Name: Sterowana polem elektrycznym ukierunkowana migracja neuronalnych komórek progenitorowych w środowiskach 2D i 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Poznaj metodę badania migracji komórek progenitorowych nerwowych pod wpływem pola elektrycznego w środowiskach 2D i 3D. Technika ta umożliwia śledzenie kierunkowego ruchu komórek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant Royal Society URF UF051616, UK oraz grant Europejskiej Rady ds. Badań StG 243261 przyznany BS. Praca w laboratorium MZ jest również wspierana przez grant California Institute of Regenerative Medicine RB1-01417.

1. Izolacja neuralnych komórek progenitorowych
<ol>
 <li>Wypreparować całe mózgi myszy w dniach embrionalnych E14-16 i umieścić je w zimnej pożywce podstawowej DMEM/F12. Usunąć wszystkie opony mózgowe pod mikroskopem anatomicznym, a następnie przenieść mózgi do szalki Petriego o średnicy 35 mm.</li>
 <li>Za pomocą precyzyjnej pęsety mechanicznie rozdrobić mózgi na fragmenty tkanki i przenieść je do probówki o pojemności 15 ml, a następnie odwirować próbki z prędkością 800 rpm przez 3 min w celu usunięcia zanieczyszczeń.</li>
 <li>Dodać pożywkę DMEM/F12 zawierającą bFGF i EGF, a następnie homogenizować za pomocą pipety 1 ml.</li>
 <li>Przepuścić zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.</li>
 <li>Wysiać komórki do kolb w zagęszczeniu 2-5 x 104 komórek/ml, następnie przeprowadzać całkowitą wymianę pożywki co 3 dni i pasażować komórki co 6 dni.</li>
 <li>Po co najmniej 5 pasażach rozbić neurosfery do pojedynczych komórek przy użyciu trypsyny i EDTA, a następnie hodować je w komorach elektrotaktycznych powlekanych poli-D-lizyną/lamininą (przygotowanych zgodnie z opisem w punkcie 2 poniżej). Przez cały czas stosować pożywkę wzrostową zawierającą suplement N2, bFGF i EGF, aby zachować właściwości NPC.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komory elektrotaktycznej
<ol>
 <li>Przygotować szklane paski o wymiarach 22 x 11 mm, dzieląc autoklawowane szkiełka podstawkowe o grubości no.1 i wymiarach 22 x 22 mm na pół za pomocą rysika diamentowego.</li>
 <li>Utworzyć wolnostojącą szklaną studzienkę o wymiarach wewnętrznych 22 x 10 mm, sklejając ze sobą cztery pionowo ustawione paski 22 x 11 mm za pomocą wysokopróżniowego smaru silikonowego. Pozostawić studzienki do całkowitego wyschnięcia i utwardzenia przez noc.</li>
 <li>Następnego dnia przymocować dwa szklane paski 22 x 11 mm równolegle do siebie, zachowując odstęp 10 mm, do dna szalki hodowlanej o średnicy 100 mm, używając smaru silikonowego. Odizolować obszar między paskami, umieszczając szkiełko podstawkowe 22 x 22 mm na każdym z końców, przymocowane do dna szalki smarem z trzech stron, z wyjątkiem strony najbliższej środkowi.</li>
 <li>Umieścić szklaną studzienkę przygotowaną w kroku 2.2 na szkiełkach podstawkowych w taki sposób, aby wewnętrzne ścianki stworzyły zamkniętą przestrzeń do wysiewu komórek na dno szalki. Uszczelnić wszystkie połączenia smarem silikonowym. Pokryć ten zamknięty obszar sekwencyjnie poli-D-lizyną, a następnie lamininą: dodać 1 ml poli-D-lizyny do komory i pozostawić na 5 min, aby poli-D-lizyna związała się z dnem szalki; przemyć komorę sterylnym PBS dwa razy, następnie rozcieńczyć lamininę w sterylnym PBS do stężenia 20 μg/ml i pokryć nią dno szalki. Pozostawić w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
 <li>Następnego dnia zebrać komórki i przygotować 1 ml zawiesiny zawierającej 1 x 10⁴ komórek. Usunąć lamininę ze szklanej studzienki, pozwalając jej całkowicie wyschnąć, i zastąpić ją 1 ml zawiesiny komórkowej. Umieścić szalkę w inkubatorze w temperaturze 37° C na minimum 4 godziny, aby umożliwić adhezję.</li>
