Name: Protokół wykrywania i usuwania wolnych rodników w fazie gazowej w głównym nurcie dymu papierosowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj metodę spin-trapping ESR do wykrywania wolnych rodników w dymie papierosowym i oceny zdolności antyoksydantów roślinnych do ich usuwania. Technika ta pozwala ilościowo określić stężenie rodników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez National Institute of Health, grant nr NIH/NCRR P41-RR 016292 (dla ACERT).

1. Materiały
Wszystkie rozpuszczalniki użyte w tej pracy były stopnia czystości reagent. Pułapka spinowa, w tym N-tert-butyl-α-phenylnitrone (PBN), oraz standardowy znacznik spinowy 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperinyoxyl (TEMPO) zostały zakupione w firmie Sigma i użyte bez dodatkowej modyfikacji. Roślinne przeciwutleniacze zostały pozyskane komercyjnie z firmy Swanson, Inc. USA.
2. Przygotowanie dymu papierosowego i analiza wolnych rodników
<ol>
	<li>W celu wprowadzenia przeciwutleniaczy do filtra, przeciwutleniacze pycnogenol i ekstrakt z pestek winogron rozpuszczono najpierw w 95% etanolu, natomiast likopen rozpuszczono w acetonie. Objętość rozpuszczalnika różniła się w zależności od rozpuszczalności przeciwutleniacza.</li>
	<li>Zastosowano ilość przeciwutleniaczy wynoszącą 0,4 mg/filtr. Następnie powleczono je 10 mg węgla aktywnego. W tym celu węgiel aktywny mieszano przez ok. 12 h z roztworem przeciwutleniacza w warunkach beztlenowych, po czym przefiltrowano i osuszono w próżni.</li>
	<li>Przeciwutleniacze wprowadzono następnie do konwencjonalnego filtra octanowego (filtr CA). W tym celu filtr przecięto na dwa kawałki. Powleczone roślinne przeciwutleniacze umieszczono między dwoma kawałkami filtra i owinięto kawałkiem taśmy, tworząc strukturę typu „kanapka” filtr-przeciwutleniacz-filtr (Rys. 1A). Ten połączony filtr przymocowano następnie do cygaretek zawierających tytoń. Filtr kontrolny wykonano w ten sam sposób co filtr z przeciwutleniaczami, z wyjątkiem tego, że nie dodano przeciwutleniacza.</li>
	<li>Przed symulacją palenia badane papierosy rozpakowano i przechowywano w środowisku o stałej wilgotności (20 °C, 60% wilgotności względnej) przy użyciu nasyconego roztworu NaBr przez minimum 2 dni.</li>
	<li>Symulację palenia do analizy rutynowej przeprowadzono w temperaturze otoczenia przy użyciu jednoportowego urządzenia do palenia, które, jak pokazano na Rys. 1, składa się z aspiratora wodnego lub pompy próżniowej/kompresora powietrza GAST DOA-P104-BN (Benton Harbor, Mich) połączonego z układem do pułapkownictwa spinowego poprzez trójnik z jednym otwartym końcem. Zaciągania wykonywano poprzez zatykanie otwartego końca, który pozostawał otwarty pomiędzy zaciągnięciami. Przepływ gazu sprawdzano miernikiem przepływu i ustawiono na poziomie ~2,2 SCFH = 17,5 mL/s poprzez regulację zaworu umieszczonego pomiędzy pompą a wylotem.</li>
	<li>Badane papierosy palono przy objętości zaciągnięcia 35 mL przez czas 2 sekund, powtarzając czynność co 60 sekund, analogicznie do1. Symulację palenia w celu ilościowego oszacowania wolnych rodników w fazie gazowej przeprowadzono w połączeniu z systemem pułapkownictwa spinowego, jak pokazano na Rys. 1.</li>
	<li>Dla każdego papierosa wykonano dziesięć intensywnych zaciągnięć (35 mL/zaciągnięcie). Wolne rodniki w fazie gazowej zbierano, przepuszczając MCS przez wkład filtra Cambridge, a następnie wprowadzano do roztworu pułapkowania (0,05 M PBN w benzenie, 2,0 mL).</li>
	<li>Po ostatnim zaciągnięciu napowietrzony roztwór pułapkujący doprowadzono do początkowej objętości (2,0 mL) za pomocą tego samego benzenu. Alikwot przeniesiono do szklanej rurki o długości ~250 mm i średnicy wewnętrznej 3 mm, zamkniętej na jednym końcu.</li>
	<li>Roztwór pułapkujący odtleniono za pomocą procedury zamrażania-pompowania-rozmrażania. Zamrożono go w ciekłym azocie, a następnie zastosowano próżnię. Następnie rozmrożono go w atmosferze argonu, pozwalając na ucieczkę uwięzionych pęcherzyków gazu, i ponownie zamrożono. Po trzykrotnym powtórzeniu tego cyklu rurkę zamknięto ogniwem palnika w próżni i wykorzystano do dalszych pomiarów ESR. Krok ten jest konieczny, ponieważ tlen, który jest dobrze rozpuszczalny w benzenie, poszerza linie ESR rodników organicznych. Odtlenianie znacząco poprawia stosunek sygnału do szumu.</li>
	<li>Widma ESR pasma X rejestrowano na spektrometrze Bruker EMX przy częstotliwości 9,34 GHz w warunkach standardowych. Ustawienia spektrometru stosowane w większości eksperymentów wynosiły: pole centralne 3312,5 G, szerokość skanowania 80 G, amplituda modulacji 0,5 G, stała czasowa 82 µs, czas skanowania 40 s.</li>
	<li>Addukty pułapki spinowej są stosunkowo stabilne w warunkach eksperymentalnych, co w niektórych przypadkach wymagało 25 akumulacji, co zazwyczaj trwało ~20 min. Jednak po 12 h intensywność sygnałów ESR w roztworze benzenu spadła około 5-krotnie.</li>
	<li>Aby określić stężenie adduktu pułapkującego, zintegrowano jego początkowe widmo ESR pierwszej pochodnej. Wynikowe widmo absorpcyjne wykazuje szerokie tło singletowe, najprawdopodobniej wynikające z produktów sadzy/smoły zawartych w dymie. 
	 
