Name: Ilościowe i zautomatyzowane wysokoprzepustowe badania przesiewowe RNAi całego genomu u C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Poznaj zautomatyzowane badania przesiewowe RNAi całego genomu u C. elegans w celu ilościowej analizy funkcji genów. Ta metoda umożliwia identyfikację genów zaangażowanych w odpowiedź immunologiczną na grzyby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy D. Braendle, C. L. Kurz i F. Montañana-Sanchis za ich wkład. Projekt ten był wspierany przez granty z ANR oraz Conseil Regional PACA, a także finansowanie instytucjonalne z INSERM i CNRS.

<ol><li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854-854 (1998).</li>
<li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li>
<li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li>
<li>Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33, 40-48 (2003).</li>
<li>Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).</li>
<li>Frand, A. R., Russel, S., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+molting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans molting.</a> PLoS Biol. 3, e312-e312 (2005).</li>
<li>Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-genome+RNAi+Screen+for+C.+elegans+miRNA+pathway+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes.</a> Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).</li>
<li>O'Rourke, E. J., Conery, A. L., Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-animal+high-throughput+screens%3A+the+C+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-animal high-throughput screens: the C elegans model.</a> Methods Mol. Biol. 486, 57-75 (2009).</li>
<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li>
<li>Stiernagle, T. The C. elegans Research Community. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1551-8507 (2006).</li>
<li>Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPowell%2C+JR+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. Ewbank, J., Vivier, E. 415, Humana Press. 403-427 (2008).</li>
<li>Cardoso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XNP-1%2FATR-X+acts+with+RB%2C+HP1+and+the+NuRD+complex+during+larval+development+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">XNP-1/ATR-X acts with RB, HP1 and the NuRD complex during larval development in C. elegans.</a> Dev. Biol. 278, 49-59 (2005).</li>
<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).</li>
<li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+RNAi+of+C.+elegans+Using+the+Hypersensitive+rrf-3+Strain+Reveals+Novel+Gene+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions.</a> PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).</li>
<li>Couillault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1%2C+an+ortholog+of+human+SARM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).</li>
<li>Morton, E., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suite+of+MATLAB-based+computational+tools+for+automated+analysis+of+COPAS+Biosort+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data.</a> Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).</li>
<li>Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+physiological+activation+of+osmosensitive+gene+expression+mimics+transcriptional+signatures+of+pathogen+infection+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans.</a> PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).</li>
<li>Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fatty+acid+synthase+fasn-1+acts+upstream+of+WNK+and+Ste20%2FGCK-VI+kinases+to+modulate+antimicrobial+peptide+expression+in+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20/GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis.</a> Virulence. 1, 113-122 (2010).</li>
<li>Duverger, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-automated+high-throughput+approach+to+the+generation+of+transposon+insertion+mutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).</li>
<li>Ruzanov, P., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+SAGE+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).</li>
<li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+in+a+dish%3A+high-throughput+analyses+of+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).</li>
<li>Okoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antifungal+compounds+active+against+Candida+albicans+using+an+improved+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay.</a> PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).</li>
<li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).</li>
<li>Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+compounds+with+bioactivity+against+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+by+a+screen+based+on+the+functional+genomics+of+the+marine+bacterium+Pseudoalteromonas+tunicata+D2%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li>
</ol>

Laboratorium Ewbanka współpracuje z Union Biometrica oraz Modul-Bio.

