Name: Transsiatkówkowe zapisy ERG z siatkówki myszy: fotoodpowiedzi pręcików i czopków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Poznaj metodę transsiatkówkowych zapisów ERG z siatkówki myszy, umożliwiającą izolację fotoodpowiedzi pręcików i czopków. Technika ta wspiera badania nad funkcją siatkówki i chorobami wzroku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez Career Development Award przyznane przez Research to Prevent Blindness, granty NIH EY19312 i EY19543 (VJK), a także przez nieograniczony grant z Research to Prevent Blindness oraz EY02687 (Department of Ophthalmology and Visual Sciences na Washington University).

1. Wykonywanie elektrod
<ol>
	<li>Przygotować elektrody szklane. Odważyć 120 mg agaru i wymieszać go w 10 mL wody destylowanej (końcowe stężenie agaru 1,2%). Roztopić roztwór agaru w kąpieli wodnej. Wypełnić kapilary szklane (stosujemy kapilary Word Presision Instruments TW100-4 o następujących wymiarach: długość = 100 mm, OD/ID = 1/0,75 mm i objętość wewnętrzna = 44 μL) roztworem agaru za pomocą plastikowej strzykawki. Pozostawić agar do zestalenia w temperaturze pokojowej przez 10 min. W ten sposób można wypełnić do ~200 kapilar (pozostałą mieszankę agaru można przechowywać w temperaturze -4 °C i wykorzystać wielokrotnie).</li>
	<li>Przeciąć kapilary na pół za pomocą noża diamentowego.</li>
	<li>Namoczyć otrzymane elektrody szklane w roztworze do elektrod mysich przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 4 °C. Przechowywać elektrody w 4 °C i używać ich w okresie od 3 do 4 miesięcy.</li>
</ol>
2. Przygotowanie eksperymentu
<ol>
	<li>Mysz poddać adaptacji do ciemności przez noc. Do rejestracji transretinalnej sterowanej pręcikami należy użyć myszy typu dzikiego (np. C57Bl/6), a do rejestracji transretinalnej sterowanej czopkami myszy Tα-/- pozbawione sygnalizacji pręcikowej8.</li>
	<li>Przygotować 1 L roztworu perfuzyjnego, 100 mL roztworu do elektrod oraz 20 mL roztworu inkubacyjnego (patrz poniżej) i przefiltrować roztwór perfuzyjny przez filtr Millipore 0,45 μm lub 0,22 μm (opcjonalnie).</li>
	<li> skalibrować źródło światła (stymulator optyczny z diodą LED 505 nm lub żarówką halogenową) za pomocą fotometru umieszczonego na płaszczyźnie siatkówki. W przypadku źródła światła LED należy użyć dyfuzora optycznego, aby uzyskać jednorodność światła.</li>
	<li>Przygotować komorę perfuzyjną do eksperymentu (konstrukcje komór mogą się różnić). Nasza komora jest wykonana z 3 mm pleksiglasu, z dnem wykonanym z pokrywki małej plastikowej szalki Petriego i posiada aktywną objętość perfuzji ~400 μL (L = 25 mm, W = 8 mm, H ≈ 2 mm). Wypełnić dolną przestrzeń elektrodową komory roztworem do elektrod zawierającym 2 mM L-glutaminianu i 10 mM BaCl2. Za pomocą plastikowych rurek i szklanej kapilary stworzyć połączenie między roztworem w dolnej przestrzeni elektrodowej (wykonane z złączki rurki plastikowej przymocowanej do dna komory) a uchwytem elektrody. Upewnić się, że w elektrodzie, łączących rurkach lub uchwycie elektrody nie ma pęcherzyków powietrza (w razie potrzeby przepłukać roztwór za pomocą plastikowej strzykawki).</li>
	<li>Zamontować komorę rejestracyjną na stoliku mikroskopu (opcjonalnie: mikroskop może być zamontowany na stole antywibracyjnym i osłonięty klatką Faradaya w celu zminimalizowania zakłóceń mechanicznych i elektromagnetycznych). Podłączyć dolny uchwyt elektrody do dodatniego bieguna przedwzmacniacza wzmacniacza różnicowego (np. wzmacniacz Warner Instruments DP-311). Wycentrować i wyrównać dolny otwór elektrody komory z plamką światła stymulującego. Podłączyć linię perfuzyjną do komory rejestracyjnej i uruchomić perfuzję.</li>
	<li>Napowietrzać roztwór perfuzyjny mieszanką 95% O2/5% CO2, inkubując go w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C. CO2 dostosowuje pH roztworu do wartości 7,2. Roztwór przepływa z butelki do komory rejestracyjnej grawitacyjnie, przechodząc przez ceramiczny rezystor podgrzewający go do 36-37 °C. Aby zmniejszyć straty ciepła, grzałka powinna znajdować się jak najbliżej komory rejestracyjnej, idealnie na stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Za pomocą regulatora przepływu ustawić szybkość przepływu na około 1 mL/min.</li>
