Name: Badania przesiewowe RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj metodę RNAi do identyfikacji regulatorów ekspresji białek postembrionalnych u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych białek i mikroskopii fluorescencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować dr. Rickowi Padgetowi (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) za przekazanie cDNA dbl-1 oraz dr. Christopherowi Rongo (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) za marker do iniekcji. Laboratorium dr. Bartha Granta przeprowadziło bombardowanie za pomocą armatki genowej w celu integracji konstrukcji dbl-1 z tagiem gfp w niskiej liczbie kopii. Laboratorium René Garcii udzieliło pomocy technicznej podczas tworzenia texIs100. Laboratoria René Garcii, Robyn Lints oraz Hongmina Qina zapewniły merytoryczne wsparcie. Praca ta była finansowana z funduszy startowych Departamentu Medycyny Molekularnej i Komórkowej TAMHSC. Mikroskop konfokalny z systemem Compound Scope i dyskiem spinning disk został zakupiony ze środków zapewnionych przez departament oraz Biuro Dziekana TAMHSC College of Medicine.

<ol><li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+small+animal+models%2C+where+are+we%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li>
<li>Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+approaches+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional genomic approaches in C. elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).</li>
<li>Boutros, M., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: RNA interference.</a> Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimethylpsoralen+induces+small+deletion+mutations+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).</li>
<li>Frokjaer-Jensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).</li>
<li>Giordano-Santini, R., Dupuy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectable+genetic+markers+for+nematode+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">Selectable genetic markers for nematode transgenesis.</a> Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833(2008).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li>
<li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+enhanced+RNAi+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants.</a> Genetics. , (2011).</li>
<li>Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Caenorhabditis+elegans+genes+regulating+longevity+using+enhanced+RNAi-sensitive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).</li>
<li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li>
<li>Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li>
<li>Kamath, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
<li>Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+bli-4+%28I%29+locus+of+Caenorhabditis+elegans+disrupt+both+adult+cuticle+and+early+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development.</a> Genetics. , 129-195 (1991).</li>
<li>Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bli-4+locus+of+Caenorhabditis+elegans+encodes+structurally+distinct+kex2%2Fsubtilisin-like+endoproteases+essential+for+early+development+and+adult+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology.</a> Genes & Development. 9, 956-971 (1995).</li>
<li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+I.+Wild-type+growth+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction.</a> Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFbeta+pathway+components%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li>
<li>Qu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+analysis+of+the+Ahringer+Caenorhabditis+elegans+RNAi+feeding+library%3A+a+guide+for+genome-wide+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens.</a> BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).</li>
<li>Nelson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bow-Tie+Genetic+Architecture+for+Morphogenesis+Suggested+by+a+Genome-Wide+RNAi+Screen+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, e1002010(2011).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854(1998).</li>
<li>Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+mutant+allele+identification+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 865-867 (2008).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Przedstawiona tutaj metoda przesiewowa RNAi umożliwia czułą i szybką analizę produktów genów wymaganych do prawidłowego (lub transgenicznego) fenotypu postembrionalnego. Przedstawionym przykładem jest przesiewanie genów zaangażowanych w lokalizację subkomórkową białka znakowanego fluorescencyjnie. Protokół ten można jednak zmodyfikować w celu zidentyfikowania genów wpływających na inne interesujące badacza fenotypy postembrionalne.
Metoda ta wykorzystuje podejście oparte na genach kandydatach ...