Niniejszy protokół umożliwia prowadzenie szeroko zakrojonych badań przesiewowych RNAi u C. elegans na podłożach stałych, wykorzystując poziom ekspresji fluorescencyjnego genu reporterowego jako odczyt. Został on zoptymalizowany z wykorzystaniem narzędzi automatycznych w celu ułatwienia analiz wysokoprzepustowych, co pozwala na łatwą i szybką obsługę dużej liczby próbek w sposób wydajny, niezawodny i powtarzalny. Opisano również inne metody, które w mniejszym stopniu opierają się na zautomatyzowanym dozowaniu próbek ciekłych 8.
	Kluczowym aspektem organizacyjnym protokołu było opracowanie niezawodnej metody śledzenia próbek poprzez adaptację komercyjnego oprogramowania MBioLIMS do procedury przesiewowej RNAi, we współpracy z firmą ModulBio. Na każdym etapie procedury płytki są obecnie identyfikowane za pomocą kodów kreskowych generowanych w systemie LIMS. Ponieważ LIMS rejestruje również tożsamość klonów w każdej studzince na każdej płytce, przejście od studzinki do potencjalnego genu jest proste. Co więcej, LIMS łączy się z bazą danych społeczności WormBase, umożliwiając bezpośredni dostęp do danych molekularnych i funkcjonalnych dla dowolnego genu. LIMS ułatwia również przeprowadzanie analiz na poziomie płytki, a nawet chromosomu i całego genomu. W przypadku tych analiz dane są przechowywane w sposób w pełni kompatybilny z wcześniej opisanymi narzędziami, takimi jak COPAmulti 16.
	Kluczowym punktem eksperymentalnym w tej metodzie jest dostosowanie ilości pożywki do liczby nicieni. W wielu analizach niezbędne jest, aby nicienie nie głodowały pod koniec eksperymentu, jednak równie ważne jest, aby na początku nie było zbyt dużo pożywki. Zaobserwowaliśmy, że wysoka gęstość pożywki zmniejsza indukcję fluorescencji w protokole z wykorzystaniem nicieni niosących reporter pnlp-29::GFP. Może to odzwierciedlać obniżoną wydajność infekcji w przypadku hodowli nicieni w zbyt dużej ilości bakterii (BS, wyniki nieopublikowane). Jednocześnie istotne są warunki hodowli bakterii RNAi, ponieważ determinują one, czy dsRNA jest produkowane na optymalnym poziomie. Niektóre protokoły dla RNAi na dużą skalę wymagają hodowli klonów RNAi na płytkach agarowych przed zaszczepieniem kultur płynnych 8. Uzyskaliśmy skuteczne wyciszanie genów, pomijając ten krok. Zdecydowaliśmy się na hodowlę nadmiarowej ilości każdej kultury, aby zapewnić jednorodne wyniki. Opisany protokół w rzeczywistości dostarcza wystarczającego materiału do przeprowadzenia 2 lub 3 przesiewów równolegle. Jednak w celu uzyskania najbardziej wiarygodnych wyników preferujemy przeprowadzanie przesiewów w dubletach, wykorzystując niezależne kultury nicieni, bakterii RNAi oraz zarodników grzybów.
	Kolejnym krytycznym krokiem jest zastosowanie podłoża, które nie jest ani zbyt wilgotne, ani zbyt suche. Jeśli płytki nie są wystarczająco suche, bakterie RNAi nie wysychają prawidłowo i nicienie będą pływać podczas testu. Może to powodować problemy. Na przykład nicienie nie są efektywnie infekowane przez D. coniospora w cieczy (C. Couillault, nieopublikowane wyniki). Z drugiej strony, na suchych płytkach zwiększa się osmolarność pożywki hodowlanej. Ma to bezpośredni wpływ na fizjologię nicieni 17, w tym na indukcję niektórych genów peptydów przeciwdrobnoustrojowych, takich jak nlp 29 18. Objętość używana do nakładania nicieni i zarodników jest kluczowa dla zapewnienia skutecznego i szybkiego wyschnięcia. Jeśli do świeżych płytek doda się więcej niż 10 μL cieczy, do wyschnięcia studni może być potrzebnych wiele godzin. Może to utrudniać stosowanie metod robotycznych do nakładania nicieni na płytki. Na przykład urządzenie Biosort dozuje każdego nicienia w około 1 μL cieczy. Obecnie rozdzielamy nicienie ręcznie, co pozwala nam również przezwyciężyć tendencję nicieni w roztworze do sedymentacji.