	<li>Podłączyć górną elektrodę do drugiego (ujemnego) bieguna przedwzmacniacza za pomocą drugiego uchwytu elektrody. Przymocować sondę termopary do górnej elektrody za pomocą pierścienia O-ring. Upewnić się, że końcówki elektrody i termopary znajdują się blisko siebie, aby odczyt temperatury był dokonywany jak najbliżej centrum siatkówki. Zanurzyć końcówkę górnej elektrody w roztworze perfuzyjnym i umieścić ją w centrum komory. Odczekać 10-15 min na stabilizację linii bazowej.</li>
	<li>Dostosować napięcie DC grzałki tak, aby temperatura roztworu wynosiła 36-37 °C.</li>
</ol>
3. Izolowanie siatkówki mysiej
<ol>
	<li>Przy słabym czerwonym świetle uśmierć mysz przystosowaną do ciemności za pomocą CO2 oraz zwichnięcia szyjnego. Opcjonalnie: wykonaj znak referencyjny na gałce ocznej każdej myszy, wypalając najbardziej grzbietowy punkt twardówki za pomocą wypalarki lub rozgrzanej szpilki sekcyjnej. Wszystkie kolejne procedury przeprowadza się w świetle podczerwonym, korzystając z konwerterów obrazu podczerwonego zamontowanych w mikroskopie sekcyjnym.</li>
	<li>Wypreparuj oczy za pomocą zakrzywionych nożyczek, wywierając delikatny nacisk i rozciągając skórę po bokach każdego oka. Przetnij obie gałki oczne na pół pod oświetleniem podczerwonym, używając mikronużyczek lub żyletki.</li>
	<li>Usuń rogówkę i soczewkę. Usuń jak największą ilość ciała szklistego.</li>
	<li>Oddziel pierwszą siatkówkę od warstwy nabłonka pigmentowego i, jeśli to konieczne, dokładnie oczyść ją pęsetą, aby usunąć pozostałe ziarna nabłonka pigmentowego. Zazwyczaj do transretinalnych rejestracji z czuczcików i czopków wykorzystujemy całą siatkówkę. Jeśli jednak chcesz rejestrować sygnały konkretnie z części grzbietowej siatkówki myszy, która posiada więcej czopków M/L9, przed oddzieleniem siatkówki usuń część brzuszną oczodołu za pomocą żyletki lub mikronużyczek, wykorzystując znak wypalony jako punkt odniesienia.</li>
	<li>Umieść drugą przeciętą gałkę oczną w małej szalce Petriego z roztworem inkubacyjnym i inkubuj preparat w ciemnej komorze nasyconej czystym tlenem do momentu użycia. Zazwyczaj w tych warunkach druga gałka oczna myszy może być przechowywana przez kilka godzin w temperaturze pokojowej i wykorzystana do rejestracji.</li>
	<li>Za pomocą szklanej lub plastikowej pipety przenieś wyizolowaną siatkówkę do kropli roztworu perfuzyjnego (ok. 300 μl) na pokrywce szalki Petriego. Dodaj 5-6 małych kropli roztworu elektrody zawierającego BaCl2, aby przeprowadzić preinkubację siatkówki z BaCl2. Umieść kwadratowy fragment (ok. 5x5 mm) papieru filtrującego Millipore (typ HARG 0,45 μm) z fabrycznie wykonanym otworem w centrum (o średnicy 2-2,5 mm), którego rogi od strony tylnej zostały nasmarowane (używamy smaru i uszczelniacza zaworowego Dow Corning 111), w tej samej kropli roztworu. Za pomocą pęsety ułóż siatkówkę na papierze filtrującym (warstwą fotoreceptorów do góry) i dociśnij jej brzegi na obwodzie, aby ją płasko zamocować. Siatkówka powinna być wycentrowana nad otworem w papierze filtrującym.</li>
	<li>Za pomocą pęsety przenieś papier filtrujący z siatkówką do komory perfuzyjnej i umieść go nad przestrzenią dolnej elektrody, wyrównanej z punktem stymulacji. Delikatnie dociśnij nasmarowane brzegi papieru filtrującego, aby połączyć go z komorą.</li>
	<li>Umieść górną elektrodę nad centrum siatkówki (lekko dotykając warstwy fotoreceptorów). Wycentrowanie górnej elektrody na siatkówce zwiększa amplitudę sygnału (do ~20-40% w porównaniu z umieszczeniem jej bliżej brzegu siatkówki). Chociaż takie położenie elektrody nieznacznie zniekształca efektywną intensywność bodźca świetlnego docierającego do małego sektora siatkówki (~12-15% jej całkowitej powierzchni), jest to nadal optymalny sposób rozmieszczenia elektrody. Preparat jest teraz gotowy do rejestracji transretinalnej.</li>
</ol>
4. Rejestracja transretinalna
<ol>