 <li>Po osiągnięciu przez komórki odpowiedniej konfluencji usunąć całe medium z komory. Ostrożnie zdjąć szklaną studzienkę. Utworzyć „dach” nad komórkami, ostrożnie przymocowując za pomocą smaru silikonowego autoklawowane szkiełko podstawkowe 22 x 22 mm, rozpięte między dwoma paskami 22 x 11 mm. Przykryć komórki kilkoma kroplami medium, aby zapobiec ich wysychaniu.</li>
 <li>Utworzyć izolowany rezerwuar medium na każdym końcu komory, tworząc dwie wodoszczelne bariery ze smaru silikonowego, które biegną od jednej krawędzi szalki do drugiej, nad dachem komory. Wypełnić komorę świeżym medium, zapewniając przepływ z jednego rezerwuaru medium do drugiego. Przenieść szalkę z powrotem do inkubatora na 12 godzin, aby umożliwić regenerację komórek.</li>
</ol>
3. Przyłożenie pola elektrycznego do komory elektrotaktycznej
<ol>
 <li>Przygotuj pokrywkę do naczynia, wywiercając w niej dwa otwory, po jednym nad każdym zbiornikiem komory migracyjnej.</li>
 <li>Wymień całe medium w komorze na pożywkę hodowlaną zawierającą 25 mM buforu HEPES i przenieś naczynie do systemu obrazowania z kontrolą temperatury. Ustaw parametry eksperymentalne dla rejestracji time-lapse i wielopozycyjnej. Wyrównaj komorę tak, aby katoda i anoda znajdowały się odpowiednio po lewej i prawej stronie, co zapewni poziomy przebieg wektora EF w widoku przez mikroskop i w zapisie systemu obrazowania.</li>
 <li>Napełnij dwa zlewki roztworem Steinberga (58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca(NO3)2.4H20, 1,3 mM MgSO4.7H20 i 4,6 mM Trizma base, pH 7,4). Połącz oddzielną zlewkę z każdym zbiornikiem medium za pomocą wcześniej przygotowanych mostków szklanych (rurki szklane o długości ~13 cm i średnicy ~3 mm, wygięte w kształt litery U poprzez podgrzewanie w płomieniu palnika Bunsena), wypełnionych 2% (w/v) roztworem agaru Steinberga, przechodzącymi przez otwory w pokrywce. Zamknij obwód elektryczny, umieszczając elektrody Ag/AgCl podłączone do zasilacza DC w każdej zlewce z roztworem Steinberga.</li>
 <li>Ustaw pokrętło napięcia w zasilaczu na 0 i włącz urządzenie. Pomierz napięcie w komorze elektrotaktycznej, zwiększając wartość na pokrętle za pomocą woltomierza, a następnie dostosuj je do wymagań eksperymentalnych.</li>
 <li>Rozpocznij rejestrację time-lapse. Co godzinę wymieniaj medium i w razie potrzeby ponownie dostosuj napięcie. Do zbiorników można dodawać świeże medium, leki lub odczynniki chemiczne zgodnie z potrzebami. Podczas wymiany medium można rozważyć dwie poniższe opcje:
 <ol>
 <li>Opcja nr 1 – aby tymczasowo wstrzymać rejestrację time-lapse, ostrożnie wyjmij mostki szklane z komory, aby uniknąć poruszenia pokrywki, użyj sterylnej pipety Pasteura, by delikatnie zastąpić całe medium świeżym, włóż z powrotem mostki szklane, a następnie wznowij rejestrację.</li>
 <li>Opcja nr 2 – alternatywnie do wymiany medium można użyć specjalnie wykonanej pokrywki z 4 otworami (po dwa nad każdym zbiornikiem komory migracyjnej). Dwa otwory służą do połączenia mostków szklanych, a pozostałe dwa do wymiany medium. Opcja 2 umożliwia ciągłą rejestrację bez zakłóceń podczas wymiany medium.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
4. Przygotowanie organotypowego skrawka rdzenia kręgowego
<ol>
 <li>Przeprowadzić sekcję lędźwiowego rdzenia kręgowego u 2-tygodniowych myszy C57 BL/6.</li>
 <li>Pokroić rdzenie kręgowe na sekcje o grubości 500 μm za pomocą tnącego urządzenia do tkanek McIlwain.</li>
 <li>Rozdzielić sekcje pod mikroskopem anatomicznym i wybrać te z nienaruszoną strukturą strzałkową/osiową rdzenia kręgowego.</li>