	Wcześniej zgłosiliśmy modyfikację urządzenia Biosort, która pozwoliła na analizę jednej płytki 96-dołkowej w ciągu 36 minut 19. Producent urządzenia, firma UBI, oferuje obecnie modyfikację Biosort pozwalającą na dalsze skrócenie czasu analizy. W systemie „FastReFlex” próbki są kierowane bezpośrednio przez celę przepływową w celu analizy, z pominięciem filtra pułapki pęcherzykowej. Skutkuje to znacznym skróceniem czasu akwizycji danych; całą płytkę można przeanalizować w 22 min, co pozwala na opracowanie około 20 płytek dziennie. Gdyby jednak płytek nie zamrożono, między pierwszą a ostatnią wystąpiłby 8-godzinny odstęp. Biorąc pod uwagę stosunkowo krótki czas trwania eksperymentu, przy infekcji trwającej zaledwie 18 godzin, wprowadziłoby to niedopuszczalną zmienną między płytkami. Zamrażanie płytek przed analizą nie tylko rozwiązuje ten problem, ale jest również niezbędne w kontekście analiz wysokoprzepustowych, ponieważ przy obecnym protokole i standardowych robotach do obsługi cieczy 2 osoby mogą z łatwością przetworzyć do 50 płytek tygodniowo. Obecnie rutynowo przesiewamy 30 płytek tygodniowo, co pozwala na przeprowadzenie przesiewu całego genomu w czasie krótszym niż 2 miesiące.
	Interesującą cechą tego protokołu jest fakt, że wykorzystuje on stały agar, co umożliwia przeprowadzanie testów, których nie można wykonać w hodowli ciekłej. Ponieważ fizjologia nicieni różni się w zależności od warunków hodowli 20,21, możliwość przeprowadzania analiz na podłożu stałym może stanowić uzupełnienie standardowych przesiewów w środowisku ciekłym. W przypadku niektórych fenotypów (np. ruchu) analizę można przeprowadzać bezpośrednio na 96-dołkowych płytkach z podłożem stałym. Jednak w obecnym przesiewie, ponieważ urządzenie Biosort nie może pobierać próbek z stałych podłoży, nicienie są najpierw przenoszone do cieczy przed zamrożeniem. Z drugiej strony, COPAS Biosort umożliwia wieloparametryczną analizę ilościową kompatybilną z pomiarem wielu różnych fenotypów. Prawdopodobnie w przypadku dowolnego przesiewu nie wszystkie mierzone parametry będą stanowiły główny odczyt. Niemniej jednak pomiary te mogą być przydatne z kilku powodów. Pozwalają one ustalić, czy test przebiegł prawidłowo. Na przykład można sprawdzić liczbę i wielkość nicieni w każdej studzience. Odchylenie od wartości oczekiwanych powinno występować tylko wtedy, gdy klon RNAi blokuje wzrost lub rozmnażanie. Studzienki zawierające mniej niż 20 nicieni lub/i zwierzęta o 30% mniejsze (TOF) w porównaniu ze standardową kontrolą niemającą wpływu na wzrost (np. gfp(RNAi)) mogą zostać wykluczone z późniejszych analiz. Funkcję tych klonów można zbadać za pomocą alternatywnego protokołu, w którym nicienie są eksponowane na bakterie RNAi po zaawansowaniu ich rozwoju 15. Różne parametry mogą być również wykorzystane do doprecyzowania wyboru genów kandydackich (hitów), na przykład poprzez ograniczenie hitów tylko do tych, które wpływają na fluorescencję zieloną, ale nie czerwoną. Dokładna metoda wyboru hitów będzie zależeć od rodzaju przesiewu i jego konkretnego odczytu. Ze względu na złożoność danych generowanych podczas ilościowego przesiewu całego genomu konieczna może być współpraca ze statystykiem.
	Opisany przez nas protokół można z łatwością dostosować do innych rodzajów testów. Na przykład, na etapie infekcji *D. coniospora* może zostać zastąpiony dowolnym innym patogenem zdolnym do infekcji na podłożach stałych. Może to być szczególnie użyteczne, ponieważ ustalono, że wiele czynników wirulencji istotnych dla infekcji Serratia marcescens w hodowli płynnej nie odgrywa roli podczas infekcji na podłożu stałym (E. Pradel, komunikacja osobista). Protokół ten jest również w pełni kompatybilny z testowaniem związków chemicznych 22-24lub do identyfikacji związków o aktywności biologicznej z wykorzystaniem różnych bibliotek bakterii 25zatem powinno znaleźć ogólne zastosowanie w C. elegans społeczność badawcza.

