Sterowana polem elektrycznym ukierunkowana migracja neuronalnych komórek progenitorowych w środowiskach 2D i 3D

Ogólnym celem tej procedury jest zarejestrowanie wpływu zastosowanych pól elektrycznych na migrację neuronalnych komórek progenitorowych w hodowli 2D i modelach 3D ex vivo. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie i ekspansję neuronalnych neuronalnych komórek progenitorowych in vitro. Drugim krokiem jest przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki progenitorowej neuronów.

Następnie, w celu przygotowania hodowli 2D, neuronalne komórki progenitorowe są siane w specjalnie zaprojektowanych komorach elektrotaktycznych. Alternatywnie, w celu przygotowania modelu 3D ex vivo, neuronalne komórki progenitorowe są oznaczane haczykami 3, 3, 3, 4, 2 i wstrzykiwane do modelu organotypowego wycinka rdzenia kręgowego. Ostatecznie do komór elektrycznych przykładane jest pole elektryczne i wykonywany jest zapis poklatkowy, aby pokazać, że komórki progenitorowe migrują w kierunku katody pola elektrycznego zarówno w środowiskach 2D, jak i 3D.

Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona nowatorską metodę śledzenia na żywo indukowanej polem elektrycznym migracji pojedynczych komórek po przeszczepieniu do organotypowego modelu 3D, bardzo zbliżonego do środowiska naturalnego. Metoda ta może nie tylko zapewnić wprowadzenie do techniki elektro, migracji komórek nerwowych entalnych przeszczepionych do wycinka rdzenia kręgowego, ale może być również zastosowana do innych systemów, które jako modele wycinków mózgu są małe. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj paski szkła o wymiarach 22 na 11 milimetrów, dzieląc autoklaw 22 na 22 milimetry.

Okładka o grubości pierwszej przesuwa się na pół za pomocą pisaka diamentowego. Następnie stwórz wolnostojącą szklaną studnię o wymiarach wewnętrznych, 22 na 10 milimetrów, sklejając cztery pionowe, stojące paski o wymiarach 22 na 11 milimetrów razem z wysokopróżniowym smarem silikonowym, pozostaw studnię do całkowitego wyschnięcia i stwardnienia przez noc. Następnego dnia przymocuj 2 paski szkła o wymiarach 22 na 11 milimetrów równolegle do siebie, pozostawiając odstęp 10 milimetrów od podstawy 100-milimetrowej naczynia hodowlanej za pomocą smaru silikonowego.

Następnie uszczelnij obszar między tymi paskami, przyklejając szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 22 milimetry ze smarem silikonowym. Umieść szklankę dobrze na szkiełkach nakrywkowych, tak aby ściany wewnętrzne tworzyły ograniczoną przestrzeń do wysiewu komórek. Uszczelnij wszystkie połączenia smarem silikonowym.

Pokryj ten ograniczony obszar kolejno poli de lycyną, a następnie lamininą, jak opisano w dołączonym manuskrypcie. W tej procedurze należy pobrać mózgi myszy od E 14 do E 16 i umieścić je w zimnym podłożu podstawowym D-M-E-M-F 12. Następnie usuń opony mózgowe pod mikroskopem anatomicznym.

Następnie przenieś mózgi na 35-milimetrową szalkę Petriego. Użyj cienkich kleszczy, aby rozdzielić mózg na fragmenty tkanki. Następnie przenieś je do wirówki probówkowej o pojemności 15 mililitrów.

Próbki pobierać z prędkością 800 obr./min przez trzy minuty w celu usunięcia zanieczyszczeń D. Następnie do próbek A-D-M-E-M-F 12 zawierające BFDF i DGF. Tritrate zjadł je jednomililitrową pipetą.

Następnie uzyskać zawiesinę jednokomórkową z sitkiem do komórek. Umieść komórki w kolbach w ilości od 20 000 do 50 000 komórek na mililitr. Następnie co trzy dni wykonuj pełną wymianę pożywki, która polega na odwirowaniu komórek z prędkością 1 300 obr./min przez pięć minut.

Odrzucenie supinatu Resus, zawieszenie PT w świeżej pożywce i powrót komórek do kolby komórek co sześć dni po co najmniej pięciu porcjach. Przenieś NEUROSPHERES do 15-mililitrowej wirówki probówkowej z prędkością 1 500 obr./min na pięć minut. Odrzuć supinat.

Ponownie zawiesić osad w cyklach EDTA, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki. Przed wykonaniem zliczania komórek należy przygotować jeden mililitr zawiesiny zawierającej 10 000 komórek. Następnie dobrze usuń lamininę ze szklanki i pozostaw do całkowitego wyschnięcia.

Zastąp go jednym mililitrem zawiesiny komórek. Następnie umieść naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej cztery godziny, aby umożliwić nasadki. Gdy komórki będą wystarczająco zlewne, usuń pożywkę z komory.

Ostrożnie zdejmij szkło. Następnie uformuj dach nad komórkami, ostrożnie mocując szklane szkiełko nakrywkowe autoklawu o wymiarach 22 na 22 milimetry między paskami o wymiarach 2 22 na 11 milimetrów ze smarem silikonowym. Pamiętaj, aby przykryć komórki kilkoma kroplami pożywki, aby uniknąć wysuszenia.

Następnie uformuj izolowany zbiornik pożywki na każdym końcu komory, tworząc dwie wodoszczelne silikonowe bariery tłuszczowe, które biegną od jednego końca naczynia do drugiego. Napełnij komorę świeżym medium, zapewniając przepływ z jednego zbiornika medium do drugiego. Następnie włóż naczynie z powrotem do inkubatora na 12 godzin, aby umożliwić regenerację komórek.

