Rejestracja transretinalnego ERG z siatkówki myszy: fotoreakcje czopków i pręcików

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykonanie zapisów elektroretinogramu przezretinalnego z wyizolowanej, nienaruszonej siatkówki myszy w celu uzyskania odpowiedzi świetlnych indukowanych przez czopki i pręciki. W pierwszej kolejności przygotowywane są kapilary szklane oraz komora perfuzyjna do zapisów. Obie czaszki gałek ocznych myszy zaadaptowanej do ciemności zostają wyciętą.

Podświetlając próbkę światłem podczerwonym, usuwa się rogówkę i ciało szkliste. Siatkówkę oddziela się od nabłonka pigmentowego i kładzie stroną fotoreceptorów stroną górną na papierze filtracyjnym. Siatkówkę na papierze filtracyjnym przenosi się do komory perfuzyjnej na stole mikroskopu i umieszcza między dwiema elektrodami podłączonymi do wzmacniacza różnicowego.

Na koniec, z płasko zamontowanej siatkówki myszy rejestrowane są odpowiedzi świetlne pośredniczone przez pręciki i czopki. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak klasyczne rejestracje z pojedynczych komórek, jest to, że umożliwia ona długotrwałe rejestracje z receptorów pręcikowych i czopkowych w myszach typu dzikiego oraz modyfikowanych genetycznie, z jednoczesnym dostępem do podawanych leków. Metoda ta staje się szczególnie użyteczna w celu uzyskania stabilnych odpowiedzi z rzadkich i delikatnych czopków mysich.

Zacznij od przygotowania kapilar szklanych. Przygotuj 10 mililitrów 1,2% agaru w kąpieli wodnej. Wypełnij szklane kapilary roztworem agaru za pomocą plastikowej strzykawki, w której agar szybko krzepnie.

Przetnij kapilary na pół za pomocą noża diamentowego. Namocz powstałe elektrody szklane w roztworze do elektrod dla myszy przez co najmniej 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przygotuj mikroskop w sposób ogólny, aby zminimalizować zakłócenia mechaniczne i elektromagnetyczne.

Zamontuj mikroskop na stole antywibracyjnym i osłoń go klatką Faradaya. Funkcje te nie są jednak niezbędne. Skalibruj źródło światła za pomocą fotometru umieszczonego w płaszczyźnie siatkówki.

W przypadku zastosowania źródła światła LED należy użyć dyfuzora optycznego, aby uzyskać jednorodność światła, wykorzystując do tego celu plastikową rurkę oraz kapilarę szklaną. Należy połączyć dolną elektrodę z uchwytem elektrody. Następnie należy wypełnić przestrzeń dolnej elektrody komory perfuzyjnej roztworem elektrolitycznym.

Upewnij się, że w elektrodzie, przewodach łączących lub uchwycie elektrody nie ma pęcherzyków powietrza. Usuń wszelkie pęcherzyki, przepłukując roztwór za pomocą strzykawki. Po umieszczeniu komory rejestracyjnej pod mikroskopem podłącz dolny uchwyt elektrody do dodatniego bieguna przedwzmacniacza wzmacniacza różnicowego.

Następnie wyśrodkować i wyrównać otwór dolnej elektrody komory z plamką światła stymulującego, a roztwór perfuzyjny z buforem wodorowęglanowym z 95%tlenem i 5%dwutlenkiem węgla inkubować w kąpieli wodnej o temperaturze 40 °C. pH roztworu wyniesie 7,2. Podłączyć linię perfuzyjną do komory rejestracyjnej i uruchomić perfuzję.

Roztwór przepływa z butelki do komory rejestrującej siłą grawitacji. Przechodząc przez ceramiczny rezystor, zostaje on ponownie podgrzany do 36 lub 37 °C. Aby zminimalizować straty ciepła, grzałka powinna znajdować się jak najbliżej komory rejestrującej.

W idealnych warunkach, na stoliku mikroskopu, należy ustawić regulator przepływu w drodze roztworów i dostosować go do wartości około one milliliter per minute. Następnie należy połączyć górną elektrodę z drugim biegunem ujemnym stopnia głowicowego, używając uchwytu elektrody z pierścieniem O-ring, a sondę termopary przymocować do tej elektrody tak, aby ich końcówki znajdowały się jak najbliżej siebie, co zapewni pomiar temperatury w pobliżu centrum siatkówki. Następnie należy zanurzyć końcówkę górnej elektrody w roztworze perfuzyjnym i umieścić ją w centrum komory.

Odczekaj od 10 do 15 minut w celu stabilizacji linii bazowej. Na koniec dostosuj napięcie DC grzałki tak, aby temperatura roztworu wynosiła 36-37°C. Przygotuj mysz poprzez adaptację do ciemności przez całą noc.