<table><tbody><tr><td>BactoAgar </td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przylepna folia AeraSeal</td><td>Dutscher</td><td>760214</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl-&amp;#946;-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>AB-0481</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Głęboka płytka 96-dołkowa </td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>AB-0932</td><td></td></tr><tr><td>Płaska płytka 96-dołkowa </td><td>Falcon BD</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Okrągła płytka 96-dołkowa </td><td>Falcon BD</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8032</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Robot TECAN </td><td>Tecan Group Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquidator96&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; </td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>COPAS Biosort </td><td>Union Biometrica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIMS </td><td>Modul-Bio</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowe i zautomatyzowane wysokoprzepustowe przesiewy rnai w całym genomie u c. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Interferencja RNA jest potężną metodą badania funkcji genów, szczególnie gdy jest prowadzona w skali całego genomu i w ujęciu ilościowym. W przypadku C. elegans funkcję genu można wyciszyć w prosty i wydajny sposób, podając nicieniom bakterie wykazujące ekspresję dsRNA odpowiadającego konkretnemu genowi 1. Choć stworzenie bibliotek klonów RNAi obejmujących większość genomu C. elegans 2,3 otworzyło drogę do prawdziwych badań nad genomiką funkcjonalną (patrz na przykład 4-7), większość ugruntowanych metod jest pracochłonna. Moy i współpracownicy opracowali półautomatyczne protokoły, które ułatwiają przesiewy w skali całego genomu 8. Podejście to opiera się na obrazowaniu mikroskopowym i analizie obrazu.
	W niniejszym pracy opisujemy alternatywny protokół wysokoprzepustowego przesiewania całego genomu, opartego na robotycznym przetwarzaniu klonów bakteryjnych RNAi, analizie ilościowej z wykorzystaniem urządzenia COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)) oraz zintegrowanym oprogramowaniu MBioLIMS (Laboratory Information Management System firmy Modul-Bio) – technologii zapewniającej zwiększoną przepustowość w zakresie zarządzania danymi i śledzenia próbek. Metoda ta umożliwia przeprowadzanie przesiewania na płytkach z podłożem stałym. Jest to szczególnie istotne w niektórych badaniach, takich jak te dotyczące interakcji gospodarz-patogen w C. elegans, ponieważ niektóre mikroby nie infekują efektywnie nicieni w kulturach płynnych.
	Przedstawiamy sposób wykorzystania tej metody do ilościowej oceny znaczenia genów w nieswoistej odporności przeciwgrzybiczej u C. elegans. W tym przypadku podejście opiera się na zastosowaniu szczepu transgenicznego niosącego epidermalny, indukowalny infekcją fluorescencyjny gen reporterowy, w którym GFP znajduje się pod kontrolą promotora genu peptydy przeciwgrzybiczego nlp 29, oraz czerwony fluorescencyjny reporter wyrażany konstytutywnie w naskórku. Ten drugi służy jako wewnętrzna kontrola funkcjonalnej integralności naskórka oraz nieswoistego wyciszania transgenu9. W przypadku zakażenia grzybem nicienie kontrolne wykazują zieloną fluorescencję. Wyciszenie za pomocą RNAi genu niezbędnego do ekspresji nlp 29 prowadzi do zmniejszenia fluorescencji po zakażeniu. Obecnie protokół ten pozwala na przetestowanie i analizę ponad 3000 klonów RNAi tygodniowo, co otwiera możliwość przesiewania całego genomu w czasie krótszym niż 2 miesiące.

