Name: Nalewanie i uruchamianie żelu białkowego poprzez ponowne użycie komercyjnych kaset (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Naucz się ekonomicznej metody nalewania żeli poliakrylamidowych poprzez ponowne użycie kaset Invitrogen Nupage Novex. Technika ta pozwala przechowywać gotowe żele w 4°C przez kilka tygodni, znacząco obniżając koszty laboratoryjne i redukując ilość odpadów plastikowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Howard Hughes Medical Institute za przyznanie nagrody UF Science for Life dla A.H.

1. Przygotowanie kaset
<ol>
 <li>Oczyścić przednią i tylną płytkę używanej kasety do minigelu Invitrogen Nupage Novex lub innej komercyjnej kasety do minigeli.</li>
 <li>Przygotować około 1-3 ml plastikowej żywicy epoksydowej i dokładnie wymieszać zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
 <li>Nanieść żywicę epoksydową na wewnętrzną krawędź przedniej płytki, w miejscu, w którym obie płytki będą stykać się po złożeniu kasety.</li>
 <li>Podczas składania kasety wsunąć kawałek papieru filtracyjnego lub tektury przez dolną szczelinę tylnej płytki, aby zapobiec zapieczętowaniu otworu przez nadmiar żywicy. Usunąć papier filtracyjny natychmiast po złożeniu obu płytek.</li>
 <li>Zastosować żabki biurowe wzdłuż krawędzi, aby zapewnić szczelne połączenie, i pozostawić kasety na noc do pełnego utwardzenia żywicy.</li>
 <li>Uszczelnić szczelinę na dole tylnej płytki taśmą izolacyjną.</li>
</ol>
2. Wlewanie żelu rozdzielczego
<ol>
 <li>Do kolby z bocznym wylotem o pojemności 125 ml dodać następujące składniki: 2,25 ml 4X buforu do żelu rozdzielczego Tris-Base pH 8,70, 3,50 ml 30,8% akryloamidu/bisakryloamidu oraz 3,25 ml wody odczynnikowej typu I (IRG-H2O), aby uzyskać objętość całkowitą 9 ml.</li>
 <li>Odgazować roztwór przez 10 min, podłączając boczny wylot kolby do aparatury próżniowej i zakładając odwrócony korek na górną część kolby.</li>
 <li>Przenieść 9 ml odgazowanego roztworu do jednorazowej polipropylenowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, dodać 30 μl 10% persiarczanu amonu (APS) oraz 6 μl N, N, N', N',-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) i dokładnie wymieszać poprzez delikatne okrężne potrząsanie roztworem, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Niezwłocznie wlać roztwór do kasety, pozwalając mu spływać po ściance kasety, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków między płytkami żelu. Wypełnić kasetę do poziomu około 2 cm od górnej krawędzi przedniej (krótszej) płytki.</li>
 <li>Ostrożnie dodać 0,5 ml 1-butanolu nasyconego 1X buforem do żelu rozdzielczego i pozostawić żel do polimeryzacji na 1 godzinę.</li>
</ol>
3. Wlewanie żelu zagęszczającego
<ol>
 <li>Do kolby z bocznym wylotem o pojemności 125 ml dodać: 0,75 ml 4X buforu do żelu zagęszczającego Tris-Base pH 6,80, 0,40 ml 30,8% akryloamidu/bisakryloamidu oraz 1,85 ml IRG-H2O, tak aby całkowita objętość wyniosła 3 ml.</li>
 <li>Odgazować roztwór przez 10 min zgodnie z opisem w kroku 2.</li>
 <li>Podczas odgazowywania roztworu do żelu zagęszczającego, odlać 1-butanol nasycony 1X buforem do żelu rozdzielającego z górnej części żelu rozdzielającego. Przepłukać górną część żelu rozdzielającego raz wodą IRG-H2O. Odlać wodę i użyć papieru bibułowego lub papieru filtracyjnego Whatman, aby wchłonąć pozostały płyn.</li>
 <li>Odmierzyć 3 ml odgazowanego roztworu, dodać 9 μl 10% APS oraz 2 μl TEMED i dokładnie wymieszać.</li>
 <li>Szybko wlać roztwór do kasety, pozwalając mu spływać po ściance kasety, aż osiągnie poziom górnej krawędzi krótszej, przedniej płyty żelowej.</li>
 <li>Wsunąć czysty grzebień do żelu w górną część kasety żelowej i przymocować go w miejscu za pomocą zacisku biurowego na kasecie. Pozostawić żel zagęszczający do polimeryzacji na okres od 1 godziny do całej nocy.</li>
</ol>
4. Przechowywanie żelu
<ol>
 <li>Po całkowitej polimeryzacji żelu należy zdjąć zaciski biurowe i umieścić kasetę w plastikowej torebce zgrzewalnej lub w plastikowym worku zamykanym strunowo.</li>
