Name: Presynaptyczna dynamika dopaminy w wycinkach mózgu prążkowia z szybko-skanującą cykliczną woltamperometrią (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj metodę szybko-skanującej cyklicznej woltamperometrii do pomiaru presynaptycznej dynamiki dopaminy w wycinkach mózgu prążkowia myszy. Technika ta umożliwia badanie uwalniania i wychwytu neuroprzekaźnika w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zapewnione przez National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIAAA; AA-016967 oraz AA016967-01S1; TAM), fundusze startowe Wayne State University oraz program grantów badawczych Wayne State University Research Grant Program. Treść opracowania jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i nie reprezentuje oficjalnych poglądów NIAAA ani National Institutes of Health.

<ol><li>Pike, C. M., Grabner, C. P., Harkins, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+Amperometric+Electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fabrication of Amperometric Electrodes.</a> J. Vis. Exp. (27), e1040-e1040 (2009).</li>
<li>Lack, A. K., Diaz, M. R., Chappell, A., DuBois, D. W., McCool, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+ethanol+and+withdrawal+differentially+modulate+pre-+and+postsynaptic+function+at+glutamatergic+synapses+in+rat+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropyhysiol%22%5BJournal%5D)">Chronic ethanol and withdrawal differentially modulate pre- and postsynaptic function at glutamatergic synapses in rat basolateral amygdala.</a> J. Neuropyhysiol. 98, 3185-3196 (2007).</li>
<li>John, C. E., Jones, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltammetric+characterization+of+the+effect+of+monoamine+uptake+inhibitors+and+release+on+dopamine+and+serotonin+uptake+in+mouse+caudate-putamen+and+substantia+nigra+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Voltammetric characterization of the effect of monoamine uptake inhibitors and release on dopamine and serotonin uptake in mouse caudate-putamen and substantia nigra slices.</a> Neuropharmacology. 52, 1596-1605 (2007).</li>
<li>Wightman, R. M., Amatore, C., Engstrom, R. C., Hale, P. D., Kistensen, E. W., Kuhr, W. G., May, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+characterization+of+dopamine+overflow+and+uptake+in+the+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Real-time characterization of dopamine overflow and uptake in the rat striatum.</a> Neuroscience. 25, 513-523 (1988).</li>
<li>Wightman, R. M., Zimmerman, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+dopamine+extracellular+concentration+in+rat+striatum+by+impulse+flow+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res.+Brain.+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Control of dopamine extracellular concentration in rat striatum by impulse flow and uptake.</a> Brain. Res. Brain. Res. Rev. 15, 135-144 (1990).</li>
<li>Jones, S. R., Garris, P. A., Kilts, C. D., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+dopamine+uptake+in+the+basolateral+amygdaloid+nucleus%2C+caudate-putamen%2C+and+nucleus+accumbens+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of dopamine uptake in the basolateral amygdaloid nucleus, caudate-putamen, and nucleus accumbens of the rat.</a> J. Neurochem. 64, 2581-2589 (1995).</li>
<li>Michael, D. J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+monitoring+of+biogenic+amine+neurotransmission+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Biomed.+Anal%22%5BJournal%5D)">Electrochemical monitoring of biogenic amine neurotransmission in real time.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 19, 33-46 (1999).</li>
<li>Pajski, M. L., Venton, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+release+evoked+by+short+electrical+stimulations+in+striatal+brain+slices+is+primarily+activity+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22A.C.S.+Chem.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adenosine release evoked by short electrical stimulations in striatal brain slices is primarily activity dependent.</a> A.C.S. Chem. Neurosci. 1, 775-787 (2010).</li>
<li>Sanford, A. L., Morton, S. W., Whitehouse, K. L., Oara, H. M., Lugo-Morales, L. Z., Roberts, J. G., Sombers, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltammetric+detection+of+hydrogen+peroxide+at+carbon+fiber+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Voltammetric detection of hydrogen peroxide at carbon fiber microelectrodes.</a> Anal. Chem. 82, 5205-5210 (2010).</li>
<li>Park, J., Kile, B. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+voltammetric+monitoring+of+norepinephrine+release+in+the+rat+ventral+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+and+anteroventral+thalamic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo voltammetric monitoring of norepinephrine release in the rat ventral bed nucleus of the stria terminalis and anteroventral thalamic nucleus.</a> Eur. J. Neurosci. 30, 2121-2133 (2009).</li>
<li>Hashemi, P., Dankoski, E. C., Petrovic, J., Keithley, R. B., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltammetric+detection+of+5-hydroxytryptamine+release+in+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Voltammetric detection of 5-hydroxytryptamine release in the rat brain.</a> Anal. Chem. 81, 9462-9471 (2009).</li>
