Name: Monitorowanie aktywności rozszczepionej kaspazy-3 i apoptozy unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych za pomocą obrazowania żywych komórek i płatalnych substratów barwnika fluorogenicznego po depolaryzacji błony wywołanej potasem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj metodę obrazowania żywych komórek apoptozy w kulturach oligodendrocytów N19 za pomocą substratu NucView 488. Technika umożliwia monitorowanie śmierci komórkowej w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Laboratorium to otrzymało wsparcie od Canadian Institutes of Health Research, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada oraz Multiple Sclerosis Society of Canada (MSSC). GSTS otrzymał stypendium doktoranckie od MSSC. Jesteśmy wdzięczni dr Joan Boggs (Hospital for Sick Children, Toronto) za liczne pomocne dyskusje i uwagi do niniejszego manuskryptu. Dziękujemy firmie Biotium za hojny dar w postaci dodatkowej ilości NucView 488 caspase-3.

1. Rozmrażanie i hodowla komórek
<ol>
 <li>Wyjąć zapas zamrożonych unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych N19 z długoterminowego przechowywania w ciekłym azocie.</li>
 <li>Zanurzyć fiolkę z komórkami w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C aż do całkowitego rozmrożenia zawiesiny komórkowej.</li>
 <li>Do płytki hodowlanej o średnicy 10 cm dodać 7 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) z wysoką zawartością glukozy, uzupełnionego o 10% FBS (surowicy płodowej cielęcej) oraz 1% penicyliny/streptomycyny.</li>
 <li>Dodawać zawiesinę komórkową do płytki kropla po kropli, a następnie delikatnie potrząsać i kołysać płytką Petriego, aby równomiernie rozprzestrzenić komórki.</li>
 <li>Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 34 °C przy 5% CO2.</li>
 <li>Po 4 godzinach odessać pożywkę z płytek, aby usunąć pozostałości DMSO (dimetylosulfoksydu) użytego jako krioprotektant, i zastąpić ją świeżą pożywką (7 mL pożywki DMEM z wysoką zawartością glukozy, uzupełnionej o 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny).</li>
</ol>
2. Pasażowanie komórek
<ol>
 <li>Przy 70-80% konfluencji (po 4-7 dniach wzrostu) odessać pożywkę z komórek.</li>
 <li>Dodać do płytki 1 mL 0,25% trypsyny. Pipetować trypsynę, aby odlepić komórki (ok. 5 minut).</li>
 <li>Przygotować odpowiednie rozcieńczenia dla warunków eksperymentalnych oraz przeprowadzić pasaż do dodatkowej płytki 10 cm na potrzeby przyszłych eksperymentów, zachowując gęstość komórek nie mniejszą niż 0,1 x 106 cells / mL.</li>
</ol>
Uwaga: Przed wykorzystaniem komórek do eksperymentów należy przeprowadzić co najmniej dwa pasaże po ich rozmrożeniu.
3. Liczenie i wysiewanie komórek
<ol>
 <li>Aby wysiać komórki do obrazowania żywych komórek, przeprowadź trypsynizację zgodnie z wcześniejszym opisem.</li>
 <li>Pobierz około 30 μL zawiesiny komórek i policz je za pomocą komory countingowej (haemocytometru).</li>
 <li>Umieść niepowleczone szkiełko podstawowe w płytce 6-dołkowej. Do dołka dodaj komórki w gęstości 0,1 x 106 cells/mL w 2 mL pożywki DMEM high-glucose wolnej od fenolu, uzupełnionej o 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny, w temperaturze 34 °C/5% CO2.</li>
 <li>Pozostaw komórki do wzrostu przez noc (16-20 h) w temperaturze 34 °C/5% CO2 przed transfekcją.</li>
</ol>
4. Transfekcja
<ol>
 <li>Połączyć 100 μL pożywki bezsurowiczej, 0,5-4 μg oczyszczonego plazmidowego DNA oraz 4 μL FuGENE HD (Roche). Delikatnie wymieszać na wirówce vortex.</li>
 <li>Ponownie krótko wymieszać na wirówce vortex i pozostawić DNA do utworzenia kompleksów przez 5 min w temperaturze pokojowej, a następnie dodać mieszaninę DNA z FuGENE HD bezpośrednio do hodowanych komórek. Delikatnie przechylić płytkę, aby wymieszać zawartość.</li>
 <li>Hodować komórki przez kolejne 48 h w temperaturze 34 °C i przy 5% CO2 przed rozpoczęciem traktowania lub eksperymentu.</li>
</ol>
5. Przygotowanie komórek do obrazowania żywych komórek (LCI)
<ol>
 <li>Włącz skrzynkę sterującą instrumentem do obrazowania żywych komórek LCI Chamlide co najmniej 1 h przed planowanym rozpoczęciem eksperymentu. Skrzynka sterująca reguluje również temperaturę i wilgotność wewnątrz LCI Chamlide oraz kontroluje przepływ gotowej mieszaniny 5% CO2.</li>
</ol>
Uwaga: Zaleca się włączenie panelu sterowania do 3 h przed rozpoczęciem eksperymentów, aby upewnić się, że cały stolik osiągnął temperaturę 34 °C. Krok ten pozwoli zredukować dryf ogniskowej podczas obrazowania, który jest spowodowany fluktuacjami i rozszerzalnością cieplną metalowego stolika w miarę jego nagrzewania.
<ol start="2">
 <li>Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, spryskać 70% etanolu magnetyczną komorę hodowlaną Chamlide oraz pęsetę, a następnie pozostawić do wyschnięcia na 5 minut.</li>