 <li>Do torebki należy wlać 20 ml 1X buforu do żelu zagęszczającego zawierającego 0,1% azotku sodu.</li>
 <li>Torebkę należy zgrzać termicznie przez 5 sec, upewniając się, że worek nie przecieka.</li>
 <li>Żel należy przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
5. Przygotowanie próbek
<ol>
 <li>Do cienkościennej probówki do mikrocentryfugi należy dodać do 6,5 μl próbki białka, 7,5 μl 2x buforu do próbek Novex Tris-Glycine SDS, 1 μl 100 mM ditiotreitolu (DTT) oraz IRG-H2O (jeśli jest to konieczne), aby uzyskać całkowitą objętość 15 μl.</li>
<li>Próbkę należy wymieszać za pomocą wortexa, a następnie krótko odwirować, aby osadzić zawartość na dnie probówki.</li>
 <li>Próbkę należy denaturować w temperaturze 70°C przez 10 min.</li>
</ol>
6. Elektroforeza żelu
<ol>
 <li>Przygotować aparat do elektroforezy Novex.</li>
 <li>Do komory wewnętrznej wlać 200 ml buforu do elektroforezy Tris-Glycine zawierającego 500 μl przeciwutleniacza Nupage, a do komory zewnętrznej 300 ml buforu do elektroforezy Tris-Glycine.</li>
 <li>Za pomocą końcówki pipety do nakładania próbek nanieść zdenaturowane próbki białek (15 μl) do studzienek.</li>
 <li>Prowadzić elektroforezę przy napięciu 200 V przez 60-70 min.</li>
</ol>
7. Barwienie żelu
<ol>
 <li>Wyjmij kasetę z aparatury do elektroforezy i przełam uszczelnienie epoksydowe, rozdzielając dwie plastikowe płyty do żelu za pomocą noża do żeli lub sztywnej szpachelki. Ostrożnie oddziel żel od płyt, uważając, aby go nie przerwać.</li>
 <li>Przepłucz żel wodą IRG-H2O trzy razy, delikatnie wstrząsając.</li>
 <li>Barw żel przy użyciu barwnika Invitrogen SimplyBlue SafeStain przez 1 godzinę, delikatnie wstrząsając.</li>
 <li>Odlej roztwór barwiący i odbarw żel wodą IRG-H2O.</li>
</ol>
8. Czyszczenie kaset
<ol>
 <li>Za pomocą metalnej szpatułki zeskrobać lub odkleić całą żywicę epoksydową z kaset, aby można było ich ponownie użyć.</li>
 <li>Każdą z plastikowych płytek do żelu umyć roztworem łagodnego detergentu, a następnie dokładnie wypłukać wodą z kranu, a potem wodą destylowaną.</li>
</ol>
9. Reprezentatywne wyniki
Ponieważ żywica epoksydowa tworzy wodoszczelną uszczelkę (Rysunek 1), kasety nie będą przeciekać podczas wlewania do nich roztworu akryloamidu. Dodatkowo kasety żelowe można łatwo otworzyć, aby wyjąć żel do barwienia, a żywicę epoksydową można odkleić z kaset, co umożliwia ich dalsze ponowne wykorzystanie. Jak pokazano na Rysunku 2, żel wykazuje wyraźną separację markerów białek i prążków próbek, odpowiednią do rutynowej elektroforezy białek.
<img src="/files/ftp_upload/3465/3465fig1.jpg" alt="Ustawienie elektroforezy z pipetą nakładającą próbki DNA do studzienek żelu w celu analizy rozdziału." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Nakładanie żywicy epoksydowej w celu uszczelnienia kaset minizelu. Cienka warstwa żywicy epoksydowej jest nakładana na krawędź jednej z kaset przed montażem. Aby wyróżnić żywicę epoksydową, na tym obrazie została ona sztucznie zabarwiona na czerwono.
<img src="/files/ftp_upload/3465/3465fig2.jpg" alt="Elektroforeza żelowa SDS-PAGE; rozdział białek; marker masy cząsteczkowej; drabina; wynik eksperymentu." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Rozdział białek na żelu SDS-Tris-glicyna przygotowanym z użyciem wielokrotnego wykorzystania kaset do minigelu. Elektroforezę SDS-PAGE przeprowadzono zgodnie z powyższym opisem. Po elektroforezie żel wyjęto z kasety do minigelu, zabarwiono barwnikiem SimplyBlue SafeStain zgodnie z instrukcjami producenta i sfotografowano przy użyciu białego światła przechodzącego. Ścieżka M zawiera wstępnie zabarwione standardy białkowe SeeBlue Plus2. Masy cząsteczkowe białek w ścieżce M są wskazane po prawej stronie żelu w kilodaltonach (kDa). Pozostałe ścieżki przedstawiają białka z oczyszczonego lizatu bakterii eksponujących białko z tagiem glutation-S-transferazy (GST). Przedstawione białka to te, które zostały wypłukane z kuleczek glutationowych przed elucją białka z tagiem GST.