	Po odjęciu tego tła oddzielony triplet adduktu pułapkującego zintegrowano raz jeszcze (Rys. 2).</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
Większość wolnych rodników w dymie powstającym podczas palenia papierosów (faza gazowa) jest efemeryczna i niestabilna. Aby zaobserwować te rodniki, zastosowano technikę pułapkowania spinowego. Polega ona na wychwytywaniu wolnych rodników w fazie gazowej poprzez przekształcanie ich w addukt spinowy, który jest bardziej stabilny i może zostać wykryty za pomocą ESR (Rys. 1). W niniejszym badaniu do zbierania wolnych rodników w gazowej fazie dymu, które stanowią trudną do rozdzielenia mieszaninę rodników centrowych tlenowych i węglowych15, wykorzystano roztwór pułapki spinowej 0,05 M PBN. W naszym przypadku zaobserwowane stałe rozszczepienia hipertonicznego aN = 13,7 G oraz aH = 1,95 G są bardzo zbliżone do odpowiadających im wartości dla adduktów pułapkowania wolnych rodników alkoksylowych (RO.)2, co sugeruje, że stanowią one główny produkt. Wykazaliśmy, że słabe sygnały ESR i niska powtarzalność zaobserwowane w początkowych pomiarach (Rys. 2) wynikały z obecności wilgoci w strumieniu dymu. Aby rozwiązać ten problem, umieściliśmy pułapkę z ciekłym azotem (LN2) pomiędzy filtrem Cambridge a roztworem pułapki spinowej. Pułapka LN2 usunęła wodę ze strumienia MCS poprzez szybkie zamrażanie i wychwytywanie jej na wewnętrznej ściance szklanej rurki. Znacznie poprawiło to sygnały ESR i pozwoliło na uzyskanie wyników o wysokiej powtarzalności (Rys. 3).
Ilość uwięzionych wolnych rodników określono z wykorzystaniem próbki referencyjnej. W przypadku próbek kontrolnych bez przeciwutleniaczy typowe stężenie adduktów w benzenie, oszacowane poprzez porównanie podwójnego całkowania widma z podwójnym całkowaniem widma dla znanego stężenia TEMPO, wynosiło 1,24 μM (Rys.2). Ponieważ objętość powietrza przepływającego przez każdego papierosa podczas palenia wynosiła ~350 ml, daje to szacunkowe stężenie wolnych rodników w fazie gazowej MCS na poziomie ~7,1X10-9M oraz całkowitą liczbę rodników uwięzionych z fazy gazowej całego papierosa wynoszącą ~1,5X1015. Szacunkowa całkowita ilość wolnych rodników w dymie z całego papierosa, obejmująca zarówno fazę gazową, jak i cząsteczkową, wyniosła ~1016 wolnych rodników9.
Zaobserwowano zróżnicowany poziom efektu wymiatania wolnych rodników w fazie gazowej w głównym nurcie dymu papierosowego przez przeciwutleniacze roślinne. Szybkości ich wymiatania przedstawiono na Ryc. 4. Likopen oraz ekstrakt z pestek winogron wykazały najwyższe wartości, podczas gdy w przypadku pyknogenolu zaobserwowano niższą szybkość (Ryc. 4).
<img alt="Schemat układu do analizy dymu papierosowego z pułapką spinową, filtrem Cambridge i procesem z ciekłym azotem." src="/files/ftp_upload/3406/3406fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat ulepsionego projektu symulacji palenia w celu zbierania wolnych rodników w fazie gazowej w głównym nurcie dymu papierosowego (MCS) przy użyciu pułapki spinowej. MCS był zasysany przez aspirator wodny przez filtr CA, następnie przez filtr Cambridge (filtr żółty) i przeprowadzany przez pułapkę z ciekłym azotem w celu usunięcia H2O. Produkty w fazie gazowej trafiały ostatecznie do pułapki spinowej i przelatywały przez roztwór pułapki spinowej. Przeciwutleniacz roślinny umieszczono pomiędzy dwoma konwencjonalnymi filtrami octanowymi (powiększenie w okręgu A) przymocowanymi do papierosa w celu wychwytywania wolnych rodników w MCS.
<img alt="Zestaw wykresów pochodnej i całki; widma EPR; analiza: odejmowanie linii bazowej, podwójne całkowanie." src="/files/ftp_upload/3406/3406fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Ilościowe oszacowanie stężenia adduktu pułapkowania spinowego w benzenie wymaga odjęcia szerokiego sygnału tła z pierwszego widma całkowego. Parametry rozszczepienia hiperprecyzyjnego dla adduktu pułapkowania spinowego wynoszą aH = 1.95 G, aN = 13.7G.
<img alt="Porównanie widm rezonansu spinowego elektronów z zastosowaniem i bez zastosowania ciekłego azotu; analiza wykresu." src="/files/ftp_upload/3406/3406fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Przepuszczenie przez pułapkę z LN2 znacznie poprawia jakość sygnałów ESR uzyskanych podczas spin-trappingu MCS.
<img alt="Wykres analizy spektralnej; widma EPR przeciwutleniaczy: pyknogenolu, nasion winogron, likopenu, kontroli." src="/files/ftp_upload/3406/3406fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Wpływ naturalnych przeciwutleniaczy na stężenie wolnych rodników w MCS. Względne intensywności sygnałów wynoszą: kontrola – 100%, pyknogenol – 55%, ekstrakt z nasion winogron – 12%, likopen – 10%.

