Badania przesiewowe RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Celem tej procedury jest identyfikacja postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w elegancji C przy użyciu genomowego badania przesiewowego opartego na RNAi i fluorescencyjnie znakowanych białek. Po skonstruowaniu odpowiedniego szczepu przesiewowego wybiera się bibliotekę RNAi. Pierwszym krokiem procedury jest zapakowanie klonów bibliotecznych w bakterie.

Bakterie są następnie selekcjonowane, hodowane i karmione nicieniami c elegance w stadium. Po pozostawieniu nicieniom na wzrost przez 72 godziny, obserwuje się u nich zmiany w interesującym nas fenotypie. Ostatecznie zmiany w ekspresji lub lokalizacji subkomórkowej zaatakowanego białka są wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Metoda ta może zidentyfikować geny wymagane do prawidłowej subkomórkowej lokalizacji fluorescencyjnie znakowanego białka. Protokół ten można jednak zmodyfikować w celu identyfikacji genów wpływających na inne interesujące fenotypy postembrionalne. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi opublikowanymi protokołami jest to, że zoptymalizowaliśmy spójność i poziom odpowiedzi RNAi u zwierząt poprzez indukowanie produkcji dwuniciowego RNA u bakterii przed posiewem.

Zademonstruje to Kathy Fuss, pracownik naukowy z mojego laboratorium W ciągu dwóch miesięcy od rozpoczęcia eksperymentu przygotuj bibliotekę klonów bakterii pierwszej smugi z wybranych klonów biblioteki karmienia, a także kontrole pozytywne i ujemne na płytkach tetracykliny węglowej LB. Do kontroli pozytywnej należy użyć klonu zawierającego gen, który wytwarza zależny od dawki fenotyp postembrionalny, taki jak BLE cztery. W przypadku kontroli ujemnej należy użyć pustego wektora lub klonu zawierającego przewidywany pseudogen bez obserwowanych fenotypów.

Inkubować płytki przez noc dla każdego klonu, zaszczepić dwa mililitry pożywki LB zawierającej 50 mikrogramów na mililitr. Kwas węglowy z pojedynczą kolonią z płytek smugowych, inkubować kultury przez noc z mieszaniem następnego ranka. Roztwory powinny być mętną indukowaną produkcją dwuniciowego RNA poprzez dodanie IPTG do kultur i inkubację ich przez dodatkowe cztery do pięciu godzin w tych samych warunkach.

Dodanie IPTG zapewnia bardziej spójne i solidne wyciszenie produktu genu wywołane przez RNAI niż poleganie wyłącznie na IPTG i ślimaku płytki NGM Po inkubacji IPTG umieść 30 mikrolitrów kultury z każdego klonu w każdym dołku przygotowanych 24-dołkowych płytek RNAi NGM. Jeden klon na studzienkę. Każda płytka powinna mieć dwie studzienki poświęcone kontrolom.

Dokładnie określ lokalizację każdej biblioteki. Sklonuj w 24-dołkowych płytkach, teraz umieść płytki odkryte w sterylnym kapturze przepływowym do wyschnięcia przez około 20 minut. Nie pozwól, aby krawędzie agaru oderwały się od talerza.

Po wysuszeniu na etapach nicieni na płytkach podaje się instrukcje dotyczące przygotowania nicieni. W następnej sekcji zacznij od etapowej populacji pierwszego stadium larwalnego lub nicieni L jeden. Począwszy od L, jedna larwa omija potencjalne embrionalne fenotypy letalne.

Posiadanie inscenizowanej populacji zwierząt do badań przesiewowych zwiększa również pewność, że wszelkie obserwowane zmiany są spowodowane RNAi, a nie są po prostu normalnymi zmianami, które występują w różnych stadiach. Jeśli jednak RNAi powoduje opóźnienie rozwojowe, powinno to zostać odnotowane przez badanie przesiewowe Bleach. Mieszana populacja szczepu przesiewowego w stadium zaawansowania.

Tylko zarodki chronione skorupką jaja przetrwają ten etap: zwierzęta są w stanie utrzymać się w ciągu 12 godzin, jeśli są prowadzone w temperaturze 20 stopni Celsjusza lub w ciągu 18 godzin. Jeśli jest przeprowadzany w temperaturze 16 stopni Celsjusza w dniu, w którym inokulowane są kultury bakteryjne. Wybierz trzy 100-milimetrowe płytki ze zwierzętami przesiewowymi, które są zdrowe i zawierają zarówno grawitację, dorosłe osobniki, jak i zarodki.

Umyj wszystkie zwierzęta w sterylnym podłożu M nine i przenieś pranie do sterylnej 15-mililitrowej probówki z zakrętką. Jeśli pranie jest większe niż 3,5 mililitra, obróć zwierzęta i usuń wszystko oprócz 3,5 mililitra płynu. Jeśli mniej niż 3,5 mililitra.

Zwiększ objętość do 3,5 mililitra wodą lub M nine, aby uwolnić zarodki od dorosłych w 1,5 mililitra mieszaniny wodorotlenku sodu i wybielacza do każdego prania. Pozwól zwierzętom inkubować się nie dłużej niż 10 minut w tym roztworze. Po uruchomieniu timera wiruj każdą rurkę przez 10 sekund i powtarzaj wirowanie co dwie minuty.

