Monitorowanie aktywności rozszczepionej kaspazy-3 i apoptozy unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych za pomocą obrazowania żywych komórek i płatalnych substratów barwnika fluorogenicznego po depolaryzacji błony wywołanej potasem

Procedura ta pozwala na monitorowanie śmierci komórek glejowych oligo DDR w czasie rzeczywistym. Osiąga się to poprzez najpierw hodowlę komórek, a następnie komórki są przygotowywane do obrazowania żywych komórek. Następnym krokiem jest zapewnienie leczenia komórkom i monitorowanie efektów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Ostatnim krokiem jest wykonanie analizy danych. Ostatecznie wyniki pokazują wskaźniki śmierci komórek w populacji komórek po leczeniu lub bodźcu poprzez monitorowanie fluorescencji jądrowej z barwnika fluro aktywowanego kaspazą. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak barwienie immunologiczne, jest możliwość jednoczesnego zbierania wielu punktów czasowych.

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii komórki, takie jak reakcje na farmakologię, odczynniki i różne metody leczenia. Teraz ta metoda może dostarczyć informacji na temat śmierci w kulturach komórkowych. Może być również stosowany do innych układów, takich jak tkanki organotypowe ex vivo, w tym plastry mózgu.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ dostosowują się do pracy z żywą tkanką, a nie z tkanką utrwaloną. Wizualna demonstracja tej techniki jest ważna, ponieważ przygotowanie żywych próbek komórek składa się z wielu etapów w porównaniu z utrwalonymi tkankami. Najpierw rozmrozić uwiecznione komórki glejowe oligo drooga N 19 w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, podczas gdy komórki się rozmrażają.

Dodaj siedem mililitrów DMEM o wysokim poziomie glukozy uzupełnionego 10% FBS i 1% streptomycyną penicyliny do 10-centymetrowej naczynia hodowlanej. Następnie dodaj zawiesinę komórkową kroplami do płytki i delikatnie wymieszaj szalkę Petriego, aby równomiernie rozproszyć komórki. Hoduj komórki w temperaturze 34 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5-centowym dwutlenkiem węgla przez cztery godziny po czterech godzinach.

Odessać pożywkę z płytek, aby usunąć wszelkie pozostałe DMSO. Krioprotektant. Zastąp siedmioma mililitrami świeżej pożywki po czterech do siedmiu dniach wzrostu. Gdy komórki osiągną 70 do 80%Confluence, zasysaj pożywkę i pipetuj jeden mililitr kropli na arkusz komórek, inkubowaną temperaturę pokojową przez pięć minut.

Następnie zbierz komórki następne nasiono, 10-centymetrowe naczynie do hodowli tkankowych z zebranymi komórkami o gęstości 0,1 razy 10 do sześciu komórek na mililitr i umieść tę szalkę w inkubatorze do hodowli tkankowych. Po kolejnym masażu komórki można posiać do eksperymentów z obrazowaniem żywych komórek. Aby to zrobić, zbierz komórki jak poprzednio, a następnie usuń 30 mikrolitrów zawiesiny komórek i policz komórki za pomocą hemocytometru.

Następnie za pomocą sterylnych kleszczyków umieść niepowlekane szklane szkiełka nakrywkowe. W studzienkach sześciodołkowej płytki dodaj komórki do studzienki o gęstości 0,1 razy 10 do sześciu komórek na mililitr. W dwóch mililitrach wolnego od fenolu pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnione 10% FBS i 1% penicyliny streptomycyna pozwalają komórkom rosnąć przez noc w temperaturze 34 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przed transfekcją.

Następnego dnia połącz 100 mikrolitrów pożywki wolnej od surowicy 0,5 z czterema mikrogramami oczyszczonego plazmidu, DNA i czterema mikrolitrami genu HD FU. Delikatnie zmieszaj mieszaninę dwukrotnie, a następnie pozwól DNA sdojść do skompleksowania w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po upływie czasu inkubacji dodać mieszaninę DNA HD genu FU bezpośrednio do hodowanych komórek.

Delikatnie przechyl talerz, aby wymieszać. Następnie hoduj komórki przez dodatkowe 48 godzin w temperaturze 34 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przed leczeniem lub eksperymentami. Najpierw włącz skrzynkę kontrolną przyrządu LCI light pod napięciem.

Należy to zrobić na trzy godziny przed rozpoczęciem eksperymentu, aby zapewnić dokładne rozgrzanie sceny. Skrzynka kontrolna powinna być włączona co najmniej na godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu. Następnie, pracując w okapie przepływowym, spryskaj komorę hodowlaną LCI light magnetic type i kleszcze 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na pięć minut.

Wyjmij komórki z inkubatora i zbadaj je pod mikroskopem, aby potwierdzić, że są zdrowe. Komórki powinny wyglądać jak durant i dobrze rozprowadzić się na szklanym szkiełku nakrywkowym z licznymi procesami membranowymi. Komórki ze zmniejszoną liczbą przedłużeń procesu lub jądrem o nieregularnym kształcie są prawdopodobnie zestresowane transfekcją i nie nadają się do dalszych eksperymentów pracujących w okapie przepływowym.