	<li>W zależności od linii myszy, zarejestruj odpowiedzi na błysk testowy sterowany przez pręciki lub czopki M/L, w zakresie od niskiego do wysokiego natężenia skalibrowanego światła o długości fali 505 nm, dostarczanego przez źródło światła LED lub stymulator optyczny. W przypadku naszego źródła światła LED natężenie błysku jest kontrolowane przez kombinację komputerowego sterowania napięciem wejściowym diody LED, przełączalnych rezystorów oraz zestawu filtrów neutralnych (stosujemy filtry foliowe ND 0,9 E-Colour nr 211 firmy Rosco Laboratories) umieszczonych pomiędzy diodą LED a siatkówką. Czas trwania błysku testowego LED (20 ms) jest kontrolowany komputerowo. W przypadku użycia stymulatora optycznego z żarówką halogenową, natężenie i długość fali błysku testowego można kontrolować odpowiednio za pomocą zestawu filtrów neutralnych oraz interferencyjnych filtrów wąskopasmowych. Czas trwania błysku testowego może być kontrolowany przez sterowane komputerowo migawki.</li>
	<li>Opcjonalnie: aby utrzymać efektywne tłumienie komponentu glialnego fotoreakcji za pomocą BaCl2 przez cały dzień, okresowo wymieniaj roztwór dolnej elektrody (np. przed badaniem każdej siatkówki), przepłukując go za pomocą plastikowej strzykawki wypełnionej świeżym roztworem.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Roztwory
<ol>
	<li>Roztwór do perfuzji siatkówki myszy: 112.5 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2.4 mM MgCl2, 1.2 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7.2), 20 mM NaHCO3, 3 mM bursztyczanu sodu, 0.5 mM glutaminianu sodu, 0.02 mM EDTA oraz 10 mM glukozy. Dodatkowo roztwór uzupełnia się o 2 mM L-glutaminianu i 10 μM DL-AP-4 w celu zablokowania wyższych rzędów komponentów odpowiedzi świetlnej10,11, a także o 0.1% roztworów witamin MEM i aminokwasów MEM (Sigma), aby poprawić żywotność siatkówki.</li>
	<li>Roztwór elektrodowy dla myszy: 140 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2.4 mM MgCl2, 1.2 mM CaCl2, 3 mM HEPES (pH 7.4, NaOH). Roztwór w dolnej przestrzeni elektrodowej zawiera również 2 mM L-glutaminianu w celu zablokowania transmisji synaptycznej10 oraz dodatkowo 10 mM BaCl2 w celu stłumienia komponentu glejowego odpowiedzi świetlnej3,12.</li>
	<li>Roztwór do inkubacji siatkówki: rozpuścić 272 mg medium L-15 (Sigma) i 20 mg BSA w 20 mL wody dejonizowanej. Końcowe stężenia L-15 i BSA wynoszą odpowiednio 13.6 mg/mL i 1 mg/mL. pH należy dostosować do 7.4 za pomocą 1 M HCl.</li>
</ol>
<img alt="Proces dysekcji siatkówki myszy; schematy M2-M4 przedstawiają anatomię oka, dysekcję oraz konfigurację mikroskopu LED." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1."> 
Rysunek 1. Schemat przedstawiający izolację siatkówki myszy do pomiarów transretinalnego ERG.
<img alt="Schemat układu mikroprzepływowego przedstawiający rozmieszczenie elektrod do elektroforezy z łącznikiem strzykawki." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2."> 
Rycina 2. Fotografia komory perfuzyjnej i elektrod rejestrujących wraz z ich uchwytami. Czerwone strzałki wskazują kierunek przepływu perfuzyjnego.
<img alt="Układ elektrofizjologiczny do pomiaru odpowiedzi pręcików i czopków; zawiera klatkę Faradaya, diodę LED oraz wzmacniacz." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3."> 
Rycina 3. Schematyczny rysunek układu eksperymentalnego do rejestracji transretinalnego ERG. Czerwone strzałki wskazują kierunek przepływu perfuzji.
<img alt="Wykres krzywej fotoreakcji: czas vs fotonapięcie; absorpcja przejściowa; dane odpowiedzi optycznej." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4."> 
Rycina 4. Reprezentatywne wyniki: zarejestrowana rodzina odpowiedzi transretinalnych indukowanych przez pręciki mysie. Fotoreakcje zostały przefiltrowane filtrem dolnoprzepustowym 30 Hz (8-biegunowy filtr Bessela), zdigitalizowane z częstotliwością 1 kHz i zapisane na komputerze do dalszej analizy. Przedstawione ślady reprezentują średnie z 5-6 odpowiedzi przy niskich natężeniach światła oraz 2-3 odpowiedzi przy nasycających natężeniach światła.
<img alt="Wykres odpowiedzi na światło w czasie wykazujący zanik sygnału w badaniu fotonicznym." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5."> 
Rycina 5. Reprezentatywne wyniki: zarejestrowana rodzina odpowiedzi transretinalnych indukowanych przez czopki u myszy. Odpowiedzi na światło zostały przefiltrowane filtrem dolnoprzepustowym 30 Hz (8-biegunowy filtr Bessela), zdigitalizowane z częstotliwością 1 kHz i zapisane w komputerze do dalszej analizy. Przedstawione przebiegi są średnimi z 5-10 odpowiedzi przy niskim natężeniu światła i 3-5 odpowiedzi przy nasycającym natężeniu światła.

