Dynamika dopaminy presynaptycznej w skrawkach prążkowia mózgu z wykorzystaniem szybkiej cyklicznej woltamperometrii skanującej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie ogólnego protokołu szybkiego skanowania cyklicznego w telemetrii V plastrów tkanki. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez wstępne przygotowanie tkanki mózgowej do cięcia w płaszczyźnie czołowej, a następnie umieszczenie elektrod w konkretnym, badanym obszarze mózgu.

Kolejnym krokiem jest przyłożenie napięcia w formie przebiegu trójkątnego poprzez elektrodę w celu detekcji dopaminy. Na koniec do skrawka mózgu podaje się wybrany środek farmakologiczny i obserwuje jego wpływ na presynaptyczną dynamikę dopaminy. Ostatecznie protokół ten pozwala wykazać zmiany w presynaptycznej dynamice dopaminy, takie jak stymulowane uwalnianie dopaminy oraz szybkość wychwytu dopaminy, przy użyciu szybkiej skanującej woltamperometrii cyklicznej.

Choć metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w dynamikę dopaminy przedsynaptycznej, można ją zastosować również do innych układów, w tym u różnych zwierząt i dla innych neuroprzekaźników, takich jak szczury i muszki owocowe oraz odpowiednio serotonina i norepinefryna, co demonstrują Francis Mena, MEA Khalid i Erin oo, doktoranci z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, zgodnie z towarzyszącym manuskryptem, należy przygotować trzy rodzaje roztworów sztucznego płynu mózgo-rdzeniowego: sacharozowy A-C-S-F, roztwór A-C-S-F do pomiarów woltamperometrycznych oraz zmodyfikowany roztwór A-CSF do kalibracji elektrod. Następnie należy przelać 10 ml sacharozowego A-CSF do małego zlewka i umieścić go w pojemniku z lodem. Następnie w pojemniku z lodem należy umieścić szybkoschnący klej Loctite.

Następnie przygotuj żyletkę oraz niezbędne narzędzia do sekcji, takie jak pęseta, szpatułka i nożyczki, przecierając je wacikiem nasączonym alkoholem. Po tym uśmierć mysz poprzez dekapitację i szybko wyjmij jej mózg. Umieść mózg w zlewce z lodowatym sacharozą, A CSF, na około 10 minut.

W międzyczasie należy przygotować mikrotom VIBRAM do krojenia. Do kąpieli z próbką należy wsypać kruszony lód. Następnie należy umieścić komorę z próbką w urządzeniu Vibram i mocno ją zamocować.

Dodać więcej lodu wokół komory z próbką, aby wypełnić luki, upewniając się, że lód nie dostał się do wnętrza komory. Następnie umieścić oczyszczone żyletkę w uchwycie na ostrze. Po tym wypełnić komorę z próbką lodowatym roztworem sucrose A CSF.

Następnie nalej niewielką ilość zimnego roztworu sucrose A CSF na kawałek ręcznika papierowego umieszczonego na odwróconej płytce Petriego. Za pomocą pęsety przenieś na niego świeżo wypreparowany mózg myszy. Następnie usuń móżdżek, wykonując cięcie wzdłuż osi przyśrodkowej bocznej za pomocą żyletki.

Tworzy to płaską podstawę, którą można przymocować do stolika wibracyjnego. Następnie nanieś kroplę kleju Loctite na stolik z próbką. Bezzwłocznie przymocuj płaski koniec przygotowanego mózgu do stolika, utrzymując go w pozycji jak najbardziej pionowej.

Następnie umieść stolik w komorze z próbką i dokręć śrubę. Upewnij się, że mózg jest całkowicie zanurzony w sucrose A CSF w komorze. Po tym ustaw stolik za pomocą pokrętła sterującego tak, aby ostrze brzytwy znajdowało się na wysokości górnej części mózgu.

Optymalne parametry wibratora uzyskuje się, ustawiając częstotliwość i prędkość na niskie wartości. Następnie należy ustawić grubość przekroju na 400 micrometers. Pierwsze kilka przekrojów zazwyczaj nie zawiera prążkowia.

Powtarzać krojenie do momentu uzyskania plastrów zawierających prążkowie. Po dotarciu do regionu stri AAL, za pomocą pędzla podnieść plaster i umieścić go w zlewce z natlenionym płynem CSF w temperaturze pokojowej.