Przechylić płytkę sześciodołkową i usunąć szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszków. Szybko umieść komórkę szkiełka nakrywkowego stroną do góry w dolnej płycie komory. Nie dopuścić do wyschnięcia szkiełka nakrywkowego.

Następnie przymocuj magnetyczny korpus główny komory hodowlanej i dodaj 500 mikrolitrów pożywki z oryginalnej płytki sześciodołkowej na wierzch szkiełka nakrywkowego. Ponowne użycie pożywki zmniejsza ilość stresu wywieranego na komórki spowodowanego zmianami środowiskowymi i może być również przydatne do oceny wydzielanych czynników zewnątrzkomórkowych. Po dodaniu pożywki umieść szklaną pokrywę na komorze hodowlanej i użyj warkocza do chusteczek Kim o zawartości 70%, aby usunąć wszelkie pozostałości materiału, który mógłby zakłócać mikroskopię z dna szkiełka nakrywkowego.

Umieść komorę hodowlaną w inkubatorze o temperaturze 34 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 30 minut. Ten krok zapewni, że sama komora ogrzeje się o 34 stopnie, aby zmniejszyć przesuwanie się szkiełka nakrywkowego. W miarę nagrzewania się metalu konieczne jest działanie przy jak najniższym oświetleniu pomieszczenia podczas wykonywania kolejnych czynności.

Po pierwsze, Thora wcześniej przygotowała elequa z widokiem bomby atomowej w temperaturze pokojowej. Następnie wyjmij komorę hodowlaną z inkubatora i szybko umieść ją w komorze środowiskowej mikroskopu. Włącz 5% wstępnie zmieszany zbiornik dwutlenku węgla z podwójnym regulatorem.

Następnie użyj 10-krotnego obiektywu z lampą mikroskopu ustawioną na około 2,5 V i czasem naświetlania na 240 milisekund. Ustaw ostrość za pomocą mikroskopii jasnego pola, aby zwizualizować komórki na monitorze komputera. Następnie dodaj do komórek 80-milimolowe stężenie jonu potasu lub innego induktora apoptozy poprzez wymianę pożywki z powolną i miejscową perfuzją za pomocą pompy perystaltycznej.

Substrat Nuke View 4 88 jest stabilny w hodowli komórkowej podczas eksperymentów trwających do 36 godzin. W związku z tym możliwe jest przeprowadzanie eksperymentów w tym czasie. Najpierw ustaw mikroskop, aby uwidocznić fluorescencję z czerwonego i zielonego białka fluorescencyjnego.

Następnie kliknij czerwony kanał, aby wyświetlić transfekowane komórki. Zaznacz i zapisz około 12 klatek, w których znajduje się kilka transfekowanych komórek, i zapisz te punkty etapu XY. Niech mikroskop rejestruje obrazy w kanale czerwonym jasnym i zielonym w tych zapisanych punktach etapu co sześć minut.

Po zebraniu wielu punktów XY z duplikatów lub potrójnych eksperymentów, skompiluj dane z oddzielnych eksperymentów przeprowadzonych w różnych dniach i przeprowadź analizę danych i testy statystyczne zgodnie z opisem w pisemnym protokole, aby porównać stosunek ujemnych komórek w zatoce CASP do dodatnich w zatoce CASP. Substrat Nuke view 4 88 może wskazywać na zwiększoną szybkość apoptozy kultur komórek glejowych N 19 oligo DDR. Po leczeniu wysokim zewnątrzkomórkowym stężeniem potasu, te wyjściowe obrazy zostały uzyskane przy użyciu 10-krotnego obiektywu.

Komórki N 19 transfekowano RFP i traktowano trzema mikrolitrami jądra jądrowego, 4 88 substratem dla komórek kontrolnych lub trzema mikrolitrami jądra widokowego, 4 88 substratem i 80 milimolowym potasem. Obrazy te ilustrują, że liczba komórek apoptotycznych wzrasta z czasem, trzy, sześć i dziewięć godzin po leczeniu 80-milimolowym potasem w warunkach kontrolnych nie zaobserwowano znaczących ilości apoptozy w porównaniu z 80-milimolowymi kulturami potasu. Zielony sygnał tła obserwowany w warunkach kontrolnych wskazuje komórki, które ulegają apoptozie bez dodatku pozakomórkowego potasu.

12-godzinny kurs czasowy jest wystarczający dla badań obejmujących urazy neurologiczne Po 12 godzinach kultury traktowane potasem wykazały około 45% śmierć komórek. Praktycznie żadna z komórek w eksperymencie kontrolnym nie wykazuje apoptozy w ciągu 12 godzin. Chociaż w innych sytuacjach eksperymenty mogą wymagać dłuższego czasu.

Ten wykres pokazuje wzrost liczby trzech dodatnich komórek kaspazy w czasie 12-godzinnego eksperymentu. Po natrudzeniu tę technikę można wykonać w ciągu jednej godziny, a dane można zebrać w ciągu nocy, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zachowaniu spójności między zabiegami Zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak barwienie immunologiczne, można wykorzystać do przyjrzenia się innym białkom zaangażowanym w badane szlaki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować próbki do obrazowania. Pobieranie zestawu danych i analizowanie danych.