 <li>Wyjąć komórki z inkubatora i upewnić się, że są zdrowe. Powinny być przyległe i dobrze rozpływać się na szkiełku nakrywce, z licznymi wypustkami błoniastymi. Komórki poddane stresowi po transfekcji nie nadają się do eksperymentów; charakteryzują się one zmniejszoną liczbą wypustek, a często również nieregularnym kształtem jądra.</li>
 <li>Przechylić płytkę 6-dołkową i usunąć szkiełko nakrywkę za pomocą pęsety. Szybko umieścić szkiełko nakrywkę stroną z komórkami do góry w dolnej części komory hodowlanej. Nie dopuścić do wyschnięcia szkiełka nakrywki.</li>
 <li>Przymocować magnetyczną część główną komory hodowlanej i dodać 500 μL pożywki z oryginalnej płytki 6-dołkowej na wierzch szkiełka nakrywki. Ponowne wykorzystanie tej pożywki zmniejszy stres komórek wywołany zmianami środowiskowymi, a także może być przydatne do oceny wydzielanych czynników zewnątrzkomórkowych.</li>
 <li>Nałożyć szklaną przykrywkę na komorę hodowlaną.</li>
 <li>Za pomocą chusteczki KimWipe spryskanej 70% etanolu usunąć wszelkie pozostałości materiału z dna szkiełka nakrywki, które mogłyby zakłócić obrazowanie mikroskopowe.</li>
 <li>Umieścić komorę hodowlaną w inkubatorze w temperaturze 34 °C/5% CO2 na 30 min. Krok ten zapewni nagrzanie się samej komory do 34 °C, co zredukuje przesuwanie się szkiełka nakrywki podczas rozgrzewania się metalu.</li>
</ol>
6. Ustawienia mikroskopu
Obrazy zostały pozyskane przy użyciu odwróconego mikroskopu Leica DMIRE2 z niestandardową soczewką przekaźnikową i obudową koła filtrów emisyjnych umożliwiającą kasetowe ładowanie wielu kół (Quorum Technologies Inc., Guelph, ON).
<ol>
 <li>Jasne pole – lampa ustawiona na 2,5 V, czas ekspozycji 240 ms.</li>
 <li>Czerwone białko fluorescencyjne (RFP) – wzmocnienie ustawione na 140 przez 200 ms.</li>
 <li>Zielone białko fluorescencyjne (GFP) – wzmocnienie ustawione na 140 przez 500 ms.</li>
 <li>Nasz mikroskop posiada lampę z regulacją natężenia zamiast tarczy obrotowej, aby kontrolować ilość światła docierającego do komórek. Eksperymenty przeprowadzamy przy natężeniu światła wynoszącym 90% maksymalnej mocy lampy.</li>
</ol>
7. Traktowanie komórek induktorami apoptozy oraz substratem dla kaspazy-3 NucView 488
<ol>
 <li>Ważne jest, aby wcześniej przygotować duże zapasy induktorów apoptozy i zamrozić je w alikwotach, tak aby stężenia były spójne pomiędzy poszczególnymi eksperymentami.</li>
 <li>Substrat NucView 488 jest światłoczuły. Należy przygotować alikwoty po 15 μL, aby ograniczyć liczbę cykli zamrażania i rozmrażania, a probówki przechowywać w temperaturze -20 °C, owinięte folią aluminiową. Przed użyciem należy pracować przy jak najmniejszym oświetleniu pomieszczenia, aby zredukować ekspozycję substratu NucView 488 na światło.</li>
 <li>Szybko wyjmij komorę hodowlaną z inkubatora, aby komórki nie były narażone na spadek temperatury. Umieść komorę hodowlaną w komorze środowiskowej mikroskopu i użyj zacisków, aby zapobiec przesuwaniu się komory. Na tym etapie należy również przyciemnić światła w pomieszczeniu.</li>
 <li>Włącz butlę z 5% mieszanką CO2 z podwójnym regulatorem.</li>
 <li>Używając obiektywu 10x, ustaw ostrość, aby zlokalizować komórki na monitorze komputera, korzystając z mikroskopii w jasnym polu. Uwaga: w celu skrócenia czasu ekspozycji należy użyć obiektywu o największej aperturze numerycznej dla pożądanego powiększenia.</li>
 <li>Podaj induktory apoptozy do komórek (w naszym przypadku 80 mM potasu lub 100 mM glutaminianu), stosując jedną z poniższych metod. Jako przykład posłużymy się podaniem 80 mM potasu, wykorzystując KCl rozpuszczony jako koncentrat 10x w typowej pożywce hodowlanej.
 <ol>
 <li>Wymiana pożywki poprzez powolną i lokalną perfuzję: 
 - Użyj pompy perystaltycznej, aby wymienić pożywkę w komorze hodowlanej na nową pożywkę zawierającą 80 mM potasu. 
 - Jeden koniec rurki będzie podawał 10 mL zapasu 80 mM potasu rozpuszczonego w DMEM wolnej od fenolu, a drugi koniec rurki będzie usuwał pożywkę z komory. 
 - Należy przeprowadzić co najmniej 10-krotną wymianę pożywki, aby upewnić się, że pożywka pozostała w komorze ma prawidłowe stężenie potasu. 
 - Po wymianie pożywki dodaj do pożywki w komorze 3 μL substratu NucView 488. Wymieszaj za pomocą pipety.</li>
 <li>Bezpośrednie dodanie 80 mM K+ i substratu NucView 488 do pożywki w komorze hodowlanej: 
 - Przygotuj 10-krotny roztwór zapasowy 80 mM potasu rozpuszczonego w DMEM wolnej od fenolu. 
 - Dodaj 3 μL substratu NucView 488 do 50 μL 10-krotnego roztworu 80 mM potasu. Wymieszaj za pomocą pipety. Dodaj do 500 μL DMEM wolnej od fenolu w komorze hodowlanej. 
 Uwaga: metoda ta jest preferowana, jeśli zależy nam na zachowaniu lub ocenie wzrostu bądź innych czynników wydzielniczych, które mogą być obecne w oryginalnej pożywce. Stwierdziliśmy, że substrat NucView 488 jest stabilny w hodowli komórkowej w eksperymentach trwających do 36 h.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
8. Obrazowanie żywych komórek
<ol>
 <li>Kliknij kanał czerwony, aby wyświetlić przetransfekowane komórki.</li>
