Izolacja komórek wykazujących ekspresję LacZ z tkanek ucha wewnętrznego myszy z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wyizolowanie komórek wykazujących pozytywną ekspresję LAX Z z błędnika nowonarodzonego myszy za pomocą cytometrii przepływowej. Osiąga się to poprzez wstępną izolację dużej liczby błędników myszy w stosunkowo krótkim czasie, aby zachować żywotność komórek i uzyskać odpowiednią ilość tkanki wyjściowej. W drugim kroku komórki LAX Z pozytywne są dysocjowane, a następnie znakowane w celu przygotowania tkanki do sortowania.

Następnie komórki są sortowane za pomocą cytometrii przepływowej. Otrzymane populacje LAX Z high oraz lax low mogą być następnie wykorzystane w dalszych eksperymentach. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad uchem, takie jak profil genetyczny lub charakterystyka konkretnych populacji komórek wewnątrz ucha wewnętrznego.

Procedurę zademonstruje Taha Gen A, student medycyny z naszego laboratorium. Najpierw należy napełnić 35 milimetrowe płytki Petriego roztworem HBSS i umieścić je na bloku z lodu. Następnie, przy użyciu nożyc irydowych, należy odciąć głowy od 12 do 15 uśpionych myszy postnatalnych w wieku od 0 do 3 dni, linii reporterowej axon, two laxy oraz typu dzikiego.

Umieścić głowy w 60 milimetrowej szalce Petriego na bloku lodu. Następnie, używając pęsety Dumont numer pięć oraz nożyczek irydowych, wyciąć żuchwę i język z głów, a następnie przeciąć podstawę czaszki na poziomie podniebienia. Teraz usunąć skórę pokrywającą kalvarium i przeciąć podstawę czaszki, wsuwając nożyczki od dolnej części otworu wielkiego do środka podniebienia.

Wykonaj kolejne nacięcie nożyczkami od przeciętej krawędzi podniebienia do górnej części otworu wielkiego po obu stronach, uważając, aby nie uszkodzić torebki błędnika. Następnie zakończ izolację kości skroniowej, wykonując dwa nacięcia pod kątem 45 stopni, zaczynając od górnej części ramy i otworu wielkiego, aż do cięcia wieńcowego na podniebieniu twardym.

Następnie umieść wyizolowane kości skroniowe w 35 milimetrowych szalkach Petriego zawierających HBSS na bloku lodu i przenieś blok lodu do sterylnej komory sekcyjnej. Następnie napełnij kolejną 35 milimetrową szalkę Petriego, tym razem PBS, i ustaw ją na bloku lodu. Używając dwóch pęset numer 55.

Mikrodysekcję rozpoczynamy od delikatnego usunięcia kory, pnia mózgu oraz móżdżku z kości skroniowej pokrywającej torebkę błędnika. Następnie, bez usuwania torebki błędnika, odłupujemy fragmenty torebki ślimaka, zaczynając od wejścia nerwu błędnikowo-ślimakowego i kontynuując w głąb torebki błędnika. Po odsłonięciu podstawy ślimaka delikatnie wyciągamy narząd Cortiego wraz z otaczającymi go tkankami.

Następnie, zaczynając od podstawy, usuń wszelkie pozostałości zwoju spiralnego i prążka naczyniowego, a następnie przenieś ślimaka do szalki Petriego wypełnionej PBS. Pierwszym krokiem jest pipetowanie 50 µL sterylnego PBS do centrum jednej lub dwóch studni niepowlekanej płytki hodowlanej z sześcioma studniami. Następnie przenieś nie więcej niż 20 przekrojonych wzdłużnie ślimaków do każdej kropli PBS.

Następnie podgrzej wstępnie 50 µL aliquoty 0,125% trypsyny przez około dwie minuty w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Po tym dodaj trypsynę do ślimaka, uważając, aby nie potrząsać naczyniem.

Inkubować ślimaka w temperaturze 37 °C przez osiem minut. Przerwać trypsynizację, dodając 50 µL inhibitora trypsyny z soi do każdej kropli, a następnie dodać dodatkowe 50 µL pełnej pożywki, ustawiając pipetę P 200 na 125 µL. Używając tępej końcówki pipety o pojemności 300 µL, delikatnie potryturirmek komórki 80 razy, uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza.

Następnie, po utryturowaniu każdej kropli, dodać do nich dodatkowe 200 µL pełnej pożywki. Teraz komórki należy przefiltrować przez sito komórkowe o rozmiarze oczek 40 µm do nowej studzienki w tej samej płytce 6-dołkowej, a następnie przenieść komórki z każdej studzienki do oddzielnych standardowych probówek do analizy FACS.

Następnie do każdej z trzech probówek należy dodać 100 µL komórek typu dzikiego, a następnie rozcieńczyć je 300 µL pełnej pożywki w przypadku samej grupy CUG. Próbkę kontrolną, składającą się z 10 µL axon oraz dwóch komórek LAX Z, należy rozcieńczyć w 390 µL pełnej pożywki. Pozostałe komórki axon i dwie komórki lax Z należy przenieść do probówek fax w 400 µL OTs.

Następnie po inkubowaniu probówek w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 10 minut, dodaj 200 µL rozcieńczonego CUG do każdej odpowiedniej probówki fax. Następnie, chroniąc wszystkie probówki przed światłem, inkubuj komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 25 minut. W celu przygotowania barwienia podczas inkubacji komórek, przelej 10 mL świeżo przygotowanego heaps plus FBS do probówki o pojemności 15 mL i umieść probówkę w lodzie.