<ol><li>Baum, S. L., Anderson, I. G. M., Baker, R. R., Murphy, D. M., Rowlands, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+spin+resonance+and+spin+trap+investigation+of+free+radicals+in+cigarette+smoke%3A+development+of+a+quantification+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica.+Acta%22%5BJournal%5D)">Electron spin resonance and spin trap investigation of free radicals in cigarette smoke: development of a quantification procedure.</a> Analytica Chimica. Acta. 481, 1-13 (2003).</li>
<li>Bluhm, A. L., Weinstein, J., Sousa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+in+tobacco+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Free radicals in tobacco smoke.</a> Nature. 229, 500-500 (1971).</li>
<li>Church, D. F., Pryor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-radical+chemistry+of+cigarette+smoke+and+its+toxicological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health.+Perspect%22%5BJournal%5D)">Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications.</a> Environ. Health. Perspect. 64, 111-126 (1985).</li>
<li>Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Stavrides, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenging+effects+of+hemoglobin+and+related+heme+containing+compounds+on+nitric+oxide%2C+reactive+oxidants+and+carcinogenic+volatile+nitrosocompounds+of+cigarette+smoke.+a+new+method+for+protection+against+the+dangerous+cigarette+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Scavenging effects of hemoglobin and related heme containing compounds on nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke. a new method for protection against the dangerous cigarette constituents.</a> Anticancer. Res. 14, 2717-2726 (1994).</li>
<li>Hecht, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke+carcinogens+and+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke carcinogens and lung cancer.</a> Journal of the National Cancer Institute. 91, 1194-1210 (1999).</li>
<li>Kodama, M., Kaneko, M., Aida, M., Inoue, F., Nakayama, T., Akimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radical+chemistry+of+cigarette+smoke+and+its+implication+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Free radical chemistry of cigarette smoke and its implication in human cancer.</a> Anticancer. Res. 17, 433-437 (1997).</li>
<li>Nair, A. K., Brandt, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+smoking+on+health+care+costs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oklahoma+State+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Effects of smoking on health care costs.</a> Journal of Oklahoma State Medical Association. 93, 245-250 (2000).</li>
<li>Nishizawa, M., Kohno, M., Nishimura, M., Kitagawa, A., Niwano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Peroxyradicals+in+Cigarette+Smoke+and+the+Scavenging+Effect+of+Shikonin%2C+a+Naphthoquinone+Pigment%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Pharm.+Bull%22%5BJournal%5D)">Presence of Peroxyradicals in Cigarette Smoke and the Scavenging Effect of Shikonin, a Naphthoquinone Pigment.</a> Chem. Pharm. Bull. 53, 796-799 (2005).</li>
<li>Pryor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+and+the+involvement+of+free+radical+reactions+in+chemical+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke and the involvement of free radical reactions in chemical carcinogenesis.</a> Br. J. Cancer. 8, 19-23 (1987).</li>
<li>Pryor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+radicals+and+the+role+of+free+radicals+in+chemical+carcinogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health.+Perspect%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke radicals and the role of free radicals in chemical carcinogenicity.</a> Environ. Health. Perspect. 105, 875-882 (1997).</li>
<li>Rozzi, N. I., Singh, R. K., Vierling, R. A., Watkins, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercritical+fluid+extraction+of+lycopene+from+tomato+processing+byproducts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food.+Chem%22%5BJournal%5D)">Supercritical fluid extraction of lycopene from tomato processing byproducts.</a> J. Agric. Food. Chem. 50, 2638-2643 (2002).</li>
<li>Shopland, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+use+and+its+contribution+to+early+cancer+mortality+with+a+special+emphesis+on+cigarette+smoking%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental.+Health.+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Tobacco use and its contribution to early cancer mortality with a special emphesis on cigarette smoking.</a> Environmental. Health. Perspectives. 103, 131-142 (1995).</li>
<li>Shrikhandle, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wine+products+with+health+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Wine products with health benefits.</a> Food Res. Int. 33, 469-474 (2000).</li>
<li>Valavanidis, A., Haralambous, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+by+electron+paramagnetic+resonance+of+free+radical+species+in+the+mainstream+and+sidestream+smoke+of+cigarettes+with+conventional+acetate+filters+and+%27bio-filters%27%5BTitle%5D)+AND+%22Redox.+Rep%22%5BJournal%5D)">A comparative study by electron paramagnetic resonance of free radical species in the mainstream and sidestream smoke of cigarettes with conventional acetate filters and 'bio-filters'.</a> Redox. Rep. 6, 161-171 (2001).</li>
<li>Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke%3A+involvement+of+reactive+oxygen+species+and+stable+free+radicals+in+mechanisms+of+oxidative+damage%2C+carcinogenesis+and+synergistic+effects+with+other+respirable+particles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke: involvement of reactive oxygen species and stable free radicals in mechanisms of oxidative damage, carcinogenesis and synergistic effects with other respirable particles.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 6, 445-462 (2009).</li>
</ol>