<ol><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Raymond, S., Weintraub, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide+gel+as+a+supporting+medium+for+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis.</a> Science. 130, 711-711 (1959).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Elektroforeza białek w żelu jest niezbędną metodą w większości laboratoriów biologii molekularnej. Dostępne w handlu minigele zapewniają wysoki poziom wygody, lecz mogą być kosztowne. W niniejszym materiale pokazujemy, jak ponownie wykorzystać kasety do minigeli popularnej marki komercyjnej. Metoda ta zachowuje wygodę korzystania z gotowych żeli, ale przy niewielkim ułamku kosztów zakupu gotowych minigeli. Kluczowym krokiem w tej procedurze jest nałożenie odpowiedniej ilości żywicy epoksydowej w celu całkowitego uszczeln...

<table><tbody><tr><td>Kaseta do minigelu Invitrogen Nupage Novex (1,0 mm)</td><td>Invitrogen</td><td>NC2010</td><td>Dostępne w wersjach z 2, 5, 10, 12, 15 i 24 dołkami</td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa</td><td>Loctite</td><td>108771</td><td></td></tr><tr><td>Taśma izolacyjna</td><td>Scotch Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kolba z bocznym wylotem 125 ml</td><td>Pyrex</td><td>5360</td><td></td></tr><tr><td>4X bufor do żelu rozdzielczego Tris-Base</td><td></td><td></td><td>1,5 M Tris-base pH 8,7</td></tr><tr><td>akrylamid </td><td>Fisher Scientific</td><td>01065-500</td><td></td></tr><tr><td>Bis-akryloamid </td><td>MP Biomedicals</td><td>800173</td><td></td></tr><tr><td>30,8% roztwór akrylamidu</td><td></td><td></td><td>30:0,8 akrylamid: bis-akrylamid w IRG-H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>10% APS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179-25</td><td>0,1 g nadtlenosiarczanu amonu w 1 ml IRG-H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, przygotowany bezpośrednio przed użyciem</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Acros Organics</td><td>138450500</td><td></td></tr><tr><td>1-butanol nasycony 1X buforem do żelu rozdzielczego</td><td></td><td></td><td>5:2 1-butanol do buforu żelu rozdzielającego 1X</td></tr><tr><td>4X bufor do żelu zagęszczającego Tris-Base</td><td></td><td></td><td>1,5 M Tris-base pH 6,8</td></tr><tr><td>Grzebień do żelu</td><td>Invitrogen</td><td>NC3015</td><td>15 dołków, grubość 1,0 mm</td></tr><tr><td>Zgrzewarka impulsowa</td><td>Sprzęt do ogrzewania elektrycznego TEW</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woreczek z możliwością zgrzewania termicznego</td><td>Kapak/Scotchpak</td><td></td><td>1 o pojemności 1 pinta (6,5&quot; x 8&quot;)</td></tr><tr><td>Bufor do przechowywania żeli</td><td></td><td></td><td>Bufor żelu zagęszczającego 1X z 0,1% azotkiem sodu</td></tr><tr><td>bufor do próbek Novex SDS Tris-Glicyna (2X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC2676</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>10X