Następnie dodaj 1,8 mililitra schłodzonego do temperatury lodu roztworu HEPES do każdej z probówek FACS pod sterylną komorą z wyłączonymi światłami, aby zminimalizować ekspozycję na światło. Następnie odwiruj komórki przy 1200 RPM przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po tym usuń nadsącz i resuspenderaj osad w 300 mikrolitrach pełnej pożywki.

Połącz wszystkie alikwoty próbki do sortowania, a następnie dodaj jodek propidyny do każdej odpowiedniej probówki do końcowego stężenia 1 µg/mL. Na koniec, po zabezpieczeniu komórek, ponownie umieść je na lodzie. Ustaw bramki sortowania, zbierając najpierw 1000 zdarzeń dla niebarwionych komórek typu dzikiego, aby określić rozkład komórek na wykresie rozpraszania światła w przód (forward scatter) względem rozpraszania bocznego (side scatter).

Dostosuj parametry rozproszenia światła w przód (forward scatter) i w bok (side scatter) w razie potrzeby. Następnie wykonaj kompensację, wykorzystując niebarwione komórki typu dzikiego, barwione PI komórki typu dzikiego oraz aksony barwione CUG. Dwie komórki LAX Z.

Napełnij dwie probówki FACS 500 µL pełnej pożywki. Następnie rozpocznij analizę od bramkowania komórek typu dzikiego barwionych PI oraz komórek Lae CUG barwionych aksonem, aby wykluczyć zanieczyszczenia na podstawie wykresu rozrzutu sygnału forward scatter versus side scatter. Wyklucz dublety i agregaty, korzystając z wykresu wysokości sygnału forward scatter versus powierzchnia sygnału forward scatter.

Następnie wyklucz martwe komórki dodatnie pod kątem PI na podstawie wykresu powierzchni rozproszenia przedniego (forward scatter area) względem powierzchni PE sci five. Dla każdego ustawienia bramki przygotuj wykres powierzchni rozproszenia przedniego względem powierzchni cascade lub Pacific blue. Przeanalizuj 10 000 zdarzeń z probówki z próbką do sortowania zawierającej komórki barwione axon two laxy PI i CUG, stosując wszystkie bramki ustawione dla komórek typu dzikiego na podstawie wykresów z komórek typu dzikiego.

Utwórz bramki dla komórek z wysoką fluorescencją Cascade Blue, które stanowią mniej niż 1% całkowitej liczby zdarzeń. Bramki Cascade Blue High powinny teraz zawierać około 15 do 20% komórek w próbce Axon two laxy. Po wyznaczeniu tych komórek Axon two high przy użyciu wykresu analizy komórek Axon two laxy, utwórz bramkę dla najniższej fluorescencji, obejmującą 15 do 20% komórek, stosując wyżej wspomnianą strategię bramkowania.

Posortuj komórki do probówek FACS zawierających pełną pożywkę, utrzymując probówki do zbierania w komorze chłodzonej do 4 °C podczas sortowania. Zapisz liczbę komórek zliczonych przez cytometr przepływowy dla każdej populacji na tych dwóch rycinach. Obszary rozproszenia bocznego (side scatter) w stosunku do obszarów rozproszenia przedniego (forward scatter) dla dysocjowanego typu dzikiego po lewej stronie oraz axon two LA Z po prawej stronie.

Przedstawiono komórki ślimaka. Zwróć uwagę na bramkowanie wyraźnych grup zdarzeń o znacznie większym rozmiarze niż zdarzenia znajdujące się bliżej osi Y, oznaczone jako populacja ujemna pod względem obecności debris. Typowo od 40 do 45% komórek wolnych od debris jest odzyskiwanych zarówno ze ślimaków typu dzikiego, jak i axin two LAX Z w tych dwóch panelach.

Wysokość rozproszenia światła w przód (forward scatter height) w stosunku do powierzchni rozproszenia światła w przód (forward scatter area) jest wykorzystywana do wykluczenia dubletów z wcześniej wygrodzonych zanieczyszczeń. Wyklucza się zdarzenia z populacji negatywnej, które odbiegają od oczekiwanej liniowej charakterystyki wykresu. Taka procedura przygotowawcza zazwyczaj pozwala uzyskać 71,1% zdarzeń w wyznaczonej bramce.

Jodek propidium, wykrywany przez pięciokanałowy system PE SCI, służy do wykluczania martwych komórek, co widoczne jest na tych wykresach rozrzutu. Około 95% sortowanych komórek było żywych i nie pobrały one PI w tych panelach. Kanał Cascade blue został wykorzystany do wykrycia fluorescencyjnego substratu CUG, co przedstawiono na rysunku po prawej stronie.

Średnio około 20% komórek wykazujących pozytywny wynik CUG to komórki z wysokim poziomem lae, co odpowiada około 15 000 komórkom axon, czyli średnio od dwóch do dwunastu komórek o wysokim poziomie na zwierzę. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat przygotowania i izolacji komórek laxy high z tkanek ucha wewnętrznego przy użyciu cytometrii przepływowej, zarówno na potrzeby eksperymentów z Turingiem komórkowym, jak i badań takich jak profilowanie genów.