<li>Borue, X., Cooper, S., Hirsh, J., Condron, B., Venton, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+serotonin+release+and+clearnece+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of serotonin release and clearnece in drosophila.</a> J. Neuroscience. Methods. 179, 300-308 (2009).</li>
<li>Vickrey, T. L., Condron, B., Venton, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+endogenous+dopamine+changes+in+drosophila+melanogaster+using+fast-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection of endogenous dopamine changes in drosophila melanogaster using fast-scan cyclic voltammetry.</a> Anal. Chem. 81, 9306-9313 (2009).</li>
<li>Makos, M. A., Han, K. A., Heien, M. L., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+in+vivo+electrochemistry+to+study+the+physiological+effects+of+cocaine+and+other+stimulants+on+the+drosophila+melanogaster+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22A.C.S.+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Using in vivo electrochemistry to study the physiological effects of cocaine and other stimulants on the drosophila melanogaster dopamine transporter.</a> A.C.S. Chem Neurosci. 1, 74-83 (2009).</li>
<li>Budygin, E. A., John, C. E., Mateo, Y., Daunais, J. B., Friedman, D. P., Grant, K. A., Jones, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+ethanol+exposure+alters+presynaptic+dopamine+function+in+striatum+of+monkeys%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Chronic ethanol exposure alters presynaptic dopamine function in striatum of monkeys: a preliminary study.</a> Synapse. 50, 266-268 (2003).</li>
<li>Jones, S. R., Gainetdinov, R. R., Jaber, M., Giros, B., Wightman, R. M., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+neuronal+plasticity+in+response+to+inactivation+of+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter.</a> PNAS. 95, 4029-4034 (1998).</li>
<li>Kennedy, R. T., Jones, S. R., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+observation+of+dopamine+autoreceptor+effects+in+rat+striatal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Dynamic observation of dopamine autoreceptor effects in rat striatal slices.</a> J. Neurochem. 59, 449-445 (1992).</li>
<li>Rice, M. E., Cragg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+amplifies+reward-related+dopamine+signals+in+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum.</a> Nat. Neurosci. 7, 583-584 (2004).</li>
<li>Zhang, L., Doyon, W. M., Clark, J. J., Phillips, P. E., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+of+tonic+and+phasic+dopamine+transmission+in+the+dorsal+and+ventral%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Controls of tonic and phasic dopamine transmission in the dorsal and ventral.</a> 76, 396-404 (2009).</li>
<li>Paredes, D., Grnaholm, A. C., Bickford, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+NGF+and+BDNF+on+baseline+glutamate+and+dopamine+release+in+the+hippocampal+formation+of+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of NGF and BDNF on baseline glutamate and dopamine release in the hippocampal formation of the adult rat.</a> Brain. Res. 11141, 56-64 (2007).</li>
<li>Goggi, J., Puller, I. A., Carney, S. L., Bradford, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+pathways+involved+in+the+short-term+potentiation+of+dopamine+release+by+BDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Signalling pathways involved in the short-term potentiation of dopamine release by BDNF.</a> Brain. Res. 968, 156-161 (2003).</li>
<li>Cheer, J. F., Wassum, K. M., Heien, M. L., Phillips, P. E., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+enhance+subsecond+doapmine+relese+in+the+nucleus+accumbens+of+awake+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids enhance subsecond doapmine relese in the nucleus accumbens of awake rats.</a> J. Neurosci. 24, 4393-4400 (2004).</li>
<li>Phillips, P. E., Stuber, G. D., Heien, M. L., Wightman, R. M., Carelli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsecond+dopamine+release+promotes+cocaine+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking.</a> Nature. 422, 614-618 (2003).</li>
<li>Robinson, D. L., Heien, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+dopamine+concentration+transients+increases+in+dorsal+and+ventral+striatum+of+male+rats+duing+introduction+of+conspecifics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Frequency of dopamine concentration transients increases in dorsal and ventral striatum of male rats duing introduction of conspecifics.</a> J. Neurosci. 22, 10477-10486 (2002).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Przedstawiony tutaj protokół demonstruje, jak przygotować i wykorzystać koronalne skrawki mózgu myszy do eksperymentów FSCV. Chociaż metoda ta jest specyficzna dla pozyskiwania i pomiaru dynamiki dopaminy, inne neuroprzekaźniki, takie jak adenozyna, nadtlenek wodoru, norepinefryna i serotonina, były monitorowane in vivo lub in vitro za pomocą FSCV 3, 8 - 11. FSCV można wykorzystać do monitorowania niektórych z tych innych neurochemikaliów poprzez proste modyfikacje kształtu fali przykładanej ...