 <li>Wybierz i zapisz około dwunastu klatek, na których widocznych jest kilka przetransfekowanych komórek, a następnie zapisz te „punkty stołu X-Y”. W zależności od ilości pamięci komputera, liczba punktów stołu, które będziesz w stanie zarejestrować, może być ograniczona.</li>
 <li>Ustaw mikroskop tak, aby co 6 minut rejestrował obrazy (w polu jasnym, kanale czerwonym i kanale zielonym) w zapisanych punktach stołu.</li>
 <li>Wszelkie zabarwienie na zielono widoczne we wczesnych etapach eksperymentów prawdopodobnie wskazuje na komórki, które już przechodzą apoptozę, zazwyczaj w wyniku transfekcji i/lub stresu środowiskowego. Apoptoza wywołana zabiegami eksperymentalnymi zostanie wykryta w późniejszym punkcie czasowym eksperymentu.</li>
</ol>
9. Analiza statystyczna
<ol>
 <li> W każdym eksperymencie programujemy mikroskop tak, aby rejestrował wiele punktów X-Y w celu efektywnego zebrania dużego zestawu danych. Każdy eksperyment wykonuje się w dublecie lub tryplikacie, a dane są kompilowane z oddzielnych doświadczeń przeprowadzonych w różne dni. Z każdego zestawu danych analizujemy do 15 pól widzenia i porównujemy stosunek komórek kaspaza-ujemnych do komórek kaspaza-dodatnich (całkowita liczba komórek w polu widzenia/całkowita liczba komórek kaspaza-dodatnich). </li>
 <li>Zapisane pomiary z każdego zestawu danych są grupowane w większy zestaw próbek, a następnie porównywane ze sobą za pomocą tabeli ANOVA (p = 0.05). Przedstawiamy błędy standardowe średniej (SEM) dla każdego eksperymentu, a następnie porównujemy różnice w średnich, wykonując test porównania średnich Tukeya (p = 0.05), aby ustalić, które warianty traktowania różnią się od siebie znacząco.</li>
</ol>
10. Reprezentatywne wyniki
Opisaliśmy eksperyment ilustrujący, w jaki sposób substrat NucView 488 może wskazywać zwiększone tempo apoptozy w kulturach komórek N19-OLG po zastosowaniu wysokiego stężenia potasu zewnątrzkomórkowego. Komórki N19 zostały transfekowane białkiem RFP, a następnie poddane działaniu 3 μL substratu NucView 488 (kontrola) lub 3 μL substratu NucView 488 oraz 80 mM [K+] (grupa badana). Komórki monitorowano, a obrazy pozyskiwano w ciągu 12 h, co jest odpowiednim czasem dla badań dotyczących uszkodzeń neurologicznych (Ryc. 1A). W warunkach kontrolnych nie zaobserwowano istotnych ilości apoptozy w porównaniu z kulturami traktowanymi 80 mM [K+] (pole kreskowane), które wykazały około 45% śmierci komórek po 12 h (Ryc. 1B). Tło w postaci zielonego sygnału zaobserwowane w warunkach kontrolnych wskazuje na komórki przechodzące apoptozę bez dodania potasu zewnątrzkomórkowego. W eksperymencie kontrolnym praktycznie żadna z komórek nie wykazywała apoptozy w punkcie czasowym 12 h, choć w innych sytuacjach konieczne może być wydłużenie czasu trwania eksperymentów. Obrazy pozyskano przy użyciu obiektywu 10x. Pasek skali = 100 μm.
<img alt="Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej pokazujące apoptozę komórek po traktowaniu 80 mM K+, wykres porównawczy z kontrolą." src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. (A) Eksperyment z przebiegiem czasowym trwającym 12 h dla kultur N19 OLG 48 h po transfekcji eksprymującej RFP-MBP (kanał czerwony) wraz z 3 μL substratu NucView 488 (kanał zielony). Kultury były traktowane końcowym stężeniem 80 mM [K+] (panele lewe) lub nie były traktowane w ramach kontroli (panele prawe). Obrazy pozyskiwano w odstępach 6 min; w kulturach traktowanych 80 mM [K+] w obrębie jąder komórkowych (prostokąt w kreskę) można zaobserwować istotną aktywację kaspazy-3 w formie rozciętej (sygnał zielony) w porównaniu z eksperymentem kontrolnym. (B) Procent komórek z rozciętą kaspazą-3 (obliczony poprzez podzielenie całkowitej liczby komórek w polu widzenia przez całkowitą liczbę komórek kaspaza-dodatnich). W porównaniu z warunkami kontrolnymi, po 12 h od traktowania K+ zaobserwowano śmierć około 45% komórek.
sVideo 1. Eksperyment z przebiegiem czasowym trwającym 12 h dla kultur N19-OLG 48 h po transfekcji, wykazujących ekspresję RFP-MBP (kanał czerwony) z zastosowaniem 3 μL substratu NucView 488 (kanał zielony), wraz z obrazami w jasnym polu oraz obrazem scalonym z trzech kanałów, po zastosowaniu 80 mM [K+]. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3422/sVideo1_N19_OLGs_80mM_KCl.mov">kliknąć tutaj</a>, aby wyświetlić/pobrać ten plik wideo.
sVideo 2. Eksperyment z przebiegiem czasowym trwającym 12 h w kulturach N19-OLG 48 h po transfekcji wyrażających RFP-MBP (kanał czerwony) z 3 μL substratu NucView 488 (kanał zielony), wraz z obrazami w polu jasnym i obrazem scalonym z trzech kanałów. W odniesieniu do kultur nie zastosowano żadnej obróbki; w przeciwieństwie do kultur komórkowych traktowanych 80 mM [K+] można zaobserwować migrację N19-OLG przez pole widzenia mikroskopu (porównać z sVideo 1). Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3422/sVideo2_N19_OLGs_control_no_treatment.mov">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć/pobrać ten plik wideo.

