Izolowanie komórek wykazujących ekspresję LacZ z tkanek ucha wewnętrznego myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wyizolowanie luźnych komórek Z dodatnich ze ślimaka noworodków myszy za pomocą cytometrii przepływowej. Osiąga się to poprzez wyizolowanie dużej liczby ślimaków myszy w stosunkowo krótkim czasie, aby utrzymać komórki przy życiu i mieć odpowiednią tkankę wyjściową. W drugim etapie komórki LAX Z dodatnie są dysocjowane, a następnie znakowane w celu przygotowania tkanki do sortowania.

Komórki są następnie sortowane za pomocą cytometrii przepływowej. Uzyskane w ten sposób populacje LAX Z high i lax low mogą być następnie wykorzystane do dalszych eksperymentów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad uchem, takie jak profile genów lub określone populacje komórek w uchu wewnętrznym.

Procedurę zademonstruje student medycyny Taha Gen A z naszego laboratorium. Najpierw napełnij 35-milimetrowe szalki Petriego HBSS i umieść je na bloku lodu. Następnie, po użyciu nożyczek do tęczówki, aby ściąć głowy 12 do 15, poddanych eutanazji poporodowych, od zera do trzech dni aksonów, dwóch luźnych reporterów i myszy typu dzikiego.

Umieść głowy na 60-milimetrowej szalce Petriego na bloku lodu. Następnie użyj kleszczy Dumonta numer pięć i nożyczek do tęczówki, aby wyciąć żuchwę i język z głów, a następnie przeciąć podstawę czaszki na poziomie palety. Teraz usuń leżącą na powierzchni skórę łydki i przetnij podstawę czaszki, wkładając nożyczki w dolnej części otworu wielkiego do środka podniebienia.

Wykonaj kolejne nacięcie nożyczkami od przyciętej krawędzi podniebienia do górnej części cielęcia po obu stronach. Uważając, aby nie uszkodzić kapsułki uszowej. Następnie zakończ izolację kości skroniowej, wykonując 2 nacięcia pod kątem 45 stopni, zaczynając od górnej części ramy i magnum rozciągając się do cięcia koronalnego na podniebieniu twardym.

Następnie umieść izolowane kości skroniowe na 35-milimetrowych szalkach Petriego zawierających HBSS na bloku lodu i przenieś blok lodu do sterylnego okapu preparacyjnego. Następnie napełnij kolejną 35-milimetrową szalkę Petriego, tym razem PBS i umieść ją na bloku lodu. Za pomocą dwóch kleszczy numer 55.

Rozpocznij mikrodysekcję od delikatnego usunięcia kory, pnia mózgu i móżdżku z kości skroniowej leżącej nad torebką uszną. Następnie, nie usuwając torebki usznej, odłup części torebki ślimakowej, zaczynając od wejścia do przedsionkowego nerwu ślimakowego i kontynuując do torebki usznej. Po odsłonięciu podstawy ślimaka delikatnie wyciągnij narząd Cortiego i otaczające go tkanki.

Następnie, zaczynając od podstawy, usuń wszelkie pozostałe spiralne zwoje i prążki i przenieś ślimak na szalkę Petriego wypełnioną pierwszą pipetą PBS. 50 mikrolitrów sterylnego PBS do środka jednego do dwóch dołków niepowlekanej sześciodołkowej płytki hodowlanej. Następnie przenieś nie więcej niż 20 axin, dwa luźne ślimaki do każdej kropli PBS.

Następnie podgrzej 50 mikrolitrów porcji 0,125% trypsyny przez około dwie minuty w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. A następnie dodaj trypsynę do ślimaka. Uważając, aby nie wstrząsnąć naczyniem.

Inkubuj ślimak w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez osiem minut. Zakończ trypsynizację, dodając 50 mikrolitrów inhibitora trypsyny sojowej do każdej kropli, a następnie dodaj dodatkowe 50 mikrolitrów pełnej pożywki po ustawieniu pipety P 200 na 125 mikrolitrów. Użyj końcówki pipety o pojemności 300 mikrolitrów, aby delikatnie przetarć komórki 80 razy, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków.

Następnie, po roztarciu każdej kropli, dodaj do każdej dodatkowe 200 mikrolitrów pełnej pożywki. Cóż, teraz przepuść komórki przez sitko o wielkości 40 mikronów do nowej studzienki. W tej samej płytce sześciodołkowej, a następnie przenieś komórki z każdej studzienki do indywidualnych standardowych rurek faksowych.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów komórek typu dzikiego do każdej z trzech probówek, a następnie rozcieńcz 300 mikrolitrami pełnej pożywki tylko dla CUG. Kontroluj rozcieńczyć 10 mikrolitrów aksonu, dwie komórki LAX Z w 390 mikrolitrach pełnych pożywek. Przenieś pozostały akson dwóch luźnych komórek Z do lamp faksowych w 400 mikrolitrowych OT.