<table><tbody><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>7447407</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>EMD Millipore</td><td>7647145</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>7791186</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>10035048</td><td></td></tr><tr><td>Bikarbonat sodu</td><td>EMD Millipore</td><td>144558</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu, dwutlenek</td><td>EMD Millipore</td><td>7558794</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>50997</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>50817</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>57501</td><td></td></tr><tr><td>Włókno węglowe</td><td>Goodfellow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapilara szklana</td><td>A-M Systems</td><td>602000</td><td></td></tr><tr><td>Drut srebrny</td><td>A-M Systems</td><td>787000</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda stymulacyjna wolframowa</td><td>Plastics One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drut platynowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drut ołowiany</td><td>Squires Electronics, Cornelius, OR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klej chwilowy Loctite 404</td><td>Hankal Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ostrze brzytwy</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igła kręgowa BD</td><td>BD Biosciences</td><td>REF 405234</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne</td><td>Feather Safety Razor Co, Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie TH</td><td>ESA Inc., Chelmsford, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora do nagrywania zanurzeniowego</td><td>Custom Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/neurolog-system/" target="_blank"&gt;Izolator stymulacji Neorolog&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Digitimer Ltd.</a></td><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/neurolog-system/stimulator-modules/digitimer-nl800a-part-neurolog-system/" target="_blank"&gt;NL800A&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny regulator temperatury</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop (SZX7)&lt;strong&gt;&lt;/strong&gt;</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System do sekcjonowania Vibratome 3000</td><td>St. Louis, MO.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa perfuzyjna</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>H110708</td><td></td></tr><tr><td>Wciągarka mikropipet</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potencjostat ChemClamp</td><td>Dagan Corporations</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dynamika dopaminy presynaptycznej w przekrojach mózgu w obrębie prążka z wykorzystaniem szybkiej woltamperometrii cyklicznej

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Szeroko zakrojone badania skupiły się na neuroprzekaźniku dopaminie ze względu na jej znaczenie w mechanizmie działania substancji psychoaktywnych (np. kokainy i amfetaminy), rolę, jaką odgrywa w chorobach psychiatrycznych (np. schizofrenii i zespole nadpobudliwości z deficytem uwagi), oraz jej zaangażowanie w zaburzenia degeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona i choroba Huntingtona. W normalnych warunkach fizjologicznych dopamina reguluje aktywność lokomotoryczną, funkcje poznawcze, uczenie się, afekt emocjonalny oraz wydzielanie hormonów neuroendokrynnych. Jedno z największych zagęszczeń neuronów dopaminergicznych znajduje się w prążkowiu, który można podzielić na dwa odrębne regiony neuroanatomiczne znane jako jądro półleżące oraz jądro ogoniaste i skorupa. Celem jest przedstawienie ogólnego protokołu szybkiej skaningowej woltamperometrii cyklicznej (FSCV) w plastrach prążkowia myszy. FSCV jest dobrze zdefiniowaną techniką elektrochemiczną, która umożliwia pomiar uwalniania i wychwytu dopaminy w czasie rzeczywistym w konkretnych regionach mózgu. W FSCV do wykrywania utleniania dopaminy stosuje się węglowe mikroelektrody włókniste (średnica ~ 7 μm). Przewagą analityczną zastosowania FSCV do wykrywania dopaminy jest zwiększona rozdzielczość czasowa wynosząca 100 milisekund oraz rozdzielczość przestrzenna poniżej dziesięciu mikronów, co dostarcza informacji uzupełniających względem mikrodializy in vivo.

