Dynamika dopaminy presynaptycznej w przekrojach mózgu w obrębie prążka z wykorzystaniem szybkiej woltamperometrii cyklicznej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie ogólnego protokołu dla szybkiego skanowania cyklicznego V Telemetry w plastrach tkanki. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie tkanki mózgowej do cięcia w płaszczyźnie wieńcowej, a następnie umieszczenie elektrod w określonym obszarze mózgu będącym przedmiotem zainteresowania.

Kolejnym krokiem jest przyłożenie napięcia w postaci przebiegu trójkątnego poprzez elektrodę w celu detekcji dopaminy. Następnie do skrawka mózgu podaje się interesujący nas czynnik farmakologiczny i obserwuje jego wpływ na presynaptyczną dynamikę dopaminy. Ostatecznie protokół ten pozwala wykazać zmiany w presynaptycznej dynamice dopaminy, takie jak stymulowane uwalnianie dopaminy oraz tempo wychwytu dopaminy za pomocą szybkiej cyklicznej woltamperometrii skanującej.

Choć metoda ta może dostarczyć wglądu w presynaptyczną dynamikę dopaminy, można ją zastosować również do innych układów, w tym różnych zwierząt i neuroprzekaźników, takich jak szczury i muszki owocowe, a odpowiednio serotonina i norepinefryna, co wykazują Francis Mena, MEA Khalid i Erin oo, doktoranci z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, zgodnie z załączonym manuskryptem, należy przygotować trzy rodzaje sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego: roztwór sacharozowy A-C-S-F, roztwór A-C-S-F do pomiarów woltamperometrycznych oraz zmodyfikowany roztwór A-CSF do kalibracji elektrod. Następnie należy przelać 10 ml sacharozowego A-CSF do małego zlewki i umieścić ją w pojemniku z lodem. Następnie w pojemniku z lodem należy umieścić szybkoschnący klej Loctite.

Następnie przygotować żyletkę oraz niezbędne narzędzia do sekcji, takie jak pęseta, szpatułka i nożyczki, przecierając je wacikiem nasączonym alkoholem. Potem uśmiercić mysz poprzez dekapitację i szybko wyjąć jej mózg. Umieścić mózg w zlewce z lodowatą sacharozą, A CSF, na około 10 minut.

W międzyczasie przygotuj VIBRAM do krojenia. Umieść kruszony lód w kąpieli dla próbek. Następnie umieść komorę z próbką w urządzeniu Vibram i mocno ją przymocuj.

Dodać więcej lodu wokół komory z próbką, aby wypełnić luki, upewniając się, że lód nie dostał się do wnętrza komory. Następnie umieścić oczyszczone ostrze żyletki w uchwycie na ostrze. Po tym czasie wypełnić komorę z próbką lodowatym roztworem sucrose A CSF.

Następnie wlej niewielką ilość zimnego płynu CSF z sacharozą A na ręcznik papierowy umieszczony na odwróconej płytce Petriego. Przenieś świeżo wypreparowany mózg myszy na ręcznik za pomocą pęsety. Następnie usuń móżdżek, wykonując cięcie wzdłuż osi boczno-przyśrodkowej za pomocą żyletki.

Pozwala to na stworzenie płaskiej podstawy, którą można przymocować do stolika wibracyjnego. Następnie nanieś kroplę kleju Loctite na stolik z próbką. Bezzwłocznie przymocuj płaski koniec przygotowanego mózgu do stolika, dbając o to, aby znajdował się on w pozycji jak najbardziej pionowej.

Następnie umieść stół w komorze z preparatem i dokręć śrubę. Upewnij się, że mózg jest całkowicie zanurzony w roztworze sucrose A CSF w komorze. Po tym ustaw stół za pomocą pokrętła regulacyjnego tak, aby ostrze żyletki znajdowało się na wysokości górnej części mózgu.

Optymalne parametry wibratora uzyskuje się, ustawiając niską częstotliwość oraz prędkość. Następnie należy ustawić grubość przekroju na 400 micrometers. Pierwsze kilka przekrojów zazwyczaj nie zawiera prążkowia.

Powtarzać krojenie aż do uzyskania plastrów zawierających prążkowie. Po dotarciu do obszaru stri AAL należy za pomocą pędzla podnieść plaster i umieścić go w zlewce z natlenionym płynem CSF w temperaturze pokojowej.