bufor do elektroforezy Tris-gllicyna</td><td>Invitrogen</td><td>LC2675</td><td>1 l roztworu stokowego 10X: 29,0 g Tris-Base, 144,0 g glicyny, 10,0 g SDS</td></tr><tr><td>XCell &lt;em&gt;SureLock&lt;/em&gt; Mini-komórka</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Nóż do żelu</td><td>Invitrogen</td><td>EI9010</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue Safe Stain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6065</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie i prowadzenie elektroforezy białek w żelu z wykorzystaniem wielokrotnego użycia komercyjnych kaset

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

Ocena białek za pomocą analizy elektroforezy w żelach poliakryloamidowych z dodatkiem dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) jest powszechną techniką stosowaną przez badaczy w dziedzinie biochemii i biologii molekularnej1-4. W laboratoriach, w których codziennie przeprowadzane są analizy białek, koszt komercyjnie dostępnych żeli poliakryloamidowych (˜$10/żel) może z czasem stać się znaczący. Aby ograniczyć te koszty, niektórzy badacze przygotowują własne żele poliakryloamidowe. Tradycyjne metody odlewania tych żeli zazwyczaj wymagają specjalistycznego sprzętu i szklanych płytek do żeli, które mogą być drogie i uniemożliwiają odlewanie wielu żeli oraz ich przechowywanie do przyszłego użycia. Ponadto manipulowanie szklanymi płytkami podczas ich czyszczenia lub odlewania żelu może doprowadzić do przypadkowego stłuczenia, co stwarza zagrożenie dla bezpieczeństwa i może wykluczać ich stosowanie w zajęciach laboratoryjnych dla studentów. Nasz protokół demonstruje, jak jednocześnie odlewać wiele żeli białkowych poprzez recykling kaset minigel Invitrogen Nupage Novex oraz wykorzystanie niedrogich materiałów zakupionych w sklepie budowlanym. Ta ekonomiczna i usprawniona metoda obejmuje sposób przechowywania żeli w temperaturze 4°C przez kilka tygodni. Dzięki ponownemu wykorzystaniu plastikowych kaset do żeli z komercyjnie dostępnych zestawów, laboratoria często przeprowadzające elektroforezę białek mogą znacząco obniżyć koszty i pomóc środowisku. Dodatkowo plastikowe kasety są niezwykle odporne na stłuczenia, co czyni je idealnymi do użytku w laboratoriach dydaktycznych dla studentów.

Nasz protokół demonstruje, jak przygotować wiele żeli białkowych jednocześnie poprzez recykling kaset minigel Invitrogen Nupage Novex oraz wykorzystanie niedrogich materiałów zakupionych w sklepie budowlanym. Ta ekonomiczna i usprawniona metoda zawiera sposób przechowywania żeli w temperaturze 4°C przez kilka tygodni. Dzięki ponownemu wykorzystaniu plastikowych kaset do żeli pochodzących z dostępnych komercyjnie zestawów, laboratoria często przeprowadzające elektroforezę białek mogą znacząco obniżyć koszty i pomóc w ochronie środowiska.