Wykorzystanie szybkoskanującej woltamperometrii cyklicznej do pomiaru elektrycznie wywołanej dynamiki dopaminy presynaptycznej w skrawkach mózgowych prążkowia.

Dynamika dopaminy presynaptycznej w przekrojach mózgu w obrębie prążka z wykorzystaniem szybkiej woltamperometrii cyklicznej

Zakresowe badania skoncentrowano na neuroprzekaźniku dopaminie ze względu na jego znaczenie w mechanizmie działania substancji psychoaktywnych (np. kokainy i ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie ogólnego protokołu dla szybkiego skanowania cyklicznego V Telemetry w plastrach tkanki. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie tkanki mózgowej do cięcia w płaszczyźnie wieńcowej, a następnie umieszczenie elektrod w określonym obszarze mózgu będącym przedmiotem zainteresowania.Kolejnym krokiem jest przyłożenie napięcia w postaci przebiegu trójkątnego poprzez elektrodę w celu detekcji dopaminy. Następnie do skrawka mózgu podaje się interesujący nas czynnik farmakologiczny i obserwuje jego wpływ na presynaptyczną dynamikę dopaminy. Ostatecznie protokół ten pozwala wykazać zmiany w presynaptycznej dynamice dopaminy, takie jak stymulowane uwalnianie dopaminy oraz tempo wychwytu dopaminy za pomocą szybkiej cyklicznej woltamperometrii skanującej.Choć metoda ta może dostarczyć wglądu w presynaptyczną dynamikę dopaminy, można ją zastosować również do innych układów, w tym różnych zwierząt i neuroprzekaźników, takich jak szczury i muszki owocowe, a odpowiednio serotonina i norepinefryna, co wykazują Francis Mena, MEA Khalid i Erin oo, doktoranci z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, zgodnie z załączonym manuskryptem, należy przygotować trzy rodzaje sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego: roztwór sacharozowy A-C-S-F, roztwór A-C-S-F do pomiarów woltamperometrycznych oraz zmodyfikowany roztwór A-CSF do kalibracji elektrod. Następnie należy przelać 10 ml sacharozowego A-CSF do małego zlewki i umieścić ją w pojemniku z lodem. Następnie w pojemniku z lodem należy umieścić szybkoschnący klej Loctite.Następnie przygotować żyletkę oraz niezbędne narzędzia do sekcji, takie jak pęseta, szpatułka i nożyczki, przecierając je wacikiem nasączonym alkoholem. Potem uśmiercić mysz poprzez dekapitację i szybko wyjąć jej mózg. Umieścić mózg w zlewce z lodowatą sacharozą, A CSF, na około 10 minut.W międzyczasie przygotuj VIBRAM do krojenia. Umieść kruszony lód w kąpieli dla próbek. Następnie umieść komorę z próbką w urządzeniu Vibram i mocno ją przymocuj.Dodać więcej lodu wokół komory z próbką, aby wypełnić luki, upewniając się, że lód nie dostał się do wnętrza komory. Następnie umieścić oczyszczone ostrze żyletki w uchwycie na ostrze. Po tym czasie wypełnić komorę z próbką lodowatym roztworem sucrose A CSF.Następnie wlej niewielką ilość zimnego płynu CSF z sacharozą A na ręcznik papierowy umieszczony na odwróconej płytce Petriego. Przenieś świeżo wypreparowany mózg myszy na ręcznik za pomocą pęsety. Następnie usuń móżdżek, wykonując cięcie wzdłuż osi boczno-przyśrodkowej za pomocą żyletki.Pozwala to na stworzenie płaskiej podstawy, którą można przymocować do stolika wibracyjnego. Następnie nanieś kroplę kleju Loctite na stolik z próbką. Bezzwłocznie przymocuj płaski koniec przygotowanego mózgu do stolika, dbając o to, aby znajdował się on w pozycji jak najbardziej pionowej.Następnie umieść stół w komorze z preparatem i dokręć śrubę. Upewnij się, że mózg jest całkowicie zanurzony w roztworze sucrose A CSF w komorze. Po tym ustaw stół za pomocą pokrętła regulacyjnego tak, aby ostrze żyletki znajdowało się na wysokości górnej części mózgu.Optymalne parametry wibratora uzyskuje się, ustawiając niską częstotliwość oraz prędkość. Następnie należy ustawić grubość przekroju na 400 micrometers. Pierwsze kilka przekrojów zazwyczaj nie zawiera prążkowia.Powtarzać krojenie aż do uzyskania plastrów zawierających prążkowie. Po dotarciu do