<ol><li>Antczak, C., Takagi, T., Ramirez, C. N., Radu, C., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+caspase+activation+for+high-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of caspase activation for high-content screening.</a> J. Biomol. Screen. 14, 956-969 (2009).</li>
<li>Cen, H., Mao, F., Aronchik, I., Fuentes, R. J., Firestone, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEVD-NucView488%3A+a+novel+class+of+enzyme+substrates+for+real-time+detection+of+caspase-3+activity+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">DEVD-NucView488: a novel class of enzyme substrates for real-time detection of caspase-3 activity in live cells.</a> FASEB. J. 22, 2243-2252 (2008).</li>
<li>de Calignon, A., Fox, L. M., Pitstick, R., Carlson, G. A., Bacskai, B. J., Spires-Jones, T. L., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation+precedes+and+leads+to+tangles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase activation precedes and leads to tangles.</a> Nature. 464, 1201-1204 (2010).</li>
<li>Eldadah, B. A., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+pathways%2C+neuronal+apoptosis%2C+and+CNS+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Caspase pathways, neuronal apoptosis, and CNS injury.</a> J. Neurotrauma. 17, 811-829 (2000).</li>
<li>Foster, L. M., Phan, T., Verity, A. N., Bredesen, D., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+analysis+of+normal+and+shiverer+temperature-sensitive+immortalized+cell+lines+exhibiting+phenotypic+characteristics+of+oligodendrocytes+at+several+stages+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation and analysis of normal and shiverer temperature-sensitive immortalized cell lines exhibiting phenotypic characteristics of oligodendrocytes at several stages of differentiation.</a> Dev. Neurosci. 15, 100-109 (1993).</li>
<li>Fulton, D., Paez, P. M., Fisher, R., Handley, V., Colwell, C. S., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+L-type+Ca%28%2B%2B%29+currents+and+process+morphology+in+white+matter+oligodendrocyte+precursor+cells+by+golli-myelin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Regulation of L-type Ca(++) currents and process morphology in white matter oligodendrocyte precursor cells by golli-myelin proteins.</a> Glia. 58, 1292-1303 (2010).</li>
<li>Hisahara, S., Okano, H., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-mediated+oligodendrocyte+cell+death+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Caspase-mediated oligodendrocyte cell death in the pathogenesis of autoimmune demyelination.</a> Neurosci. Res. 46, 387-397 (2003).</li>
<li>Lau, A., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptors%2C+neurotoxicity+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers.+Arch%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration.</a> Pflugers. Arch. 460, 525-542 (2010).</li>
<li>Lawrence, M. S., Ho, D. Y., Sun, G. H., Steinberg, G. K., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Bcl-2+with+herpes+simplex+virus+vectors+protects+CNS+neurons+against+neurological+insults+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Bcl-2 with herpes simplex virus vectors protects CNS neurons against neurological insults in vitro and in vivo.</a> J. Neurosci. 16, 486-496 (1996).</li>
<li>Paez, P. M., Spreuer, V., Handley, V., Feng, J. M., Campagnoni, C., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+golli+myelin+basic+proteins+enhances+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased expression of golli myelin basic proteins enhances calcium influx into oligodendroglial cells.</a> J. Neurosci. 27, 12690-12699 (2007).</li>
<li>Sanchez Mejia, R. O., Friedlander, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Caspases in Huntington's disease.</a> Neuroscientist. 7, 480-489 (2001).</li>
<li>Smith, G. S. T., De Avila, M., Paez, P., Spreuer, V., Wills, M. K. B., Jones, N., Boggs, J. M., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+substitutions+and+threonine+pseudo-phosphorylation+of+the+SH3-ligand+of+18.5+kDa+myelin+basic+protein+decrease+affinity+for+the+Fyn-SH3-domain+and+alter+process+development+and+protein+localization+in+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Proline substitutions and threonine pseudo-phosphorylation of the SH3-ligand of 18.5 kDa myelin basic protein decrease affinity for the Fyn-SH3-domain and alter process development and protein localization in oligodendrocytes.</a> J. Neurosci. Res. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Smith, G. S. T., Paez, P. M., Spreuer, V., Campagnoni, C. W., Boggs, J. M., Campagnoni, A. T., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+18.5-and+21.5-kDa+isoforms+of+myelin+basic+protein+inhibit+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells%2C+in+contrast+to+golli+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Classical 18.5-and 21.5-kDa isoforms of myelin basic protein inhibit calcium influx into oligodendroglial cells, in contrast to golli isoforms.</a> J. Neurosci. Res. 89, 467-480 (2011).</li>
<li>Springer, J. E., Azbill, R. D., Knapp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+caspase-3+apoptotic+cascade+in+traumatic+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury.</a> Nat. Med. 5, 943-946 (1999).</li>
<li>Verity, A. N., Bredesen, D., Vonderscher, C., Handley, V. W., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+myelin+protein+genes+and+other+myelin+components+in+an+oligodendrocytic+cell+line+conditionally+immortalized+with+a+temperature-sensitive+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Expression of myelin protein genes and other myelin components in an oligodendrocytic cell line conditionally immortalized with a temperature-sensitive retrovirus.</a> J. Neurochem. 60, 577-587 (1993).</li>
<li>Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+critical+role+of+potassium+homeostasis+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis.</a> Prog. Neurobiol. 70, 363-386 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Choć nie jest to jedyny dostępny produkt fluorogenny do wykrywania apoptozy, stosowanie substratu NucView 488 niesie ze sobą kilka istotnych zalet. Jedną z głównych korzyści jest możliwość śledzenia apoptozy w żywych komórkach w czasie rzeczywistym, podczas gdy większość alternatywnych produktów wymaga lizy komórek lub wykazuje słabą przenikalność komórkową. Inne zalety to wysoka czułość w rozpoznawaniu kaspazy-3, wysoka przenikalność komórkowa, niska cytotoksyczność oraz brak wpływu na przebieg apoptozy. Substrat charakteryzuje się również niską fluorescencją tła do momentu jego rozszczepienia i przedostania się do jądra, co eliminuje fluorescencję tła. Sekwencja rozpoznawcza kaspazy-3 posiada 3 ładunki ujemne, a barwnik wiążący DNA posiada jeden ładunek dodatni 2. Cząsteczka DEVD-NucView 488 posiada zatem wypadkowy ładunek ujemny, co zapobiega aktywacji i wiązaniu barwnika z DNA w komórkach, w których kaspaza nie jest aktywna.
Utrzymanie spójności między eksperymentami jest niezbędne do możliwości wyciągnięcia znaczących wniosków z porównań między powtórzeniami. Jednym z głównych parametrów, który należy zachować w sposób spójny, jest gęstość komórek, ponieważ wpływa ona na wydajność transfekcji. Uzyskanie wysokiej wydajności transfekcji w unieśmiertelnionych kulturach komórek N19-OLG jest trudniejsze niż w przypadku innych popularnych linii komórkowych, takich jak HeLa czy HEK293, i w naszym doświadczeniu jest silnie zależne od gęstości 12, 13. Najlepszą wydajność transfekcji dla tych komórek uzyskano przy użyciu Fugene HD (Roche) i wynosi ona zazwyczaj około 15%, ale w zależności od konstruktu może przekroczyć 30%. Staranne zliczanie komórek pomoże w uzyskaniu powtarzalnej wydajności transfekcji. Ważne jest również, aby komórki z różnych grup badawczych były poddane temu samemu poziomowi stresu środowiskowego, szczególnie podczas pomiaru tempa apoptozy. W szczególności istotnymi zmiennymi środowiskowymi, które należy wziąć pod uwagę i które powinny pozostać stałe w różnych eksperymentach, są czas ekspozycji komórek na odczynniki do transfekcji oraz czas ekspozycji na światło. W naszych zastosowaniach ustaliliśmy, że zebranie dużej liczby pól widzenia zapewnia wystarczającą wielkość próby do przeprowadzenia porównań istotnych statystycznie [ibid].

