Badania wysokoprzepustowe wysokiej treści (High Content Screening) w chorobach neurodegeneracyjnych

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wykorzystanie analiz wysokoprzepustowych (high content assays) w komórkowych modelach chorób do ilościowego określenia szlaków dotkniętych chorobami neurodegeneracyjnymi. Aby to osiągnąć, komórkowy model fenotypu choroby wprowadza się do zautomatyzowanego systemu hodowli komórkowej, a komórki inkubuje się do momentu osiągnięcia wymaganej liczby komórek. Następnie komórki są dzielone, liczone i rozdzielane do płytek 96-dołkowych zawierających lentiwirusy wykazujące ekspresję różnych SH RNA.

Po sześciu dniach różnicowania komórkowego komórki są pobierane z systemu w celu przeprowadzenia barwienia immunocytochemicznego oraz obrazowania wysokoprzepustowego (high content imaging). Następnie obrazy są analizowane przy użyciu różnych algorytmów analitycznych w celu ilościowego określenia cech związanych ze stanem zdrowia komórek: wypustek neuronalnych oraz funkcji mitochondriów.

Wyniki są również analizowane za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji w programie Novas w celu zidentyfikowania istotnych efektów interakcji. Metoda ta pozwala na szybsze udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące funkcji genów związanych z chorobą oraz szlaków, w których one funkcjonują. Przełoży się to na lepsze zrozumienie mechanizmów patogennych uczestniczących w chorobach neurodegeneracyjnych.

Aby rozpocząć proces hodowli komórkowej, należy przygotować zautomatyzowany system hodowli komórkowej do wprowadzenia płytek hodowlanych. Wprowadź do systemu materiały eksploatacyjne, takie jak końcówki do pipet, płytki do hodowli komórkowej oraz płytki analityczne. Należy również ręcznie upewnić się, że w systemie znajduje się wystarczająca ilość pożywki do hodowli komórkowej, PBS oraz trypsyny.

Zasiaj dwie płytki typu omni tray, używając 2 × 10⁶ komórek linii neuroblastoma SH SY five Y na każdą płytkę. Hoduj komórki w optymalnym medium z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej FBS. Umieść płytki na półce wejściowej robota do hodowli komórkowych. Korzystając z graficznego interfejsu użytkownika (gui), wybierz protokół hodowli komórek adherentnych i dostosuj pliki parametrów specyficznych dla danej linii komórek adherentnych tak, aby próg konfluencji był ustawiony na 70%.

Całkowity czas inkubacji wynosi dwie minuty. Poleć systemowi przygotowanie nowych płytek omni tray z zagęszczeniem komórek wynoszącym 2 × 10⁶ komórek na płytkę. Poleć systemowi przygotowanie płytek do analizy w ramach każdej płytki omni tray z łączną liczbą 5 000 komórek na dołek; inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2.

Niniejszy protokół hodowli komórek adhezyjnych obejmuje następujące etapy. Płytki są inkubowane i obrazowane do momentu, aż komórki osiągną określony próg konfluencji. Jeśli komórki nie osiągną progu konfluencji w ciągu pięciu odczytów, płytki są usuwane z systemu.

Po osiągnięciu zdefiniowanego przez użytkownika progu konfluencji komórki są płukane, trypsynizowane i liczone. Predefiniowana liczba komórek jest dodawana do nowych płytek OmniTrait, a w przypadku uzyskania wystarczającej liczby komórek, określona liczba płytek analitycznych jest transportowana na platformę, a do każdej studzienki dozowana jest zdefiniowana liczba komórek. Na koniec płytki analityczne mogą być bezpośrednio obrazowane przy użyciu zintegrowanego mikroskopu lub wyprowadzone z systemu w celu dalszego przetwarzania, aby rozpocząć procedurę produkcji wirusa.

Zaszczep podłoże LB zawierające ampicylinę bankami bakterii w glicerolu zawierającymi wektory HRNA; inkubuj przez noc. Następnego dnia odwiruj komórki i usuń nadsącz. Wyizoluj plazmidy, korzystając z systemu oczyszczania plazmidów z komórek Wizard Magnus. Końcowy eluat zawierający DNA plazmidowe zbierz do płytek 96-dołkowych. Lentiwirus S-H-R-N-A jest produkowany przy użyciu konsorcjum RNAi, w 96-dołkowych płytkach do produkcji lentiwirusów. Wszystkie eksperymenty muszą być przeprowadzane w laboratorium klasy ML2 lub BSL2 oraz wszystkie użyte odczynniki i materiały eksploatacyjne muszą zostać po użyciu zdekontaminowane 30% chlorinem.