<table><tbody><tr><td>Agar NGM</td><td>Pożywka do wzrostu nicieni</td><td>IPM Scientific, Inc</td><td>Można przygotować zgodnie z protokołem dla agaru NGM&lt;sup&gt;25&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Pożywka M9 </td><td></td><td></td><td>22mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, &lt;br/&gt; 42mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, &lt;br/&gt; 86mM NaCl, &lt;br/&gt; 1 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Agar-agar</td><td>EMD Millipore</td><td>1.01614.1000</td><td>2% w wodzie dla płytek NGM. 4% w wodzie dla podkładek na szkiełka przedmiotowe (najpierw autoklawować, następnie rozpuścić w mikrofalówce).</td></tr><tr><td>Pepton Bacto</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td>0,25%</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Research Products International Corp.</td><td>I56000-5.0</td><td>stężenie końcowe 1 mM</td></tr><tr><td>karbenycylina</td><td>Research Products International Corp.</td><td>C46000-5.0</td><td>roztwór roboczy 50 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>Bulion LB Lennox</td><td>BD Biosciences</td><td>240230</td><td>20 g/litr</td></tr><tr><td>tetracyklina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>268054</td><td>roztwór roboczy 12,5 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>podchloryn sodu</td><td>Dowolny dostawca</td><td>5% wybielacz domowy</td><td>Używać świeżego wybielacza.</td></tr><tr><td>wodorotlenek sodu</td><td>Dowolny dostawca</td><td>CAS 1310-73-2</td><td>stok 5 N</td></tr><tr><td>pożywka M9</td><td>Wormlab Recipe Book</td><td>&lt;a href=&quot;http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab">http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab&lt;/a&gt;</td><td>&lt;sup&gt;26&lt;/sup&gt; </td></tr><tr><td>lewamizol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31742</td><td>roztwór roboczy 100 &amp;#x03BC;M - 1 mM</td></tr><tr><td>azydku sodu </td><td>Fisher Scientific</td><td>S227</td><td>roztwór roboczy 10 mM w M9</td></tr><tr><td>płytka 24-dołkowa</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>dystrybutor VWR</td></tr><tr><td>szkiełka przedmiotowe</td><td>Dowolny dostawca</td><td>75 x 25 x 1 mm</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka zakrywkowe</td><td>Dowolny dostawca</td><td>22 x 22 mm nr 1,5</td><td>Stosować grubość zalecaną przez producenta mikroskopu.</td></tr><tr><td>mikroskop złożony</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>A1m</td><td>Stosować obiektywy i filtry dostosowane do potrzeb eksperymentu.</td></tr><tr><td>pompa do mediów</td><td>Pompa perystaltyczna Manostat</td><td>Kate model #72-620-000</td><td>Stosować dreny i ustawienia odpowiednie dla urządzenia</td></tr></tbody></table>

przesiewanie rnai w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u c. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans okazał się wartościowym systemem modelowym w odkrywaniu i charakteryzacji funkcjonalnej wielu genów i szlaków genetycznych1. Bardziej zaawansowane narzędzia i zasoby do badań w tym systemie ułatwiają dalsze odkrywanie genów o bardziej subtelnych fenotypach lub rolach.
W niniejszej pracy przedstawiamy uogólniony protokół, który zaadaptowaliśmy do identyfikacji genów C. elegans wykazujących interesujące fenotypy pozazarodkowe przy użyciu RNAi2. Procedurę tę można łatwo zmodyfikować w celu analizy wybranego fenotypu, niezależnie od tego, czy wykorzystuje się optykę świetlną, czy fluorescencyjną w mikroskopie stereoskopowym lub złożonym. Niniejszy protokół przesiewowy wykorzystuje cechy fizyczne organizmu oraz narzędzia molekularne opracowane przez społeczność badawczą C. elegans. Jako przykład demonstrujemy zastosowanie zintegrowanego transgenu wykazującego produkt fluorescencyjny w badaniu przesiewowym RNAi w celu zidentyfikowania genów niezbędnych do prawidłowej lokalizacji tego produktu w późnych stadiach larwalnych oraz u osobników dorosłych. Po pierwsze, wykorzystaliśmy dostępną komercyjnie bibliotekę RNAi genomowego z pełnowymiarowymi insertami cDNA. Biblioteka ta ułatwia szybką identyfikację wielu kandydatów poprzez redukcję produktu kandydującego genu za pomocą RNAi. Po drugie, stworzyliśmy zintegrowany transgen wykazujący nasze białko z markerem fluorescencyjnym w tle wrażliwym na RNAi. Po trzecie, dzięki narażeniu wyklutych zwierząt na RNAi, badanie to pozwala na identyfikację produktów genów o kluczowej roli zarodkowej, która w przeciwnym razie maskowałaby rolę pozazarodkową w regulacji badanego białka. Na koniec, w badaniu przesiewowym wykorzystano mikroskop złożony z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

*C. elegans* okazał się wartościowym systemem modelowym dla odkrywania i charakteryzacji funkcjonalnej wielu genów oraz szlaków genowych1. Bardziej zaawansowane...