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabela specyficznych odczynników i sprzętu</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;NucView 488&lt;/em&gt; Zestaw do oznaczania kaspazy-3 w żywych komórkach</td><td>Biotium, Inc.</td><td>30029</td><td></td></tr><tr><td>odczyn do transfekcji FuGENE HD</td><td>Grupa Roche</td><td>04709705001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;modyfikowana pożywka Eagle'a</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyny</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15050-065</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>#1.5-25 mm szklana lamella </td><td>Warner Instruments</td><td>64-0715</td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;Magnetyczna komora hodowlana Chamlide CMB o średnicy 25 mm&lt;/p&gt; szkiełko nakrywka</td><td>Quorum Technologies</td><td>CM-B-40</td><td></td></tr><tr><td>Szalki hodowlane Cellstart 10 cm </td><td>VWR International</td><td>82050-576</td><td></td></tr><tr><td>płytki do hodowli tkankowych BD Falcon z 6 dołkami</td><td>VWR international</td><td>CA62406-161</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie aktywności rozszczepionej kaspazy-3 i apoptozy unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek oraz rozszczepialnych fluorescencyjnych substratów barwiących po indukowanej potasem depolaryzacji błony

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Ośrodkowy układ nerwowy może być poddany licznym stresom i urazom neurologicznym, które mogą wywołać szereg niekorzystnych skutków, prowadzących ostatecznie do redukcji populacji i funkcji neuronów. Uszkodzone aksony mogą uwalniać cząsteczki pobudzające, takie jak potas lub glutaminian, do macierzy zewnątrzkomórkowej, co z kolei może prowadzić do dalszych uszkodzeń wspomagających komórek glejowych, w tym astrocytów i oligodendrocytów 8, 16. Jeśli uraz będzie trwał, komórki przejdą w stan programowanej śmierci komórkowej (apoptozy), która jest regulowana i aktywowana przez szereg dobrze opisanych kaskad transdukcji sygnału 14. Apoptoza i nekroza tkanek mogą wystąpić po urazie czaszkowo-mózgowym, niedokrwieniu mózgu oraz napadach drgawkowych. Klasycznym przykładem regulacji apoptozy jest rodzina cysteinowych proteaz skierowanych na aspartat, czyli kaspazy. Aktywowane proteazy, w tym kaspazy, są również zaangażowane w śmierć komórek w odpowiedzi na przewlekłe choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera, choroba Huntingtona i stwardnienie rozsiane 4, 14, 3, 11, 7.
W niniejszym protokole opisujemy zastosowanie substratu kaspazy-3 NucView 488 do pomiaru szybkości apoptozy indukowanej przez kaspazę-3 w unieśmiertelnionych kulturach komórek oligodendrocytów (OLG) N19 15, 5, po wystawieniu ich na działanie różnych stresów zewnątrzkomórkowych, takich jak wysokie stężenia potasu lub glutaminianu. Warunkowo unieśmiertelniona linia komórkowa N19-OLG (reprezentująca progenitor O2A) została otrzymana od dr. Anthony'ego Campagnoniego (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5 i była wcześniej wykorzystywana do badania mechanizmów molekularnych ekspresji genu mieliny oraz transdukcji sygnałów prowadzących do różnicowania OLG (np. 6, 10). Stwierdziliśmy, że linia komórkowa ta jest odporna na transfekcję egzogennymi konstruktami podstawowego białka mieliny (MBP) połączonymi z białkiem RFP lub GFP (czerwonym lub zielonym białkiem fluorescencyjnym) 13, 12. W tej pracy kultury komórek N19-OLG traktowano chlorkiem potasu w stężeniu 80 mM lub glutaminianem sodu w stężeniu 100 mM, aby naśladować wyciek aksonalny do macierzy zewnątrzkomórkowej w celu indukcji apoptozy 9. Wykorzystaliśmy bifunkcyjny substrat kaspazy-3 zawierający podjednostkę rozpoznawczą kaspazy-3 DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) oraz barwnik wiążący DNA 2. Substrat szybko przenika do cytoplazmy, gdzie jest rozcinany przez wewnątrzkomórkową kaspazę-3. Uwolniony barwnik NucView 488 wnika do jądra komórkowego, gdzie wiąże się z DNA i fluorescuje na zielono przy 488 nm, sygnalizując apoptozę. Zastosowanie substratu kaspazy-3 NucView 488 umożliwia obrazowanie żywych komórek w czasie rzeczywistym 1, 10. W tym filmie opisujemy również hodowlę i transfekcję unieśmiertelnionych komórek N19-OLG, a także techniki obrazowania żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek w celu analizy apoptozy pośredniczonej przez kaspazę-3 w unieśmiertelnionych kulturach komórek oligodendrocytów N19 z wykorzystaniem substratu kaspazy-3 NucView 488. Technika ta znajduje zastosowanie w testach programowanej śmierci komórki w czasie rzeczywistym w różnych typach komórek i tkanek.