Brak deklarowanych konfliktów interesów.

Niezawodna ocena wpływu różnych wymiatywaczy wolnych rodników w dymie tytoniowym wymaga powtarzalnej techniki ilościowego wykrywania wolnych rodników. Wcześniej1 wykazano, że niewielkie objętości roztworów pułapek spinowych o wyższym stężeniu w rozpuszczalnikach niepolarnych są najskuteczniejsze w wychwytywaniu wolnych rodników z dymu tytoniowego. Dym papierosowy zawsze zawiera parę wodną powstałą w wyniku spalania związków organicznych oraz pozostałą wilgoć w tytoniu, która może przedostać się do rozpuszczalnika pułapkującego. Ta domieszka wody w roztworze pułapki spinowej PBN znacznie skraca czas życia adduktów pułapkowania spinowego oraz zmniejsza intensywność ich sygnałów ESR. Usunięcie tej wilgoci poprzez proste przepuszczenie MCS przez rurkę w kształcie litery U chłodzoną ciekłym azotem drastycznie poprawiło jakość widm ESR w naszych eksperymentach, mimo że pewna część rodników w fazie gazowej mogła zostać również uwięziona na zamrożonej powierzchni.
Stosując tę technikę, porównaliśmy względną wydajność różnych naturalnych związków wykazujących działanie wymiatującego rodniki, wprowadzonych do filtrów papierosowych. Stwierdziliśmy, że likopen i ekstrakt z pestek winogron bezpośrednio po włączeniu do filtrów papierosowych są w stanie wymieść do 90% wolnych rodników z gazowej fazy MSC. Tak wysoka zdolność wymiatania plasuje te tanie i łatwo dostępne naturalne związki wśród najskuteczniejszych opisanych protectorów wolnych rodników, takich jak hemoglobina i szikonina8,14. Jednak w naszych eksperymentach filtry papierosowe obciążone badanymi naturalnymi przeciwutleniaczami utraciły znaczną część swojej zdolności wymiatania po tygodniu przechowywania w temperaturze pokojowej. Rozwiązanie tego problemu może stymulować przyszłe zastosowanie likopenu i ekstraktu z pestek winogron w komercyjnych filtrach papierosowych.

