Name: Wykrywanie mikroregionalnego niedotlenienia w korze mózgowej myszy za pomocą dwufotonowego obrazowania endogennej fluorescencji NADH (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Poznaj metodę dwufotonowego obrazowania NADH do wizualizacji mikroregionalnego niedotlenienia w korze mózgowej myszy. Technika ta umożliwia analizę zaopatrzenia tlenem z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dr Maiken Nedergaard (University of Rochester Medical Center) za projekt płytki czaszkowej. Praca została wsparta grantami NIH przyznanymi S.D (R01DA026325 oraz P30AI078498) oraz grantami fundacyjnymi dla KK (program Brain and Immunoimaging fundacji DANA, American Heart Association 0635595T oraz ALS Association [#1112])).

1. Przygotowanie zwierzęcia do obrazowania
Uwaga: W badaniach wykorzystujemy dorosłe myszy C57BL. W zależności od pytania badawczego można zastosować różne szczepy transgeniczne. Operacje mikronaczyniowe oraz pulsoksymetria są łatwiejsze do przeprowadzenia u myszy o białym futrze (np. szczep FVB).
<ol>
	<li>Przygotować pole operacyjne na blacie laboratoryjnym. Wszystkie instrumenty chirurgiczne muszą zostać wysterylizowane w autoklawie lub zdezynfekowane 70% etanolem.</li>
	<li>Wprowadzić sondę rektalną i stale monitorować temperaturę ciała zwierzęcia przez cały czas trwania procedury.</li>
	<li>Zanestetyzować mysz, stosując początkowo 5% izofluranu. Po 15-30 s, gdy zwierzę przestanie się poruszać, umieścić je na podgrzewaczu (37 °C) i założyć maskę do ciągłego podawania powietrza zawierającego 1,3-1,5% izofluranu. Upewnić się, że zwierzę nie reaguje na bodziec bólowy (np. uszczypnięcie ogona).</li>
	<li>Użyć żelu do sztucznych łez, aby pokryć oczy myszy i zapobiec ich wysuszeniu pod wpływem powietrza.</li>
	<li>Za pomocą strzygarki elektrycznej usunąć sierść z głowy i obu ud. Na uda nanieść środek do depilacji (np. Nair) na 2 min, a następnie ostrożnie wytrzeć, aby usunąć pozostałą sierść. Udo to zostanie wykorzystane do oksymetrii.</li>
	<li>Zdezynfekować skórę głowy, używając 10% roztworu powidonu z jodem oraz 70% etanolu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie otwartego okna czaszkowego
<ol>
	<li>Rozpocznij od wykonania nożyczkami nacięcia skóry głowy 5 mm kudalnie od czaszki, przesuwając się o jeden centymetr. Odsuń skórę na boki, aby odsłonić czaszkę.</li>
	<li>Aby usunąć błony z powierzchni czaszki, nanieś na nią 10% roztwór chlorku żelaza. Wytrzyj nadmiar roztworu i zdrap błony pęsetą nr 5 pod kątem 45°. Ważne jest, aby starannie przygotować miejsce zabiegu, aby zapewnić bezpieczne przymocowanie płytki głownej do czaszki (kroki od 4 do 6).</li>
	<li>Używając mikroskopu sekcyjnego, zidentyfikuj obszar zainteresowania. Należy unikać szwów czaszkowych, ponieważ czaszka może nieprzewidywalnie pękać wzdłuż tych linii.</li>
	<li>Nanieś cienką warstwę kleju błyskawicznego (np. Locktite 454) wokół krawędzi okna płytki głownej (rycina 1). Ustaw płytkę głowną w taki sposób, aby obszar zainteresowania był widoczny w oknie. Wywier lekki nacisk na płytkę główną. Nanieś niewielką ilość cementu dentystycznego, aby szybko spolimeryzować klej. Przytrzymaj przez 10 sekund podczas polimeryzacji kleju.</li>
	<li>Nanieś niewielką ilość kleju błyskawicznego na krawędzie okna, aby uszczelnić połączenie płytki głównej z czaszką. Przykręć płytkę główną do uchwytu zwierzęcia pod mikroskopem sekcyjnym.</li>
	<li>Używając wiertarki Microtorque II ustawionej na 6000 rpm i wiertła IRF 005, usuń cały nadmiar kleju z czaszki i z płytki głównej. Każdy pozostały klej na płytce głównej powinien zostać usunięty, w przeciwnym razie będzie utrudniać mocowanie pokrywy szklanej.</li>
	<li>Ustaw wiertarkę na 1000 rpm i rozpocznij wiercenie w czaszce, wykonując okrąg wewnątrz okna płytki głownej o średnicy ~5 mm. Stosuj lekkie, zamiatające ruchy, jak przy rysowaniu bardzo miękkim ołówkiem. Przerywaj wiercenie co 20-30 sekund, aby usunąć pył kostny za pomocą sprężonego powietrza. 
	Uwaga: Kształt otworu w płytce głównej umożliwia dodatkowy dostęp dla wiertła (dla operatora lewo- lub praworęcznego), co ułatwia wykonanie okrągłego okna czaszkowego. Dodatkowo, dwa otwory o nieregularnym kształcie zapewniają wymaganą przestrzeń do wprowadzenia elektrody Clarka lub elektrody szklanej do tkanki mózgowej pod oknem czaszkowym w celu przeprowadzenia dodatkowych pomiarów polarygraficznych lub elektrofizjologicznych.</li>
	<li>W miarę postępów wiercenia wokół nienaruszonej czaszki w centrum tworzy się wgłębienie. Należy uważać, aby nie przebićciejśniałej czaszki, lecz uformować to wgłębienie o równomiernej grubości. Zachowaj szczególną ostrożność w pobliżu dużych naczyń krwionośnych – nie powinny one zostać uszkodzone, a jeśli to możliwe, nawet nie powinny być dotykane.</li>
	<li>Używając jednego ramienia pęsety nr 3, podważ („odskocz”) kość w centrum okna. Nanieś kroplę sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) na okno.</li>
	<li>Delikatnie wytrzyj aCSF rogiem miękkiej chusteczki higienicznej (np. Kimwipe). Zazwyczaj opona twarda jest uszkodzona w jednym lub kilku miejscach wokół krawędzi okna. Rozpocznij od jednego z tych miejsc, delikatnie podnieś, a następnie usuń oponę twardą z powierzchni mózgu, używając pęsety nr 5 pod kątem 45°. Wybierając miejsce rozpoczęcia usuwania opony twardej, unikaj obszarów przylegających do dużych naczyń krwionośnych. W przypadku wystąpienia krwawienia nanieś kroplę aCSF i odczekaj 2-3 min, aż niewielkie krwawienie ustanie.</li>
	<li>Przygotuj 0,07% agarozę niskotopliwą rozpuszczoną w aCSF. Schłodź roztopioną agarozę do temperatury ciała. Wytrzyj nadmiar aCSF z powierzchni mózgu. Wlej agarozę do okna i przykryj ją szkiełkiem przedmiotowym. Delikatnie dociśnij szkło, aby zapewnić kontakt między szkłem a płytką główną, i odczekaj 10-20 s, aż agaroza stwardnieje.</li>
	<li>Usuń nadmiar agarozy z pokrywy szklanej za pomocą pęsety i miękkiej chusteczki higienicznej.</li>
	<li>Nanieś niewielką ilość kleju błyskawicznego wokół szkła, aby przykleić je do płytki głównej. Nanieś niewielką ilość cementu dentystycznego, aby utwardzić klej (rycina 1).</li>
</ol>
3. Wstrzykiwanie dożylne i monitorowanie natlenienia krwi
Uwaga: Do dożylnego podania Texas red rutynowo wykorzystywaliśmy żyłę udową zamiast żyły ogonowej. Wynika to z faktu, że iniekcje do żyły udowej zapewniają bezpieczne i powtarzalne podanie barwnika w formie bolusa.