Celem tej procedury jest zidentyfikowanie porembryonalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek u C. elegans przy użyciu genomowego przesiewu opartego na RNAi oraz białek znakowanych fluorescencyjnie. Po skonstruowaniu odpowiedniego szczepu do przesiewu wybierana jest biblioteka RNAi. Pierwszym krokiem procedury jest wprowadzenie klonów z biblioteki do bakterii.Następnie bakterie są selekcjonowane, namnażane i podawane jako pokarm dla nicieni *C. elegans* na określonym etapie rozwoju. Po 72 godzinach wzrostu nicieni obserwuje się pod kątem zmian w badanym fenotypie. Ostatecznie zmiany w ekspresji lub lokalizacji wewnątrzkomórkowej badanego białka są wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Metoda ta pozwala zidentyfikować geny niezbędne do prawidłowej lokalizacji wewnątrzkomórkowej białka znakowanego fluorescencyjnie. Protokół ten można jednak zmodyfikować w celu identyfikacji genów wpływających na inne interesujące fenotypy poembrionalne. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi opublikowanymi protokołami jest to, że zoptymalizowaliśmy spójność i poziom odpowiedzi RNAi u zwierząt poprzez indukcję produkcji dwuniciowego RNA w bakteriach przed wysiewaniem.Procedurę zaprezentuje Kathy Fuss, pracownik naukowy z mojego laboratorium. W ciągu dwóch miesięcy od rozpoczęcia eksperymentu należy przygotować bibliotekę klonów; w pierwszej kolejności należy wykonać posiew bakterii z wybranych klonów biblioteki żerowania oraz kontroli dodatniej i ujemnej na płytkach LB z tetracykliną. Jako kontrolę dodatnią należy zastosować klon zawierający gen wywołujący fenotyp poembrionalny zależny od dawki, taki jak BLE four. Jako kontrolę ujemną należy zastosować pusty wektor lub klon zawierający przewidywany pseudogen, w przypadku którego nie zaobserwowano żadnych fenotypów.Inkubuj płytki przez noc. Dla każdego klona zaszczep 2 mL pożywki LB zawierającej 50 µg/mL kwasu karbonowego, używając pojedynczej kolonii z płytek z posiewem kreskowym. Inkubuj kultury przez noc w warunkach wytrząsania. Następnego ranka, gdy roztwory powinny stać się mętne, indukuj produkcję dwuniciowego RNA poprzez dodanie IPTG do kultur i inkubuj je przez dodatkowe cztery do pięciu godzin w tych samych warunkach.Dodanie IPTG zapewnia bardziej spójne i silne wyciszenie produktu genu indukowane przez RNAi niż poleganie wyłącznie na IPTG i powierzchni płytki NGM. Po inkubacji z IPTG nanieś 30 µl kultury z każdego klonu do poszczególnych studni przygotowanych 24-studziennych płytek NGM do RNAi. Jeden klon na studnię. Każda płytka powinna posiadać dwie studnie przeznaczone dla kontroli.Dokładnie zaznacz lokalizację każdej biblioteki. Po sklonowaniu na płytki 24-dołkowe umieść płytki bez przykrycia w sterylnym komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby wyschły przez około 20 minut. Nie dopuść do oddzielenia się brzegów agaru od ścianek płytki.Po wysuszeniu i przeniesieniu nicieni w określonym stadium rozwoju na płytki, podano instrukcje dotyczące przygotowania nicieni. W następnej sekcji należy rozpocząć od populacji nicieni w pierwszym stadium larwalnym lub L1. Rozpoczęcie pracy od larw L1 