Name: Badania przesiewowe RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj metodę RNAi do identyfikacji regulatorów ekspresji białek postembrionalnych u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych białek i mikroskopii fluorescencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować dr. Rickowi Padgetowi (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) za przekazanie cDNA dbl-1 oraz dr. Christopherowi Rongo (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) za marker do iniekcji. Laboratorium dr. Bartha Granta przeprowadziło bombardowanie za pomocą armatki genowej w celu integracji konstrukcji dbl-1 z tagiem gfp w niskiej liczbie kopii. Laboratorium René Garcii udzieliło pomocy technicznej podczas tworzenia texIs100. Laboratoria René Garcii, Robyn Lints oraz Hongmina Qina zapewniły merytoryczne wsparcie. Praca ta była finansowana z funduszy startowych Departamentu Medycyny Molekularnej i Komórkowej TAMHSC. Mikroskop konfokalny z systemem Compound Scope i dyskiem spinning disk został zakupiony ze środków zapewnionych przez departament oraz Biuro Dziekana TAMHSC College of Medicine.

<ol><li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+small+animal+models%2C+where+are+we%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li>
<li>Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+approaches+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional genomic approaches in C. elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).</li>
<li>Boutros, M., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: RNA interference.</a> Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimethylpsoralen+induces+small+deletion+mutations+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).</li>
<li>Frokjaer-Jensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).</li>
<li>Giordano-Santini, R., Dupuy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectable+genetic+markers+for+nematode+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">Selectable genetic markers for nematode transgenesis.</a> Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833(2008).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li>
<li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+enhanced+RNAi+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants.</a> Genetics. , (2011).</li>
<li>Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Caenorhabditis+elegans+genes+regulating+longevity+using+enhanced+RNAi-sensitive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).</li>
<li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li>
<li>Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li>
<li>Kamath, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
<li>Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+bli-4+%28I%29+locus+of+Caenorhabditis+elegans+disrupt+both+adult+cuticle+and+early+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development.</a> Genetics. , 129-195 (1991).</li>
<li>Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bli-4+locus+of+Caenorhabditis+elegans+encodes+structurally+distinct+kex2%2Fsubtilisin-like+endoproteases+essential+for+early+development+and+adult+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology.</a> Genes & Development. 9, 956-971 (1995).</li>
<li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+I.+Wild-type+growth+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction.</a> Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFbeta+pathway+components%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li>
<li>Qu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+analysis+of+the+Ahringer+Caenorhabditis+elegans+RNAi+feeding+library%3A+a+guide+for+genome-wide+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens.</a> BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).</li>
<li>Nelson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bow-Tie+Genetic+Architecture+for+Morphogenesis+Suggested+by+a+Genome-Wide+RNAi+Screen+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, e1002010(2011).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854(1998).</li>
<li>Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+mutant+allele+identification+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 865-867 (2008).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Przedstawiona tutaj metoda przesiewowa RNAi umożliwia czułą i szybką analizę produktów genów wymaganych do prawidłowego (lub transgenicznego) fenotypu postembrionalnego. Przedstawionym przykładem jest przesiewanie genów zaangażowanych w lokalizację subkomórkową białka znakowanego fluorescencyjnie. Protokół ten można jednak zmodyfikować w celu zidentyfikowania genów wpływających na inne interesujące badacza fenotypy postembrionalne.
Metoda ta wykorzystuje podejście oparte na genach kandydatach ...