<ol>
	<li>Obróć zwierzę częściowo na bok, aby odsłonić wewnętrzną stronę lewego uda. Użyj taśmy, aby unieruchomić zwierzę w tej pozycji.</li>
	<li>Nanieś na skórę środek odkażający, a następnie 100 % etanol.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie wzdłuż przyśrodkowej części uda od kolana do spojenia łonowego. Rozdziel tkanki miękkie poprzez rozwarstwianie tępe za pomocą pęsety #5.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę 1 ml ilością 130 μl Texas Red (2,5 mg/ml). Załóż nową igłę (rozmiar 30) i ostrożnie zagnij ją pod kątem 30°, kierując ścięcie do góry. Napełnij igłę roztworem Texas Red.</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym wprowadź igłę do żyły udowej i wstrzyknij 100 μl Texas Red. Wyjmij igłę i lekko uciśnij żyłę gazikiem, aby zatamować krwawienie.</li>
	<li>Zamknij skórę za pomocą szwu 4-0.</li>
	<li>W celu ciągłego monitorowania SpO2 we krwi (aby zapewnić odpowiednie utlenowanie krwi) umieść sondę oksymetru na prawym udzie (z którego wcześniej usunięto sierść).</li>
</ol>
4. Obrazowanie dwufotonowe
Uwaga: Jako źródła wzbudzenia wykorzystujemy system obrazowania wielofotonowego Olympus Fluoview1000 (pionowy) z femtosekundowym laserem Ti:Sa Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee. Do obrazowania stosujemy obiektywy imersyjne wodne × 10 NA 0.45 (Zeiss C-Apochromat) lub × 25 NA 1.05 (Olympus XLPlan N). Obrazy rejestrujemy z głębią 12 bitów, w rozdzielczości 512 × 512 pikseli, przy czasie przebywania piksela wynoszącym 2 μs. NADH oraz dekstran Texas-Red są wzbudzane jednocześnie przy 740 nm, a fluorescencję oddziela się od światła wzbudzenia za pomocą kombinacji lustra dichroicznego i filtra blokującego bliską podczerwień (FF665-Di01; FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, USA). Sygnał jest dzielony na dwa kanały za pomocą lustra dichroicznego (505DCXRU, Chroma, Rockingham, VT, USA) i filtrowany filtrami pasmowymi (NADH-Semrock FF460/80; Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Moc lasera mierzona za obiektywem wynosiła 10-20 mW dla obrazowania w warstwie I oraz 20-50 mW dla obrazowania w warstwie II.
<ol>
	<li>Przenieś mysz przygotowaną chirurgicznie na stolik mikroskopu. Wykonaj zdjęcie początkowe miejsca okna czaszkowego, korzystając z oświetlenia w polu jasnym przy powiększeniu 4x, aby służyło ono jako mapa referencyjna do rejestracji z angiografiami dwufotonowymi o większym powiększeniu.</li>
	<li>Przybliż obszar zainteresowania, stosując powiększenie × 10. Wybierz obszar zainteresowania w warstwach I lub II kory (do 150 μm poniżej powierzchni opon miękkich). W przypadku potrzeby zastosowania większego powiększenia użyj obiektywu × 25.</li>
	<li>Rozpocznij rejestrację serii czasowej (Rysunek 2). Zaleca się uśrednianie 3-5 klatek w celu poprawy jakości obrazu.</li>
	<li>Wywołaj hipoksemię, dodając 50 % N2 do powietrza, którym oddycha zwierzę. Obniży to poziom O2 do 10 %. Potwierdź wystąpienie hipoksemii, monitorując dane z oksymetru.</li>
	<li>Kontynuuj rejestrację serii czasowej podczas hipoksemii (na przykład przez 30 sekund) oraz po przywróceniu prawidłowego poziomu O2.</li>
	<li>Zbierz dane do obliczenia rozkładu tlenu poprzez wykrywanie, pomiar i kwantyfikację obszaru niedotlenienia oraz utlenionych cylindrów tkanki wokół naczyń krwionośnych.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Wyznacz promień cylindra tkankowego Krogha R. Można to zrobić ręcznie (Rycina 3), mierząc odległość między centrum naczynia krwionośnego a granicą, przy której wykrywana jest wysoka fluorescencja NADH.</li>
	<li>Alternatywnie można zastosować opisane wcześniej1 w materiale uzupełniającym i podsumowane w sekcji dyskusji niniejszego protokołu, obliczeniowe, niezależne od badacza, półautomatyczne wyznaczanie promienia cylindra tkankowego R oraz promienia centralnego naczynia krwionośnego r.</li>
	<li>Wyznacz obszar hipoksji za pomocą oprogramowania do analizy obrazów z otwartym dostępem, np. ImageJ. W tym celu wykorzystaj sygnał NADH, określ próg wyznaczający obszar o wysokiej intensywności NADH, a następnie zmierz powierzchnię tkanki o podwyższonej fluorescencji NADH.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 2 przedstawia wideo z obrazowaniem NADH/angiografią podczas przejściowej hypoksemii (w wersji PDF tego rysunku wykorzystano wybrane klatki obrazu). Stężenie tlenu w powietrzu wdechowym obniżono z 21 % do 10 % na okres 3 min. Ten poziom eksperymentalnie wywołanej hypoksemii jest wystarczający do wywołania ciężkiej hipoksji w korze mózgowej. Hipoksja doprowadziła do wzrostu fluorescencji NADH, początkowo w obszarach znajdujących się najdalej od dopływu krwi tętniczej. Należy zwrócić uwagę na wyraźne granice tkanek NADH, które reprezentują obserwowalne granice dyfuzji tlenu z mikrokrążenia korowego. Obraz na Rysunku 3 pokazuje geometrię granic dyfuzji tlenu otaczających naczynia mózgowe. Na podstawie tych granic możliwe jest wyznaczenie średnic cylindrów Krogha, zgodnie z wcześniejszym opisem 1.
<img alt="Układ do operacji na zwierzętach i wymiary dla eksperymentu. Schemat przedstawia dokładne pomiary nacięcia." src="/files/ftp_upload/3466/3466fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. (A) Mysz z przygotowanym oknem czaszkowym do obrazowania. (B) Wymiary płytki głowowej.
<img alt="Analiza zmian przepływu krwi w mikronaczyniach, obrazy z eksperymentu, zmienne poziomy tlenu." src="/files/ftp_upload/3466/3466fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Endogenna zielona fluorescencja NADH zwizualizowana za pomocą obrazowania dwufotonowego przez okno czaszkowe, około 50 μm poniżej powierzchni opony miękkiej. Naczynia krwionośne zwizualizowano za pomocą dekstranu Texas Red. Zawartość tlenu w wdychanym powietrzu została zmniejszona do 10% na 3 min, a następnie przywrócona do 21%. Pasek skali: 50μm.
<img alt="Obraz mikroskopowy naczyń krwionośnych, obrazowanie optyczne, kontrast czerwony i zielony, opisany pomiar." src="/files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Geometria granic fluorescencji NADH. Żółty obrys wskazuje granicę hipoksji funkcjonalnej; niebieskie okręgi przedstawiają rzutowane cylindry utlenowane (Krogha). Niebieskie linie wskazują promienie cylindrów; liczby określają promienie w mikrometrach.