protokół wykrywania i neutralizacji wolnych rodników w fazie gazowej w głównym nurcie dymu papierosowego

A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

Palenie papierosów jest powiązane z nowotworami u ludzi. Wykazano, że większość zgonów z powodu raka płuc jest spowodowana paleniem papierosów 5,6,7,12. Chociaż smole tytoniowe i pokrewne produkty w fazie cząsteczkowej dymu papierosowego są głównymi przyczynami chorób kancerogennych i mutagennych, dym papierosowy zawiera znaczne ilości wolnych rodników, które są również uważane za istotną grupę kancerogenów9,10. Wolne rodniki atakują składniki komórkowe, uszkadzając strukturę białek, lipidy oraz sekwencje DNA, co zwiększa ryzyko rozwoju różnych rodzajów nowotworów. Wdychane rodniki tworzą addukty, które przyczyniają się do wielu negatywnych skutków zdrowotnych dymu tytoniowego w płucach3. Prowadzono badania nad redukcją wolnych rodników w dymie papierosowym w celu zmniejszenia ryzyka uszkodzeń indukowanych paleniem. Doniesiono, że hemoglobina i związki zawierające hem mogą częściowo wychwytywać tlenek azotu, utleniacze reaktywne oraz kancerogenne lotne związki nitrozo dymu papierosowego4. Do wychwytywania wolnych rodników i usuwania do 90% wolnych rodników z dymu papierosowego wykorzystano „biofiltr” składający się z hemoglobiny i węgla aktywnego14. Jednak ze względu na nieopłacalność kosztową nie udało się go skomercjalizować. Inne badanie wykazało wysoką wydajność wychwytywania przez shikoninę, składnik chińskiej medycyny ziołowej8. W niniejszym badaniu przedstawiamy protokół wprowadzania powszechnych naturalnych ekstraktów przeciwutleniających do filtra papierosowego w celu wychwytywania wolnych rodników w fazie gazowej dymu papierosowego oraz pomiar efektu wychwytywania wolnych rodników w fazie gazowej w głównym nurcie dymu papierosowego (MCS) z wykorzystaniem spektroskopii elektronowego rezonansu spinowego (ESR) z pułapką spinową1,2,14. Wykazaliśmy wysoką zdolność wychwytywania likopenu oraz ekstraktu z pestek winogron, co może wskazywać na ich przyszłe zastosowanie w filtrach papierosowych. Istotną zaletą tych potencjalnych substancji wychwytujących jest to, że mogą być one pozyskiwane w dużych ilościach odpowiednio z produktów ubocznych przemysłu pomidorowego lub winiarskiego11,13

Spektroskopia ESR z pułapkowaniem spinowym została wykorzystana do zbadania wpływu roślinnych przeciwutleniaczy, takich jak likopen, pyknogenol i ekstrakt z pestek winogron, na neutralizację wolnych rodników w fazie gazowej w dymie papierosowym.

Protokół wykrywania i neutralizacji wolnych rodników w fazie gazowej w głównym nurcie dymu papierosowego