 <li>Umieścić sekcje w szalce Petriego o średnicy 35 mm zawierającej 30 μl Matrigelu, starając się ulokować je jak najbliżej centrum, a następnie inkubować w inkubatorze z 5 % CO2 w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 min, aż białka Matrigelu samoorganizują się, tworząc cienką warstwę pokrywającą powierzchnię sekcji rdzenia kręgowego. Bardzo ważne jest upewnienie się, że Matrigel uległ całkowitej polimeryzacji; w razie potrzeby inkubować szalkę Petriego w 37 °C przez kolejne 30 min.</li>
 <li>Bardzo delikatnie dodać 4-6 ml pożywki DMEM/F-12 zawierającej 25 mM buforu HEPES i 15-20% płodowej surowicy cielęcej, tak aby uniknąć bezpośredniego przepływu pożywki na sekcję. Należy dopilnować, aby sekcja nie była całkowicie zanurzona w pożywce, pozostawiając powierzchnię eksplantów dobrze wystawioną na działanie powietrza. Wymieniać pożywkę dwa razy w tygodniu.</li>
</ol>
5. Iniekcja NPC znakowanych Hoechst 33342 do organotypowego skrawka rdzenia kręgowego
<ol>
 <li>Przygotować zawiesinę NPC o stężeniu 1 × 106 komórek/μl.</li>
 <li>Preinkubować zawiesinę komórek w medium z dodatkiem 5 μM Hoechst 33342 przez 30 min.</li>
 <li>Za pomocą szklanej kapilary powoli mikroiniekować 2 μl zawiesiny do skrawka rdzenia kręgowego pod mikroskopem. Należy upewnić się, że szklana kapilara przechodzi przez matrigel (część różowa pod mikroskopem) i dociera do wnętrza skrawka rdzenia kręgowego (tkanka szara pod mikroskopem); kapilarę należy pozostawić wewnątrz skrawka rdzenia kręgowego przez co najmniej 30 sekund, aby zapobiec wypłynięciu zawiesiny komórek. Płytkę Petri z zawartym skrawkiem rdzenia kręgowego umieścić w inkubatorze (37°C 5%CO2) i pozostawić na noc.</li>
 <li>Następnego dnia, w komorze elektrotaktycznej, przyłożyć pole elektryczne (EF) o natężeniu 500 mV/mm do skrawka rdzenia kręgowego zawierającego NPC znakowane Hoechst 33342 (stosując metody opisane w punkcie 3).</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Pod wpływem szeregu fizjologicznych pól elektrycznych (EF) komórki NPC wykazywały silnie ukierunkowaną migrację w stronę katody (Rysunek 1). Tą samą obserwację poczyniono również na poziomie pojedynczych komórek w organotypowym skrawku rdzenia kręgowego. ex vivo model, środowisko 3D naśladujące in vivo warunki (rycina 2).
<img alt="Analiza ruchu komórek ze strzałkami śledzenia; wykres przedstawia ścieżki, środek masy, punkty danych." src="/files/ftp_upload/3453/3453fig1.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. NPCs wykazują ukierunkowaną migrację w EFs. PCs wykazały silnie ukierunkowaną migrację w stronę katody po narażeniu na EFs; czerwone linie i niebieskie strzałki reprezentują trajektorie i kierunek ruchu komórek (A). B przedstawia ścieżki migracji NPCs. Pasek skali: 50 μm.
<img alt="Time-lapse migracji komórek; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; analiza eksperymentu chemotaksji." src="/files/ftp_upload/3453/3453fig2.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przeszczepione NPC wykazują kierunkową migrację w stronę katody w organotypowym skrawku rdzenia kręgowego. (A) NPC znakowane Hoechst 33342 zostały przeszczepione do organotypowego skrawka rdzenia kręgowego w punkcie początkowym traktowania polem elektrycznym (EF). NPC migrowały kierunkowo w stronę katody przez 2,5 godziny, po czym odwrócono polaryzację EF (B). Zmiana polaryzacji EF wywołała gwałtowny odwrót elektrotaksji w stronę nowej katody (C). (D) Obraz przeszczepionych NPC wewnątrz skrawka rdzenia kręgowego na koniec rejestracji time-lapse. (E) Rekonstrukcja 3D przeszczepionych NPC wewnątrz skrawka rdzenia kręgowego. Sekcje skanowania 3D miały grubość 300 μm, zaczynając od środka i kończąc na dole skrawka. Linie przerywane wskazują względne pozycje tej samej populacji przeszczepionych komórek w punktach początkowym, odwrócenia i końcowym traktowania EF (odpowiednio A - C). Groty strzałek wskazują tę samą populację NPC znakowanych Hoechst 33342. Pasek skali: 50 μm.