<ol><li>Kasischke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+NADH+imaging+exposes+boundaries+of+oxygen+diffusion+in+cortical+vascular+supply+regions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood.+Flow.+Metab%22%5BJournal%5D)">Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 31, 68-81 (2011).</li>
<li>Ndubuizu, O., LaManna, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tissue+oxygen+concentration+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox.+Signal%22%5BJournal%5D)">Brain tissue oxygen concentration measurements.</a> Antioxid. Redox. Signal. 9, 1207-1219 (2007).</li>
<li>Sharan, M., Vovenko, E. P., Vadapalli, A., Popel, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+theoretical+studies+of+oxygen+gradients+in+rat+pial+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood.+Flow.+Metab%22%5BJournal%5D)">Experimental and theoretical studies of oxygen gradients in rat pial microvessels.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 28, 1597-1604 (2008).</li>
<li>Sakadzic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat. Methods. 7, 755-759 (2010).</li>
<li>Vishwasrao, H. D., Heikal, A. A., Kasischke, K. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dependence+of+intracellular+NADH+on+metabolic+state+revealed+by+associated+fluorescence+anisotropy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Conformational dependence of intracellular NADH on metabolic state revealed by associated fluorescence anisotropy.</a> J. Biol. Chem. 280, 25119-25126 (2005).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15741-15746 (1998).</li>
<li>Brown, W. R., Thore, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+cerebral+microvascular+pathology+in+ageing+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol.+Appl.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Review: cerebral microvascular pathology in ageing and neurodegeneration.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 37, 56-74 (2011).</li>
<li>de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+brain+microcirculation+may+trigger+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Impaired brain microcirculation may trigger Alzheimer's disease.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 18, 397-401 (1994).</li>
<li>Brown, C. E., Boyd, J. D., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+in+vivo+imaging+reveals+balanced+and+branch-specific+remodeling+of+mature+cortical+pyramidal+dendritic+arbors+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood.+Flow.+Metab%22%5BJournal%5D)">Longitudinal in vivo imaging reveals balanced and branch-specific remodeling of mature cortical pyramidal dendritic arbors after stroke.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 30, 783-791 (2010).</li>
<li>Wilson, D. F., Erecinska, M., Drown, C., Silver, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oxygen+dependence+of+cellular+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">The oxygen dependence of cellular energy metabolism.</a> Arch. Biochem. Biophys. 195, 485-493 (1979).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Informacje o dyfuzji tlenu o wysokiej rozdzielczości przestrzennej są istotne dla zrozumienia, w jaki sposób regulowany jest przepływ krwi w mózgu, aby dostarczyć tlen do komórek mózgowych i zaspokoić zapotrzebowanie metaboliczne. Tradycyjne pomiary polarygraficzne tlenu z wykorzystaniem szklanych elektrod typu Clarka są wysoce inwazyjne, charakteryzują się niską rozdzielczością przestrzenną2-3 oraz znacznym czasem odpowiedzi (rzędu sekund). Do tej pory jedyną nieinwazyjną metodą pomiaru pO2 w tkance mózgowej było wygaszanie fosforescencji, w którym szybkość zaniku wzbudzonej sondy jest proporcjonalna do stężenia tlenu4. Metoda ta zapewnia dokładne wartości stężeń tlenu, ale wymaga zastosowania zastrzeżonego barwnika oraz technicznie zaawansowanego systemu obrazowania czasu życia fosforescencji. W niniejszej pracy prezentujemy prostsze, bezpośrednie podejście, które można zrealizować na standardowym systemie obrazowania dwufotonowego z dwoma kanałami fluorescencji. Nasze podejście wykorzystuje wewnętrzny sygnał tkankowy5 i wymaga jedynie kontrastowej wizualizacji mikrokrążenia korowego. Ze względu na nieliniowy, w zasadzie binarny wzrost fluorescencji NADH przy funkcjonalnie ograniczonych stężeniach tlenu1, zwiększona wewnętrzna fluorescencja NADH jest obserwowana wyłącznie w obszarach z istotną, metabolicznie ograniczającą hipoksją. Ważną konsekwencją jest to, że granice tkankowe dyfuzji tlenu z korowych mikronaczyń są bezpośrednio obserwowalne jako cylindryczne zmiany intensywności endogennej fluorescencji NADH. Struktury te nazywamy cylindrami Krogha, ponieważ koncepcja cylindrycznych struktur definiujących utlenowaną objętość tkanki otaczającej naczynie krwionośne została wprowadzona przez Augusta Krogha i była niedawno obserwowana eksperymentalnie przy użyciu dwufotonowego obrazowania NADH1. Obrazy cylindrów Krogha można gromadzić w 3D, wykonując stos obrazów wzdłuż osi z (z-stack). Są one szczególnie wyraźne w sąsiedztwie naczyń doprowadzających (arteriol) penetrujących i pokrywają się z pozarteriolarne cylindrami tkanki pozbawionej kapilar1,4.