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li>
<li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li>
<li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+photoproducts%3A+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161, 487-489 (1968).</li>
<li>Wang, J. S., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+pathway+mediates+the+mouse+and+human+cone+visual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle.</a> Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).</li>
<li>Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+cone+visual+cycle+promotes+rapid+M%2FL-cone+pigment+regeneration+independently+of+the+interphotoreceptor+retinoid-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein.</a> J. Neurosci. 31, (2011).</li>
<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mass+receptor+potential+of+the+isolated+frog+retina.+I.+General+properties+of+the+response%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response.</a> Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).</li>
<li>Vinberg, F., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sets+the+physiological+value+of+the+dominant+time+constant+of+saturated+mouse+rod+photoresponse+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery.</a> PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).</li>
<li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Opisana powyżej metoda rejestracji transretinalnego ERG sterowanego przez pręciki i czopki staje się potężnym narzędziem do badania funkcji fotoreceptorów myszy zarówno u zwierząt typu dzikiego, jak i modyfikowanych genetycznie. Oprócz łatwej charakterystyki podstawowych właściwości fotoreakcji, ta prosta technika zapewnia dużą stabilność odpowiedzi podczas długotrwałych eksperymentów przeprowadzanych na preparatach siatkówki niemal nienaruszonej. Zarówno maksymalna amplituda odpowiedzi pręcików w adaptacji do ciemności,...

