacji palenia dodano pułapkę z ciekłym azotem, umieszczoną pomiędzy filtrem Cambridge a roztworem pułapki spinowej. Pułapka z ciekłym azotem usuwała wodę z głównego strumienia dymu papierosowego poprzez szybkie zamrażanie i wychwytywanie jej na wewnętrznej ściance szklanej rurki. Znacznie poprawiło to sygnały ESR i pozwoliło na uzyskanie wysoce powtarzalnych wyników.

Zaobserwowano różne poziomy efektu wymiatania wolnych rodników w fazie gazowej głównego nurtu dymu papierosowego przez przeciwutleniacze roślinne i przedstawiono ich szybkości wymiatania. Likopen oraz ekstrakt z pestek winogron wykazały najwyższe wartości, natomiast najniższa szybkość została odnotowana dla pycnogenolu. Po opanowaniu tej techniki, w przypadku prawidłowego wykonania, procedura ta zajmuje mniej niż jedną godzinę.

Podczas przeprowadzania tej procedury istotne jest przepuszczenie dymu przez pułapkę z ciekłym azotem. Poprawia to jakość widm SR oraz powtarzalność po opracowaniu metody. Technika ta pomogła badaczom z obszaru zdrowia i środowiska w eksploracji i wykrywaniu obecności zagrażających zdrowiu wolnych rodników w różnych związkach lotnych.

Po obejrzeniu filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat ilościowego oznaczania wolnych rodników w głównym nurcie dymu tytoniowego w celu ograniczenia szkodliwych skutków palenia.