Palenie papierosów wiąże się z występowaniem nowotworów u ludzi. Wykazano, że większość zgonów z powodu raka płuc jest spowodowana paleniem papierosów 5,6,7,12. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar ilości wolnych rodników w głównym nurcie dymu tytoniowego oraz ocena zdolności neutralizacji kilku przeciwutleniaczy. Jest to realizowane poprzez przygotowanie filtrów zawierających różne związki neutralizujące oraz filtrów kontrolnych bez związku neutralizującego. Następnie przeprowadzana jest symulacja palenia papierosów badawczych, w której dym przepływa przez roztwór do wychwytywania spinów.Następnie wykorzystuje się rezonans spinowy elektronów, w skrócie ESR, do rejestracji widm uwięzionych rodników oraz próbek referencyjnych. Uzyskane widma ESR poddaje się rutynowej analizie w celu oddzielenia sygnału uwięzionych rodników w fazie gazowej od tła oraz ilościowego oznaczenia stężenia rodników przy użyciu próbki referencyjnej. Ostatecznie wyniki dostarczają informacji ilościowych o zawartości wolnych rodników w głównym strumieniu dymu tytoniowego oraz szacunków zdolności neutralizacji naturalnych przeciwutleniaczy za pomocą spektroskopii ESR z pułapkami spinowymi.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami analizy dymu tytoniowego, takimi jak chromatografia gazowa, jest to, że ESR wykazuje specyficzną czułość na wolne rodniki. Zastosowanie tej techniki może pomóc w ograniczeniu szkodliwych skutków dymu tytoniowego, ponieważ wolne rodniki stanowią główną grupę kancerogenów. Metoda ta pozwala na pogłębienie wiedzy na temat wolnych rodników w dymie tytoniowym, a może być również zastosowana w innych systemach, takich jak przemysłowe spaliny oraz smog. Narodowe Centrum Badań Biomedycznych w zakresie technologii elektronowego rezonansu spinowego, znane również jako cert, jest efektem naszego szerokiego doświadczenia w opracowywaniu nowoczesnej technologii ESR.Dla badaczy zajmujących się elektronowym rezonansem spinowym oferujemy szeroki wachlarz usług skierowanych do nich oraz do społeczności biomedycznej. Nasze zaplecze jest regularnie udostępniane w celu wprowadzania przeciwutleniaczy do filtrów papierosowych. Najpierw rozpuścić przeciwutleniacze: pyknogenol oraz ekstrakt z winogron w 95% etanolu, a likopen rozpuścić w acetonie.Dostosuj objętość rozpuszczalnika w zależności od rozpuszczalności przeciwutleniaczy. Następnie połącz rozpuszczone przeciwutleniacze z węglem aktywnym, mieszając w warunkach beztlenowych przez około 12 godzin. Warunki beztlenowe uzyskuje się poprzez przepuszczanie argonu przez mieszaninę podczas mieszania.Po inkubacji przefiltruj roztwór i wysusz go w próżni. Następnie wprowadź przeciwutleniacze i węgiel do konwencjonalnego filtra octanowego, najpierw przecinając filtr na dwa kawałki. Umieść powlekone przeciwutleniacze roślinne pomiędzy dwoma kawałkami filtra, tworząc kanapkę z filtra z przeciwutleniaczami, a następnie włóż całość z powrotem do papierowego cylindra papierosa.Przygotuj filtr kontrolny w taki sam sposób jak filtr przeciwutleniający, z wyjątkiem tego, że przed rozpoczęciem procedury doświadczalnej nie dodawaj przeciwutleniacza. Papierosy badawcze należy rozpakować i przechowywać w środowisku o stałej wilgotności, wykorzystując nasycony roztwór bromku sodu przez co najmniej dwa dni. Wyjmij cygara papierosowe zawierające tytoń i przymocuj je do połączonego filtra.Przeprowadź symulację palenia do rutynowej analizy w temperaturze otoczenia, używając jednoportowego urządzenia do palenia, które składa się z aspiratora wodnego lub pompy próżniowej/kompresora powietrza połączonego z układem do pułapkowania spinowego poprzez trójnik z jednym otwartym końcem. Użyj przepływomierza, aby sprawdzić przepływ gazu i ustaw go na około 2,2 standard cubic feet per hour, regulując zawór umieszczony pomiędzy pompą a odpowietrznikiem. Zapal badane papierosy, stosując intensywną objętość zaciągnięcia wynoszącą 35 mililitrów przez czas dwóch sekund, powtarzając czynność co 60 sekund.Otwarty koniec urządzenia do palenia powinien zostać zatkany podczas wykonywania