rejestracja transretinalnego erg z siatkówki myszy: fotoreakcje czopków i pręcików

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

W siatkówce kręgowców występują dwie odrębne klasy fotoreceptorów tworzących obraz: pręciki i czopki. Pręciki są zdolne do wykrywania pojedynczych fotonów światła, podczas gdy czopki działają w sposób ciągły w szybko zmieniających się warunkach silnego oświetlenia. Absorpcja światła przez specyficzne dla pręcików i czopków pigmenty wzrokowe w segmentach zewnętrznych fotoreceptorów inicjuje kaskadę fototransdukcji, która ostatecznie prowadzi do zamknięcia kanałów sterowanych cyklicznymi nukleotydami w błonie plazmatycznej i hiperpolaryzacji komórki. Tę indukowaną światłem zmianę prądu i potencjału błonowego można zarejestrować jako fotoreakcję, stosując klasyczną technikę rejestracji elektrodą ssącą1,2 lub za pomocą transretinalnego elektroretinogramu (ERG) z izolowanych siatkówek z farmakologicznie zablokowanymi komponentami odpowiedzi postsynaptycznej3-5. Ta druga metoda umożliwia długotrwałe rejestracje z fotoreceptorów mysich z możliwością podawania leków i jest szczególnie użyteczna w celu uzyskania stabilnych fotoreakcji z nielicznych i delikatnych czopków mysich. W przypadku czopków takie eksperymenty można przeprowadzać zarówno w warunkach adaptacji do ciemności, jak i po intensywnym naświetleniu, które powoduje wybielenie niemal wszystkich pigmentów wzrokowych, aby monitorować proces regeneracji światłoczułości czopków podczas adaptacji do ciemności6,7. W tym filmie pokażemy, jak przeprowadzić transretinalne rejestracje napędzane przez pręciki oraz czopki M/L z adaptowanej do ciemności siatkówki mysiej. Rejestracje z pręcików zostaną wykonane z wykorzystaniem siatkówki myszy typu dzikiego (C57Bl/6). Dla uproszczenia, rejestracje z czopków zostaną uzyskane z genetycznie zmodyfikowanych myszy z nokautem α-podjednostki transducyny pręcików (Tα-/-), u których brak jest sygnalizacji pręcików8.

Opisujemy stosunkowo prostą metodę rejestracji transretinalnego elektroretinogramu (ERG) w celu uzyskania odpowiedzi fotoreceptorowych pręcików i czopków z nienaruszonej siatkówki myszy. Podejście to wykorzystuje blokadę przekaźnictwa synaptycznego z fotoreceptorów w celu wyizolowania ich odpowiedzi na światło i zarejestrowania ich za pomocą elektrod polowych umieszczonych w poprzek wyizolowanej, rozłożonej płasko siatkówki.

Rejestracja transretinalnego ERG z siatkówki myszy: fotoreakcje czopków i pręcików