pozwala uniknąć potencjalnych fenotypów letalnych w stadium embrionalnym.Posiadanie populacji zwierząt o określonych etapach rozwoju do przesiewania zwiększa również pewność, że wszelkie zaobserwowane różnice wynikają z RNAi, a nie są po prostu naturalnymi różnicami występującymi na różnych etapach. Należy jednak odnotować, jeśli RNAi powoduje opóźnienie rozwoju. Populacja szczepu przesiewowego o mieszanych etapach rozwoju poddana wybielaniu.Tylko embriony chronione skorupką jaja przeżyją ten etap; zwierzęta osiągną odpowiednie stadium w ciągu 12 godzin, jeśli procedura zostanie przeprowadzona w 20 °C, lub w ciągu 18 godzin, jeśli zostanie przeprowadzona w 16 °C w dniu inokulacji kultur bakteryjnych. Wybierz trzy płytki 100 mm z osobnikami szczepu przesiewowego, które są zdrowe i zawierają zarówno ciężarne osobniki dorosłe, jak i embriony.Przepłucz wszystkie zwierzęta w sterylnym medium M9 i przelej płuczkę do sterylnej probówki o pojemności 15 ml z nakrętką. Jeśli objętość płuczki przekracza 3,5 ml, odwiruj zwierzęta i usuń nadmiar cieczy, pozostawiając 3,5 ml. Jeśli objętość jest mniejsza niż 3,5 ml.Zwiększyć objętość do 3,5 mililitrów wodą lub M9, aby uwolnić embriony od osobników dorosłych, dodając do każdego przemycia 1,5 mililitra mieszaniny wodorotlenku sodu i wybielacza. Inkubować zwierzęta w tym roztworze nie dłużej niż 10 minut. Po uruchomieniu stoperem każdy probówkę wierzchać w vortexu przez 10 sekund i powtarzać wierzchanie co dwie minuty.Po każdym mieszaniu na wortexie należy sprawdzić roztwór pod stereomikroskopem w celu oceny stopnia rozpadu organizmów. W ciągu sześciu do ośmiu minut osobniki dorosłe zostaną pofragmentowane, a embriony powinny zostać uwolnione. Należy oddzielić embriony od roztworu wybielacza poprzez ich odwirowanie i usunięcie jak największej ilości supernatantu, uważając, aby nie naruszyć osadu.Następnie resuspenduj osad w objętości 10 mililitrów, dodając sterylne M9 i stosując mieszanie. Powtórz ten proces płukania co najmniej raz jeszcze, aż zapach wybielacza stanie się całkowicie niewykrywalny. Aby dokładniej zsynchronizować stadia rozwoju zwierząt, zatrzymaj je w stadium L1, inkubując embriony w medium M9 bez pożywki.Jest to realizowane poprzez przeniesienie embrionów w pożywce M9 do małej kolby Erlenmeyera. Kolbę należy inkubować z wytrząsaniem przez noc w temperaturze odpowiedniej dla danego szczepu i eksperymentu. W tym czasie zwierzęta wyklują się i następnego dnia zatrzymają w diapauzie L1.Wznowij wzrost larw z określonego punktu czasowego, przenosząc je na przygotowane bakterie wykazujące ekspresję dwuniciowego RNA. Jest to ten sam dzień, w którym na płytki 24-dołkowe naniesiono bakterie. Rozpocznij od przeniesienia zwierząt w stadium L1 do probówki o pojemności 15 ml i ich odwirowania. Następnie skoncentruj zwierzęta w 0,5–1 ml medium M9 i nanieś 5 µL skoncentrowanych nicieni na płytkę.Policz liczbę zwierząt na płytce i dostosuj stężenie roztworu nicieni. Tytułowana liczba to 30 osobników na każde od 3 do 10 µL. Na koniec nanieś około 30 osobników w stadium L1 na bakterie w każdej studzience przygotowanej płytki.W płytce 24-dołkowej liczba zwierząt