Procedura produkcji lentiwirusów nie zostanie zaprezentowana w tym filmie, lecz trwa ona cztery dni i składa się z następujących etapów. Najpierw, w dniu zerowym, wysiewa się komórki pakujące. Dzień pierwszy: komórki pakujące są transfekowane trzema plazmidami lentiwirusowymi 18 godzin po transfekcji.

Drugiego dnia pożywka zostaje zastąpiona świeżą pożywką z wysoką zawartością BSA lub wysoką zawartością surowicy. 24 godziny po wymianie pożywki, trzeciego dnia, dokonuje się zbioru wirusa, a pożywka zostaje ponownie zastąpiona świeżą pożywką z wysoką zawartością BSA lub wysoką zawartością surowicy.

Na koniec, 24 godziny po pierwszym zbiorze wirusa, w czwartym dniu, wirus jest zbierany ponownie, a komórki opakowujące są usuwane w celu obliczenia wielokrotności infekcji (MOI) lentiwirusa. Przetransdukuj komórki SH-SY5Y przy użyciu rozcieńczeń seryjnych wirusa; inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 72 godziny po transdukcji. Zwizualizuj ekspresję GFP pod mikroskopem i określ procent komórek GFP-dodatnich. Wysej lentiwirus shRNA na płytki analityczne przy MOI równym 3. Po wyseianiu lentiwirusa shRNA na płytki analityczne, wprowadź płytki do zautomatyzowanego systemu hodowli komórkowej w celu transdukcji lentiwirusowej.

Po 24 godzinach pożywkę na płytkach testowych należy zmienić na optymalną, zawierającą 0,5% FBS oraz 0,1 μM kwasu retinowego. Aby rozpocząć proces różnicowania, należy kontynuować inkubację płytek testowych w pożywce do różnicowania przez pięć dni, aby zapewnić maksymalny knockdown ekspresji genu docelowego w piątym dniu; następnie, w połowie płytek testowych, należy dodać H2O na 24 godziny, aby w szóstym dniu stymulować translokację białka DJ one do mitochondriów. Do komórek należy dodać MIT tracker w końcowym stężeniu 200 nM na studzienkę i inkubować w temperaturze 37°C przez 30 minut.

Następnie płytki można przetransportować do obrazera wysokoprzepustowego (high content, HC) w celu wykonania obrazowania. Alternatywnie płytki można wyeksportować z systemu do dalszej obróbki, np. barwienia immunocytochemicznego. W przypadku obrazowania wysokoprzepustowego zostanie obrazowanych łącznie 30 pól na każdą studnię przy użyciu obiektywu 20x, wizualizując DJ1 za pomocą zestawu filtrów trixy, mitochondria za pomocą zestawu filtrów trixy, beta three tubulin za pomocą zestawu filtrów S5 oraz jądra komórkowe za pomocą zestawu filtrów UV.

Jest to przykład obrazów złożonych komórek uzyskanych za pomocą obrazowania wysokotreściowego (high content imaging). Na rycinie trzy w panelu A przedstawiono komórki niepoddane działaniu preparatu, a w panelu B komórki traktowane H2O. DJ one jest oznakowany kolorem zielonym, mitochondria kolorem czerwonym, a jądra komórkowe kolorem niebieskim. Aby wyznaczyć średni współczynnik nakładania się (overlap coefficient) między DJ one a mitochondriami, należy przeanalizować obrazy przy użyciu aplikacji colocalization bio.

Zdefiniuj obszary zainteresowania. ROI w następujący sposób: ROIA to jądro komórkowe, rysunek 4 A i E, a ROIB to mitochondria, rysunek 4 B i F; wyklucz ROIA z ROIB. Aby zapewnić analizę wyłącznie cytoplazmy, zdefiniuj mitochondria jako obszar docelowy jeden, a DJ1 jako obszar docelowy dwa, rysunek 4 C i G. Przeanalizuj obrazy za pomocą aplikacji bio do analizy kompartymentalnej, aby określić średnią intensywność sygnału MIT tracker w obrębie mitochondriów.

Rysunek cztery B i F przedstawia średnie długości neurytów wyznaczone na podstawie barwienia beta III tubuliną. Obrazy przeanalizowano za pomocą aplikacji bio do profilowania neuronalnego (rysunek cztery D i H), wykorzystując do odczytu płytek z obrazami zautomatyzowany czytnik konfokalny Opera LX.

