Ilościowe i zautomatyzowane wysokoprzepustowe przesiewy RNAi w całym genomie u C. elegans

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe badanie funkcji genów oraz analiza tych zależności w skali całego genomu. Cel ten osiąga się poprzez wyciszenie ekspresji każdego genu za pomocą RNAi w płytkach 96-dołkowych.

Następnie przeprowadzany jest odpowiedni test funkcji genu. W tym przykładzie zdolność *S. elegans* do prawidłowej odpowiedzi na infekcję grzybiczą ocenia się poprzez analizę ekspresji indukowalnego reportera fluorescencyjnego. Następnie, przy użyciu urządzenia Coss bio sortt, przeprowadzana jest zautomatyzowana analiza ilościowa; ostatecznie analiza mierzalnych cech, takich jak ekspresja fluorescencyjnego genu reporterowego, pozwala zidentyfikować podzbiory genów niezbędnych do modulowania określonych szlaków, regulujących rozwój, zachowanie lub fizjologię.

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w różnych dziedzinach, w których dostrzegamy elegancję, takich jak rozwój, neurobiologia, a także interakcje między gospodarzem a patogenami. Pomysł na tę metodę pojawił się po raz pierwszy, gdy laboratorium Oranger opublikowało wyniki pierwszych wielkoskalowych ekranów RNA w oku. Opracowanie niezbędnych narzędzi oraz dopracowanie automatyzacji wymagało znacznego nakładu pracy.

Procedurę zaprezentuję wspólnie z Olivią, naukowcem z zespołu oraz asystentką badawczą z laboratorium Jonathana Eubanksa. Aby przygotować 10 płytek 96-dołkowych, należy zacząć od sporządzenia 100 mililitrów pożywki do hodowli nicieni (nematode growth medium) lub NGM w wodzie dejonizowanej. Instrukcje znajdują się w protokole pisemnym.

Gdy pożywka jest jeszcze ciepła, dodać 100 µg/ml ampicyliny, 12,5 µg/ml tetracykliny oraz 4 mM IPTG, a następnie szybko rozdzielić po 75 µL do każdego dołka płytki 96-dołkowej o płaskim dnie. Należy niezwłocznie sprawdzić obecność pęcherzyków powietrza w dołkach i je usunąć. Płytki przechowywać w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C.

Następnie przygotuj płytki 96-dołkowe o głębokich dołkach, dodając 1,5 ml pożywki LB z ampicyliną i tetracykliną. Do każdego dołka dodaj unikalną etykietę lub kod kreskowy. Przykryj każdą płytkę i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jeśli zostały przygotowane wcześniej; wymieszaj płytkę zapasową z pożywką LB w 96 dołkach zawierającą RNAI.

Klonuj bakterie z ampicyliną, tetracykliną i glicerolem, a następnie przenieś 3 µL każdego klonu bakteryjnego do odpowiadającego mu dołka wcześniej przygotowanej 96-dołkowej płytki głębokiej. Puste dołki wykorzystaj jako kontrole. Przykryj płytki głębokie folią klejącą i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C w obecności wstrząsania. Użytą 96-dołkową płytkę z replikami przenieś do temperatury -80 °C rano, następnego dnia po nocnej hodowli.

Przenieś 96-dołkowe płytki NGM z temperatury 4°C do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza i pozostaw je na 5 do 15 minut, aby się ogrzały i wyschły. Następnie naklej odpowiednią etykietę lub kod kreskowy na każdą płytkę. Wyjmij 96-dołkowe płytki do hodowli nocnej z inkubatora.

Odwiruj pomyślnie wyhodowane kultury bakteryjne. Płytki 96-dołkowe do głębokich próbek wiruj przez pięć minut przy 4 000 RPM. Odlej nadsącz, gwałtownie odwracając płytkę do góry dnem, a następnie szybko osusz.

Krawędziami płytki na ręczniku papierowym resuspenduj pellet bakteryjny w pozostałym płynie za pomocą wortexowania. Idealnie należy użyć dedykowanego agitatora, aby każda płytka została poddana dokładnie takiej samej obróbce. Przenieś 5 µL resuspendowanych bakterii na płytki NGM z 96 dołkami, używając wielokanałowej pipety 8 lub 12-kanałowej.

Należy unikać dotykania podłoża NGM. Pozostawić bakterie do wyschnięcia w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza przez około dwie godziny. Regularnie sprawdzając, czy podłoże NGM nie wyschło zbyt mocno, inkubować płytki 96-dołkowe R-N-A-I-N-G-M w temperaturze 37 °C przez noc w komorze wilgotnościowej.

Należy odnieść się do protokołu pisemnego w celu przygotowania zsynchronizowanej populacji nicieni po schłodzeniu płytek 96-dołkowych R-N-A-I-N-G-M w temperaturze pokojowej. Do każdego dołka należy dodać około 100–200 nicieni w 2 µL medium M9. Należy sprawdzić, czy w każdym dołku znajdują się nicienie.

Robaki powinny pływać. Pozostaw płytki do wyschnięcia w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza na maksymalnie jedną godzinę. Regularnie sprawdzaj stan płytek.