Opisujemy protokół z wykorzystaniem C. elegans oraz bibliotek RNAi dostarczanych drogą pokarmową, który umożliwia zautomatyzowany pomiar wielu parametrów, takich jak fluorescencja, rozmiar i nieprzezroczystość poszczególnych nicieni w populacji. Przedstawiamy przykład screeningu służącego do identyfikacji genów zaangażowanych w wrodzoną odporność przeciwgrzybiczą u C. elegans.

Ilościowe i zautomatyzowane wysokoprzepustowe przesiewy RNAi w całym genomie u C. elegans

Interferencja RNA jest potężną metodą badania funkcji genów, zwłaszcza gdy jest prowadzona w skali całego genomu i w kontekście ilościowym. W C. ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe badanie funkcji genów oraz analiza tych zależności w skali całego genomu. Cel ten osiąga się poprzez wyciszenie ekspresji każdego genu za pomocą RNAi w płytkach 96-dołkowych.Następnie przeprowadzany jest odpowiedni test funkcji genu. W tym przykładzie zdolność *S. elegans* do prawidłowej odpowiedzi na infekcję grzybiczą ocenia się poprzez analizę ekspresji indukowalnego reportera fluorescencyjnego. Następnie, przy użyciu urządzenia Coss bio sortt, przeprowadzana jest zautomatyzowana analiza ilościowa; ostatecznie analiza mierzalnych cech, takich jak ekspresja fluorescencyjnego genu reporterowego, pozwala zidentyfikować podzbiory genów niezbędnych do modulowania określonych szlaków, regulujących rozwój, zachowanie lub fizjologię.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w różnych dziedzinach, w których dostrzegamy elegancję, takich jak rozwój, neurobiologia, a także interakcje między gospodarzem a patogenami. Pomysł na tę metodę pojawił się po raz pierwszy, gdy laboratorium Oranger opublikowało wyniki pierwszych wielkoskalowych ekranów RNA w oku. Opracowanie niezbędnych narzędzi oraz dopracowanie automatyzacji wymagało znacznego nakładu pracy.Procedurę zaprezentuję wspólnie z Olivią, naukowcem z zespołu oraz asystentką badawczą z laboratorium Jonathana Eubanksa. Aby przygotować 10 płytek 96-dołkowych, należy zacząć od sporządzenia 100 mililitrów pożywki do hodowli nicieni (nematode growth medium) lub NGM w wodzie dejonizowanej. Instrukcje znajdują się w protokole pisemnym.Gdy pożywka jest jeszcze ciepła, dodać 100 µg/ml ampicyliny, 12,5 µg/ml tetracykliny oraz 4 mM IPTG, a następnie szybko rozdzielić po 75 µL do każdego dołka płytki 96-dołkowej o płaskim dnie. Należy niezwłocznie sprawdzić obecność pęcherzyków powietrza w dołkach i je usunąć. Płytki przechowywać w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C.Następnie przygotuj płytki 96-dołkowe o głębokich dołkach, dodając 1,5 ml pożywki LB z ampicyliną i tetracykliną. Do każdego dołka dodaj unikalną etykietę lub kod kreskowy. Przykryj każdą płytkę i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jeśli zostały przygotowane wcześniej; wymieszaj płytkę zapasową z pożywką LB w 96 dołkach zawierającą RNAI.Klonuj bakterie z ampicyliną, tetracykliną i glicerolem, a następnie przenieś 3 µL każdego klonu bakteryjnego do odpowiadającego mu dołka wcześniej przygotowanej 96-dołkowej płytki głębokiej. Puste dołki wykorzystaj jako kontrole. Przykryj płytki głębokie folią klejącą