<ol><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+with+electric+potential%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Wound healing with electric potential.</a> N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).</li>
<li>McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+cell+behavior+electrically%3A+current+views+and+future+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling cell behavior electrically: current views and future potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).</li>
<li>Borgens, R. B., Jaffe, L. F., Cohen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+and+persistent+electrical+currents+enter+the+transected+lamprey+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Large and persistent electrical currents enter the transected lamprey spinal cord.</a> PNAS. 77, 1209-1209 (1980).</li>
<li>Shapiro, S., Borgens, R., Pascuzzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillating+field+stimulation+for+complete+spinal+cord+injury+in+humans%3A+a+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg.+Spine%22%5BJournal%5D)">Oscillating field stimulation for complete spinal cord injury in humans: a phase 1 trial.</a> J. Neurosurg. Spine. 2, 3-3 (2005).</li>
<li>Zhao, M., Song, B., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-gamma+and+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN.</a> Nature. 442, 457-457 (2006).</li>
<li>Yao, L., Shanley, L., McCaig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+applied+electric+fields+guide+migration+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons.</a> J. Cell. Physiol. 216, 527-527 (2008).</li>
<li>Li, L., El-Hayek, Y. H., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-current+electrical+field+guides+neuronal+stem%2Fprogenitor+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct-current electrical field guides neuronal stem/progenitor cell migration.</a> Stem Cells. 26, 2193-2193 (2008).</li>
<li>Meng, X., Arocena, M., Penninger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp. Neurol. 227, 210-210 (2011).</li>
<li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+promote+neurite+extension+in+organotypic+spinal+cord+slice%3A+significance+for+cell+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil.+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy.</a> Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).</li>
<li>Shichinohe, H., Kuroda, S., Tsuji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+promote+neurite+extension+in+organotypic+spinal+cord+slice%3A+significance+for+cell+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil.+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy.</a> Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).</li>
<li>Song, B., Gu, Y., Pu, j <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocol. 2, 1479-1479 (2007).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Stosowane przez nas protokoły opierają się na wcześniejszych badaniach5,11. Dzięki tym metodom można utrzymać stabilną hodowlę i warunki prądu elektrycznego podczas przykładania EF poprzez mostki agarowe, roztwór Steinberga oraz elektrody Ag/AgCl do komórek lub skrawków hodowanych w specjalnie zaprojektowanych komorach elektrotaktycznych o ustandaryzowanych i precyzyjnych wymiarach. Głębokość komór można dostosować do różnych grubości próbek11, a w przypadku komórek, rozmiar komory można zmodyfikowa...