Aby zapewnić obiektywne wyznaczenie promienia cylindra tkankowego Krogha R (patrz sekcja 5.2), zmierzyliśmy radialne wartości intensywności pikseli w obrębie ściśle określonego segmentu między centrum cylindra a jego zewnętrzną granicą, wykorzystując funkcję „improfile” w programie Matlab. Zewnętrzną granicę segmentu należy dobrać tak, aby wykraczała poza widoczną granicę z odpowiednim marginesem bezpieczeństwa. W celu poprawy stosunku sygnału do szumu uśredniliśmy wartości wszystkich linii radialnych niezbędnych do pokrycia widocznego segmentu cylindra w odstępach 1°. Wynikowy średni profil intensywności radialnej w obrębie segmentu wykazał gwałtowny wzrost, który odpowiadał widocznej granicy tkanki R. Następnie do uśrednionego radialnego profilu intensywności dopasowaliśmy funkcję sigmoidalną (np. funkcję Boltzmanna), a jej punkt przegięcia (znany również jako x0) przyjęliśmy jako definicję R. Odpowiadająca temu mikroangiografia dwufotonowa (Texas-red) ujawniła przekrój pojedynczego, centralnego naczynia krwionośnego w centrum cylindra. Średnicę centralnego naczynia krwionośnego można bezpośrednio wykorzystać do wyznaczenia r.
Obrazowanie NADH metodą dwufotonową zapewnia taką samą rozdzielczość przestrzenną, jak jednoczesne obrazowanie mikroangiografii korowej w wysokiej rozdzielczości. Ważną cechą dla ilościowego zastosowania tej metody jest fakt, że p50 wzrostu fluorescencji NADH wynosi 3,4 ± 0,6&#x2009;mm&#x2009;Hg 1, a intensywność fluorescencji NADH jako funkcja mikroregionalnego pO2 tkanki może być opisana matematycznie za pomocą funkcji sigmoidalnej. Wykazujemy, że technika ta pozwala zidentyfikować obszary mózgu najbardziej podatne na hipoksję (poprzez obniżenie zawartości tlenu w powietrzu do 10 %). Wykazujemy również, że dyfuzja tlenu przebiega zgodnie z prostym geometrycznym wzorcem okołonaczyniowym.
Kluczowym etapem tej metody jest jakość przygotowania okna czaszkowego. Operacja powinna spowodować minimalne uszkodzenia, aby nie zakłócić przepływu krwi w odsłoniętym obszarze. Istnieje obawa, że w przypadku przygotowania obciążonego chirurgicznie, kora pod oknem może być początkowo niedotleniona, co uniemożliwi przeprowadzenie jakichkolwiek znaczących eksperymentów. Prawidłowo przygotowane okno czaszkowe powinno charakteryzować się nienaruszonymi dużymi i małymi naczyniami krwionośnymi z wyraźnym przepływem krwi we wszystkich typach naczyń oraz brakiem istotnych krwawień wzdłuż krawędzi. W warunkach normoksji (PaO2 80-100 mmHg, Sp O2 97-99%) miąższ mózgu powinien wykazywać jednorodną fluorescencję NADH bez widocznych, jasnych obszarów tkanki o podwyższonej fluorescencji NADH.
Fundamentalnym ograniczeniem fizycznym naszego podejścia jest ograniczona głębokość penetracji. Niebiesko-zielona fluorescencja NADH w mózgu jest szybko tłumiona przez absorpcję hemoglobiny i rozpraszanie tkankowe przy tych długościach fal. Nawet przy zastosowaniu obiektywów imersyjnych w wodzie o wysokiej aperturze numerycznej (np. 1,05), obrazowanie NADH metodą dwufotonową jest obecnie ograniczone do warstw I i II kory. Ograniczenie to jest istotne naukowo, ponieważ metabolizm energetyczny w istocie białej lub w jej sąsiedztwie prawdopodobnie różni się od metabolizmu w istocie szarej. Jednak badanie głębokich struktur korowych, takich jak warstwy IV-VI, lub struktur podkorowych, takich jak drogi istoty białej czy prążkowie, wymagałoby zastosowania specjalistycznych mikrosoczewek, zgodnie z opisem dla kory mysiej in vivo6.
Pomiar granic dyfuzji tlenu oparty na NADH może być szczególnie użyteczny w połączeniu z innymi pomiarami, takimi jak analizy hiperemii funkcjonalnej oraz detekcja szybkości przepływu w naczyniach włosowatych7. Na przykład technikę tę można dostosować&nbsp;do wizualizacji hipoksji w modelach udaru oraz choroby Alzheimera (AD). Prosta geometria dyfuzji tlenu pozwala na przewidzenie gradientu tlenowego w łożyskach mikronaczyniowych w sytuacjach, gdy gęstość naczyń włosowatych jest zmniejszona8 (np. w AD9), oraz na zbadanie, czy obszary tkanki mózgowej o zmniejszonej gęstości naczyń włosowatych są bardziej narażone na uszkodzenia hipoksyczne wynikające z mikroudarów. Możliwość obrazowania w skali mikroregionalnej pozwala również na zbadanie geometrii i wielkości mikroudarów tkankowych oraz określenie objętości tkanki, w której występuje hipoksja, a także zależności między hipoksją tkankową a późniejszą śmiercią neuronów lub przebudową naczyń włosowatych10.
Wreszcie, ponieważ wzrosty fluorescencji endogennego NADH są bezpośrednim następstwem ostrej dysfunkcji mitochondriów, metoda ta stwarza możliwość wykorzystania obrazowania NADH jako specyficznego wskaźnika metabolicznego energetycznego neuronów11 oraz miernika dysfunkcji mitochondriów.
Podsumowując, obrazowanie dwufotonowe endogennej fluorescencji NADH jest prostym i niedemandującym narzędziem, które może być wykorzystane do zrozumienia dostarczania i zużycia tlenu w mózgu zarówno w stanach prawidłowych, jak i patologicznych.