Monitorowanie aktywności rozszczepionej kaspazy-3 i apoptozy unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek oraz rozszczepialnych fluorescencyjnych substratów barwiących po indukowanej potasem depolaryzacji błony

Ośrodkowy układ nerwowy może być poddany licznym stresom i uszkodzeniom neurologicznym, które mogą wywołać szereg niekorzystnych skutków, prowadzących ostatecznie do...

Niniejsza procedura umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym śmierci komórek glejowych w wyniku oligo DDR. Osiąga się to poprzez najpierw hodowlę komórek, a następnie przygotowanie ich do obrazowania komórek żywych. Kolejnym krokiem jest poddanie komórek działaniu czynnika terapeutycznego i monitorowanie efektów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie analizy danych. Ostatecznie wyniki wskazują na tempo śmierci komórek w populacji komórkowej po zastosowaniu leczenia lub bodźca, poprzez monitorowanie fluorescencji jąder komórkowych za pomocą barwnika fluorescencyjnego aktywowanego przez kaspazy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak barwienie immunocytochemiczne, jest możliwość jednoczesnego gromadzenia danych z wielu punktów czasowych.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki, takie jak reakcje na farmakologiczne, reagentowe i różnorodne zabiegi. Obecnie metoda ta może dostarczyć informacji o procesach obumierania w kulturach komórkowych. Można ją również zastosować w innych systemach, takich jak tkanki ex vivo i organotypowe, w tym w przypadku skrawków mózgu.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności podczas adaptacji do pracy z tkanką żywą zamiast tkanki utrwalonej. Demonstracja wizualna tej techniki jest istotna, ponieważ przygotowanie próbek żywych komórek wiąże się z większą liczbą etapów w porównaniu do tkanki utrwalonej. Najpierw rozmrozić zamrożone unieśmiertelnione komórki glejowe N 19 oligo droog w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, oczekując na rozmrożenie komórek.Do naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm dodać siedem mililitrów pożywki DMEM z wysoką zawartością glukozy, uzupełnionej o 10% FBS i 1% penicyliny i streptomycyny. Następnie dodać zawiesinę komórkową do naczynia kroplami i delikatnie potrząsnąć szalką Petriego, aby równomiernie rozproszyć komórki. Hodować komórki w temperaturze 34 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez cztery godziny.Odssać pożywkę z płytek, aby usunąć pozostałości DMSO i krioprotektanta. Po czterech do siedmiu dniach wzrostu zastąpić ją siedmioma mililitrami świeżej pożywki. Gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji, odessać pożywkę i nanieść pipetą jeden mililitr kropli na płat komórkowy, inkubując w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie zebrać komórki i zasiać je w 10 cm naczyniu hodowlanym w gęstości 0,1 × 10⁶ komórek/ml, a następnie umieścić naczynie w inkubatorze do hodowli tkanek. Po kolejnym pasażu komórki można wysiać do eksperymentów z obrazowaniem żywych komórek. W tym celu zebrać komórki w ten sam sposób co wcześniej, następnie pobrać 30 µl zawiesiny komórkowej i policzyć komórki za pomocą komory licznikowej Hemocytometru.Następnie za pomocą sterylnej pęsety umieść niepowlekane szkiełka nakrywkowe. Do otworów płytki 6-dołkowej dodaj komórki w zagęszczeniu 0,1 × 10⁶ komórek/ml. W 2 ml medium DMEM z wysoką zawartością glukozy, wolnego od fenolu, uzupełnionego o 10% FBS oraz 1% penicyliny i streptomycyny, pozwól komórkom rosnąć przez noc w temperaturze 34 °C i przy 5% CO2 przed przeprowadzeniem transfekcji.Następnego dnia połączyć 100 µL medium bezsurowiczego, od 0,5 do 4 µg oczyszczonego plazmidowego DNA oraz 4 µL FUgene HD. Mieszaninę delikatnie wymieszać wirówką dwukrotnie, a następnie pozostawić DNA w temperaturze pokojowej przez pięć minut w celu utworzenia kompleksów. Po upływie czasu inkubacji dodać mieszaninę FUgene HD i DNA bezpośrednio do hodowlanych komórek.Delikatnie przechyl płytkę, aby wymieszać zawartość. Następnie inkubuj komórki przez kolejne 48 godzin w temperaturze 34 °C i 5% carbon dioxide przed rozpoczęciem zabiegu lub eksperymentu. Najpierw włącz skrzynkę sterującą instrumentem do obrazowania żywych komórek LCI Cham light.Należy to zrobić na trzy godziny przed rozpoczęciem eksperymentu, aby zapewnić dokładne rozgrzanie stolika. W minimalnym przypadku moduł sterujący powinien zostać włączony na jedną godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu. Następnie, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy spryskać komorę hodowlaną typu magnetycznego LCI Cham light oraz pęsetę 70% etanolem i pozostawić do wyschnięcia na pięć minut.Wyjmij komórki z inkubatora i obejrzyj je pod mikroskopem, aby potwierdzić, że są zdrowe. Komórki powinny być wyraźne i dobrze rozprzestrzenione na szkiełku nakrywce, z licznymi wypustkami błonowymi. Komórki o zredukowanej liczbie wypustek lub o nieregularnym kształcie jądra są prawdopodobnie