Przygotowanie i prowadzenie elektroforezy białek w żelu z wykorzystaniem wielokrotnego użycia komercyjnych kaset

Ocena białek przy użyciu analizy elektroforezy w żelach poliakrylamidowych z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) jest powszechną techniką stosowaną w biochemii...

Nazywam się David Oppenheimer i pracuję w Katedrze Biologii na Uniwersytecie Florydy. Zakup gotowych żeli poliakrylamidowych do rutynowej elektroforezy białek jest wygodny, ponieważ zawsze można mieć pod ręką żele gotowe do użycia. Jednak żele komercyjne mogą być kosztowne, jeśli w laboratorium wykonuje się ich wiele.Ponadto żele komercyjne są zazwyczaj wlewane do plastikowych kaset przeznaczonych do wyrzucenia po użyciu, co generuje odpady z tworzyw sztucznych, które zazwyczaj trafiają na wysypiska. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak ponownie wykorzystać te plastikowe kasety do przygotowania własnych żeli poliakrylamidowych, które można przechowywać przez wiele tygodni, zapewniając w ten sposób laboratorium źródło niedrogich, gotowych żeli do rutynowej elektroforezy białek. Zatem zaczynajmy.Przygotuj czyste, nowe kasety do miniżelów Novak firmy Vitrogen. Usuń około jednej łyżeczki żywicy epoksydowej i dokładnie wymieszaj roztwór za pomocą końcówki pipety. Po zakończeniu mieszania nałóż żywicę epoksydową na tył przedniej kasety w miejscu, w którym przednia i tylna kaseta będą ze sobą stykać.Po zakończeniu nakładania epoksydowej żywicy należy upewnić się, że linia jest ciągła. Włóż arkusz papieru o grubości zbliżonej do otworu dolnego, a następnie umieść tył kasety na górze. Przesuń papier; zapobiegnie to przedostaniu się żywicy do spoiwa w otworze dolnym.Zaciśnij krawędzie, aby zapewnić szczelne zamknięcie, i pozostaw kasetkę na noc do pełnego utwardzenia. Aby przygotować żel rozdzielający, do kolby z bocznym ramieniem wlej 2,25 ml buforu do żelu rozdzielającego Forex triase o pH 8,7. Następnie dodaj 3,50 ml 30,8% akrylamidu.Następnie należy dodać 3,25 ml wody dwukrotnie destylowanej, aby uzyskać całkowitą objętość dziewięciu ml. Odgazuj roztwór przez 10 minut. Po ustaniu wydzielania gazu z roztworu, przelej dziewięć ml roztworu akryloamidu do probówki o pojemności 50 ml z pomarańczową zakrętką.Następnie dodać 30 µL 10%a PS z sześcioma µL temidu. Aby rozpocząć proces polimeryzacji, należy dokładnie wymieszać roztwór przed wylaniem żelu rozdzielczego. Należy upewnić się, że dolny otwór został zaklejony taśmą izolacyjną.Następnie wlej roztwór do kasety, pozwalając mu spływać po ściance, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Przerwij nalewanie, gdy pozostanie około jednego centymetra do górnej krawędzi. Następnie wlej 0,5 ml n-butanolu nasyconego buforem żelu rozdzielczego 1x, aby całkowicie pokryć powierzchnię.Przygotuj żel zgromadzający w ten sam sposób, w jaki przygotowujesz żel rozdzielający. Do kolby z kolbką boczną dodaj bufor do żelu zgromadzającego Forex na bazie tris z 30,8% akryloamidu i podwaj ilość wody