<table><tbody><tr><td>Podkładki grzejne</td><td>Poza ciepłem organizmu</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Maść oftalmiczna (sztuczne łzy)</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% roztwór powidonu z jodem</td><td>Betadine Puredue Pharma</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>10% roztwór chlorku żelaza(III)</td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Cement</td><td>Stoelting Co.</td><td>51456</td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>Cyjanoakrylan 454&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Loctite</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> </td></tr><tr><td>aCSF</td><td>Harvard Apparatus</td><td>597316</td><td> </td></tr><tr><td>Zestaw końcówek Microtorque II</td><td>Testy Pearsona</td><td>R14-0002</td><td> </td></tr><tr><td>Wiertła IRF 007</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td> </td></tr><tr><td>Pinceta nr 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295</td><td> </td></tr><tr><td>Pinceta #5/45</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td> </td></tr><tr><td>szkiełko nakrywkowe nr 0</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>63750-01</td><td> </td></tr><tr><td>Pomnożnik fotonowy</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>HC125-02</td><td> </td></tr><tr><td>Laser ti:szafirowy Mai-Tai</td><td>Newport Corp.</td><td></td><td> </td></tr></tbody></table>

wykrywanie mikroregionalnej hipoksji w korze mózgowej myszy za pomocą obrazowania dwufotonowego endogennej fluorescencji nadh

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Zdolność mózgu do funkcjonowania przy wysokim zapotrzebowaniu metabolicznym zależy od ciągłych dostaw tlenu poprzez przepływ krwi oraz dyfuzję tlenu w tkankach. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy zilustrowany protokół eksperymentalny i metodologiczny służący do bezpośredniej wizualizacji mikroregionalnej hipoksji tkankowej oraz wnioskowania o okołonaczyniowych gradientach tlenu w korze mózgu myszy. Metoda ta opiera się na nieliniowej zależności pomiędzy intensywnością endogennej fluorescencji nikotynamidoadeninowej dinukleotydy (NADH) a ciśnieniem parcjalnym tlenu w tkance, w której obserwowana fluorescencja NADH w tkance gwałtownie wzrasta przy poziomach tlenu tkankowego poniżej 10 mmHg.1Stosujemy dwufotonową ekscytację przy 740 nm, co pozwala na jednoczesną ekscytację wrodzonej fluorescencji NADH w tkance oraz osocza krwi skontrastowanego dekstranem Texas-Red. Zalety tej metody w porównaniu z istniejącymi podejściami obejmują następujące aspekty: wykorzystuje ona wrodzony sygnał tkankowy i może być przeprowadzona przy użyciu standardowego układu dwufotonowego in vivo sprzęt obrazujący; umożliwia on ciągłe monitorowanie całego pola widzenia z rozdzielczością w głąb wynoszącą ~50 μm. Wykazujemy, że obszary tkanki mózgowej położone najdalej od naczyń krwionośnych mózgu odpowiadają podatnym obszarom watershed, które jako pierwsze ulegają hipoksji funkcjonalnej w następstwie spadku podaży tlenu naczyniowego. Metoda ta pozwala na obrazowanie mikroregionalnego natlenienia kory i jest zatem przydatna do badania roli niewystarczającej lub ograniczonej podaży tlenu do tkanek w chorobach naczyniowo-mózgowych oraz udarach.