W kolejnym kroku przygotuj pokrywkę, aby przykryć naczynie, wiercąc dwa otwory, po jednym umieszczonym nad każdym zbiornikiem komory migracyjnej. Następnie zastąp pożywkę w komorze pożywką hodowlaną zawierającą 25 milimetrowy bufor hipisów. Następnie przenieś naczynie do systemu obrazowania z kontrolowaną temperaturą.

Ustaw parametry eksperymentalne dla nagrywania poklatkowego i wielopozycyjnego. Ustaw komorę tak, aby katoda i anoda znajdowały się odpowiednio po lewej i prawej stronie, aby zapewnić, że wektor pola elektrycznego przebiega poziomo, jak ogląda się pod mikroskopem i rejestruje w systemie obrazowania. Następnie napełnij dwie zlewki.

Z rozwiązaniem Steinberga. Podłącz oddzielną zlewkę do każdego zbiornika pożywki za pomocą wstępnie przygotowanych szklanych mostków wypełnionych 2% roztworem agaru Steinberga. Następnie umieść srebrne elektrody podłączone do zasilacza prądu stałego w roztworze Steinberga.

W każdej zlewce ustaw pokrętło napięcia na zasilaczu na zero i włącz je. Zmierz napięcie w komorze elektrotaktycznej za pomocą miernika napięcia, jednocześnie przekręcając pokrętło napięcia. Następnie dostosuj napięcie do wymagań eksperymentalnych.

Następnie rozpocznij nagrywanie poklatkowe. Wykonaj wymianę medium i ponownie wyreguluj napięcie zgodnie z wymaganiami. Co godzinę do zbiorników mogą być dodawane świeże, średnie leki lub środki chemiczne, w zależności od potrzeb.

Za pomocą dodatkowych otworów wywierconych w pokrywie naczynia hodowlanego, po jednym umieszczonym nad każdym zbiornikiem pożywki. Na tym etapie przeprowadź sekcję lędźwiowego rdzenia kręgowego dwutygodniowych myszy. Następnie pokrój rdzeń kręgowy na odcinki o grubości 500 mikronów za pomocą rozdrabniacza do tkanek pod mikroskopem anatomicznym.

Oddziel plastry i wybierz te, które mają nienaruszoną strzałkową osiową strukturę rdzenia kręgowego. Następnie umieść plastry na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 30 mikrolitrów żelu MA. Umieść je jak najbliżej środka.

Trzymaj je w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut. Aby białka żelu matri mogły się samoorganizować, wytwarzać cienką warstwę pokrywającą powierzchnię wycinków rdzenia kręgowego, bardzo ważne jest, aby żel matri został całkowicie złożony. Inkubować szalkę Petriego w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kolejne 30 minut, jeśli to konieczne, a następnie dodać od czterech do sześciu mililitrów pożywki D-M-E-M-F 12 zawierającej 25 milimolowy bufor heis i 15 do 20% płodowej surowicy cielęcej.

Bardzo delikatnie, aby uniknąć spływu pożywki bezpośrednio na plastry, upewnij się, że plastry nie są całkowicie zanurzone w podłożu, pozostawiając powierzchnię bakłażanów dobrze wystawioną na działanie powietrza. Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu. Teraz inkubuj zawiesinę nerwowych komórek progenitorowych w pożywce za pomocą pięciu haczyków mikromolowych.

3, 3, 3, 4, 2 przez 30 minut. Pod mikroskopem użyj szklanej rurki kapilarnej, aby mikrowstrzyknąć dwa mikrolitry zawiesiny do wycinka rdzenia kręgowego. Powoli upewnij się, że szklana rurka kapilarna przechodzi przez matrycę i dociera do wnętrza wycinka rdzenia kręgowego.

Trzymaj szklaną rurkę wewnątrz wycinka rdzenia kręgowego przez co najmniej 30 sekund, aby uniknąć zawieszenia komórek. Przebiegnij, a następnie umieść szalkę Petriego zawierającą wycinek rdzenia kręgowego w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5 centami dwutlenku węgla na noc. Następnego dnia zbuduj komorę elektrotaktyczną wokół wycinka rdzenia kręgowego zawierającego haki 3 3 3 4 2 oznaczone komórkami neurogenezy przed zastosowaniem pola elektrycznego o napięciu 500 miliwoltów na milimetr.

Tutaj nerwowe komórki progenitorowe wykazują silnie ukierunkowaną migrację w kierunku katody pod wpływem pól elektrycznych, czerwone linie i niebieskie strzałki reprezentują odpowiednio trajektorie i kierunek ruchu komórki. A oto wykres pokazanych ścieżek migracji. Oto neuronalne komórki progenitorowe oznaczone haczykami 3 3, 3, 4 2.

Przeszczepiono je do organotypowego wycinka rdzenia kręgowego w punkcie początkowym leczenia polem elektrycznym. Po tym, jak neuronalne komórki progenitorowe migrowały kierunkowo w kierunku katody przez 2,5 godziny, polaryzacja pola elektrycznego została odwrócona. Zmiana polaryzacji pola elektrycznego spowodowała gwałtowne odwrócenie axxis w kierunku nowej katody.

Oto obraz przeszczepionych nerwowych komórek progenitorowych w obrębie wycinka rdzenia kręgowego. Na końcu nagrania poklatkowego i rekonstrukcji 3D przeszczepionych nerwowych komórek progenitorowych w obrębie wycinka rdzenia kręgowego pokazano tutaj. Masa opanowana.

Tę technikę można wykonać w ciągu dwóch tygodni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo po jej opracowaniu. Technika ta toruje obecnie drogę naukowcom zajmującym się biologią komórki do zbadania migracji nerwowych komórek progenowych w systemach hodowli 2D i 3D w odpowiedzi i zastosowaniu do pola elektrycznego.