Zazwyczaj można uzyskać od trzech do czterech skrawków zawierających kompleks prążkowia, w tym jądro ogoniaste, skorupę oraz jądro półleżące. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy pozostawić skrawki do aklimatyzacji w A CSF napowietrzonym mieszanką 95%O2 5%CO2 w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę. Aby rozpocząć tę procedurę, należy podłączyć przewody do zanurzeniowej komory rejestracyjnej.

Następnie pompuj natleniony płyn A CSF w temperaturze pokojowej z prędkością 1 ml/min. Po wypełnieniu specjalnie skonstruowanego uchwytu do skrawków przez płyn A CSF, ustaw kontroler temperatury na 32 °C. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza znajdujące się pod siatką za pomocą strzykawki z igłą.

Za pomocą strzykawki wytwórz podciśnienie w przewodzie odpływowym, aby rozpocząć przepływ i kontrolować przelewanie buforu. Na krawędzi uchwytu do skrawków umieść chusteczkę Kimwipe, która będzie pełnić rolę knota. Następnie przenieś skrawka do uchwytu w komorze rejestracyjnej, która jest stale perfundowana natlenionym A CSF w temperaturze pokojowej.

Zanurz srebrowo-chlorkową elektrodę odniesienia w uchwycie do skrawków i podłącz ją do modułu wejściowego za pomocą klipsa krokodylka. Przymocuj mikroelektrodę z włókna węglowego do mikromanipulatora i podłącz ją do modułu wejściowego za pomocą klipsa krokodylka. Następnie opuść wolframową elektrodę stymulującą oraz mikroelektrodę z włókna węglowego do powierzchni skrawka mózgu w roztworze soli.

Elektroda stymulująca zostanie wykorzystana do podania pojedynczego impulsu lub serii impulsów stymulacji elektrycznej do skrawka w celu wywołania uwalniania neuroprzekaźników, aby zmierzyć elektrycznie wywołaną dopaminę za pomocą szybkiej cyklicznej woltamperometrii skanującej (FSCV), aplikując do elektrody napięcie o przebiegu trójkątnym. Utrzymaj potencjał mikroelektrody z włókna węglowego na poziomie -0,4 V. Następnie zwiększ go do górnej granicy +1,2 V.

Następnie obniż potencjał z powrotem do -0,4 V przy szybkości skanowania 400 V/s. Stymuluj skrawek co pięć minut i dokonuj pomiaru wolumetrycznego otrzymanego poziomu dopaminy FLX przez 15 sekund za każdym razem, po uzyskaniu co najmniej trzech stabilnych zapisów elektrycznie stymulowanego uwalniania dopaminy, zdefiniowanych jako różnica mniejsza niż 10% między wysokościami pików.

Przełącz perfuzję skrawka na płyn CSF zawierający wybrany czynnik farmakologiczny, przy szybkości przepływu 1 mL/min przez 30 min, aby uzyskać maksymalny efekt podobny do zapisu bazowego. Wykonuj elektryczną stymulację uwalniania dopaminy co pięć minut podczas perfuzji farmakologicznej. Rycina A przedstawia przykład pomiaru elektrycznie wywołanego uwalniania dopaminy z wykorzystaniem FSCV po pojedynczej stymulacji impulsem w jądrze ogonowym i skorupie.

Rycina B przedstawia trójwymiarowy wykres pseudokolorowy, który łączy informacje z przebiegów natężenia prądu w czasie oraz z woltamperometrii cyklicznej. Podobnie ryciny A i C przedstawiają uwalnianie dopaminy wywołane pojedynczym impulsem stymulacji elektrycznej odpowiednio w rdzeniu (core) i otoczce (shell) jądra zbierającego, a trójwymiarowe wykresy pseudokolorowe dla rdzenia i otoczki jądra zbierającego są przedstawione odpowiednio na rycinach B i D. Przedstawiono tutaj reprezentatywne przebiegi po potraktowaniu skrawka preparatu środkiem farmakologicznym przez 30 minut, a następnie zastosowaniu stymulacji pojedynczym impulsem w celu wywołania uwalniania dopaminy w jądrze ogoniasto-putamen.

Odczynnikami wykorzystanymi w eksperymentach są chinol, metamfetamina oraz czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania koronalnych skrawków mózgu myszy w celu uzyskania i pomiaru dynamiki dopaminy presynaptycznej przy użyciu szybkiej i prawdopodobnie telemetrii.