Wykrywanie mikroregionalnego niedotlenienia w korze mózgowej myszy za pomocą dwufotonowego obrazowania endogennej fluorescencji NADH
21 lutego 2012
Tutaj opisujemy metodę bezpośredniej wizualizacji mikroregionalnego niedotlenienia tkanek w korze myszy in vivo. Opiera się na równoczesnym obrazowaniu dwufotonowym dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADH) i mikrokrążenia korowego. Ta metoda jest przydatna do analizy zaopatrzenia tkanek w tlen w wysokiej rozdzielczości.
Ogólnym celem tej procedury jest bezpośrednia wizualizacja mikroregionalnego niedotlenienia tkanek w korze myszy in vivo. Osiąga się to poprzez przygotowanie otwartego okna czaszki czaszki u znieczulonej myszy. Następnie barwnik fluorescencyjny jest wstrzykiwany dożylnie w celu oznaczenia naczyń krwionośnych mózgu.
Na koniec równolegle z obrazowaniem fotonowym przeprowadza się wewnętrzną fluorescencję NADH i znakowane fluorescencyjnie mikrokrążenie korowe. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na funkcjonalne niedotlenienie w mikroobszarach miąższu mózgu poprzez wizualizację obecności zredukowanej formy nikotynamidu, dinukleotydu adeninowego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak elektrody typu Clark, jest to, że daje ona wysoką rozdzielczość specjalną w dużym polu widzenia, a także jest mniej inwazyjna.
Metoda ta może być prowadzona na standardowo stosowanym systemie dwufotograficznym z dwoma kanałami fluorescencyjnymi. Cześć, nazywam się Steve Hurst, jestem profesorem i kierownikiem katedry mikrobiologii i immunologii na Uniwersytecie w Rochester, demonstrując dzisiejszą procedurę, będzie syn Anity z Laboratorium Kishka, a także Oxana Paulka, adiunkt naukowy z mojego laboratorium, dr Kishka, który był pionierem techniki obrazowania NADH, nie może być tutaj dzisiaj, ponieważ niedawno przeprowadził się do Niemiec. Po przygotowaniu miejsca operowanego za pomocą niezbędnych narzędzi, które zostały autoklawowane lub zdezynfekowane 70% etanolem, a mysz została znieczulona 5% izofluorem, umieść ją na poduszce grzewczej i nałóż maskę na twarz, aby dostarczyć 1,3 do 1,5% izofluoru w powietrzu.
Sprawdź poziom znieczulenia, wykonując uszczypnięcie ogona. Następnie włóż sondę doodbytniczą i stale mierz temperaturę ciała zwierzęcia przez cały czas trwania zabiegu. Nałóż sztuczny żel łzowy na oczy myszy, aby zapobiec ich wysuszeniu.
Następnie usuń włosy z głowy i obu ud nałóż depilator na udo na dwie minuty, aby usunąć pozostałe włosy, udo zostanie użyte do oksymetrii. Na koniec zdezynfekuj skórę głowy za pomocą 10% roztworu jodu powidonu i 70% etanolu. Aby zrobić okno czaszki zaczynające się od pięciu milimetrów, rozpieszczał czaszkę nożyczkami.
Wykonaj nacięcie na skórze głowy i przesuń się o jeden centymetr. Przesuń skórę na boki, aby odsłonić czaszkę Aby usunąć błony na szczycie czaszki. Zastosuj 10% roztwór chlorku żelaza.
Zetrzyj nadmiar roztworu i zeskrob membrany pod kątem 45 stopni. Numer pięć, pęseta Za pomocą mikroskopu preparacyjnego zidentyfikuj obszar zainteresowania. Nałóż cienką warstwę szybkiego kleju wokół krawędzi okna płyty czołowej.
Ustawić płytę górną w taki sposób, aby obszar zainteresowania był odsłonięty w oknie i lekko docisnąć płytę górną. Nałóż niewielką ilość cementu dentystycznego, aby szybko spolimeryzować klej. Przytrzymaj przez 10 sekund, aż klej polimeryzuje.