przekraczająca 30 na dołek może prowadzić do głodowania. Po wyschnięciu plamek, co zajmie kilka minut, zabezpiecz pokrywkę gumką receptorką. Inkubuj zwierzęta w pozycji odwróconej w wymaganej temperaturze i czasie, aby uzyskać zwierzęta na pożądanym etapie rozwoju. Gdy nicienie będą gotowe do przesiewu, potwierdź, że kontrole pozytywna i negatywna wykazują oczekiwane fenotypy. Następnie obserwuj zwierzęta eksperymentalne pod kątem nieprawidłowości rozwojowych.Następnie, korzystając z mikroskopu stereoskopowego, przymocuj od 8 do 12 osobników z każdej studni do szkiełek Agri PET 4% za pomocą pięciomikrolitrowej kropli środka anestetycznego. Po nałożeniu odpowiedniego szkiełka nakrywkowego, przeprowadź obserwacje co najmniej pięciu osobników przy użyciu mikroskopu świetlnego. Prowadź uporządkowaną bazę danych zawierającą gen, liczbę zaobserwowanych osobników oraz wyniki fenotypowe.W każdym eksperymencie RNAi należy zweryfikować fenotyp uzyskany w wyniku RNAi za pomocą innego fenotypu wtórnego, jeśli jest to możliwe, a także poprzez powtórzenie eksperymentu; w powtórzeniach można wykorzystać bakterie z tej samej passy. Starsze passy mogą prowadzić do słabego wzrostu w nocnych kulturach płynnych i powinny zostać najpierw ponownie rozrysowane. Niektóre kultury bakteryjne mogą nie rosnąć prawidłowo ze względu na produkt genu ekspresowany w ich plazmidzie.W takim przypadku należy po prostu skoncentrować bakterie przed wysianiem na płytki. W przypadku prowadzenia ciągłego przesiewu ważne jest, aby zawsze mieć przygotowaną wystarczającą liczbę embrionów do wyznaczenia stadium rozwoju. Szczep przesiewowy powinien być zawsze karmiony, a nie głodzony, oraz wolny od zanieczyszczeń, które mogłyby wpłynąć na badany fenotyp.Ustaliliśmy harmonogram karmienia zwierząt w celu ich utrzymania. Geny wpływające na lokalizację DBL one zidentyfikowano za pomocą RNAi, wykorzystując szczep zaprojektowany na potrzeby tego przesiewu. Prawidłowa ekspresja znacznika GFP dbl one obejmuje ciała komórek brzusznego sznura nerwowego oraz rząd punktów u zwierząt karmionych antysensownym RA przeciwko DBL.Jeden z mRNA wykazał silnie osłabioną ekspresję DBL one. Zwierzęta te były również małe, podobnie jak osobniki pozbawione funkcjonalnego DBL L one. Przesiew RNA I pozwolił na skuteczną identyfikację wielu innych genów, których produkty wpływają na lokalizację DBL one, rozszerzając tym samym naszą wiedzę na temat transportu wewnątrzkomórkowego TGF beta i stanowiąc punkt wyjścia dla wielu dalszych badań.Stosując tę metodę, jedna osoba może w rozsądny sposób przygotować i obserwować od dwóch do czterech serii eksperymentów w każdym tygodniu. Na przykład zwierzęta poddane procedurze w poniedziałek i wtorek mogą być obserwowane odpowiednio w czwartek i piątek, a następnie zwierzęta mogą być ponownie przygotowane w piątek i sobotę na poniedziałek i wtorek. Obserwacja podczas przeprowadzania całej procedury przesiewowej.Ważne jest, aby zapewnić stałą dostępność embrionów do wyznaczania stadium rozwoju, dlatego należy regularnie utrzymywać linię przesiewową. Ponadto istotne jest sporządzanie szczegółowych notatek ze wszystkich obserwacji.