Po każdym wirowaniu obserwuj roztwór pod lunetą preparacyjną dla tusz zwierzęcych. W ciągu sześciu do ośmiu minut dorosłe osobniki zostaną rozdrobnione, a zarodki powinny zostać uwolnione. Usunąć zarodki z roztworu wybielacza, osadzając je w granulkach i usuwając jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu.

Następnie ponownie zawiesić granulkę w objętości 10 mililitrów, dodając sterylny M nine i używając mieszania. Powtórz ten proces prania co najmniej jeszcze raz, aż zapach wybielacza będzie całkowicie niewyczuwalny. Aby ściślej zainscenizować, zwierzęta zatrzymują je w stadium L one, wykluwając zarodki na pożywce M nine bez jedzenia.

Odbywa się to poprzez przeniesienie zarodków z M nine do małej kolby Erlenmeyera. Wstrząsnąć kolbą przez noc w temperaturze odpowiedniej dla szczepu i eksperymentować. W tym czasie wszystkie zwierzęta wykluwają się i zatrzymują w L jedną diapauzę następnego dnia.

Wznów wzrost larw od ustalonego punktu czasowego, przenosząc je do przygotowanych bakterii wykazujących ekspresję dwuniciowego RN. Jest to ten sam dzień, w którym na 24-dołkowych płytkach wykryto bakterie. Zacznij od przeniesienia zwierząt L one do 15-mililitrowej rurki i obrócenia ich w dół. Następnie skoncentruj zwierzęta w jednej połowie do jednego mililitra M dziewięć i umieść pięć mikrolitrów skoncentrowanych nicieni na talerzu.

Policz liczbę zwierząt na talerzu i dostosuj stężony roztwór nicieni. TE 30 robaków na każde trzy do 10 mikrolitrów. Na koniec nanieś około 30 litrów jednoetapowych zwierząt na bakterie w każdym dołku przygotowanych.

Płytka 24-dołkowa Więcej niż 30 zwierząt na studzienkę może spowodować głód Po wyschnięciu plam, co zajmie kilka minut, zabezpiecz pokrywkę gumką, inkubuj zwierzęta odwrócone w wymaganej temperaturze i czasie trwania, aby naciąć zwierzęta na pożądanym etapie. Gdy nicienie są gotowe do badań przesiewowych, należy potwierdzić, że kontrole pozytywne i ujemne wytwarzają oczekiwane fenotypy. Następnie obserwuj zwierzęta doświadczalne pod kątem nieprawidłowości rozwojowych.

Następnie, za pomocą mikroskopu preparacyjnego, zamontuj od ośmiu do 12 zwierząt z każdej studzienki na 4% szkiełkach PET Agri z pięciomikrolitrową kroplą środka znieczulającego. Po nałożeniu odpowiedniego szkiełka nakrywkowego należy przeprowadzić obserwacje co najmniej pięciu zwierząt za pomocą mikroskopii złożonej. Prowadź uporządkowaną bazę danych genu, liczby obserwowanych zwierząt i wyników fenotypowych.

Dla każdego eksperymentu RNAI sprawdź, czy każdy fenotyp wytworzony przez R RNAi jest inny fenotyp wtórny, jeśli to możliwe, a powtarzając eksperyment, w powtórzonych eksperymentach można wykorzystać bakterie z tej samej smugi. Starsze smugi mogą powodować słaby wzrost płynnych kultur nocnych i powinny być najpierw ponownie smugowane. Niektóre kultury bakteryjne nie będą dobrze rosły z powodu produktu genowego ulegającego ekspresji w ich plazmidzie.

W takim przypadku po prostu skoncentruj bakterie przed poszyciem. W przypadku trwającego badania przesiewowego ważne jest, aby duża liczba zarodków była zawsze gotowa do oceny stopnia zaawansowania. Szczep przesiewowy powinien być zawsze karmiony, nie głodzony i wolny od zanieczyszczeń, które mogą wpływać na fenotyp będący przedmiotem zainteresowania.

Ustaliliśmy harmonogram konserwacji karmienia zwierząt. Geny, które wpływają na lokalizację DBL one, zostały zidentyfikowane przez RNAi przy użyciu projektu szczepu dla tego badania. Normalna ekspresja znacznika GFP dbl obejmuje brzuszne ciała komórkowe rdzenia nerwowego i rząd zwierząt puncti karmionych antysensownym RA do DBL.

Jedno mRNA wykazywało poważnie osłabioną ekspresję DBL one. Zwierzęta te były również małe, podobnie jak zwierzęta pozbawione funkcjonalnego DBL L. Badanie przesiewowe RNA I z powodzeniem zidentyfikowało wiele innych genów, których produkty wpływają na lokalizację DBL one, poszerzając w ten sposób naszą wiedzę na temat tego, w jaki sposób TGF beta jest transportowany subkomórkowo i zapewniając punkt wyjścia dla wielu innych badań.

Korzystając z tej metody, jedna osoba może rozsądnie zainscenizować i obserwować od dwóch do czterech zestawów eksperymentów tygodniowo. Na przykład zwierzęta wystawiane w poniedziałek i wtorek można obserwować odpowiednio w czwartek i piątek, a zwierzęta mogą być ponownie wystawiane w piątek i sobotę w poniedziałek i wtorek. Obserwacja Podczas wykonywania tej procedury na całym ekranie.

Ważne jest, aby utrzymać dużą ilość zarodków w gotowości do oceny stopnia zaawansowania, dlatego regularnie utrzymuj szczep przesiewowy. Ważne jest również, aby robić szczegółowe notatki ze wszystkich obserwacji.