Następnie, po inkubacji probówek w inkubatorze z wilgotnością 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, dodaj 200 mikrolitrów rozcieńczonego CUG do każdej odpowiedniej rurki faksowej. Następnie, chroniąc wszystkie probówki przed światłem, inkubuj komórki w inkubatorze nawilżanym o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 25 minut. Do barwienia podczas inkubacji komórek umieść 10 mililitrów świeżo przygotowanych pryzm plus FBS w 15-mililitrowej probówce i umieść probówkę na lodzie.

Następnie dodaj 1,8 mililitra lodowatego roztworu do każdej z rurek faksowych pod sterylnym kapturem przy wyłączonym świetle, aby zminimalizować ekspozycję na światło. Następnie odwiruj komórki z prędkością 1200 obr./min przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki w 300 mikrolitrach pełnej pożywki.

Zebrać wszystkie podwielokrotności próbki do sortowania, a następnie dodać jodek propidyny do każdej odpowiedniej probówki do końcowego stężenia jednego mikrograma na mililitr. Na koniec, po przykryciu komórek, ponownie umieść je na lodzie. Skonfiguruj bramki sortowania, najpierw zbierając 1000 zdarzeń niebarwionych komórek typu dzikiego, aby określić rozkład komórek na wykresie punktowym do przodu i po boku.

W razie potrzeby dostosuj parametry rozproszenia do przodu i z boku. Następnie skompensuj to niebarwionym dzikim typem PI, barwionym dzikim typem i barwionym aksonem CUG. Dwie komórki LAX Z.

Napełnij dwie rurki faksowe 500 mikrolitrami pełnego nośnika. Następnie rozpocznij analizę od bramki barwionych dzikimi komórkami PI i aksonów dwóch Lae CUG, aby wykluczyć zanieczyszczenia na podstawie wykresu rozproszenia do przodu i z boku. Wyklucz dublety i kępki, korzystając z wykresu wysokości rozproszenia do przodu w stosunku do obszaru rozproszenia do przodu.

Następnie wyklucz martwe komórki PI dodatnie na podstawie obszaru rozproszenia do przodu w porównaniu z wykresem pięcioobszarowym PE sci. Dla każdego umiejscowienia chodu ustaw wykres obszaru rozproszenia z przodu w porównaniu z obszarem kaskadowym lub niebieskim pacyficznym. Przeanalizuj 10 000 zdarzeń z probówki sortującej zawierającej akson dwóch luźnych komórek barwionych PI i CUG, używając wszystkich bramek ustawionych z komórkami typu dzikiego, używając wykresów z komórek typu dzikiego.

Utwórz bramki dla kaskadowych niebieskich wysokich komórek, które stanowią mniej niż 1% całkowitej liczby zdarzeń. Kaskadowe Niebieskie Wysokie Wrota powinny teraz zawierać około 15 do 20% komórek w drugiej luźnej próbce Axon. Uczynienie tych aksonów dwiema wysokimi komórkami za pomocą wykresu analizy dwóch luźnych komórek Axon tworzy teraz bramę dla najmniejszej grypy, od 15 do 20% komórek przy użyciu wspomnianej strategii bramkowania.

Posortuj komórki do tub faksowych zawierających pełne nośniki, utrzymując probówki zbiorcze w komorze schłodzonej do czterech stopni Celsjusza podczas sortowania. Zapisz liczbę komórek zliczonych przez cytometr przepływowy dla każdej populacji na tych dwóch liczbach. Boczne obszary rozproszenia kontra przednie obszary rozproszenia zdysocjowanego typu wild po lewej stronie i aksonu dwa LA Z po prawej.

Pokazane są komórki ślimaka. Zwróćmy uwagę na bramkowanie odrębnych grup zdarzeń o znacznie większym rozmiarze niż te zdarzenia znajdujące się bliżej osi Y, oznaczone jako populacja ujemna szczątków. Zazwyczaj w tych dwóch panelach pobiera się od 40 do 45% komórek wolnych od zanieczyszczeń zarówno ze ślimaka LAX Z typu dzikiego, jak i axin two LAX

Wysokość rozproszenia z przodu w stosunku do obszaru rozproszenia do przodu służy do wykluczenia dubletów z poprzednio bramkowanych szczątków. Wyklucza się ujemne zdarzenia populacyjne odbiegające od oczekiwanego liniowego charakteru powierzchni. To przygotowanie zwykle daje 71,1% zdarzeń w wyznaczonej bramie. Tu.

Jodek propidyny, wykryty przez pięć kanałów PE SCI, służy do wykluczenia martwych komórek, jak zaobserwowano na tych wykresach rozrzutu. Około 95% posortowanych komórek było żywotnych i nie przyjmowało PI PI w tych panelach. Niebieski kanał kaskadowy został użyty do wykrycia substratu fluorescencyjnego CUG, jak widać na rysunku po prawej.

Średnio około 20% komórek CUG dodatnich to wysokie komórki lae, które korelują z około 15 000 aksonów, dwie wysokie komórki na 10 do 12 zwierząt. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować i wyizolować wiotkie komórki o wysokim poziomie za pomocą cytometrii przepływowej z tkanek ucha wewnętrznego zarówno do eksperymentów Turinga w komórkach, jak i eksperymentów, takich jak profilowanie genów.