obszaru stri AAL należy za pomocą pędzla podnieść plaster i umieścić go w zlewce z natlenionym płynem CSF w temperaturze pokojowej.Zazwyczaj można uzyskać od trzech do czterech skrawków zawierających kompleks talamiczny, w tym jądro ogoniaste, putamen oraz jądro półleżące. Przed przystąpieniem do eksperymentu należy pozostawić skrawki do aklimatyzacji w A CSF napowietrzanym mieszanką 95%O2 5%CO2 w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę. Aby rozpocząć tę procedurę, należy podłączyć rurki do zanurzeniowej komory rejestracyjnej.Następnie pompuj natleniony A CSF w temperaturze pokojowej z prędkością 1 ml na minutę. Po wypełnieniu specjalnie zbudowanego uchwytu do skrawków przez A CSF, ustaw kontroler temperatury na 32°C. Za pomocą strzykawki z igłą usuń wszelkie pęcherzyki powietrza znajdujące się pod siatką.Za pomocą strzykawki wytwórz podciśnienie w przewodzie odpływowym, aby uruchomić przepływ i kontrolować przelewanie buforu. Umieść chusteczkę Kim wipe na krawędzi uchwytu do skrawków, aby pełniła rolę knota. Następnie przenieś skrawek do uchwytu w komorze rejestracyjnej, która jest stale perfundowana natlenionym A CSF w temperaturze pokojowej.Zanurz srebrowo-chlorkową elektrodę odniesienia w uchwycie do skrawków i połącz ją z modułem głowicowym za pomocą klipsa krokodylkowego. Przymocuj mikroelektrodę z włókna węglowego do mikromanipulatora i podłącz ją do modułu głowicowego za pomocą klipsa krokodylkowego. Następnie opuść wolframową elektrodę stymulującą oraz mikroelektrodę z włókna węglowego do powierzchni skrawka mózgu w roztworze soli.Elektrodę stymulującą wykorzystuje się do podawania pojedynczego lub wielu impulsów stymulacji elektrycznej do skrawka w celu wywołania uwalniania neuroprzekaźników, co pozwala na pomiar elektrycznie wywołanej dopaminy za pomocą szybkiej cyklicznej woltamperometrii skanującej (FSCV), poprzez przyłożenie do elektrody napięcia o przebiegu trójkątnym. Utrzymuje się potencjał mikroelektrody z włókna węglowego na poziomie -0,4 V, a następnie zwiększa go do górnej granicy +1,2 V.Następnie obniż potencjał do -0,4 V przy szybkości przeskanowania 400 V/s. Stymuluj skrawek co pięć minut i wykonuj pomiar wolumetryczny wynikowego wyrzutu dopaminy (FLX) przez 15 sekund za każdym razem, po uzyskaniu co najmniej trzech stabilnych zapisów elektrycznie stymulowanego uwalniania dopaminy, zdefiniowanych jako różnica mniejsza niż 10% między wysokościami pików.Przełącz perfuzję skrawka na płyn mózgowo-rdzeniowy zawierający interesujący czynnik farmakologiczny, przy szybkości przepływu 1 ml/min przez 30 minut, aby uzyskać maksymalny efekt podobny do zapisu bazowego. Wykonuj elektrycznie stymulowane uwalnianie dopaminy co pięć minut podczas perfuzji farmakologicznej. Rysunek A przedstawia przykład pomiaru elektrycznie wywołanego uwalniania dopaminy z wykorzystaniem FSCV, po pojedynczej stymulacji impulsem w jądrze ogonowym i skorupie.Rysunek B przedstawia trójwymiarowy wykres pseudokolorystyczny, który łączy informacje z przebiegów natężenia prądu w funkcji czasu oraz z woltamperogramu cyklicznego. Analogicznie, rysunki A i C przedstawiają uwalnianie dopaminy wywołane pojedynczym impulsem stymulacji elektrycznej odpowiednio w rdzeniu i otoczce jądra półleżącego, a trójwymiarowe wykresy pseudokolorystyczne dla rdzenia i otoczki jądra półleżącego przedstawiono odpowiednio na rysunkach B i D. Przedstawione tutaj są reprezentatywne przebiegi po poddaniu skrawka działaniu środka farmakologicznego przez 30 minut, a następnie zastosowaniu stymulacji pojedynczym impulsem w celu wywołania uwalniania dopaminy w prążkowiu brzuszno-grzbietowym (caudate putamen).Odczynnikami użytymi w eksperymentach są chinol, metamfetamina oraz czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat przygotowania koronalnych przekrojów mózgu myszy w celu uzyskania i pomiaru presynaptycznej dynamiki dopaminy przy użyciu szybkiej woltamperometrii.