Nałóż niewielką ilość szybkiego kleju na krawędzie okna, aby uszczelnić płytę głowy i czaszkę. Następnie przykręć płytkę głowicy do uchwytu na zwierzę pod lunetą preparacyjną. Za pomocą zestawu dwóch wierteł z mikromomentem obrotowym o prędkości 6 000 obr./min i wiertła IRF 0 0 5.
Usuń cały nadmiar kleju z czaszki i płyty głowy. Następnie ustaw wiertło na tysiąc obrotów na minutę i rozpocznij wiercenie czaszki, wykonując okrąg wewnątrz okienka płyty głowicy o średnicy około pięciu milimetrów. Wykonuj lekkie, zamaszyste ruchy, tak jakbyś rysował bardzo miękkim ołówkiem.
Przerywaj wiercenie co 20 do 30 sekund i użyj sprężonego powietrza do usunięcia pyłu kostnego. W miarę postępu wiercenia wokół nienaruszonej czaszki pośrodku tworzy się nora. Uważaj, aby nie przebijać cienkiej czaszki, ale upewnij się, że ta nora ma równą grubość.
Ponadto należy zachować szczególną ostrożność w pobliżu dużych naczyń krwionośnych. Nie należy ich narażać na szwank, a jeśli to możliwe, nawet ich nie dotykać Jednym bolcem pęsety podnieś kość pośrodku okna i nałóż na okno kroplę sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego. Używając rogu chusteczki Kim, delikatnie zetrzyj sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy pod kątem 45 stopni.
Numer pięć, pęseta. Zlokalizuj obszar uszkodzonej opony twardej wzdłuż krawędzi okna i podnieś go, aby go zdjąć. Jeśli wystąpi krwawienie, nałóż kroplę sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego i odczekaj dwie do trzech minut, aż niewielkie krwawienie ustanie.
Następnie przygotuj 10 mililitrów 0,07% niskotopliwego aero rozpuszczonego w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym. Doprowadź stopione aeros do temperatury ciała. Zetrzyj nadmiar sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego z powierzchni mózgu.
Wlej aeros do okna i przykryj je szklanym zjeżdżalem. Następnie delikatnie dociśnij szkło, aby zetknęło się ze szkłem i odczekaj od 10 do 20 sekund, aż aero będzie solidne. Za pomocą pęsety i miękkiej bibułki usuń nadmiar aero ze szklanej pokrywy.
Nałóż niewielką ilość szybkiego kleju na szkło, aby przykleić je do płyty głównej. Następnie nałóż niewielką ilość cementu dentystycznego, aby zestalić klej do wstrzyknięcia do żyły udowej. Odwróć zwierzę częściowo, aby odsłonić wewnętrzną stronę lewego uda.
Użyj taśmy, aby zabezpieczyć zwierzę. W tej pozycji nałóż na skórę peeling antyseptyczny, a następnie stuprocentowy etanol. Następnie wykonaj nacięcie wzdłuż przyśrodkowej części uda od kolana do syntezy łonowej.
W razie potrzeby oddziel tkanki miękkie przez rozwarstwienie. Napełnij strzykawkę o pojemności jednego mililitra 130 mikrolitrami czerwieni teksańskiej. Zamocuj nową igłę o rozmiarze 30 i zegnij ją ostrożnie pod kątem 30 stopni, utrzymując skos do góry.
Napełnij igłę roztworem Texas Red pod mikroskopem preparacyjnym, włóż igłę do żyły udowej i wstrzyknij sto mikrolitrów czerwieni teksańskiej. Wyjąć igłę i lekko przycisnąć żyłę gazą, aby zatamować krwawienie. Zamknij skórę za pomocą czterech szwów w celu ciągłego monitorowania nasycenia krwi tlenem.