W niniejszej pracy opisujemy metodę bezpośredniej wizualizacji mikroregionalnej hipoksji tkankowej w korze mózgu myszy in vivo. Metoda ta opiera się na jednoczesnym obrazowaniu dwufotonowym nikotynamidowo-adeniny-dinukleotydu (NADH) oraz mikrokrążenia korowego. Metoda ta jest przydatna do wysokorozdzielczej analizy zaopatrzenia tkanki w tlen.

Wykrywanie mikroregionalnej hipoksji w korze mózgowej myszy za pomocą obrazowania dwufotonowego endogennej fluorescencji NADH

Zdolność mózgu do funkcjonowania przy wysokim zapotrzebowaniu metabolicznym zależy od ciągłej dostawy tlenu poprzez przepływ krwi oraz dyfuzję tlenu w tkankach. ...

Ogólnym celem tej procedury jest bezpośrednia wizualizacja mikroregionalnej hipoksji tkankowej w korze mózgu myszy in vivo. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie otwartego okna czaszkowego u znieczulonej myszy. Następnie dożylnie wstrzykuje się barwnik fluorescencyjny w celu oznakowania naczyń krwionośnych mózgu.Na koniec przeprowadzono jednoczesne obrazowanie fotonowe wewnętrznej fluorescencji NADH oraz fluorescencyjnie znakowanej mikrokrążenia kory mózgowej. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące funkcjonalną hipoksję w mikroregionach miąższu mózgu poprzez wizualizację obecności zredukowanej formy nikotynamidoadeninodynukleotydu. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak elektrody typu Clarka, jest wysoka rozdzielczość przestrzenna w szerokim polu widzenia oraz mniejsza inwazyjność.Tę metodę można przeprowadzić na standardowym systemie dwufotonowym z dwoma kanałami fluorescencyjnymi. Dzień dobry, jestem Steve Hurst, profesor i kierownik katedry mikrobiologii i immunologii na Uniwersytecie w Rochester. Procedurę zaprezentują dziś Anita's son z laboratorium dr. Kishki oraz Oxana Paulka, profesor asystent w moim laboratorium. Dr Kishka, pionier techniki obrazowania NADH, nie może być dzisiaj obecny ze względu na niedawną przeprowadzkę do Niemiec. Po przygotowaniu pola operacyjnego za pomocą niezbędnych narzędzi, które zostały poddane autoklawowaniu lub zdezynfekowane 70% ethanol, oraz po znieczuleniu myszy 5% isof fluorine, należy umieścić zwierzę na podkładce grzewczej i założyć maskę twarzową w celu podawania 1,3 do 1,5% isof fluorine w powietrzu.Sprawdź poziom znieczulenia, wykonując ucisk ogona. Następnie wprowadź sondę rektalną i przez cały czas trwania procedury na bieżąco mierz temperaturę ciała zwierzęcia. Nałóż żel do sztucznych łez na oczy myszy, aby zapobiec ich wysychaniu.Następnie należy usunąć sierść z głowy oraz obu ud, nakładając środek do depilacji na udo przez dwie minuty w celu usunięcia pozostałej sierści; udo to zostanie wykorzystane do oksymetrii. Na koniec należy zdezynfekować skórę czaszki, używając 10% roztworu powidon-jodu oraz 70% etanolu. Aby wykonać okno czaszkowe, należy naciąć czaszkę nożyczkami w odległości pięciu milimetrów od krawędzi.Wykonaj nacięcie skóry głowy i posuń się o jeden centymetr. Odsuń skórę na boki, aby odsłonić czaszkę i usunąć znajdujące się na niej błony. Zastosuj 10% roztwór chlorku żelaza.Zetrzyj nadmiar roztworu i zeskrob błony pod kątem 45 stopni. Numer pięć, pęseta. Używając mikroskopu sekcyjnego, zidentyfikuj obszar zainteresowania. Nałóż cienką warstwę kleju szybkoschnącego wokół krawędzi otworu w płytce głowowej.Ustaw płytkę głowową w taki sposób, aby obszar zainteresowania był widoczny w okienku, a następnie lekko dociśnij płytkę. Nałóż niewielką ilość cementu stomatologicznego, aby szybko spolimeryzować klej. Przytrzymaj przez 10 sekund podczas polimeryzacji kleju.Nanieś niewielką ilość kleju szybkoschnącego na krawędzie okna, aby uszczelnić płytkę głowową i czaszkę. Następnie przykręć płytkę głowową do uchwytu zwierzęcia pod mikroskopem dissectingowym. Użyj zestawu dwóch wiertarek mikro-momentowych ustawionych na 6, 000 RPM oraz wiertła IRF 0 0 5.Usuń cały nadmiar kleju z czaszki oraz z płytki stabilizującej głowę. Następnie ustaw wiertarkę na 1000 RPM i rozpocznij wiercenie w czaszce, wykonując wewnątrz otworu płytki stabilizującej głowę okrąg o średnicy około 5 mm. Stosuj lekkie, zamiatające ruchy, tak jakbyś rysował bardzo miękkim ołówkiem.Należy przerywać wiercenie co 20 do 30 sekund i używać sprężonego powietrza do usuwania pyłu kostnego. W miarę postępu wiercenia, wokół nienaruszonej czaszki w centrum tworzy się kanał. Należy uważać, aby nie przebić cienkiej czaszki, dbając jednocześnie o to, aby kanał ten miał równomierną grubość.Dodatkowo należy zachować szczególną ostrożność w pobliżu dużych naczyń krwionośnych. Nie wolno ich uszkodzić, a jeśli to możliwe, nawet nie należy ich dotykać. Za pomocą jednego ramienia pęsety unieś kość w centrum okna i nanieś kroplę sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego na okno. Używając rogu chusteczki Kim wipe, delikatnie usuń sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy, przecierając pod kątem 45 stopni.Numer pięć, pęseta. Zlokalizuj obszar uszkodzonej opony twardej wzdłuż krawędzi okna i unieś go, aby go usunąć. W przypadku wystąpienia krwawienia nanieś kroplę sztucznego CSF i odczekaj od dwóch do trzech minut, aż niewielkie