zaciągnięć i pozostawiony otwarty pomiędzy nimi. Gdy koniec jest odblokowany, przez papierosa przedostaje się niewielki strumień powietrza, co odpowiada warunkom pomiędzy zaciągnięciami. Należy wykonać 10 intensywnych zaciągnięć dla każdego papierosa, zbierając wolne rodniki w fazie gazowej poprzez przepuszczanie głównego strumienia dymu papierosowego przez wkład filtra Cambridge, a następnie wprowadzając go do roztworu pułapkującego spiny.Pułapka z ciekłym azotem usuwa parę wodną z głównego strumienia dymu, jednak nie wpływa w istotny sposób na rodniki w fazie gazowej. Po ostatnim zaciągnięciu przenieś alikwot roztworu pułapkującego z bąbelkowania do szklanej probówki z próbką o długości około 10 cali i średnicy wewnętrznej trzech milimetrów. Ponieważ tlen poszerza widma ESR i obniża czułość metody, odgazuj roztwór z tlenu metodą zamrażania-pompowania-odmrażania, najpierw zanurzając probówkę w ciekłym azocie, następnie odsysając roztwór pompą olejową, a następnie odmrażając roztwór w atmosferze argonu.Powtórz tę metodę zamrażania, pompowania i rozmrażania kilka razy. Następnie zapieczętuj probówkę w próżni. Probówka jest teraz gotowa.W celu przeprowadzenia dalszych pomiarów ESR, zarejestruj widma ESR w paśmie X na spektrometrze Bruker EMX przy częstotliwości 9,34 gigahertza. W warunkach standardowych zapoznaj się z pisanym protokołem w celu ustalenia typowych ustawień spektrometru. W przypadku tych eksperymentów wykonaj 25 akumulacji ESR, co zazwyczaj zajmuje około 20 minut.Chociaż addukty pułapek spinowych są stosunkowo stabilne w warunkach eksperymentalnych po 12 godzinach, natężenie sygnałów ESR w roztworze benzenu spadło pięciokrotnie. Aby określić stężenie adduktu pułapkującego, należy zintegrować początkowe widmo ESR pierwszej pochodnej. Otrzymane widmo absorpcyjne wykazuje szerokie tło singletowe, co najprawdopodobniej wynika z obecności produktów w postaci sadzy i smoły zawartych w dymie.Po odjęciu tego tła, zintegruj oddzielony triplet adduktu pułapkującego. Powtórz tę czynność, aby wyznaczyć stężenie wolnych rodników. Wartości podwójnych całek dla roztworu pułapkowania spinów porównuje się z wartościami dla roztworu rodnika nitroksylowego TEMPO o znanym stężeniu z eksperymentu zaprezentowanego tutaj, a także z dodatkowymi obliczeniami zawartymi w protokole pisemnym.Uzyskano stężenie wolnych rodników w fazie gazowej głównego strumienia dymu papierosowego wynoszące około 7,1 × 10⁻⁹ M. Na tej podstawie ustalono, że całkowita liczba rodników wychwyconych z fazy gazowej całego papierosa wynosi około 1,5 × 10¹⁵. Podczas tego eksperymentu wstępne pomiary wykazały słabe sygnały ESR oraz niską powtarzalność ze względu na obecność wilgoci w strumieniu dymu.Aby rozwiązać ten problem, do urządzenia do symulacji palenia dodano pułapkę z ciekłym azotem, umieszczoną pomiędzy filtrem Cambridge a roztworem pułapki spinowej. Pułapka z ciekłym azotem usuwała wodę z głównego strumienia dymu papierosowego poprzez szybkie zamrażanie i wychwytywanie jej na wewnętrznej ściance szklanej rurki. Znacznie poprawiło to sygnały ESR i pozwoliło na uzyskanie wysoce powtarzalnych wyników.Zaobserwowano różne poziomy efektu wymiatania wolnych rodników w fazie gazowej głównego nurtu dymu papierosowego przez przeciwutleniacze roślinne i przedstawiono ich szybkości wymiatania. Likopen oraz ekstrakt z pestek winogron wykazały najwyższe wartości, natomiast najniższa szybkość została odnotowana dla pycnogenolu. Po opanowaniu tej techniki, w przypadku prawidłowego wykonania, procedura ta zajmuje mniej niż jedną godzinę.Podczas przeprowadzania tej procedury istotne jest przepuszczenie dymu przez pułapkę z ciekłym azotem. Poprawia to jakość widm SR oraz powtarzalność po opracowaniu metody. Technika ta pomogła badaczom z obszaru zdrowia i środowiska w eksploracji i wykrywaniu obecności zagrażających zdrowiu wolnych rodników w różnych związkach lotnych.Po obejrzeniu filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat ilościowego oznaczania wolnych rodników w głównym nurcie dymu tytoniowego w celu ograniczenia szkodliwych skutków palenia.