presynaptic-dopamine-dynamics-striatal-brain-slices-with-fast-scan

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Dynamika dopaminy przedsynaptycznej w plastkach mózgu zwojowego z szybką cykliczną voltametrią skanującą

Nowa metoda optycznego pomiaru neurotransmisji z wykorzystaniem fluorescencyjnych analogów dopaminy.

Wizualizacja uwalniania dopaminy w pojedynczych zakończeniach presynaptycznych za pomocą FFN

Technika amperometryczna mierzy uwalnianie dopaminy z pojedynczej komórki poprzez wykrywanie prądu utleniania powstającego podczas spontanicznego utleniania dopaminy. Metodologia jednoczesnego zaciskania napięcia (voltage clamp) i amperometrii ujawnia mechanistyczną zależność między całkowitą „aktywnością” transportera dopaminy a regulacyjną rolą tej aktywności w transporcie zwrotnym dopaminy.

Pomiar uwalniania dopaminy z pojedynczej komórki przy jednoczesnym zastosowaniu zacisku napięciowego i amperometrii

Ten film demonstruje wszczepienie elektrod i kaniul u znieczulonego szczura w celu pomiaru uwalniania dopaminy w jądrze półleżącym za pomocą potencjostatu oraz infuzji leków w celu modulacji aktywności dopaminergicznej w brzusznej części nakrywki.

Monitorowanie uwalniania dopaminy w modelu szczurzym za pomocą manipulacji receptorem neuronów dopaminergicznych VTA

Gwałtowne wahania dopaminy zewnątrzkomórkowej (DA) pośredniczą zarówno w przetwarzaniu nagrody, jak i w motywowanym zachowaniu u ssaków. Manuskrypt ten opisuje połączone zastosowanie szybkiej woltamperometrii cyklicznej (FSCV) i doustnej dawki degustacyjnej w celu określenia, w jaki sposób degustatory zmieniają szybkie uwalnianie dopaminy u obudzonych, swobodnie poruszających się szczurów.