destylowanej, aby uzyskać całkowitą objętość 3 ml. Odgazuj przez 10 minut, a następnie dodaj 9 µL 10% APS oraz 2 µL TEMED.Następnie należy dokładnie wymieszać zawiesinę po upływie jednej godziny. Pozostaw żel rozdzielający do czasu polimeryzacji w linii prostej.Ostrożnie odlej roztwór i wypłucz żel dwukrotnie destylowaną wodą. Odlej wodę i użyj papieru chłonnego, aby wchłonąć pozostałe ciecze. Szybko wlej roztwór żelu zagęszczającego do kasety i wypełnij ją tak bardzo, jak to możliwe.Następnie ostrożnie włóż grzebień do żelu i użyj dużego klipsa biurowego, aby go unieruchomić. Pozostaw żel na czas od jednej godziny do jednego dnia. Aby przechowywać żel, umieść go w woreczku nadającym się do zgrzewania termicznego. Wlej 20 ml buforu do żelu startowego 1x z 0,1% azydku sodu. Całkowicie zamknij woreczek i upewnij się, że nie ma żadnych wycieków.Przechowywać żel w temperaturze 4 °C. Aby przygotować próbki białek, należy dodać odpowiednią ilość białka do cienkościennej probówki do wirówki. W tym przypadku używamy 6,5 µL.Następnie dodaj 7,5 µL buforu do próbek no vx trix glycine SCS. Dodaj 1 µL 100 mM DTT i, jeśli to konieczne, uzupełnij wodą destylowaną do uzyskania całkowitej objętości 15 µL, aby zdenaturować białko. Inkubuj próbki w temperaturze 70 °C przez 10 minut.Przygotuj aparat do elektroforezy i wlej do komory wewnętrznej 200 ml 1x buforu do prowadzenia żelu Tris-glicyna z dodatkiem 500 µl przeciwutleniacza NewAge. Następnie wlej 300 ml 1x buforu do prowadzenia glicynowego do komory zewnętrznej. Ostrożnie nanieś 15 µl próbki białka do dołka, używając końcówki pipety do nakładania próbek na żel.Po zakończeniu nakładania próbek, przeprowadź elektroforezę żelu przy napięciu 200 V przez 60 do 90 minut. Po uruchomieniu procesu białka zaczną migrować przez żel poliakrylamidowy w zależności od ich wielkości. Mniejsze białka będą migrować szybciej niż białka większe.Ostrożnie wyjmij żel z kasety i przemyj go trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną przez pięć minut przy delikatnym mieszaniu. Po trzecim przemyciu zabarw żel barwnikiem in vitro gin, simply blue safe stain i delikatnie mieszaj przez jedną godzinę. Odlej pozostały barwnik i odbarw żel wodą podwójnie destylowaną.Jeśli chcą Państwo uzyskać krótsze i ciemniejsze prążki, należy prowadzić elektroforezę w żelu przez krótszy czas. Jeżeli natomiast chcą Państwo rozdzielić prążki w ścieżkach, należy wydłużyć czas przebiegu. Aby usunąć żywicę epoksydową i umożliwić ponowne wykorzystanie kaset, należy zeskrobać pozostałości epoksydu za pomocą noża do żeli.W dzisiejszym materiale pokazaliśmy, jak ponownie wykorzystać plastikowe kasety dołączane do komercyjnie dostępnych żeli poliakrylamidowych. Ważne jest użycie żywicy epoksydowej przeznaczonej do plastiku w celu uszczelnienia kaset żelowych. Należy również stosować odczynniki wysokiej jakości i zawsze nosić rękawiczki podczas pracy z niepolimeryzowanym akrylamidem.Dziękujemy i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