Zazwyczaj można uzyskać od trzech do czterech skrawków zawierających kompleks talamiczny, w tym jądro ogoniaste, putamen oraz jądro półleżące. Przed przystąpieniem do eksperymentu należy pozostawić skrawki do aklimatyzacji w A CSF napowietrzanym mieszanką 95%O2 5%CO2 w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę. Aby rozpocząć tę procedurę, należy podłączyć rurki do zanurzeniowej komory rejestracyjnej.

Następnie pompuj natleniony A CSF w temperaturze pokojowej z prędkością 1 ml na minutę. Po wypełnieniu specjalnie zbudowanego uchwytu do skrawków przez A CSF, ustaw kontroler temperatury na 32°C. Za pomocą strzykawki z igłą usuń wszelkie pęcherzyki powietrza znajdujące się pod siatką.

Za pomocą strzykawki wytwórz podciśnienie w przewodzie odpływowym, aby uruchomić przepływ i kontrolować przelewanie buforu. Umieść chusteczkę Kim wipe na krawędzi uchwytu do skrawków, aby pełniła rolę knota. Następnie przenieś skrawek do uchwytu w komorze rejestracyjnej, która jest stale perfundowana natlenionym A CSF w temperaturze pokojowej.

Zanurz srebrowo-chlorkową elektrodę odniesienia w uchwycie do skrawków i połącz ją z modułem głowicowym za pomocą klipsa krokodylkowego. Przymocuj mikroelektrodę z włókna węglowego do mikromanipulatora i podłącz ją do modułu głowicowego za pomocą klipsa krokodylkowego. Następnie opuść wolframową elektrodę stymulującą oraz mikroelektrodę z włókna węglowego do powierzchni skrawka mózgu w roztworze soli.

Elektrodę stymulującą wykorzystuje się do podawania pojedynczego lub wielu impulsów stymulacji elektrycznej do skrawka w celu wywołania uwalniania neuroprzekaźników, co pozwala na pomiar elektrycznie wywołanej dopaminy za pomocą szybkiej cyklicznej woltamperometrii skanującej (FSCV), poprzez przyłożenie do elektrody napięcia o przebiegu trójkątnym. Utrzymuje się potencjał mikroelektrody z włókna węglowego na poziomie -0,4 V, a następnie zwiększa go do górnej granicy +1,2 V.

Następnie obniż potencjał do -0,4 V przy szybkości przeskanowania 400 V/s. Stymuluj skrawek co pięć minut i wykonuj pomiar wolumetryczny wynikowego wyrzutu dopaminy (FLX) przez 15 sekund za każdym razem, po uzyskaniu co najmniej trzech stabilnych zapisów elektrycznie stymulowanego uwalniania dopaminy, zdefiniowanych jako różnica mniejsza niż 10% między wysokościami pików.

Przełącz perfuzję skrawka na płyn mózgowo-rdzeniowy zawierający interesujący czynnik farmakologiczny, przy szybkości przepływu 1 ml/min przez 30 minut, aby uzyskać maksymalny efekt podobny do zapisu bazowego. Wykonuj elektrycznie stymulowane uwalnianie dopaminy co pięć minut podczas perfuzji farmakologicznej. Rysunek A przedstawia przykład pomiaru elektrycznie wywołanego uwalniania dopaminy z wykorzystaniem FSCV, po pojedynczej stymulacji impulsem w jądrze ogonowym i skorupie.

Rysunek B przedstawia trójwymiarowy wykres pseudokolorystyczny, który łączy informacje z przebiegów natężenia prądu w funkcji czasu oraz z woltamperogramu cyklicznego. Analogicznie, rysunki A i C przedstawiają uwalnianie dopaminy wywołane pojedynczym impulsem stymulacji elektrycznej odpowiednio w rdzeniu i otoczce jądra półleżącego, a trójwymiarowe wykresy pseudokolorystyczne dla rdzenia i otoczki jądra półleżącego przedstawiono odpowiednio na rysunkach B i D. Przedstawione tutaj są reprezentatywne przebiegi po poddaniu skrawka działaniu środka farmakologicznego przez 30 minut, a następnie zastosowaniu stymulacji pojedynczym impulsem w celu wywołania uwalniania dopaminy w prążkowiu brzuszno-grzbietowym (caudate putamen).

Odczynnikami użytymi w eksperymentach są chinol, metamfetamina oraz czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat przygotowania koronalnych przekrojów mózgu myszy w celu uzyskania i pomiaru presynaptycznej dynamiki dopaminy przy użyciu szybkiej woltamperometrii.