i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C w obecności wstrząsania. Użytą 96-dołkową płytkę z replikami przenieś do temperatury -80 °C rano, następnego dnia po nocnej hodowli.Przenieś 96-dołkowe płytki NGM z temperatury 4°C do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza i pozostaw je na 5 do 15 minut, aby się ogrzały i wyschły. Następnie naklej odpowiednią etykietę lub kod kreskowy na każdą płytkę. Wyjmij 96-dołkowe płytki do hodowli nocnej z inkubatora.Odwiruj pomyślnie wyhodowane kultury bakteryjne. Płytki 96-dołkowe do głębokich próbek wiruj przez pięć minut przy 4 000 RPM. Odlej nadsącz, gwałtownie odwracając płytkę do góry dnem, a następnie szybko osusz.Krawędziami płytki na ręczniku papierowym resuspenduj pellet bakteryjny w pozostałym płynie za pomocą wortexowania. Idealnie należy użyć dedykowanego agitatora, aby każda płytka została poddana dokładnie takiej samej obróbce. Przenieś 5 µL resuspendowanych bakterii na płytki NGM z 96 dołkami, używając wielokanałowej pipety 8 lub 12-kanałowej.Należy unikać dotykania podłoża NGM. Pozostawić bakterie do wyschnięcia w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza przez około dwie godziny. Regularnie sprawdzając, czy podłoże NGM nie wyschło zbyt mocno, inkubować płytki 96-dołkowe R-N-A-I-N-G-M w temperaturze 37 °C przez noc w komorze wilgotnościowej.Należy odnieść się do protokołu pisemnego w celu przygotowania zsynchronizowanej populacji nicieni po schłodzeniu płytek 96-dołkowych R-N-A-I-N-G-M w temperaturze pokojowej. Do każdego dołka należy dodać około 100–200 nicieni w 2 µL medium M9. Należy sprawdzić, czy w każdym dołku znajdują się nicienie.Robaki powinny pływać. Pozostaw płytki do wyschnięcia w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza na maksymalnie jedną godzinę. Regularnie sprawdzaj stan płytek.Nicienie powinny pełzać, a nie pływać. Płytki należy umieścić w komorze wilgotnościowej w temperaturze 25°C na noc. Po wybraniu wysoce infekcyjnej partii zarodników Judge Miria.Użyj buforu M nine do zebrania zarodników z płytki o średnicy 9 cm. Rozdziel 4 µL zawiesiny zarodników do każdej studzienki i sprawdź obecność zarodników w każdej z nich. Nicienie powinny pływać.Pozostaw płytki do wyschnięcia w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza przez około jedną godzinę. Regularnie sprawdzaj płytki, aż nicienie zaczną się poruszać. Następnie umieść zainfekowane płytki w komorze wilgotnościowej w temperaturze 25 °C na noc.Przed analizą należy sprawdzić nicienie, szybko obserwując je pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu potwierdzenia prawidłowego rozwoju, dobrej indukcji GFP w próbkach kontrolnych negatywnych oraz zmniejszonej fluorescencji GFP w próbkach kontrolnych pozytywnych. Jeśli indukcja jest prawidłowa, należy za pomocą ośmio- lub dwunastokanałowej pipety wielokanałowej przenieść nicienie wraz z 100 µL 50 mM NaCl i 0,05% tritonu do nowej, opisanej lub zakodowanej płytki 96-dołkowej z dnem okrągłym.Zamrozić płytki w temperaturze -80 °C do momentu przeprowadzenia analizy. W dniu analizy rozmrozić zamrożone płytki w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu płytek przystąpić do