Nicienie powinny pełzać, a nie pływać. Płytki należy umieścić w komorze wilgotnościowej w temperaturze 25°C na noc. Po wybraniu wysoce infekcyjnej partii zarodników Judge Miria.

Użyj buforu M nine do zebrania zarodników z płytki o średnicy 9 cm. Rozdziel 4 µL zawiesiny zarodników do każdej studzienki i sprawdź obecność zarodników w każdej z nich. Nicienie powinny pływać.

Pozostaw płytki do wyschnięcia w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza przez około jedną godzinę. Regularnie sprawdzaj płytki, aż nicienie zaczną się poruszać. Następnie umieść zainfekowane płytki w komorze wilgotnościowej w temperaturze 25 °C na noc.

Przed analizą należy sprawdzić nicienie, szybko obserwując je pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu potwierdzenia prawidłowego rozwoju, dobrej indukcji GFP w próbkach kontrolnych negatywnych oraz zmniejszonej fluorescencji GFP w próbkach kontrolnych pozytywnych. Jeśli indukcja jest prawidłowa, należy za pomocą ośmio- lub dwunastokanałowej pipety wielokanałowej przenieść nicienie wraz z 100 µL 50 mM NaCl i 0,05% tritonu do nowej, opisanej lub zakodowanej płytki 96-dołkowej z dnem okrągłym.

Zamrozić płytki w temperaturze -80 °C do momentu przeprowadzenia analizy. W dniu analizy rozmrozić zamrożone płytki w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu płytek przystąpić do automatycznej analizy z użyciem systemu COPA bios.

Urządzenie Sortt przetwarza płytkę studzko po studzku i analizuje parametry każdego nicienia, takie jak ich fluorescencja. Przepisz informacje uzyskane z systemu COPA bios sortt do pliku Excel w celu weryfikacji jakości danych. Następnie zapisz surowe dane, w tym gęstość optyczną, długość osiową oraz emisje fluorescencyjne, w pakiecie limbs do późniejszych szczegółowych analiz ilościowych.

W tym eksperymencie robaki transgeniczne konstytutywnie eksponowały reporter P call 12 ds red oraz indukowalny PNLP 29 GFP. Robaki reporterowe poddano działaniu grupy kontrolnej lub klonu A-G-F-P-R-N-A eye przez 48 godzin. Panele po lewej stronie przedstawiają niezinfekowane robaki, a panele po prawej stronie przedstawiają robaki 18 godzin po infekcji D spora.

Gdy interesującym fenotypem jest ekspresja reportera GFP, studnie genowe z klonem GFP RNAi stanowią solidną kontrolę. System COPA bios SORTT generuje dane liczbowe dla każdego analizowanego nicienia. Wykresy te przedstawiają średnią i odchylenie standardowe dla każdej studni z nicieniami transgenicznymi.

Konstytutywna ekspresja reportera p call 12 DS red oraz indukowalnego reportera PNLP 29 GFP po RNAI i infekcji diaspora. Sorter analizuje czas przelotu (TOF), który odpowiada wielkości nicieni, fluorescencję czerwoną oraz stosunek fluorescencji zielonej do TOF. Niektóre klony wywołują zaburzenia wzrostu i/lub wpływają na ekspresję P 12 DS red.

Inne specyficznie wpływają na ekspresję FP. Na przykład ten konkretny klon jest skierowany przeciwko genowi NS Y, o którym wcześniej wykazano, że jest ważny dla regulacji NLP 29. Fluorescencja zielona i czerwona oraz TOF są mierzone w jednostkach dowolnych, lecz stałych.

Jedną z innowacji tego protokołu jest zastosowanie mrożenia płytek w celu odroczenia ich analizy. Mrożenie pozwala na przechowywanie płytek do dwóch tygodni bez istotnej zmiany wyników, co zostało tutaj wykazane. Choć bezwzględne wartości zmierzonej fluorescencji mogą ulec zmianie, ich proporcje względne pozostają zbliżone.

Cztery nicienie niosące transgeny PNLP 29 GFP oraz P call 12 ds red zostały zainfekowane diasporą lub nie. Po 18 godzinach każdą płytkę podzielono w przybliżeniu na dwie części; jedną połowę przeanalizowano natychmiast, a drugą zamrożono w temperaturze -80 °C na 24 godziny przed rozmrożeniem. Dla każdej próbki obliczono wartości analizy średniej wielkości, mętności oraz fluorescencji zielonej i czerwonej.

Wykres przedstawia stosunek średniej dla próbek zainfekowanych do próbek niezainfekowanych w przypadku zaprezentowanych tutaj próbek zamrożonych i żywych. Z podwójnych analiz reprezentatywnej płytki otrzymano znormalizowane stosunki fluorescencji dla każdej studni, gdzie wartość ta stanowi iloraz średniej fluorescencji studni i średniej przyciętej całej płytki. Po opanowaniu, niniejszy protokół pozwoli grupie od dwóch do trzech osób przeprowadzić przesiew całego genomu w ciągu dwóch do trzech miesięcy.

Pomyślna realizacja tego protokołu wymaga ścisłej współpracy zespołowej. Członkowie mojej grupy włożyli ogromny wysiłek w opracowanie procedury, która jest wydajna i stosunkowo łatwa do przeprowadzenia.