krwawienie ustąpi.Następnie przygotuj 10 ml 0,07% niskotopliwego aero rozpuszczonego w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym. Doprowadź roztopione aero do temperatury ciała. Usuń nadmiar sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego z powierzchni mózgu.Wlej aero w okienko i przykryj je szkiełkiem podstawowym. Następnie delikatnie dociśnij szkiełko, aby zapewnić kontakt między nim a płytką głowową, i odczekaj od 10 do 20 sekund, aż aero stężeje. Za pomocą pęsety i miękkiej chusteczki higienicznej usuń nadmiar aero ze szkiełka osłonowego.Nałóż niewielką ilość kleju szybkozastygającego wokół szkła, aby przykleić je do płytki głowowej. Następnie nałóż niewielką ilość cementu dentystycznego, aby utrwalić klej przed wstrzyknięciem do żyły udowej. Obróć zwierzę częściowo, aby odsłonić wewnętrzną stronę lewego uda.Użyj taśmy, aby unieruchomić zwierzę. W tej pozycji zastosuj szorowanie antyseptyczne, a następnie nałóż 100% etanol na skórę. Następnie wykonaj nacięcie wzdłuż przyśrodkowej strony uda, od kolana do syntezy łonowej.W razie potrzeby oddziel tkanki miękkie za pomocą rozczepiania tępego. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml 130 µL Texas red. Przymocuj nową igłę o rozmiarze 30 G i ostrożnie zagnij ją pod kątem 30°, kierując ścięcie igły do góry.Napełnij igłę roztworem Texas Red pod mikroskopem stereoskopowym, wprowadź igłę do żyły udowej i wstrzyknij 100 µL Texas Red. Wyjmij igłę i lekko uciśnij żyłę gazikiem, aby zatamować krwawienie. Zamknij skórę za pomocą szwu 4-0 w celu ciągłego monitorowania wysycenia krwi tlenem.Umieść sondę oksymetru na prawym udzie, z którego wcześniej usunięto owłosienie. Aby rozpocząć obrazowanie, przenieś chirurgicznie przygotowaną mysz na stolik mikroskopu. Wykonaj początkowe zdjęcie miejsca okna czaszkowego, korzystając z oświetlenia w polu jasnym przy powiększeniu czterokrotnym, aby służyło ono jako mapa referencyjna do rejestracji z większym powiększeniem w celu obrazowania fotonów.Przybliż obszar zainteresowania, używając 10-krotnego powiększenia. Wybierz obszar zainteresowania w warstwach kory. Naciśnij jeden lub dwa przyciski, aby rozpocząć rejestrację serii czasowej.Zalecamy użycie średnio od trzech do pięciu klatek w celu zwiększenia jakości obrazu. Następnie wywołaj hipoksemię, dodając 50% nitrogen do powietrza, którym oddycha zwierzę. Spowoduje to obniżenie poziomu tlenu do 10%. Zweryfikuj wystąpienie hipoksemii, monitorując dane z oksymetru.Kontynuuj rejestrację serii czasowej podczas hipoksemii przez około 30 sekund oraz po przywróceniu prawidłowego poziomu tlenu. Zbierz dane do obliczenia rozkładu tlenu poprzez wykrywanie, pomiar i ilościowe określenie obszaru niedotlenienia oraz cylindrów tkanek utlenowanych wokół naczyń krwionośnych. Aby wyznaczyć promień cylindra tkankowego R, zmierz odległość między środkiem naczynia krwionośnego a granicą, przy której wykrywana jest wysoka fluorescencja NADH.Metody przetwarzania danych opisano w protokole pisemnym. Rysunek przedstawia jednoczesne obrazy NADH i geograficzne z filmu zarejestrowanego podczas przejściowej hipoksemii; stężenie tlenu w powietrzu wdechowym obniżono z 21% do 10% na okres trzech minut. Ten poziom eksperymentalnie wywołanej hipoksemii jest wystarczający do wywołania ciężkiej hipoksji w korze mózgowej.Hipoksja doprowadziła do wzrostu fluorescencji NADH, zaznaczonej na zielono, początkowo w obszarach najdalej oddalonych od dopływu krwi tętniczej. Należy zwrócić uwagę na ostre granice NADH w tkance, które reprezentują obserwowalne granice dyfuzji tlenu z mikrokrążenia korowego, zaznaczone na czerwono. Poniżej znajduje się obraz współbieżny mikro naczyń korowych znakowanych fluorescencyjnie na czerwono oraz wewnętrznej fluorescencji NADH z istoty szarej kory na zielono; rozkład intensywności fluorescencji NADH ma charakter binarny.Występują obszary z jednolicie niską fluorescencją NADH oraz obszary z jednolicie wysoką fluorescencją NADH. Żółte linie reprezentują granice tkankowe pomiędzy obszarami o niskiej i wysokiej fluorescencji NADH. Granice tkankowe te wykazują zależność przestrzenną względem pobliskich mikronaczyń.Zależność ta jest określana przez dyfuzję tlenu z mikronaczyń do tkanki. W niektórych przypadkach cylindryczny charakter lub cylindryczna tkanka CRO tych granic tkankowych może być bezpośrednio rozpoznana, co wskazują niebieskie linie. W tym przypadku granica tkankowa ma kształt koła z koncentrycznym centralnym naczyniem krwionośnym po opanowaniu metody.Technikę tę można przeprowadzić w 1,5 godziny, jeśli jest ona wykonana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o przyklejeniu szkiełka przykrywnego do metalowej płytki, aby zapobiec pionowemu przemieszczeniu się powierzchni kory wskutek obrzęku. Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić dodatkowe analizy, takie jak pomiary hiperemii funkcjonalnej, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące związku między hipoksją tkankową a sprzężeniem naczyniowo-nerwowym.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat wizualizacji mikroregionalnej hipoksji tkankowej w korze mózgu myszy.