automatycznej analizy z użyciem systemu COPA bios.Urządzenie Sortt przetwarza płytkę studzko po studzku i analizuje parametry każdego nicienia, takie jak ich fluorescencja. Przepisz informacje uzyskane z systemu COPA bios sortt do pliku Excel w celu weryfikacji jakości danych. Następnie zapisz surowe dane, w tym gęstość optyczną, długość osiową oraz emisje fluorescencyjne, w pakiecie limbs do późniejszych szczegółowych analiz ilościowych.W tym eksperymencie robaki transgeniczne konstytutywnie eksponowały reporter P call 12 ds red oraz indukowalny PNLP 29 GFP. Robaki reporterowe poddano działaniu grupy kontrolnej lub klonu A-G-F-P-R-N-A eye przez 48 godzin. Panele po lewej stronie przedstawiają niezinfekowane robaki, a panele po prawej stronie przedstawiają robaki 18 godzin po infekcji D spora.Gdy interesującym fenotypem jest ekspresja reportera GFP, studnie genowe z klonem GFP RNAi stanowią solidną kontrolę. System COPA bios SORTT generuje dane liczbowe dla każdego analizowanego nicienia. Wykresy te przedstawiają średnią i odchylenie standardowe dla każdej studni z nicieniami transgenicznymi.Konstytutywna ekspresja reportera p call 12 DS red oraz indukowalnego reportera PNLP 29 GFP po RNAI i infekcji diaspora. Sorter analizuje czas przelotu (TOF), który odpowiada wielkości nicieni, fluorescencję czerwoną oraz stosunek fluorescencji zielonej do TOF. Niektóre klony wywołują zaburzenia wzrostu i/lub wpływają na ekspresję P 12 DS red.Inne specyficznie wpływają na ekspresję FP. Na przykład ten konkretny klon jest skierowany przeciwko genowi NS Y, o którym wcześniej wykazano, że jest ważny dla regulacji NLP 29. Fluorescencja zielona i czerwona oraz TOF są mierzone w jednostkach dowolnych, lecz stałych.Jedną z innowacji tego protokołu jest zastosowanie mrożenia płytek w celu odroczenia ich analizy. Mrożenie pozwala na przechowywanie płytek do dwóch tygodni bez istotnej zmiany wyników, co zostało tutaj wykazane. Choć bezwzględne wartości zmierzonej fluorescencji mogą ulec zmianie, ich proporcje względne pozostają zbliżone.Cztery nicienie niosące transgeny PNLP 29 GFP oraz P call 12 ds red zostały zainfekowane diasporą lub nie. Po 18 godzinach każdą płytkę podzielono w przybliżeniu na dwie części; jedną połowę przeanalizowano natychmiast, a drugą zamrożono w temperaturze -80 °C na 24 godziny przed rozmrożeniem. Dla każdej próbki obliczono wartości analizy średniej wielkości, mętności oraz fluorescencji zielonej i czerwonej.Wykres przedstawia stosunek średniej dla próbek zainfekowanych do próbek niezainfekowanych w przypadku zaprezentowanych tutaj próbek zamrożonych i żywych. Z podwójnych analiz reprezentatywnej płytki otrzymano znormalizowane stosunki fluorescencji dla każdej studni, gdzie wartość ta stanowi iloraz średniej fluorescencji studni i średniej przyciętej całej płytki. Po opanowaniu, niniejszy protokół pozwoli grupie od dwóch do trzech osób przeprowadzić przesiew całego genomu w ciągu dwóch do trzech miesięcy.Pomyślna realizacja tego protokołu wymaga ścisłej współpracy zespołowej. Członkowie mojej grupy włożyli ogromny wysiłek w opracowanie procedury, która jest wydajna i stosunkowo łatwa do przeprowadzenia.