<table><tbody><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF-basic</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0026</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>Suplement N2 (100X) w formie ciekłej</td><td>Invitrogen</td><td>02048</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka DMEM/F12 (wysoka zawartość glukozy)</td><td>Invitrogen</td><td>31330-095</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lizyna</td><td>EMD Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Naturalna laminina mysia</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Macierz błony podstawnej z obniżoną zawartością czynników wzrostu (Matrigel)</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Krojanka do tkanek McIlwaina</td><td>The Mickle Laboratory Engineering Co Ltd</td><td>TC752-PD</td><td></td></tr><tr><td>Smar silikonowy wysokopróżniowy Dow Corning</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td></td></tr></tbody></table>

sterowana polem elektrycznym migracja kierunkowa komórek progenitorowych neuronów w środowiskach 2d i 3d

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenne pola elektryczne (EF) występują naturalnie in vivo i odgrywają kluczową rolę podczas rozwoju i regeneracji tkanek oraz narządów, w tym ośrodkowego układu nerwowego1,2. Endogenne EF są generowane przez komórkową regulację transportu jonowego w połączeniu z oporem elektrycznym komórek i tkanek. Wykazano, że zastosowanie terapii EF może wspomagać funkcjonalną naprawę uszkodzeń rdzenia kręgowego u zwierząt i ludzi3,4. W szczególności udowodniono, że migracja komórek sterowana przez EF zachodzi w szerokiej gamie typów komórek5,6, w tym w komórkach progenitorowych neuronów (NPC)7,8. Stosowanie pól elektrycznych prądu stałego (DC) nie jest powszechną techniką w większości laboratoriów. Wcześniej opisaliśmy szczegółowe protokoły stosowania DC EF w kulturach komórek i tkanek5,11. W niniejszym materiale prezentujemy demonstrację wideo standardowych metod opartych na obliczonej natężeniu pola w celu przygotowania środowisk 2D i 3D dla NPC oraz zbadania odpowiedzi komórkowych na stymulację EF zarówno w warunkach wzrostu pojedynczych komórek w 2D, jak i w organotypowym skrawku rdzenia kręgowego w 3D. Skrawek rdzenia kręgowego jest idealną tkanką biorcą do badania zachowań NPC ex vivo po transplantacji, ponieważ organizacja cytoarchitektoniczna tkanki jest dobrze zachowana w tych kulturach9,10. Ponadto ten model ex vivo umożliwia procedury, które nie są technicznie wykonalne przy śledzeniu komórek in vivo, dzięki zastosowaniu rejestracji time-lapse na poziomie pojedynczej komórki. Krytycznie istotne jest ocenianie zachowań komórek nie tylko w środowisku 2D, ale także w organotypowych warunkach 3D, które naśladują środowisko in vivo. System ten pozwoli na obrazowanie o wysokiej rozdzielczości z wykorzystaniem naczyń z kryształem przedmiotowym w kulturze tkanek lub narządów, z 3D śledzeniem migracji pojedynczych komórek in vitro oraz ex vivo, i może stanowić krok pośredni przed przejściem do paradygmatów in vivo.

Niniejszy protokół demonstruje metody wykorzystywane do tworzenia środowisk 2D i 3D w specjalnie zaprojektowanych komorach elektrotaktycznych, które umożliwiają śledzenie komórek in vivo/ex vivo przy użyciu rejestracji time-lapse na poziomie pojedynczych komórek, w celu zbadania galwanotaksji/elektrotaksji oraz innych odpowiedzi komórkowych na elektryczne pola (EFs) prądu stałego (DC).

Sterowana polem elektrycznym migracja kierunkowa komórek progenitorowych neuronów w środowiskach 2D i 3D