pouring-and-running-a-protein-gel-by-reusing-commercial-cassettes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wlewanie i uruchomienie żelu białkowego poprzez ponowne użycie komercyjnych kaset

W tym filmie prezentujemy metodę elektroforetycznego rozdzielania białek z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Elektroforetyczne rozdział białek

W niniejszym filmie opisujemy charakterystykę kompleksów wielobiałkowych (MPCs) za pomocą nieodbarwiającej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE). W pierwszym wymiarze dializowane lizaty komórkowe są rozdzielane metodą BN-PAGE w celu identyfikacji poszczególnych MPCs. W drugim wymiarze, SDS-PAGE, wybrane MPCs są dalej rozdzielane w celu analizy ich składników za pomocą immunoblottingu.

Błękitna natywna elektroforeza w żelach poliakrylamidowych (BN-PAGE) do analizy kompleksów wielobiałkowych z lizatów komórkowych

Członkowie rodzaju Burkholderia są patogenami o znaczeniu klinicznym.  Opisujemy metodę całkowitej ekstrakcji białek bakteryjnych, wykorzystującą mechaniczne rozerwanie i elektroforezę żelową 2D do późniejszej analizy proteomicznej.

Metody ekstrakcji białka całkowitego i elektroforezy żelowej 2D dla gatunków Burkholderia

V3 to procedura western blot z użyciem żeli bez plam. Technologia bezbarwna pozwala naukowcom na wizualizację jakości separacji białek, weryfikację wydajności transferu, a co najważniejsze, walidację zmiany w białku będącym przedmiotem zainteresowania przy użyciu całkowitej kwantyfikacji białka jako niezawodnej kontroli obciążenia.

V3 Bezbarwny przepływ pracy dla praktycznej, wygodnej i niezawodnej kontroli całkowitego obciążenia białkami w Western blotting

Ten protokół bada najnowsze osiągnięcia w przeprowadzaniu analiz Western blot. Te nowatorskie modyfikacje wykorzystują system żelowy Bis-Tris z 35-minutowym czasem trwania elektroforezy, 7-minutowy system suchego transferu blottingu oraz wykrywanie i obrazowanie białek fluorescencyjnych w podczerwieni, które generują wyższą rozdzielczość, jakość, czułość i lepszą dokładność danych zachodnich.

Najszybszy western w mieście: współczesna wariacja na temat klasycznej analizy Western Blot

Przedstawiono metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z niemodyfikowanego lizatu tkankowego za pomocą aminowo-reaktywnego białka sieciującego sprzężonego z nowatorskim dwuwymiarowym systemem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych

Gel-seq umożliwia badaczom jednoczesne przygotowanie bibliotek dla sekwencji DNA i RNA przy znikomych dodatkowych kosztach, zaczynając od 100 - 1000 komórek za pomocą prostego urządzenia hydrożelowego. W artykule przedstawiono szczegółowe podejście do wytwarzania urządzenia, a także protokół biologiczny do generowania sparowanych bibliotek.

Gel-seq: metoda jednoczesnego przygotowania biblioteki sekwencjonowania DNA i RNA przy użyciu matryc hydrożelowych

Tutaj opisujemy protokół dla ogólnej metody pościgu za impulsami, która pozwala na analizę kinetyczną fałdowania, transportu i degradacji białek w żywych komórkach.

Analiza fałdowania, transportu i degradacji białek w żywych komórkach za pomocą pościgu impulsów radioaktywnych

Tutaj prezentujemy protokół ekstrakcji, dystrybucji i identyfikacji superkompleksów mitochondrialnych, który minimalizuje narażenie na detergenty i Coomassie Blue. Protokół ten zapewnia optymalną równowagę między rozdzielczością a zachowaniem aktywności enzymów, jednocześnie minimalizując ryzyko utraty labilnych interakcji białko-białko.

Hybrydowa elektroforeza przezroczysta/niebieska natywna do separacji i analizy superkompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Eksperyment wykorzystany tutaj pokazuje metodę molekularnego dokowania w połączeniu z testem przesunięcia termicznego komórkowego w celu przewidywania i walidacji interakcji między małymi cząsteczkami a celami białkowymi.

Przewidywanie docelowego białka i walidacja związku małocząsteczkowego

Naucz się ekonomicznej metody nalewania żeli poliakrylamidowych poprzez ponowne użycie kaset Invitrogen Nupage Novex. Technika ta pozwala przechowywać gotowe żele w 4°C przez kilka tygodni, znacząco obniżając koszty laboratoryjne i redukując ilość odpadów plastikowych.

Przygotowanie i prowadzenie elektroforezy białek w żelu z wykorzystaniem wielokrotnego użycia komercyjnych kaset

Przeglądaj więcej filmów