Wizualizuj mitochondria za pomocą lasera 561 nanometr oraz jądra komórkowe przy użyciu obrazowania z wzbudzeniem UV. Przeanalizuj łącznie 30 pól na każdą studninkę, stosując obiektyw 60 x z imersją wodną. Na koniec przeanalizuj obrazy, wykorzystując algorytm cech teksturalnych spot edge ridge lub SER.

Filtr krawędziowy SER przepuszcza intensywność pikseli tworzących wzory przypominające krawędzie. Im bardziej pofragmentowane są mitochondria, tym wyższy jest wynik krawędziowy SER. W tym filmie wykorzystano analizy wysokoprzepustowe (HC), aby zidentyfikować modulatory białka DJ-1A, którego utrata powoduje autosomalny recesywny parkinsonizm.

Ten pierwszy reprezentatywny wynik ilustruje interakcję epistatyczną z DJ one. Wykres słupkowy po lewej stronie przedstawia znormalizowane jednostki fluorescencji, a obrazy po prawej stronie pokazują komórki SHSY five Y znakowane na czerwono mito trackerem w celu ilościowego oznaczenia żywotności komórek.

Zaobserwowano, że wyciszenie DJ one w komórkach poddanych działaniu toksyny doprowadziło do większego spadku żywotności komórek w porównaniu z komórkami zainfekowanymi kontrolnym lentiwirusem (scrambled). Wyciszenie genu docelowego A wywołało efekt podobny do tego, który zaobserwowano w komórkach z wyciszeniem DJ one. Jednakże wyciszenie zarówno DJ one, jak i genu docelowego A spowodowało znacznie większy spadek żywotności komórek niż utrata każdego z tych genów z osobna, co sugeruje interakcję epistatyczną pomiędzy DJ one a genem docelowym A. Kolejny przykład dotyczy genu regulującego translokację DJ one.

Wykres słupkowy przedstawia znormalizowany współczynnik pokrycia pomiędzy DJ one a mitochondriami, co odzwierciedla translokację DJ one z cytoplazmy do mitochondriów. Panele od A do D przedstawiają obrazy komórek SHSY five Y, w których DJ onea znakowano na zielono, mitochondria na czerwono, a jądra komórkowe na niebiesko. Po narażeniu komórek na działanie toksyny DJ one translokuje z cytoplazmy do mitochondriów, co ilościowo objawia się wyższym współczynnikiem pokrycia pomiędzy DJ one a mitochondriami.

W komórkach, w których gen docelowy B został wyciszony, mniej białka DJ one translokuje do mitochondriów po wystawieniu komórek na działanie toksyny, co sugeruje, że gen docelowy B bierze udział w transporcie DJ one do mitochondriów. Przedstawiono tutaj przykład genu zaangażowanego w wzrost neuronów. Znormalizowane długości neurytów pokazano na wykresie słupkowym, a komórki wykorzystane do kwantyfikacji długości neurytów widoczne są na obrazach, gdzie beta three tubulin zaznaczono kolorem zielonym, a jądra komórkowe kolorem niebieskim.

Wyciszenie genu docelowego C w komórkach SH-SY5Y typu dzikiego prowadzi do istotnego zwiększenia długości neurytów w porównaniu z komórkami zainfekowanymi lentiwirusem wykazującym ekspresję scrambled shRNA. Efekt ten zanika w komórkach inkubowanych z toksyną. Ostatecznie wyniki te stanowią przykład genu zaangażowanego w morfologię mitochondriów.

Na wykresie przedstawiono średnie wartości segmentacji grzebieni mitochondrialnego retikulum endoplazmatycznego (SER) dla komórek SHSY five Y zainfekowanych scrambled HRNA lub A-S-H-R-N-A celującym w gen D. Obraz A i obraz C są obrazami kompozytowymi komórek SHSY five Y zainfekowanych odpowiednio scrambled HRNA lub A-H-R-N-A celującym w gen D. Mitochondria są zabarwione na czerwono, natomiast jądra komórkowe na niebiesko.

Obrazy B i D stanowią wizualizacje ilościowego oznaczenia grzbietów SER, zaobserwowane w tym przypadku. Zakażenie komórek SHSY five Y typu dzikiego hRNA celującym w gen D skutkuje wzrostem wartości segmentacji mitochondrialnych grzbietów SER w porównaniu z komórkami zainfekowanymi sfragmentaryzowanym lentiwirusem. Podejście to może utorować drogę badaczom z dziedziny neurodegeneracji do sprawnego eksplorowania i opisywania szlaków zaangażowanych w patogenezę choroby.

Doprowadzi to następnie do wyznaczenia lepszych celów dla opracowania terapii.