quantitative-automated-high-throughput-genome-wide-rnai-screens-c

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ilościowe i zautomatyzowane wysokowydajne przesiewowe badania RNAi na całym genomie w C. elegans

Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Prezentujemy sposób wykorzystania techniki karmienia RNAi do wyciszania genów docelowych oraz oceny fenotypu wielkości ciała u C. elegans. Metoda ta może zostać zastosowana w szeroko zakrojonych badaniach przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnych, interesujących komponentów genetycznych, takich jak te zaangażowane w regulację wielkości ciała poprzez sygnalizację DBL-1/TGF-β.

Wykorzystanie strategii karmienia w celu indukowania interferencji RNA do przesiewowej analizy genów zaangażowanych w regulację wielkości ciała u nicienia C. elegans

RNAi to potężne narzędzie genetyczne dostępne dla badaczy C. elegans. W tym filmie przedstawiono metodę leczenia większej liczby robaków RNAi niż karmienie płytkami przy użyciu płynnych warunków hodowli.

Karmienie RNAi w hodowli płynnej: wysokoprzepustowa metoda obniżania ekspresji genów u C. elegans

Źródło: Anderson, Q. L. i wsp. Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych z wykorzystaniem Caenorhabditis elegans do badania knockdownów genów podczas interakcji gospodarz-patogen. Przedstawiono w nim procedurę przygotowania powalanych robaków i przenoszenia ich na płytki testowe w celu oceny skutków zabijania robaków przez patogeny.

Wielodołkowy test na bazie płynu do badań przesiewowych nokautów C. elegans

Podczas gdy karmienie dsRNA u C. elegans jest potężnym narzędziem do oceny funkcji genów, obecne protokoły dla dużych ekranów żywieniowych skutkują zmienną skutecznością eliminacji. Opisujemy ulepszony protokół wykonywania badań przesiewowych karmienia RNAi na dużą skalę, który skutkuje wysoce skutecznym i powtarzalnym obniżeniem ekspresji genów.

Wielkoskalowy knockdown genów u C. elegans przy użyciu bibliotek zasilających dsRNA do generowania odpornych fenotypów utraty funkcji

Galaxy i DAVID stały się popularnymi narzędziami, które pozwalają badaczom bez wykształcenia bioinformatycznego analizować i interpretować dane RNA-Seq. Opisujemy protokół dla badaczy C. elegans do przeprowadzania eksperymentów RNA-Seq, uzyskiwania dostępu i przetwarzania zestawu danych za pomocą Galaxy oraz uzyskiwania znaczących informacji biologicznych z list genów za pomocą DAVID.

Analiza transkryptomiczna C. elegans powiedział: Dane sekwencjonowania RNA za pośrednictwem pakietu Tuxedo Suite w projekcie Galaxy

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

W tym artykule opisany jest protokół o wysokiej przepustowości do szybkiego i niezawodnego określania poziomów ekspresji genów w pojedynczych lub zbiorczych próbkach C. elegans. Protokół ten nie wymaga izolacji RNA i wytwarza cDNA bezpośrednio z próbek. Może być używany razem z wysokoprzepustowymi, multipleksowanymi, nanofluidycznymi platformami qPCR w czasie rzeczywistym.

Wysokoprzepustowy ilościowy RT-PCR w pojedynczych i masowych próbkach C. elegans przy użyciu technologii nanofluidycznej

Aby zbadać interakcje chaperon-chaperon i chaperon-substrate, przeprowadzamy syntetyczne badania przesiewowe interakcji w Caenorhabditis elegans za pomocą interferencji RNA w połączeniu z łagodnymi mutacjami lub nadmierną ekspresją białek opiekuńczych i monitorujemy dysfunkcję białek specyficznych dla tkanek na poziomie organizmu.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badań przesiewowych pod kątem interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanek

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Poznaj zautomatyzowane badania przesiewowe RNAi całego genomu u C. elegans w celu ilościowej analizy funkcji genów. Ta metoda umożliwia identyfikację genów zaangażowanych w odpowiedź immunologiczną na grzyby.

Ilościowe i zautomatyzowane wysokoprzepustowe przesiewy RNAi w całym genomie u C. elegans

Przeglądaj więcej filmów