a-protocol-for-detecting-scavenging-gas-phase-free-radicals

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Protokół wykrywania i usuwania wolnych rodników w fazie gazowej w głównym dymie papierosowym

Komórki nabłonka płuc można wyizolować z dróg oddechowych myszy i hodować na granicy fazy powietrze-ciecz jako model zróżnicowanego nabłonka oddechowego. Opisano protokół izolacji, hodowli i narażania tych komórek na dym papierosowy z głównego strumienia w celu zbadania odpowiedzi molekularnych na tę toksynę środowiskową.

Izolacja komórek nabłonka dróg oddechowych myszy i ekspozycja na eksperymentalny dym tytoniowy w układzie interfejsu powietrze-ciecz

Source: Li, T., et al. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates how cigarette smoke extract weakens antimicrobial defense in lung epithelial cells by reducing AMP production, leading to increased bacterial invasion. The procedure measures intracellular bacterial load to assess the impact of smoke exposure on host-pathogen interactions.

Analyzing the Effects of Cigarette Smoke on Antimicrobial Defense in Lung Epithelial Cells

Chemia biomimetyczna oparta na rodnikach została zastosowana do tworzenia bibliotek niezbędnych do rozwoju biomarkerów.

Wolne rodniki w biologii chemicznej: od zachowania chemicznego do rozwoju biomarkerów

Celem tego protokołu jest wystawienie ludzkich organotypowych 3D modeli tkanek oskrzelowych i nosowych na główny nurt dymu papierosowego (CS) na granicy powietrze-ciecz. Wpływ CS na tkanki jest następnie badany za pomocą testu aktywności cytochromu P450, pomiaru bicia rzęsek i podejścia opartego na biologii systemowej.

Ocena skutków powtarzającego się narażenia organotypowych modeli 3D hodowli tkanek oskrzelowych i nosowych na cały dym papierosowy

Korzystając z zoptymalizowanych testów ex vivo ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), wykazaliśmy, że preparat palnego wyrobu tytoniowego wyraźnie hamuje wewnątrzkomórkowo wydzielane cytokiny za pośrednictwem receptorów i cytolityczną zdolność efektorowych PBMC. Te szybkie testy mogą być przydatne w ocenie produktu i zrozumieniu potencjalnych długoterminowych skutków narażenia na palenie tytoniu.

Metody oceny cytotoksyczności i immunosupresji preparatów palnych wyrobów tytoniowych

Celem badania była ocena biologicznego wpływu 15 składników dymu papierosowego przy użyciu kombinacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym opartego na impedancji i platformy opartej na badaniach przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS) do oceny toksykologicznej in vitro. Badanie to dostarcza informacji na temat skutecznych dawek, toksyczności i sposobów działania badanych związków.

Analiza przesiewowa o wysokiej zawartości w celu oceny skutków toksykologicznych szkodliwych i potencjalnie szkodliwych składników (HPHC)

Ten protokół opisuje metodę wystawiania gryzoni na działanie oparów papierosów elektronicznych (E-vapor) i dymu papierosowego. Komory ekspozycyjne są konstruowane poprzez modyfikację komór anestezjologicznych za pomocą zautomatyzowanego systemu pompowania, który dostarcza gryzoniom parę E lub dym papierosowy. System ten można łatwo zmodyfikować, aby uwzględnić wiele eksperymentalnych punktów końcowych.

Porównanie wpływu oparów papierosów elektronicznych i dymu papierosowego w nowatorskim systemie ekspozycji in vivo

Tutaj opisujemy programowalne urządzenie laboratoryjne, które może być używane do tworzenia ekstraktów konwencjonalnego dymu papierosowego i aerozolu z papierosów elektronicznych. Metoda ta stanowi użyteczne narzędzie do bezpośrednich porównań między tradycyjnymi papierosami a papierosami elektronicznymi i stanowi przystępny punkt wyjścia do badań nad papierosami elektronicznymi.

Sterowane mikrokontrolerem urządzenie do wytwarzania płynnych ekstraktów z konwencjonalnego dymu papierosowego i aerozolu z papierosów elektronicznych

Na całym świecie rośnie liczba użytkowników elektronicznych papierosów (e-papierosów). Niewiele jednak wiadomo na temat skutków zdrowotnych wywoływanych przez wdychane aerozole do e-papierosów. W tym artykule opisano technikę wytwarzania aerozolu w e-papierosach odpowiednią do narażenia zwierząt i późniejszych badań toksykologicznych. Takie protokoły są wymagane do ustanowienia eksperymentalnie odtwarzalnych i znormalizowanych systemów ekspozycji na e-papierosy.

Wytwarzanie aerozolu z papierosów elektronicznych przez urządzenie do waporyzacji maszynowej trzeciej generacji: zastosowanie do badań toksykologicznych

Opisujemy tutaj metody czułego i dokładnego oznaczania zmian 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-oxodGuo), 1,N 6-etheno-2'-deoksyadenozyny (1,N 6-dAdo) i 1,N 2-etheno-2'-deoksyguanozyny (1,N 2-dGuo) w DNA. Metody te zastosowano do oceny wpływu drobnego pyłu zawieszonego (PM2,5) w tkankach (płuca, wątroba i nerki) narażonych myszy A/J.

Kwantyfikacja trzech zmian DNA za pomocą spektrometrii mas i ocena ich poziomów w tkankach myszy narażonych na działanie drobnego pyłu zawieszonego w otoczeniu

Poznaj metodę spin-trapping ESR do wykrywania wolnych rodników w dymie papierosowym i oceny zdolności antyoksydantów roślinnych do ich usuwania. Technika ta pozwala ilościowo określić stężenie rodników.

Protokół wykrywania i neutralizacji wolnych rodników w fazie gazowej w głównym nurcie dymu papierosowego

Przeglądaj więcej filmów