Do rejestracji transretinalnych sterowanych przez pręciki należy użyć myszy typu dzikiego, takich jak C 57 black six, lub myszy z knockoutem alfa transdukującego pręciki, pozbawionych sygnalizacji pręcików, do rejestracji transretinalnych sterowanych przez czopki. Przed rozpoczęciem pracy w ciemności należy przygotować kawałek kwadratowej papieru filtracyjnego, wykonując w jego centrum otwór o średnicy od 2 do 2,5 mm i smarując jego rogi. Wszystkie poniższe kroki muszą być wykonywane w świetle podczerwonym. Mikroskop dissectingowy jest wyposażony w konwertery obrazu podczerwonego do badania hemisectorowanych gałek ocznych.

Usuń obie rogówki oraz soczewki. Podczas tych czynności usuń jak największą ilość ciała szklistego. Pracuj na jednym oczku po kolei.

Drugą część gałki ocznej można przechowywać przez kilka godzin w naczyniu z roztworem inkubacyjnym w pudełku przepuszczającym światło, nasyconym czystym tlenem w temperaturze pokojowej, w celu rejestracji z całych siatkówek. Oddziel pierwszą siatkówkę od warstwy nabłonka barwnikowego, a w razie potrzeby dokładnie oczyść ją pęsetą, aby usunąć pozostałe ziarna nabłonka barwnikowego. Aby dokonać rejestracji z regionu grzbietowego siatkówki, przed oddzieleniem siatkówki usuń brzuszną część gałki ocznej za pomocą żyletki lub mikronożyczek.

Kierując się znacznikami Corry, usuń brzuszny puchar oka. Użyj pipety, aby przenieść wyizolowaną siatkówkę do kropli roztworu perfuzyjnego na pokrywce szalki Petriego. Następnie dodaj od pięciu do sześciu małych kropli roztworu elektrolitycznego zawierającego chlorek baru.

Za pomocą pęsety umieść przygotowany filtr z otworem w kropli roztworu perfuzyjnego z siatkówką. Ułóż siatkówkę na papierze filtrującym stroną z fotoreceptorami do góry. Następnie dociśnij krawędzie na obwodzie, aby uzyskać płaski preparat.

Siatkówkę należy wycentrować nad otworem w papierze filtracyjnym. Następnie przenieść papier filtracyjny z siatkówką do komory perfuzyjnej i umieścić go nad punktem stymulacji, wyrównując go z przestrzenią dolnej elektrody. Lekko docisnąć krawędzie papieru filtracyjnego z tłuszczem, aby przymocować go do komory.

Na koniec umieść górną elektrodę nad centrum siatkówki w taki sposób, aby elektroda lekko dotykała warstwy fotoreceptorów. Następnie przystąp do eksperymentu polegającego na rejestracji przezsiatkówkowej. Do analizy wykorzystujemy oprogramowanie do akwizycji i analizy danych pClamp 10 firmy Molecular Devices zgodnie z protokołem.

Podczas długich sesji rejestracyjnych wykorzystaliśmy światło LED o długości fali 505 nm z tego źródła LED. Aby utrzymać efektywne tłumienie komponentu glejowego odpowiedzi fotycznej, należy wymienić roztwór dolnej elektrody. Przed testowaniem każda siatkówka powinna zostać odpowiednio przygotowana.

Intensywność błysku źródła światła LED była kontrolowana poprzez połączenie komputerowego sterowania rezystorami przełączalnymi napięcia LED oraz zestawu filtrów neutralnych rozmieszczonych pomiędzy diodą LED a siatkówką. Czas trwania błysku testowego LED, zazwyczaj 20 milisekund, był kontrolowany przez komputer. Przedstawione zapisy transretinalne z udziałem pręcików u myszy C 57 black six pokazują przebiegi reprezentujące średnie z pięciu do sześciu odpowiedzi przy niskich intensywnościach światła oraz z dwóch do trzech odpowiedzi przy nasycających intensywnościach światła.

Każdy ślad tych danych z rejestracji sygnałów przez czopki w siatkówce, pochodzących z myszy z nokautem genu alfa transdukcyjnego pręcików, stanowi średnią z pięciu do 10 odpowiedzi przy niskim natężeniu światła oraz trzech do pięciu odpowiedzi przy nasycającym natężeniu światła. Po obejrzeniu tego filmu powinniśmy mieć dobrą wiedzę na temat przeprowadzania rejestracji elektroretinogramów z izolowanej siatkówki myszy w celu uzyskania fotoodpowiedzi zależnych od pręcików i czopków.