detection-microregional-hypoxia-mouse-cerebral-cortex-two-photon

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wykrywanie hipoksji mikroregionalnej w korze mózgowej myszy poprzez dwufotonowe obrazowano fluorescencji endogennego NADH

Dynamikę przepływu krwi w korze mózgu można badać in vivo, obrazując fluorescencyjne barwniki dekstranowe wstrzyknięte do żyły ogonowej gryzoni za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Niniejszy film pokazuje, jak obrazować dynamikę przepływu krwi w neocortex myszy przy użyciu preparatu okna czaszkowego przykrytego szkłem.

Metoda obrazowania przepływu krwi w neokorze za pomocą obrazowania dwufotonowego przez okno czaszkowe

Przedstawiamy procedurę eksperymentalną pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu (pO2) w naczyniach krwionośnych mózgu, opartą na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji. Opisano procedury przygotowania zwierząt oraz obrazowania zarówno dla obrazowania pO2 w szerokim polu widzenia z wykorzystaniem detektora CCD u szczurów, jak i obrazowania pO2 opartego na dwufotonowym wzbudzeniu u myszy.

Pomiar utlenowania krwi mózgowej oparty na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji

Celem jest monitorowanie stanu redoks mitochondriów w izolowanych sercach w kontekście fizjologicznych ciśnień obciążenia wstępnego i następczego. Przedstawiono biventrykularny model pracującego serca królika. Do monitorowania stanu redoks mitochondriów w tkance epikardialnej wykorzystano obrazowanie fluorescencyjne NADH o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej.

Obrazowanie fluorescencyjne NADH w izolowanych, pracujących sercach królika z obiema komorami

Source: Nishimura, C.  Kwantyfikacja architektury naczyń mózgowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej w mysim modelu zapalenia nerwów wywołanego wirusem HIV. J. Vis. Exp. (2016). Ten film pokazuje wizualizację in vivo naczyń włosowatych kory mózgowej myszy przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Przedstawiono w nim etapy wstrzykiwania barwnika fluorescencyjnego znieczulonej myszy z cienkim oknem korowym czaszki, przygotowywania zestawu do obrazowania i uzyskiwania szczegółowych obrazów struktur...

 Mikroskopia dwufotonowa do obrazowania in vivo mikrokrążenia mózgu myszy 

Źródło: Ouyang, Y., i wsp. Jednoczesne obrazowanie PET/MRI podczas niedotlenienia mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2015)Ten film przedstawia technikę oceny uszkodzenia niedotlenienia mózgu za pomocą jednoczesnej pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) i rezonansu magnetycznego (MRI). Znieczulona mysz przechodzi podwiązanie wspólnej tętnicy szyjnej (CCA), zmniejszając przepływ krwi do jednej półkuli mózgu i predysponując ją do uszkodzenia wywołanego niedotlenieniem. Obrazowanie PET i MRI ocenia...

Obrazowanie uszkodzenia mózgu wywołanego niedotlenieniem-niedokrwieniem mózgu w modelu mysim

Opisano metodę znakowania neuronów barwnikami fluorescencyjnymi w określonych funkcjonalnych mikrodomenach kory nowej. Po pierwsze, obrazowanie optyczne sygnału wewnętrznego służy do uzyskania mapy funkcjonalnej. Następnie mikroskopia dwufotonowa jest używana do oznaczania i obrazowania neuronów w mikrodomenie mapy.

Celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego

Uszkodzenia mózgu wynikające z niedokrwienia mózgu mogą być nieinwazyjnie obrazowane i badane u szczurów za pomocą przedklinicznej pozytonowej tomografii emisyjnej połączonej z wstrzykiwaną sondą radioaktywną, 18F-fluorodeoksyglukozą. Co więcej, wykorzystanie nowoczesnych narzędzi programowych, które zawierają szablony mózgu dotyczące ilości zainteresowania (VOI), znacznie zwiększa ilość informacji uzyskanych z tych badań.

Nieinwazyjne obrazowanie i analiza niedokrwienia mózgu u żywych szczurów przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej z 18F-FDG

Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje jednoczesną pozytonową tomografię emisyjną i obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego. W modelu niedotlenienia i niedokrwienia mózgu dynamiczne zmiany w dyfuzji i metabolizmie glukozy zachodzą w trakcie i po urazie. Ewoluujące i niepowtarzalne uszkodzenia w tym modelu wymagają jednoczesnej akwizycji, jeśli mają zostać pozyskane znaczące dane obrazowania multimodalnego.

Jednoczesne obrazowanie PET/MRI podczas niedotlenienia-niedokrwienia mózgu myszy

Ten artykuł opisuje metodę, za pomocą której architektura naczyniowa w mózgu może być określona ilościowo za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo i ex vivo.

Kwantyfikacja architektury naczyń mózgowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej w mysim modelu zapalenia nerwów wywołanego przez HIV

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

Poznaj metodę dwufotonowego obrazowania NADH do wizualizacji mikroregionalnego niedotlenienia w korze mózgowej myszy. Technika ta umożliwia analizę zaopatrzenia tlenem z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Wykrywanie mikroregionalnego niedotlenienia w korze mózgowej myszy za pomocą dwufotonowego obrazowania endogennej fluorescencji NADH (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie mikroregionalnej hipoksji w korze mózgowej myszy za pomocą obrazowania dwufotonowego endogennej fluorescencji NADH

Przeglądaj więcej filmów