Endogenne pola elektryczne (EF) występują naturalnie in vivo i odgrywają krytyczną rolę podczas rozwoju i regeneracji tkanek oraz narządów, w tym...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zarejestrowanie wpływu przyłożonych pól elektrycznych na migrację komórek progenitorowych neuronów w kulturach 2D oraz modelach 3D ex vivo. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację i ekspansję komórek progenitorowych neuronów in vitro. Drugim krokiem jest przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek progenitorowych neuronów.Następnie, w celu przygotowania hodowli 2D, komórki progenitorowe neuronów wysiewa się do specjalnie zaprojektowanych komór elektrotaktycznych. Alternatywnie, do przygotowania modelu 3D ex vivo, komórki progenitorowe neuronów znakuje się białkiem Hook3 i wstrzykuje do organotypowego modelu skrawka rdzenia kręgowego. Ostatecznie, do komór elektrotaktycznych przykłada się pole elektryczne i wykonuje rejestrację time-lapse, aby wykazać, że komórki progenitorowe migrują w stronę katody pola elektrycznego zarówno w środowisku 2D, jak i 3D.Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona nowatorską metodę śledzenia na żywo migracji poszczególnych komórek indukowanej polem elektrycznym po przeszczepieniu ich do 3D modelu organotypowego, który ściśle przypomina środowisko naturalne. Metoda ta może nie tylko dostarczyć wglądu w technikę elektrokinetyczną oraz migrację komórek neuroepithelialnych przeszczepionych do skrawka rdzenia kręgowego, ale może być również zastosowana w innych systemach, takich jak modele małych skrawków mózgu. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj szklane paski o wymiarach 22 na 11 mm, dzieląc autoklawowane szkło o wymiarach 22 na 22 mm.Przeciąć szkiełka podstawkowe o grubości nr 1 na pół za pomocą rylca diamentowego. Następnie stworzyć wolnostojącą studzienkę szklaną o wymiarach wewnętrznych 22 na 10 mm, sklejając cztery pionowo ustawione paski o wymiarach 22 na 11 mm za pomocą wysokopróżniowego smaru silikonowego; pozostawić studzienkę do całkowitego wyschnięcia i utwardzenia przez noc. Następnego dnia przytwierdzić dwa szklane paski o wymiarach 22 na 11 mm równolegle do siebie, zachowując odstęp 10 mm, do dna naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm, używając smaru silikonowego.Następnie uszczelnij obszar pomiędzy tymi paskami, przytwierdzając szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 by 22 milimetrów za pomocą smaru silikonowego. Umieść wgłębnik szklany na szkiełkach nakrywkowych w taki sposób, aby ścianki wewnętrzne stworzyły ograniczoną przestrzeń do wysiewania komórek. Wszystkie połączenia uszczelnij smarem silikonowym.Pokryj ten ograniczony obszar sekwencyjnie polilizyną, a następnie lamininą, zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie. W tej procedurze pobierz mózgi od myszy w dniach E 14 do E 16 i umieść je w zimnej pożywce podstawowej D-M-E-M-F 12. Następnie usuń oponami mózgowymi pod mikroskopem anatomicznym.Następnie przenieś mózgi do 35 milimetrowejy szalki Petriego. Za pomocą precyzyjnej pęsety rozdziel mózgi na fragmenty tkanki. Następnie przenieś je do 15 mililitrowej probówki do wirowania.Próbki wirowano z prędkością 800 RPM przez trzy minuty w celu usunięcia zanieczyszczeń D. Następnie do próbek dodano A-D-M-E-M-F 12 zawierający BFDF oraz DGF. Próbki wymieszano za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra.Następnie uzyskaj zawiesinę pojedynczych komórek za pomocą sitka do komórek. Wysiej komórki do kolb w zagęszczeniu od 20 000 do 50 000 komórek na mililitr. Następnie co trzy dni wymieniaj całkowicie pożywkę, co obejmuje wirowanie komórek przy 1 300 RPM przez pięć minut.Odlej nadlewkę, zawieś PT w świeżej pożywce i przełóż komórki z powrotem do kolby co sześć dni, po upływie co najmniej pięciu. Przenieś NEUROSPHERES do probówki o pojemności 15 ml i wiruj przy 1 500 RPM przez pięć minut. Odlej nadlewkę.Resuspenduj osad w TRIS-EDTA, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Przed wykonaniem zliczenia komórek przygotuj jeden mililitr zawiesiny zawierającej 10 000 komórek. Następnie usuń lamininę z dołka szklanego i pozwól jej całkowicie wyschnąć.Zastąp ją jednym mililitrem zawiesiny komórkowej. Następnie umieść szalkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na minimum cztery godziny, aby umożliwić adhezję. Po osiągnięciu przez komórki odpowiedniej konfluencji, usuń pożywkę z komory.Ostrożnie usuń szkło. Następnie utwórz „dach” nad komórkami, mocując ostrożnie za pomocą smaru silikonowego szkiełko nakrywowe do autoklawu o wymiarach 22 by 22 milimetrów pomiędzy dwiema listwami o wymiarach 22 by 11 milimetrów. Pamiętaj, aby pokryć komórki kilkoma kroplami pożywki, aby zapobiec ich wysychaniu.Następnie utworzyć odizolowane zbiorniki z pożywką na każdym końcu komory, tworząc dwie wodoszczelne bariery z smaru silikonowego, rozciągające się od jednego końca naczynia do drugiego. Wypełnić komorę świeżą pożywką, zapewniając przepływ z jednego zbiornika