Umieść sondę pulsoksymetru na prawym udzie, z którego wcześniej usunięto włosy. Aby rozpocząć obrazowanie, przenieś chirurgicznie przygotowaną mysz do etapu mikroskopu. Zrób wstępne zdjęcie miejsca okna czaszki za pomocą oświetlenia jasnego pola przy czterokrotnym powiększeniu, aby użyć go jako mapy referencyjnej do rejestracji z większym powiększeniem do anies fotonów.
Powiększ obszar zainteresowania za pomocą 10-krotnego powiększenia. Zaznacz obszar zainteresowania w warstwach kory mózgowej. Jeden lub dwa zaczynają rejestrować szeregi czasowe.
Zalecamy użycie średnio od trzech do pięciu klatek, aby poprawić jakość obrazu. Następnie wywołaj hipoksemię, dodając 50% azotu do powietrza, którym oddycha zwierzę. Spowoduje to obniżenie poziomu tlenu do 10%Sprawdź hipoksemię, monitorując dane z pulsoksymetru.
Kontynuuj rejestrowanie szeregów czasowych przez hipoksemię przez około 30 sekund i po przywróceniu normalnego poziomu tlenu. Zbierz dane do obliczenia rozkładu tlenu, wykrywając, mierząc i określając ilościowo obszar niedotlenienia i natlenionych cylindrów tkankowych wokół naczyń krwionośnych. Aby określić promień cylindra tkanki rechotliwej R, zmierz odległość między środkiem naczynia krwionośnego a granicą, na której wykrywana jest wysoka fluorescencja NADH.
Zapoznaj się z pisemnym protokołem, aby uzyskać informacje o metodach przetwarzania danych. Rysunek ten przedstawia równoczesne obrazy geograficzne NADH z wideo nagranego podczas przejściowej hipoksemii, wdychane stężenie tlenu zostało obniżone z 21% do 10% przez okres trzech minut. Ten poziom eksperymentalnie wywołanej hipoksemii jest wystarczający do wywołania ciężkiego niedotlenienia w korze mózgowej.
Niedotlenienie doprowadziło do wzrostu fluorescencji NADH pokazanej początkowo na zielono w obszarach najbardziej oddalonych od dopływu krwi tętniczej. Zwróć uwagę, że ostre granice tkanki NADH, które reprezentują obserwowalne granice tkankowe dyfuzji tlenu z mikrokrążenia korowego, pokazane na czerwono. Oto równoległy obraz fluorescencyjnie znakowanych mikronaczyń kory na czerwono i wewnętrznej fluorescencji NADH z istoty szarej kory na zielono, rozkład intensywności fluorescencji NADH jest binarny.
Istnieją obszary o jednolicie niskiej fluorescencji NADH i obszary o jednolicie wysokiej fluorescencji NADH. Żółte linie reprezentują granice tkanek między obszarami o niskiej i wysokiej fluorescencji NADH. Te granice tkanek wykazują przestrzenny związek z pobliskimi mikronaczyniami.
Zależność ta jest określana przez dyfuzję tlenu z mikronaczyń do tkanki. W niektórych przypadkach cylindryczny charakter lub cylinder tkankowy CRO tych granic tkankowych można bezpośrednio rozpoznać, jak wskazują niebieskie linie. Tutaj granica tkanki ma okrągły kształt z koncentrycznym centralnym naczyniem krwionośnym Po opanowaniu.
Tę technikę można wykonać w 1,5 godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o przyklejeniu szkła nakrywkowego do metalowej płytki, aby zapobiec pionowemu ruchowi powierzchni kory mózgowej z powodu obrzęku. Po tej procedurze można przeprowadzić dodatkowe analizy, takie jak pomiary przekrwienia czynnościowego, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak związek między niedotlenieniem tkanek a sprzężeniem naczyniowo-mózgowym.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować mikroregionalne niedotlenienie tkanek w korze myszy.