<table><tbody><tr><td>Agar NGM</td><td>Pożywka do wzrostu nicieni</td><td>IPM Scientific, Inc</td><td>Można przygotować zgodnie z protokołem dla agaru NGM&lt;sup&gt;25&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Pożywka M9 </td><td></td><td></td><td>22mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, &lt;br/&gt; 42mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, &lt;br/&gt; 86mM NaCl, &lt;br/&gt; 1 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Agar-agar</td><td>EMD Millipore</td><td>1.01614.1000</td><td>2% w wodzie dla płytek NGM. 4% w wodzie dla podkładek na szkiełka przedmiotowe (najpierw autoklawować, następnie rozpuścić w mikrofalówce).</td></tr><tr><td>Pepton Bacto</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td>0,25%</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Research Products International Corp.</td><td>I56000-5.0</td><td>stężenie końcowe 1 mM</td></tr><tr><td>karbenycylina</td><td>Research Products International Corp.</td><td>C46000-5.0</td><td>roztwór roboczy 50 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>Bulion LB Lennox</td><td>BD Biosciences</td><td>240230</td><td>20 g/litr</td></tr><tr><td>tetracyklina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>268054</td><td>roztwór roboczy 12,5 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>podchloryn sodu</td><td>Dowolny dostawca</td><td>5% wybielacz domowy</td><td>Używać świeżego wybielacza.</td></tr><tr><td>wodorotlenek sodu</td><td>Dowolny dostawca</td><td>CAS 1310-73-2</td><td>stok 5 N</td></tr><tr><td>pożywka M9</td><td>Wormlab Recipe Book</td><td>&lt;a href=&quot;http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab">http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab&lt;/a&gt;</td><td>&lt;sup&gt;26&lt;/sup&gt; </td></tr><tr><td>lewamizol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31742</td><td>roztwór roboczy 100 &amp;#x03BC;M - 1 mM</td></tr><tr><td>azydku sodu </td><td>Fisher Scientific</td><td>S227</td><td>roztwór roboczy 10 mM w M9</td></tr><tr><td>płytka 24-dołkowa</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>dystrybutor VWR</td></tr><tr><td>szkiełka przedmiotowe</td><td>Dowolny dostawca</td><td>75 x 25 x 1 mm</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka zakrywkowe</td><td>Dowolny dostawca</td><td>22 x 22 mm nr 1,5</td><td>Stosować grubość zalecaną przez producenta mikroskopu.</td></tr><tr><td>mikroskop złożony</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>A1m</td><td>Stosować obiektywy i filtry dostosowane do potrzeb eksperymentu.</td></tr><tr><td>pompa do mediów</td><td>Pompa perystaltyczna Manostat</td><td>Kate model #72-620-000</td><td>Stosować dreny i ustawienia odpowiednie dla urządzenia</td></tr></tbody></table>

przesiewanie rnai w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u c. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans okazał się wartościowym systemem modelowym w odkrywaniu i charakteryzacji funkcjonalnej wielu genów i szlaków genetycznych1. Bardziej zaawansowane narzędzia i zasoby do badań w tym systemie ułatwiają dalsze odkrywanie genów o bardziej subtelnych fenotypach lub rolach.
W niniejszej pracy przedstawiamy uogólniony protokół, który zaadaptowaliśmy do identyfikacji genów C. elegans wykazujących interesujące fenotypy pozazarodkowe przy użyciu RNAi2. Procedurę tę można łatwo zmodyfikować w celu analizy wybranego fenotypu, niezależnie od tego, czy wykorzystuje się optykę świetlną, czy fluorescencyjną w mikroskopie stereoskopowym lub złożonym. Niniejszy protokół przesiewowy wykorzystuje cechy fizyczne organizmu oraz narzędzia molekularne opracowane przez społeczność badawczą C. elegans. Jako przykład demonstrujemy zastosowanie zintegrowanego transgenu wykazującego produkt fluorescencyjny w badaniu przesiewowym RNAi w celu zidentyfikowania genów niezbędnych do prawidłowej lokalizacji tego produktu w późnych stadiach larwalnych oraz u osobników dorosłych. Po pierwsze, wykorzystaliśmy dostępną komercyjnie bibliotekę RNAi genomowego z pełnowymiarowymi insertami cDNA. Biblioteka ta ułatwia szybką identyfikację wielu kandydatów poprzez redukcję produktu kandydującego genu za pomocą RNAi. Po drugie, stworzyliśmy zintegrowany transgen wykazujący nasze białko z markerem fluorescencyjnym w tle wrażliwym na RNAi. Po trzecie, dzięki narażeniu wyklutych zwierząt na RNAi, badanie to pozwala na identyfikację produktów genów o kluczowej roli zarodkowej, która w przeciwnym razie maskowałaby rolę pozazarodkową w regulacji badanego białka. Na koniec, w badaniu przesiewowym wykorzystano mikroskop złożony z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

*C. elegans* okazał się wartościowym systemem modelowym dla odkrywania i charakteryzacji funkcjonalnej wielu genów oraz szlaków genowych1. Bardziej zaawansowane...

Celem tej procedury jest zidentyfikowanie porembryonalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek u C. elegans przy użyciu genomowego przesiewu opartego na RNAi oraz białek znakowanych fluorescencyjnie. Po skonstruowaniu odpowiedniego szczepu do przesiewu wybierana jest biblioteka RNAi. Pierwszym krokiem procedury jest wprowadzenie klonów z biblioteki do bakterii.Następnie bakterie są selekcjonowane, namnażane i podawane jako pokarm dla nicieni *C. elegans* na określonym etapie rozwoju. Po 72 godzinach wzrostu nicieni obserwuje się pod kątem zmian w badanym fenotypie. Ostatecznie zmiany w ekspresji lub lokalizacji wewnątrzkomórkowej badanego białka są wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Metoda ta pozwala zidentyfikować geny niezbędne do prawidłowej lokalizacji wewnątrzkomórkowej białka znakowanego fluorescencyjnie. Protokół ten można jednak zmodyfikować w celu identyfikacji genów wpływających na inne interesujące fenotypy poembrionalne. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi opublikowanymi protokołami jest to, że zoptymalizowaliśmy spójność i poziom odpowiedzi RNAi u zwierząt poprzez indukcję produkcji dwuniciowego RNA w bakteriach przed wysiewa