Badanie szybkiej dynamiki dopaminy za pomocą cyklicznej woltamperometrii Fast Scan podczas doustnej dawki degustacyjnej u obudzonych szczurów

Szybko-skanująca cykliczna woltamperometria może monitorować in vivo neurotransmisję dopaminy w kontekście leków, chorób i innych eksperymentalnych manipulacji. W niniejszej pracy opisano implementację QNsim1.0, oprogramowania do modelowania elektrycznie stymulowanych odpowiedzi dopaminy zgodnie z ilościowym modelem neurobiologicznym w celu ilościowego oszacowania dynamiki uwalniania i wychwytu zwrotnego dopaminy.

Modelowanie danych szybkiego skanowania woltamperometrii cyklicznej na podstawie elektrycznie stymulowanych danych neurotransmisji dopaminy przy użyciu QNsim1.0

Celem tego protokołu jest bezpośrednie manipulowanie receptorami brzusznego obszaru nakrywki w celu zbadania ich udziału w subsekundowym uwalnianiu dopaminy.

Skojarzona infuzja i stymulacja z woltamperometrią cykliczną Fast-Scan (CIS-FSCV) w celu oceny regulacji dopaminy fazowej przez receptory brzusznego obszaru nakrywki

Niniejszy raport demonstruje technikę mechanicznej izolacji pojedynczych żywych neuronów z zachowaniem przytwierdzonych boutonów presynaptycznych. Neurony poddane wibrodysocjacji charakteryzują się zaletami takimi jak szybki czas przygotowania, doskonała kontrola farmakologiczna oraz usprawniona stabilizacja potencjału błonowego (space-clamp) bez wpływu komórek sąsiednich. Metoda ta może być wykorzystywana do obrazowania elementów synaptycznych oraz rejestracji metodą patch-clamp.

Wibrodysocjacja neuronów z plastrów mózgu gryzoni w celu badania transmisji synaptycznej i obrazowania terminali presynaptycznych

Niezawodna metoda badania lawin neuronalnych, czyli niezależnych od skali czasowo-przestrzennych wybuchów aktywności, które świadczą o dynamice stanu krytycznego w korze mózgu. Lawiny pojawiają się spontanicznie w rozwijających się warstwach powierzchownych hodowli kory, co umożliwia długoterminowe pomiary aktywności przy użyciu planarnych zintegrowanych matryc wieloelektrodowych (MEA) w ściśle kontrolowanych warunkach.

Rejestracja lawin neuronalnych w kulturach organotypowych za pomocą macierzy wieloelektrodowej

Interfejs elektroda-tkanka w elektrodach do rejestracji sygnałów neuronalnych może być charakteryzowany za pomocą spektroskopii impedancyjnej (EIS) oraz woltamperometrii cyklicznej (CV). Zastosowanie polaryzacji napięciowej zmienia właściwości elektrochemiczne interfejsu elektroda-tkanka i może poprawić zdolność rejestracji. Polaryzacja napięciowa, EIS, CV oraz rejestracje neuronalne są metodami komplementarnymi.

Polaryzacja napięciowa, woltametria cykliczna i spektroskopia impedancyjna dla interfejsów neuronalnych

Nagrania par to równoczesne nagrania klamrów całych komórek z dwóch synaptycznie połączonych neuronów, umożliwiające precyzyjną elektrofizjologiczną i farmakologiczną charakterystykę synaps między poszczególnymi neuronami. Poniżej opisujemy szczegółową metodologię i wymagania dotyczące ustalenia tej techniki w organotypowych kulturach plastrów hipokampa w dowolnym laboratorium wyposażonym do elektrofizjologii.

Sparowane nagrania całych komórek w organotypowych wycinkach hipokampa

Poznaj metodę szybko-skanującej cyklicznej woltamperometrii do pomiaru presynaptycznej dynamiki dopaminy w wycinkach mózgu prążkowia myszy. Technika ta umożliwia badanie uwalniania i wychwytu neuroprzekaźnika w czasie rzeczywistym.

Dynamika dopaminy presynaptycznej w przekrojach mózgu w obrębie prążka z wykorzystaniem szybkiej woltamperometrii cyklicznej

Przeglądaj więcej filmów