rnai-screening-to-identify-postembryonic-phenotypes-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie RNAi w celu zidentyfikowania fenotypów po zarodkowych u C. elegans

Neureksyny i neuroliginy są białkami adhezyjnymi błony neuronów, które pełnią kluczowe role w różnicowaniu i transmisji synaptycznej. Mutanty C. elegans z niedoborem neuroliginy wykazują defekt w wykrywaniu siły osmotycznej, jednak gdy posiadają one również mutację w genie kodującym neureksynę, odzyskują fenotyp typu dzikiego.

Unikanie osmotyczne u Caenorhabditis elegans: funkcja synaptyczna dwóch genów, ortologów ludzkich genów NRXN1 i NLGN1, jako kandydatów w badaniach nad autyzmem

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Opisujemy protokół z wykorzystaniem C. elegans oraz bibliotek RNAi dostarczanych drogą pokarmową, który umożliwia zautomatyzowany pomiar wielu parametrów, takich jak fluorescencja, rozmiar i nieprzezroczystość poszczególnych nicieni w populacji. Przedstawiamy przykład screeningu służącego do identyfikacji genów zaangażowanych w wrodzoną odporność przeciwgrzybiczą u C. elegans.

Ilościowe i zautomatyzowane wysokoprzepustowe przesiewy RNAi w całym genomie u C. elegans

Prezentujemy sposób wykorzystania techniki karmienia RNAi do wyciszania genów docelowych oraz oceny fenotypu wielkości ciała u C. elegans. Metoda ta może zostać zastosowana w szeroko zakrojonych badaniach przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnych, interesujących komponentów genetycznych, takich jak te zaangażowane w regulację wielkości ciała poprzez sygnalizację DBL-1/TGF-β.

Wykorzystanie strategii karmienia w celu indukowania interferencji RNA do przesiewowej analizy genów zaangażowanych w regulację wielkości ciała u nicienia C. elegans

Podczas gdy karmienie dsRNA u C. elegans jest potężnym narzędziem do oceny funkcji genów, obecne protokoły dla dużych ekranów żywieniowych skutkują zmienną skutecznością eliminacji. Opisujemy ulepszony protokół wykonywania badań przesiewowych karmienia RNAi na dużą skalę, który skutkuje wysoce skutecznym i powtarzalnym obniżeniem ekspresji genów.

Wielkoskalowy knockdown genów u C. elegans przy użyciu bibliotek zasilających dsRNA do generowania odpornych fenotypów utraty funkcji

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Ten protokół opisuje, jak badać procesy komórkowe podczas przekształcania losu komórki u Caenorhabditis elegans in vivo. Wykorzystując transgeniczne zwierzęta, można zaobserwować in vivo nadekspresję czynnika transkrypcyjnego CHE-1 indukującego los neuronu pod wpływem promotora szoku cieplnego i pośredniczące w RNAi wyczerpanie komórki rozrodczej czynnika regulującego chromatynę LIN-53 do przeprogramowania neuronów.<br...

Zastosowanie RNAi i ekspresji czynnika transkrypcyjnego wywołanej szokiem cieplnym do przeprogramowania komórek rozrodczych na neurony u C. elegans

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Aby zbadać interakcje chaperon-chaperon i chaperon-substrate, przeprowadzamy syntetyczne badania przesiewowe interakcji w Caenorhabditis elegans za pomocą interferencji RNA w połączeniu z łagodnymi mutacjami lub nadmierną ekspresją białek opiekuńczych i monitorujemy dysfunkcję białek specyficznych dla tkanek na poziomie organizmu.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badań przesiewowych pod kątem interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanek

W tym filmie zaprezentowano technikę mikroiniekcji do gonady C. elegans w celu stworzenia zwierząt transgenicznych.

Generowanie stabilnych transgenicznych *C. elegans* metodą mikrowstrzykiwania

Poznaj metodę RNAi do identyfikacji regulatorów ekspresji białek postembrionalnych u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych białek i mikroskopii fluorescencyjnej.

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Przeglądaj więcej filmów