poddane stresowi wskutek transfekcji i nie nadają się do dalszych eksperymentów wykonywanych w komorze z laminarnym przepływem powietrza.Przechyl płytkę sześciodołkową i usuń szkiełko nakrywkę za pomocą pęsety. Szybko umieść szkiełko nakrywkę stroną z komórkami do góry w dolnej płytce komory. Nie dopuść do wyschnięcia szkiełka nakrywki.Następnie przymocuj magnetyczną główną część komory hodowlanej i nanieś 500 µL medium z oryginalnej płytki 6-dołkowej na górną powierzchnię szkiełka podstawowego. Ponowne wykorzystanie medium zmniejsza stres komórkowy wywołany zmianami środowiskowymi i może być również przydatne przy ocenie czynników wydzielanych do środowiska pozakomórkowego. Po dodaniu medium nałóż szklaną pokrywę na komorę hodowlaną i za pomocą chusteczki Kimwipe nasączonej 70% etanolem usuń z dolnej strony szkiełka podstawowego wszelkie pozostałości, które mogłyby zakłócić obraz podczas mikroskopii.Umieść komorę hodowlaną w inkubatorze w temperaturze 34 °C i 5% carbon dioxide na 30 minut. Krok ten zapewni rozgrzanie samej komory do 34 °C, aby zminimalizować przesuwanie się szkiełka nakrywkowego. W miarę nagrzewania się metalu, w kolejnych krokach należy pracować przy jak najniższym oświetleniu pomieszczenia.Najpierw Thora wcześniej przygotowała kulturę nuke view w temperaturze pokojowej. Następnie wyjmij komorę hodowlaną z inkubatora i szybko umieść ją w komorze środowiskowej mikroskopu. Włącz butlę z 5% gotową mieszaniną dwutlenku węgla z podwójnym regulatorem.Następnie, używając obiektywu 10x przy napięciu lampy mikroskopu ustawionym na około 2,5 V i czasie ekspozycji wynoszącym 240 ms, ustaw ostrość w trybie mikroskopii w polu jasnym, aby zwizualizować komórki na monitorze komputera. Następnie dodaj do komórek jony potasu w stężeniu 80 mM lub inny induktor apoptozy poprzez wymianę medium z zastosowaniem powolnej perfuzji lokalnej za pomocą pompy perystaltycznej.Podłoże nuke view 4 88 jest stabilne w hodowli komórkowej w eksperymentach trwających do 36 godzin. W związku z tym możliwe jest przeprowadzanie doświadczeń w tym przedziale czasowym. Najpierw należy ustawić mikroskop tak, aby umożliwić wizualizację fluorescencji czerwonego i zielonego białka fluorescencyjnego.Następnie kliknij kanał czerwony, aby wyświetlić przetransfekowane komórki. Wybierz i zapisz około 12 klatek, na których widocznych jest kilka przetransfekowanych komórek, a następnie zapisz te punkty stolika XY. Ustaw mikroskop tak, aby co sześć minut rejestrował obrazy w jasnym polu w kanale czerwonym oraz kanale zielonym w tych zapisanych punktach stolika.Po zebraniu wielu punktów XY z eksperymentów przeprowadzonych w dubletach lub triplikatach, zestaw dane z oddzielnych doświadczeń wykonanych w różne dni i przeprowadź analizę danych oraz testy statystyczne zgodnie z opisem w protokole pisemnym, aby porównać stosunek komórek z ujemnym sygnałem w zatoce CASP do komórek z dodatnim sygnałem w zatoce CASP. Podłoże Nuke view 4 88 może wskazywać na zwiększone tempo apoptozy w kulturach komórek glejowych N 19 oligo DDR. Obrazy bazowe zostały uzyskane przy użyciu obiektywu 10x po zastosowaniu wysokiego stężenia potasu zewnątrzkomórkowego.Komórki N 19 przetransfekowano białkiem RFP, a następnie poddano działaniu trzech mikrolitrów substratu NukeView 488 (w przypadku komórek kontrolnych) lub trzech mikrolitrów substratu NukeView 488 oraz 80 milimolowego roztworu potasu. Obrazy te pokazują, że liczba komórek apoptotycznych zwiększa się w czasie – odpowiednio trzy, sześć i dziewięć godzin po traktowaniu 80 milimolowym roztworem potasu. W warunkach kontrolnych nie zaobserwowano istotnych ilości apoptozy w porównaniu z kulturami traktowanymi 80 milimolowym roztworem potasu. Tło w postaci zielonego sygnału zaobserwowane w warunkach kontrolnych wskazuje na komórki przechodzące apoptozę bez dodania potasu zewnątrzkomórkowego.12-godzinny przebieg czasowy jest wystarczający dla badań obejmujących uszkodzenia neurologiczne. Po 12 godzinach w kulturach traktowanych potasem odnotowano około 45% śmierci komórek. Praktycznie żadna z komórek w eksperymencie kontrolnym nie wykazuje apoptozy w 12. godzinie. Choć w innych sytuacjach eksperymenty mogą wymagać dłuższego czasu trwania.Ten wykres przedstawia wzrost liczby komórek wykazujących pozytywną reakcję na kaspazę 3 w czasie trwania 12-godzinnego eksperymentu. Po opanowaniu metody, technikę tę można przeprowadzić w ciągu jednej godziny, a dane można zebrać przez noc, jeśli procedura zostanie wykonana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury ważne jest zachowanie spójności między poszczególnymi wariantami traktowania zgodnie z opisany metodą.Do badania innych białek efektorowych zaangażowanych w analizowane szlaki sygnałowe można wykorzystać inne metody, takie jak barwienie immunocytochemiczne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat przygotowania próbek do obrazowania. Należy teraz zebrać zestaw danych i przeprowadzić jego analizę.