W siatkówce kręgowców występują dwie odrębne klasy fotoreceptorów odpowiedzialnych za tworzenie obrazu: pręciki i czopki. Pręciki są w stanie wykryć pojedyncze fotony światła ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykonanie zapisów transretinalnego elektroretinogramu z wyizolowanej, nienaruszonej siatkówki myszy w celu uzyskania odpowiedzi świetlnych indukowanych przez pręciki i czopki. W pierwszej kolejności przygotowuje się kapilary szklane oraz komorę perfuzyjną do zapisów. Obie czaszki gałek ocznych myszy zaadaptowanej do ciemności zostają poddane hemiscektomii.Pod iluminacją podczerwieną usunięto rogówkę, soczewkę i ciało stałe. Siatkówkę oddzielono od nabłonka pigmentowego i położono stroną fotoreceptorów do góry na papierze filtracyjnym. Siatkówkę na papierze filtracyjnym przeniesiono do komory perfuzyjnej na stole mikroskopu i umieszczono pomiędzy dwiema elektrodami podłączonymi do przedwzmacniacza różnicowego.Na koniec, z płasko zamontowanej siatkówki myszy rejestrowane są odpowiedzi świetlne pośredniczone przez pręciki i czopki. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak klasyczne pomiary z pojedynczych komórek, jest to, że umożliwia ona długotrwałe rejestracje z receptorów pręcikowych i czopkowych z dostępem do leków u myszy typu dzikiego oraz zmodyfikowanych genetycznie. Staje się ona szczególnie użyteczna w celu uzyskania stabilnych odpowiedzi z rzadkich i delikatnych czopków mysich.Zacznij od przygotowania kapilar szklanych. Przygotuj 10 mililitrów 1,2% agaru w kąpieli wodnej. Wypełnij kapilary szklane roztworem agaru za pomocą plastikowej strzykawki, w której agar szybko krzepnie.Przeciąć kapilary na pół za pomocą noża diamentowego. Namoczyć otrzymane elektrody szklane w roztworze do elektrod dla myszy przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 4 °C. Następnie przygotować mikroskop w sposób ogólny, aby zminimalizować zakłócenia mechaniczne i elektromagnetyczne.Zamocuj mikroskop na stole antywibracyjnym i umieść go w klatce Faradaya. Funkcje te nie są jednak niezbędne. Skalibruj źródło światła za pomocą fotometru umieszczonego na płaszczyźnie siatkówki.W przypadku źródła światła LED należy zastosować dyfuzor optyczny, aby uzyskać jednorodność oświetlenia, wykorzystując do tego celu rurkę plastikową oraz kapilarę szklaną. Należy nawiązać połączenie pomiędzy dolną elektrodą a uchwytem elektrody. Następnie należy wypełnić przestrzeń dolnej elektrody komory perfuzyjnej roztworem elektrolitu.Upewnij się, że w elektrodzie, przewodach łączących lub uchwycie elektrody nie ma pęcherzyków powietrza. Usuń wszelkie pęcherzyki, przepłukując roztwór za pomocą strzykawki. Po umieszczeniu komory rejestracyjnej pod mikroskopem podłącz dolny uchwyt elektrody do dodatniego bieguna przedwzmacniacza różnicowego.Następnie należy wycentrować i wyrównać otwór dolnej elektrody komory z plamką światła stymulującego, używając roztworu perfuzyjnego z buforem wodorowęglanowym nasyconego 95% oxygen, 5% carbon dioxide, inkubując go w kąpieli wodnej o temperaturze 40 °C. pH roztworu wyniesie 7,2. Podłącz linię perfuzyjną do komory rejestrującej i uruchom perfuzję.Roztwór przepływa z butelki do komory pomiarowej pod wpływem grawitacji. Przechodząc przez rezystor ceramiczny, zostaje ponownie podgrzany do 36 lub 37 °C. Aby zminimalizować straty ciepła, grzałka powinna znajdować się jak najbliżej komory pomiarowej.W idealnym przypadku, na stoliku mikroskopu, należy ustawić regulator przepływu w drodze roztworów i dostroić go do wartości około jednego mililitra na minutę. Następnie podłączyć górną elektrodę do drugiego bieguna ujemnego głowicy za pomocą uchwytu elektrody z o-ringiem; przymocować sondę termopary do tej elektrody tak, aby ich końcówki znajdowały się jak najbliżej siebie, co zapewni odczyt temperatury w pobliżu centrum siatkówki. Następnie zanurzyć końcówkę górnej elektrody w roztworze perfuzyjnym i umieścić ją w centrum komory.Odczekaj od 10 do 15 minut aż linia bazowa się ustabilizuje. Na koniec dostosuj napięcie prądu stałego (DC) dla grzejnika tak, aby temperatura roztworu wynosiła od 36 do 37 stopni Celsjusza. Przygotuj mysz poprzez adaptację do ciemności przez noc.Do zapisów transretinalnych sterowanych przez pręciki należy użyć myszy typu dzikiego, np. C 57 black six, lub myszy z knockoutem alpha transdukcji pręcików, pozbawionych sygnalizacji pręcikowej, do zapisów transretinalnych sterowanych przez czopki. Przed rozpoczęciem pracy w ciemności należy przygotować kawałek kwadratowego papieru filtracyjnego, wykonując w jego centrum otwór o średnicy od 2 do 2,5 mm i nasmarując jego narożniki. Wszystkie poniższe kroki muszą być wykonywane w świetle podczerwonym. Mikroskop stereoskopowy jest wyposażony w konwertery obrazu podczerwonego do badania przekrojonych gałek ocznych.Usuń obie rogówki oraz soczewki. Podczas tych czynności usuń jak największą ilość ciała szklistego. Postępuj, pracując nad jednym oczkiem po kolei.Drugą rogówkę można przechowywać przez kilka godzin w naczyniu z roztworem inkubacyjnym w komorze świetlnej nasyconej czystym tlenem w temperaturze pokojowej, aby przeprowadzić pomiary z całych siatkówek. Oddziel pierwszą siatkówkę od warstwy nabłonka barwnikowego, a w razie potrzeby dokładnie oczyść ją pęsetą, aby usunąć pozostałe ziarna nabłonka barwnikowego. Aby przeprowadzić pomiary z regionu grzbietowego siatkówki, przed oddzieleniem siatkówki usuń brzuszną część rogówki za pomocą żyletki lub mikronoareczek.Kierując się znacznikami korry, usuń brzuszną część oka. Za pomocą pipety przenieś wyizolowaną siatkówkę do kropli roztworu perfuzyjnego na pokrywce szalki Petriego. Następnie dodaj od pięciu do sześciu małych kropli roztworu elektrolitu zawierającego chlorek baru.Za pomocą pęsety umieść przygotowany filtr z otworem w kropli roztworu perfuzyjnego z siatkówką. Ułóż siatkówkę na papierze filtracyjnym stroną z fotoreceptorami do góry. Następnie dociśnij jej krawędzie na obwodzie, aby uzyskać płaski preparat.Siatkówka powinna być wycentrowana nad otworem w papierze filtracyjnym. Następnie przenieś papier filtracyjny z siatkówką do komory perfuzyjnej i umieść go nad punktem stymulacji w linii z przestrzenią dla elektrody dolnej. Lekko dociśnij smarowane krawędzie papieru filtracyjnego, aby połączyć go z komorą.Na koniec umieść górną elektrodę nad centrum siatkówki w taki sposób, aby elektroda lekko dotykała warstwy fotoreceptorów. Następnie przystąp do eksperymentu polegającego na wykonywaniu rejestracji transretinalnych. Do analizy wykorzystujemy oprogramowanie do akwizycji i analizy danych peak lamp 10 firmy Molecular Devices zgodnie z opisaną procedurą.Podczas długich sesji rejestracyjnych wykorzystaliśmy światło LED o długości fali 505 nanometrów z tego źródła LED. Aby utrzymać efektywne tłumienie komponentu glejowego odpowiedzi fotycznej, należy wymienić roztwór dolnej elektrody. Przed testowaniem każda siatkówka powinna być odpowiednio przygotowana.Intensywność błysku źródła światła LED była kontrolowana poprzez połączenie komputerowego sterowania rezystorami przełączalnymi napięcia LED oraz zestawem filtrów neutralnych gęstości umieszczonych pomiędzy diodą LED a siatkówką. Czas trwania błysku testowego LED, zazwyczaj 20 milisekund, był kontrolowany przez komputer. Te rejestracje transretinalne sterowane pręcikami u myszy szczepu C 57 black six przedstawiają przebiegi będące średnimi z pięciu do sześciu odpowiedzi przy niskich intensywnościach światła oraz z dwóch do trzech odpowiedzi przy nasycających intensywnościach światła.Każdy ślad danych z kodowania odpowiedzi siatkówki sterowanej czopkami, pochodzących od myszy z nokautem białka alpha w procesie transdukcji pręcików, reprezentuje średnią z pięciu do 10 odpowiedzi przy niskim natężeniu światła oraz z trzech do pięciu odpowiedzi przy nasycającym natężeniu światła. Po obejrzeniu tego filmu powinniśmy mieć dobrą wiedzę na temat przeprowadzania pomiarów elektroretinogramu z izolowanej siatkówki myszy w celu uzyskania fotoodpowiedzi sterowanych pręcikami i czopkami.