rnai-screening-to-identify-postembryonic-phenotypes-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie RNAi w celu zidentyfikowania fenotypów po zarodkowych u C. elegans

Neureksyny i neuroliginy są białkami adhezyjnymi błony neuronów, które pełnią kluczowe role w różnicowaniu i transmisji synaptycznej. Mutanty C. elegans z niedoborem neuroliginy wykazują defekt w wykrywaniu siły osmotycznej, jednak gdy posiadają one również mutację w genie kodującym neureksynę, odzyskują fenotyp typu dzikiego.

Unikanie osmotyczne u Caenorhabditis elegans: funkcja synaptyczna dwóch genów, ortologów ludzkich genów NRXN1 i NLGN1, jako kandydatów w badaniach nad autyzmem

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Opisujemy protokół z wykorzystaniem C. elegans oraz bibliotek RNAi dostarczanych drogą pokarmową, który umożliwia zautomatyzowany pomiar wielu parametrów, takich jak fluorescencja, rozmiar i nieprzezroczystość poszczególnych nicieni w populacji. Przedstawiamy przykład screeningu służącego do identyfikacji genów zaangażowanych w wrodzoną odporność przeciwgrzybiczą u C. elegans.

Ilościowe i zautomatyzowane wysokoprzepustowe przesiewy RNAi w całym genomie u C. elegans

Prezentujemy sposób wykorzystania techniki karmienia RNAi do wyciszania genów docelowych oraz oceny fenotypu wielkości ciała u C. elegans. Metoda ta może zostać zastosowana w szeroko zakrojonych badaniach przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnych, interesujących komponentów genetycznych, takich jak te zaangażowane w regulację wielkości ciała poprzez sygnalizację DBL-1/TGF-β.

Wykorzystanie strategii karmienia w celu indukowania interferencji RNA do przesiewowej analizy genów zaangażowanych w regulację wielkości ciała u nicienia C. elegans

Podczas gdy karmienie dsRNA u C. elegans jest potężnym narzędziem do oceny funkcji genów, obecne protokoły dla dużych ekranów żywieniowych skutkują zmienną skutecznością eliminacji. Opisujemy ulepszony protokół wykonywania badań przesiewowych karmienia RNAi na dużą skalę, który skutkuje wysoce skutecznym i powtarzalnym obniżeniem ekspresji genów.

Wielkoskalowy knockdown genów u C. elegans przy użyciu bibliotek zasilających dsRNA do generowania odpornych fenotypów utraty funkcji

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Aby zbadać interakcje chaperon-chaperon i chaperon-substrate, przeprowadzamy syntetyczne badania przesiewowe interakcji w Caenorhabditis elegans za pomocą interferencji RNA w połączeniu z łagodnymi mutacjami lub nadmierną ekspresją białek opiekuńczych i monitorujemy dysfunkcję białek specyficznych dla tkanek na poziomie organizmu.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badań przesiewowych pod kątem interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanek

Genetycznie podatny na uszkodzenia nicień Caenorhabditis elegans może być używany jako prosty i tani model do odkrywania leków. Opisano tutaj protokół identyfikacji leków przeciwnowotworowych, które hamują dalszą sygnalizację białek RAS i EGFR.

Identyfikacja inhibitorów EGFR i RAS za pomocą Caenorhabditis elegans

Ten protokół zapewnia prostą, niedrogą procedurę ilościowego określania wskaźnika śmiertelności zarodkowej u Caenorhabditis elegans. Umożliwia bezpośrednie wykrywanie zaburzeń zarodkowych w populacjach bez specjalistycznego sprzętu lub doświadczenia w wybieraniu dżdżownic. Protokół może być stosowany do ilościowego określania wpływu mutacji genetycznych, wyciszenia genów za pośrednictwem interferencji RNA i diety.

Określanie wskaźnika śmiertelności embrionalnej u Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę RNAi do identyfikacji regulatorów ekspresji białek postembrionalnych u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych białek i mikroskopii fluorescencyjnej.

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Przeglądaj więcej filmów