monitoring-cleaved-caspase-3-activity-apoptosis-immortalized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Monitorowanie aktywności rozszczepionej kaspazy-3 i apoptozy unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych za pomocą obrazowania żywych komórek i płatalnych substratów barwnika fluorogenicznego po depolaryzacji błony wywołanej potasem

Ten film opisuje test luminescencyjny in vitro kaspazy-3/7 do ilościowego określenia śmierci komórki lub apoptozy. Test mierzy luminescencję wytwarzaną po rozszczepieniu kaspazy-3/7 proluminescencyjnego substratu DEVD. Generowana luminescencja jest proporcjonalna do aktywności kaspazy-3/7.

Test kaspazy-3/7: Test oparty na luminescencji do ilościowego określania apoptozy poprzez pomiar aktywności kaspazy-3/7 w eksplantatach skóry żaby

Ten film pokazuje aktywację białek kaspazy u ludzkich makrofagów za pomocą białek reporterowych dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Prodomeny kaspazy-1 są połączone z niefluorescencyjnymi fragmentami białek Wenus, które są rekrutowane do kompleksów inflamasomowych. Bliskość inflamasomów indukuje ponowne fałdowanie i fluorescencję fragmentów Wenus, potwierdzając aktywację kaspazy w makrofagach.

Wizualizacja aktywacji kaspazy w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Testy multipleksowe mogą dostarczyć korzystnych informacji dla podstawowych mechanizmów komórkowych i wyeliminować marnotrawstwo odczynników oraz niepotrzebne powtarzalne eksperymenty. Opisujemy tutaj multipleksowy test aktywności kaspazy-3/7, przy użyciu metod fluorescencyjnych i luminescencyjnych, w celu określenia żywotności komórek w modelu podwzgórza in vitro po prowokacji oksydacyjnej kwasem palmitynowym.

Zastosowanie testu multipleksowania kaspazy w celu określenia apoptozy w modelu komórkowym podwzgórza

Termin anastasis odnosi się do zjawiska, w którym umierające komórki odwracają proces samobójstwa komórki na późnym etapie, naprawiają się i ostatecznie przeżywają. Tutaj pokazujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które przechodzą anastazę.

Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę

Aby zająć się mechanizmami demielinizacji i apoptozy neuronów w uszkodzeniach korowych zapalnych zaburzeń demielinizacyjnych, używane są różne modele zwierzęce. Opisujemy tutaj podejście ex vivo polegające na użyciu limfocytów T CD8 + specyficznych dla oligodendrocytów na wycinkach mózgu, co powoduje śmierć oligodendroglialną i neuronalną. Omówiono potencjalne zastosowania i ograniczenia modelu.

Model ex vivo ataku limfocytów T kierowanego przez oligodendrocyty w ostrych wycinkach mózgu

Anastasis jest technicznie trudne do wykrycia in vivo, ponieważ komórki, które odwróciły proces śmierci komórki, mogą być morfologicznie nie do odróżnienia od normalnych zdrowych komórek. Poniżej opisujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które ulegają anastazie u żywych zwierząt, przy użyciu naszego nowo opracowanego systemu biosensorów CaspaseTracker in vivo.

Wykrywanie anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół zastosowania rodaminy 123 do identyfikacji potencjału błony mitochondrialnej (MMP) i badania indukowanej przez CLIC4 apoptozy komórek HN4 in vitro. Pod zwykłym mikroskopem fluorescencyjnym i konfokalnym laserowym skaningowym mikroskopem fluorescencyjnym zarejestrowano zmianę MMP w czasie rzeczywistym.

Wykrywanie potencjału błony mitochondriów w celu badania apoptozy komórek HN4 indukowanej knockdownem CLIC4 in vitro

Ten protokół opisuje dwumolekularną komplementację fluorescencji kaspazy (BiFC); metodę opartą na obrazowaniu, która może być użyta do wizualizacji indukowanej bliskości kaspaz inicjujących, co jest pierwszym krokiem w ich aktywacji.

Oświetlanie szlaków aktywacji kaspazy za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Protokół ten opisuje metodę obrazowania żywymi komórkami do monitorowania przepuszczalności błony lizosomalnej podczas nekroptozy, wykorzystującą sondy fluorescencyjne wykrywające zmiany w integralności błony lizosomalnej i zakwaszeniu.

Obrazowanie żywymi komórkami permeabilizacji błony lizosomalnej podczas nekroptozy

Poznaj metodę obrazowania żywych komórek apoptozy w kulturach oligodendrocytów N19 za pomocą substratu NucView 488. Technika umożliwia monitorowanie śmierci komórkowej w czasie rzeczywistym.

Monitorowanie aktywności rozszczepionej kaspazy-3 i apoptozy unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych za pomocą obrazowania żywych komórek i płatalnych substratów barwnika fluorogenicznego po depolaryzacji błony wywołanej potasem (Wideo) | JoVE Journal

Monitorowanie aktywności rozszczepionej kaspazy-3 i apoptozy unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek oraz rozszczepialnych fluorescencyjnych substratów barwiących po indukowanej potasem depolaryzacji błony

Przeglądaj więcej filmów