transretinal-erg-recordings-from-mouse-retina-rod-cone

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestracje ERG przez siatkówkę u myszy: Odpowiedzi fotoreceptorów pręcików i czopków

Przedstawimy sposób rejestracji odpowiedzi na błysk z pojedynczych czopków mysich przy użyciu elektrody ssącej.

Rejestracje metodą ssania z pojedynczych komórek fotoreceptorów czopkowych myszy

Niniejszy artykuł zawiera opis sposobu wycinania i rejestrowania aktywności z izolowanego preparatu siatkówki myszy. W szczególności opisujemy, jak rejestrować odpowiedzi na światło z populacji komórek zwojowych znakowanych fluorescencyjnie, a następnie identyfikować i analizować ich morfologię.<br...

Izolowany preparat siatkówki do rejestracji odpowiedzi świetlnej genetycznie znakowanych komórek zwojowych siatkówki

Ten film pokazuje nagranie bezpośrednio sprzężonego elektroretinogramu (DC-ERG) na przystosowanym do ciemności, znieczulonym nabłonku barwnikowym siatkówki myszy (RPE). Po zastosowaniu kropli rozszerzających zwierzę umieszcza się w ustawieniu do nagrywania, a elektrodę kapilarną wypełnioną buforem solnym umieszcza się na rogówce. Po ustaleniu linii bazowej rejestruje się DC-ERG.