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę wizualizacji mikroregionalnej hipoksji tkankowej w korze mysiego mózgu in vivo z wykorzystaniem dwufotonowego obrazowania. Technika ta pozwala na wysokorozdzielczościową analizę zaopatrzenia tkanki w tlen poprzez jednoczesne obrazowanie NADH i mikrokrążenia kortykalnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Techniki obrazowania
- Fizjologia
Tło
- Hipoksja tkankowa jest krytycznym czynnikiem w różnych schorzeniach neurologicznych.
- Tradycyjne metody pomiaru stężenia tlenu mogą być inwazyjne i mniej precyzyjne.
- Dwufotonowe obrazowanie oferuje mniej inwazyjną alternatywę z wyższą rozdzielczością przestrzenną.
- NADH jest kluczowym wskaźnikiem stanu metabolicznego komórek i dostępności tlenu.
Cel badania
- Rozwój metody do wizualizacji w czasie rzeczywistym hipoksji tkankowej w korze mysiego mózgu.
- Poprawa rozumienia mikroregionalnego zaopatrzenia w tlen w tkankach mózgu.
- Dostarczenie mniej inwazyjnej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami.
Stosowane metody
- Przygotowanie okna czaszkowego u znieczulonych myszy.
- Wstrzyknięcie dożylne fluorescencyjnego barwnika do zobrazowania naczyń krwionośnych mózgu.
- Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie fluorescencji NADH i mikrokrążenia.
- Monitorowanie nasycenia krwi tlenem podczas obrazowania.
Główne wyniki
- Udana wizualizacja funkcjonalnej hipoksji w mikroregionach mózgu.
- Uzyskano obrazy NADH i naczyń krwionośnych o wysokiej rozdzielczości przestrzennej.
- Metoda wykazała się mniejszą inwazyjnością w porównaniu z tradycyjnymi technikami.
- Wyniki wskazują na potencjalną poprawę rozumienia metabolizmu mózgu.
Wnioski
- Rozwinięta metoda stanowi cennym narzędzie do badania hipoksji tkankowej.
- Poprawia zdolność analizy zaopatrzenia w tlen w mózgu.
- Ta technika może prowadzić do nowych wglądów w zaburzenia neurologiczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Direct visualization of microregional hypoxia in the mouse cortex using two-photon NADH imaging addresses a critical gap in understanding tissue oxygenation at high spatial resolution. This capability enables mechanistic de-risking of neurovascular targets and supports predictive confidence in early-stage CNS drug discovery. The method's non-invasive, quantitative outputs inform portfolio decisions where oxygen supply and metabolic stress are key risk factors.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neurovascular metabolic pathways under hypoxic stress.
- Supports functional target validation by mapping oxygen gradients and tissue vulnerability.
- Facilitates predictive confidence in selecting targets linked to hypoxia-driven pathology.
Screening & Assay Development
- Provides a validated in vivo system for quantifying NADH fluorescence as a hypoxia biomarker.
- Enables reproducible, quantitative assessment of tissue oxygenation across experimental conditions.
- Supports assay standardization for evaluating compound effects on microregional oxygen supply.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of neurovascular compromise and stroke.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of hypoxia-modulating interventions.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates targeting oxygen delivery or metabolic resilience.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for CNS and neurovascular programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on oxygen diffusion and metabolic stress in brain tissue.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible NADH fluorescence readouts for compound evaluation.
- Analytics: Enables spatial mapping and statistical comparison of hypoxic versus oxygenated regions.
- Translational Research: Provides mechanistic continuity for preclinical models of stroke and neurovascular disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse CNS hypoxia studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurovascular target validation.
- Operational Value: Standardizes in vivo hypoxia measurement with high spatial resolution and reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for CNS programs by clarifying oxygenation risk factors.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of assets targeting metabolic or vascular mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in two-photon microscopy and in vivo surgical preparation.
- Needs access to standard two-photon imaging systems with dual fluorescence channels.
- Demands rigorous cross-team standardization for imaging and data analysis protocols.
- Adaptation to other brain regions or disease models may require protocol optimization.
- Potential limitations include surgical complexity and the need for precise oxygen modulation.