do drugiego. Następnie umieścić naczynie z powrotem w inkubatorze na 12 godzin w celu regeneracji komórek.W następnym kroku przygotuj pokrywkę do naczynia, wiercąc w niej dwa otwory, z których każdy znajduje się nad jednym z rezerwuarów komory migracyjnej. Następnie wymień medium w komorze na medium hodowlane zawierające 25 milimolowy bufor HIPPS. Po tym czasie przenieś naczynie do systemu obrazowania z kontrolą temperatury.Ustaw parametry eksperymentalne dla rejestracji w odstępach czasu (time lapse) oraz wielopozycyjnej. Wyrównaj komorę tak, aby katoda i anoda znajdowały się odpowiednio po lewej i prawej stronie, co zapewni poziomy przebieg wektora pola elektrycznego w obrazie mikroskopowym i systemie obrazowania. Następnie napełnij dwa zlewki.Przy użyciu roztworu Steinberga. Połącz oddzielny zlew z każdym zbiornikiem z pożywką, wykorzystując wcześniej przygotowane mostki szklane wypełnione 2% roztworem agaru Steinberga. Następnie umieść srebrne elektrody podłączone do zasilacza prądu stałego w roztworze Steinberga.W każdym zlewce ustaw pokrętło napięcia zasilacza na zero i włącz urządzenie. Mierząc napięcie w komorze elektrotaktycznej za pomocą woltomierza, stopniowo zwiększaj wartość na pokrętle napięcia. Następnie dostosuj napięcie zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.Następnie rozpocznij nagrywanie poklatkowe. Wymień medium i w razie potrzeby ponownie dostosuj napięcie. Co godzinę do zbiorników można dodawać świeże medium, leki lub odczynniki chemiczne, zgodnie z potrzebami.Wykorzystując dodatkowe otwory wywiercone w pokrywie szalki hodowlanej, z których każdy znajduje się nad zbiornikiem z pożywką. Na tym etapie należy wypreparować rdzenie kręgowe odcinka lędźwiowego u dwutygodniowych myszy. Następnie, używając krojarki do tkanek Machel-Wane pod mikroskopem anatomicznym, należy pociąć rdzenie kręgowe na przekroje o grubości 500 micron.Rozdziel plastry i wybierz te, w których struktura rdzenia kręgowego w przekroju strzałkowym i osiowym jest nienaruszona. Następnie umieść plastry w 100 milimetrowej szalce Petriego zawierającej 30 µL żelu MA. Umieść je jak najbliżej środka.Przechowuj je w inkubatorze z 5% carbon dioxide w temperaturze 37 degrees Celsius przez co najmniej 30 minut. Aby białka matrigelu mogły samoorganizować się i utworzyć cienką warstwę pokrywającą powierzchnię skrawków rdzenia kręgowego, bardzo ważne jest, aby matrigel został całkowicie zmontowany. W razie potrzeby inkubuj szalkę Petriego w temperaturze 37 degrees Celsius przez kolejne 30 minut, a następnie dodaj od czterech do sześciu mililitrów pożywki D-M-E-M-F 12 zawierającej 25 millimolar heis buffer oraz 15 do 20% fetal calf serum.Bardzo delikatnie, aby uniknąć bezpośredniego przepływu medium na plastry, upewnij się, że plastry nie są całkowicie zanurzone w medium, pozostawiając powierzchnię bakłażanów dobrze wystawioną na powietrze. Wymieniaj medium dwa razy w tygodniu. Teraz inkubuj zawiesinę komórek progenitorowych neuronów w medium z pięciomikromolarnymi hakami.3, 3, 3, 4, 2 przez 30 minut. Pod mikroskopem, za pomocą szklanej kapilary, wstrzyknij mikroobjętościowo 2 µL zawiesiny do skrawka rdzenia kręgowego. Powoli upewnij się, że szklana kapilara przechodzi przez matrigel i dociera do wnętrza skrawka rdzenia kręgowego.Pozostaw szklaną rurkę wewnątrz skrawka rdzenia kręgowego przez co najmniej 30 sekund, aby uniknąć zawieszenia komórek. Następnie umieść szalkę Petriego zawierającą skrawek rdzenia kręgowego w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 na noc. Następnego dnia zbuduj wokół skrawka rdzenia kręgowego komorę elektrotaktyczną zawierającą haczyki 3 3 3 4 2 z oznakowanymi komórkami neurogenezy, a następnie przyłóż pole elektryczne o natężeniu 500 mV/mm.Tutaj komórki progenitorowe neuronów wykazują silnie ukierunkowaną migrację w stronę katody pod wpływem pól elektrycznych; czerwone linie i niebieskie strzałki reprezentują odpowiednio trajektorie i kierunek ruchu komórek. A tutaj znajduje się wykres przedstawiający ścieżki migracji. Tutaj przedstawiono komórki progenitorowe neuronów znakowane hooks 3 3, 3, 4 2.Zostały one przeszczepione do organotypowego skrawka rdzenia kręgowego w momencie rozpoczęcia zabiegu polem elektrycznym. Po tym, jak progenitorowe komórki neuronalne migrowały kierunkowo w stronę katody przez 2,5 godziny, polaryzację pola elektrycznego odwrócono. Zmiana polaryzacji pola elektrycznego wywołała gwałtowny zwrot aksonów w kierunku nowej katody.Oto obraz przeszczepionych komórek progenitorowych neuronów w przekroju rdzenia kręgowego. Na końcu nagrania poklatkowego przedstawiona jest rekonstrukcja 3D przeszczepionych komórek progenitorowych neuronów w przekroju rdzenia kręgowego. Masowo opanowane.Technika ta, po odpowiednim wdrożeniu, może zostać przeprowadzona w ciągu dwóch tygodni. Obecnie otwiera ona przed badaczami w dziedzinie biologii komórki możliwość badania migracji komórek progenitorowych neuronów w systemach hodowli 2D i 3D w odpowiedzi na przyłożone pole elektryczne.