Zapis elektroretinogramu z bezpośrednim sprzężeniem nabłonka barwnikowego siatkówki u myszy

Opisujemy przygotowanie cienkich wycinków siatkówki z wodnych salamander tygrysich (Ambystoma tigrinum) i wyjaśniamy, jak używamy tych wycinków do badania przetwarzania synaptycznego w siatkówce, uzyskując podwójne zapisy napięcia całego ogniwa z fotoreceptorów oraz komórek poziomych i dwubiegunowych drugiego rzędu.

Jednoczesne zapisy całych komórek z fotoreceptorów i neuronów drugiego rzędu w preparacie plastra siatkówki

Pokażemy, jak przygotować wycinki siatkówki z oka myszy i rejestrować reakcje świetlne w neuronach siatkówki. Cała procedura przeprowadzana jest w warunkach przystosowanych do ciemności.

Rejestrowanie wywołanych światłem odpowiedzi postsynaptycznych w neuronach w adaptowanych do ciemności, mysich preparatach siatkówki przy użyciu technik patch clamp

Opisujemy protokół monitorowania dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopków za pomocą preparatu ex-vivo siatkówki myszy. Protokół ten umożliwia kompleksowe badania sygnalizacji stożka Ca2 + w ważnym systemie modelowym ssaków, myszy.

Obrazowanie dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów stożkowych siatkówki myszy

Elektroretinogram (ERG) to potencjał elektryczny generowany przez siatkówkę w odpowiedzi na światło. W artykule opisano, w jaki sposób można wykorzystać ERG do oceny funkcji siatkówki u szczurów przystosowanych do ciemności oraz jak można go wykorzystać do oceny interwencji neuroprotekcyjnej, w tym przypadku zdalnego warunkowania niedokrwiennego.

Wykorzystanie elektroretinogramu do oceny funkcji siatkówki gryzoni i ochronnych skutków warunkowania wstępnego niedokrwiennego kończyn na odległość

Ex vivo ERG może być używany do rejestrowania aktywności elektrycznej komórek siatkówki bezpośrednio z izolowanych nienaruszonych siatkówk zwierząt lub ludzi. Pokazujemy tutaj, jak powszechne systemy ERG in vivo można dostosować do zapisów ERG ex vivo w celu zbadania aktywności elektrycznej komórek siatkówki.

Jednoczesne badanie funkcjonalne ex vivo dwóch siatkówk za pomocą systemu elektroretinogramu in vivo

Ten protokół opisuje jednoczesny pomiar elektroretinogramu i wzrokowych potencjałów wywołanych u znieczulonych szczurów.

Jednoczesna rejestracja elektroretinografii i wzrokowych potencjałów wywołanych u znieczulonych szczurów

Pokazujemy chirurgiczne implanty i procedury rejestrujące do pomiaru wizualnych sygnałów elektrofizjologicznych z oka (elektroretinogram) i mózgu (wizualny potencjał wywołany) u przytomnych szczurów, co jest bardziej analogiczne do stanu ludzkiego, gdzie nagrania są prowadzone bez zakłóceń znieczulenia.

Implantacja i rejestracja bezprzewodowego elektroretinogramu i wizualnego potencjału wywołanego u świadomych szczurów

Tutaj prezentujemy metodę rejestrowania wywołanych światłem reakcji elektrycznych nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) u myszy za pomocą techniki znanej jako DC-ERG, po raz pierwszy opisanej przez Marmorsteina, Peacheya i współpracowników na początku 2000 roku.

Elektroretinogram ze sprzężeniem bezpośrednim (DC-ERG) do rejestrowania wywołanych światłem reakcji elektrycznych nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Poznaj metodę transsiatkówkowych zapisów ERG z siatkówki myszy, umożliwiającą izolację fotoodpowiedzi pręcików i czopków. Technika ta wspiera badania nad funkcją siatkówki i chorobami wzroku.

Rejestracja transretinalnego ERG z siatkówki myszy: fotoreakcje czopków i pręcików

Przeglądaj więcej filmów