electric-field-controlled-directed-migration-neural-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Polem kontrolowana migracja komórek progenitorów neuronalnych w środowiskach 2D i 3D

Demonstrujemy, że nadekspresja receptorówy czynnika wzrostu naskórka (EGFR) zwiększa ruchliwość neuralnych komórek macierzystych (NSCs) z wykorzystaniem nowatorskiego urządzenia mikroprzepływowego opartego na żelu agarozy. Technologia ta może być łatwo zaadaptowana do innych systemów komórek ssaków, w których źródła komórek są ograniczone, takie jak ludzkie neuralne komórki macierzyste, a czas realizacji badania jest krytyczny.

Ocena mobilności neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem mikroprzepływowego urządzenia opartego na żelu agarozy

W tym protokole pokazujemy, jak konstruować niestandardowe komory, które pozwalają na zastosowanie pola elektrycznego prądu stałego, aby umożliwić obrazowanie poklatkowe translokacji komórek prekursorowych pochodzenia nerwowego w dorosłym mózgu podczas galwanotaksji.

Test galwanotaksji do analizy kinetyki migracji neuronalnych komórek prekursorowych w zewnętrznie przyłożonym polu elektrycznym prądu stałego

Ten film demonstruje użycie mikroprzepływowego chipa pokrytego macierzą zewnątrzkomórkową do różnicowania nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych lub NPC za pomocą stymulacji elektrycznej. Po wysianiu i przyleganiu do pokrytego obszaru NPC rosną, a zastosowanie prądu stałego wyzwala ich różnicowanie w neurony, astrocyty i oligodendrocyty.

Różnicowanie nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych wywołane stymulacją elektryczną

Prezentujemy test migracji komórek ex vivo, który pozwala na precyzyjne określenie potencjału migracji komórek grzebienia nerwowego jelit w obecności różnych czynników wzrostu.

Ilościowy test migracji komórek dla mysich jelitowych progenitorów nerwowych

Migracja neuroblastów jest kluczowym krokiem w neurogenezie poporodowej. Opisany tutaj protokół może być wykorzystany do zbadania roli kandydatów na regulatory migracji neuroblastów poprzez zastosowanie nukleofekcji DNA/małego RNA spinki do włosów (shRNA) oraz testu migracji 3D z neuroblastami wyizolowanymi z pourodzeniowego strumienia migracyjnego rostralnego gryzoni.

Nukleofekcja neuroblastów gryzoni do badania migracji neuroblastów in vitro

Prezentujemy metodę zastosowania fizjologicznego pola elektrycznego do migrujących, unieśmiertelnionych komórek prostaty w specjalnie wykonanej komorze galwanotaksji. Za pomocą tej metody wykazujemy, że 2 linie nienowotworowych komórek prostaty wykazują różne stopnie kierunkowości migracji w terenie.

Wykorzystanie specjalnie zaprojektowanych komór galwanotaksji do badania kierunkowej migracji komórek prostaty

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Prezentujemy rozwój samoorganizujących się, trójwymiarowych wiązek podłużnie wyrównanych somatów astrocytarnych i procesów w nowej obudowie z biomateriału. Te zaprojektowane "żywe rusztowania", wykazujące średnicę w skali mikronów, a jednocześnie wydłużające się na centymetry, mogą służyć jako stanowiska testowe do badania mechanizmów neurorozwojowych lub ułatwiać neuroregenerację poprzez kierowanie migracją neuronów i/lub odnajdywaniem ścieżek aksonalnych.

Trójwymiarowe, wyrównane sieci astrocytów oparte na inżynierii tkankowej w celu podsumowania mechanizmów rozwojowych i ułatwienia regeneracji układu nerwowego

W tym badaniu prezentujemy protokół różnicowania nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (NPC) indukowanych wyłącznie przez stymulację impulsami prądu stałego (DC) w systemie mikroprzepływowym.

Różnicowanie neuronalnych komórek prekursorowych pod wpływem pola elektrycznego w urządzeniach mikroprzepływowych

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę badania migracji komórek progenitorowych nerwowych pod wpływem pola elektrycznego w środowiskach 2D i 3D. Technika ta umożliwia śledzenie kierunkowego ruchu komórek w czasie rzeczywistym.

Sterowana polem elektrycznym migracja kierunkowa komórek progenitorowych neuronów w środowiskach 2D i 3D

Przeglądaj więcej filmów