Name: Adnotacja funkcji genów roślin za pomocą połączonej genomiki, metabolomiki i informatyki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Poznaj metodę adnotacji funkcji genów roślin poprzez połączenie profilowania metabolitów i analizy koekspresji. Technika ta umożliwia identyfikację kluczowych genów metabolicznych z wykorzystaniem HPLC i sieci koekspresji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy prof. Kazuki Saito z RIKEN PSC oraz dr. Bjoern Usadel z MPIMP za pomocne dyskusje. TT jest wspierany stypendium z fundacji Alexandra von Humboldta.

1. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Materiał roślinny jest zbierany i niezwłocznie zamrażany.</li>
	<li>Zamrożony materiał roślinny jest rozcierany w młynku miksującym (lub w moździerzu), a następnie przechowywany w probówce Falcon lub probówce Eppendorf w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja do profilowania metabolitów
<ol>
	<li>Odmierz porcję zamrożonego materiału roślinnego do probówki Eppendorf o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Dodaj 5 μl buforu do ekstrakcji na każdy miligram masy świeżej zamrożonego materiału roślinnego.</li>
	<li>Dodaj jedną kulkę metalową (lub gilconia) i homogenizuj zamrożony proszek za pomocą Mixer Mill przez 2 min przy 25 l s-1.</li>
	<li>Wirowarkuj przez 10 min przy 12 000 rpm.</li>
	<li>Przenieś nadsącz do filtra wirówkowego NANOSEP.</li>
	<li>Wirowarkuj przez 2 min przy 4 000 rpm.</li>
	<li>Przenieś nadsącz do nowej probówki Eppendorf i przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
3. Profilowanie metabolitów metodą LC-MS
<ol>
	<li>Przygotować układ HPLC i sprawdzić temperaturę termostatu kolumny oraz tacy na próbki.</li>
	<li>Ustawić warunki MS i sprawdzić stan próżni oraz kapilary grzejnej.</li>
	<li>Przeprowadzić kalibrację m/z detektora MS.</li>
	<li>Przenieść 50 μl ekstraktów do szklanej fiolki do analizy LC-MS.</li>
	<li>Wstrzyknąć 5 μl ekstraktów do układu LC-MS.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Skonfiguruj program Xcalibur lub Metalign 4 i wybierz dane do analizy.</li>
	<li>Przygotuj tabelę wykrytych pików interesujących Cię związków zgodnie z klasą związków podaną w Tabeli I.</li>
	<li>Zidentyfikuj piki na podstawie współelucji związków wzorcowych.</li>
	<li>Opisz wykryte piki, wykorzystując analizę MS2, przegląd literatury oraz wyszukiwanie w bazach danych metabolomów (Rysunek 2, 12,13).</li>
</ol>
5. Przewidywanie ścieżki metabolicznej
<ol>
	<li>Opracuj prawdopodobną ścieżkę z wykorzystaniem wykrytych związków. Przewidywanie ścieżki na podstawie adnotacji pików powinno opierać się na strukturze chemicznej wykrytych związków poprzez przewidywanie łączących je funkcji enzymatycznych w obrębie ścieżki metabolicznej 13. Strukturyzacja etapów biosyntezy powinna być przeprowadzona przy precyzynej adnotacji pików. Jednakże określenie szczegółowej struktury chemicznej, na przykład części cukrowej, nie jest w tym kroku niezbędne, ponieważ przewidywanie części cukrowej i pozycji przyłączenia jest bardzo trudne do zidentyfikowania za pomocą analizy MS. Określenie rodzaju cukru, takiego jak heksozyd czy pentozyd, zostanie przeprowadzone za pomocą testu enzymatycznego donora cukru w ostatnim etapie projektu. Przewidywanie ścieżki powinno być zazwyczaj konstruowane w sposób, w którym mała cząsteczka jest produktem pośrednim większej cząsteczki, z wyjątkiem niektórych przypadków, takich jak reakcja dehydratacji. Przydatna do przewidywania jest lista mas cząsteczkowych atomów, na przykład 16 m/z dla różnicy między grupami -H a -OH (utlenianie), 14 m/z (atom węgla) dla różnicy między -OH a -OMe (metylacja) oraz 162 m/z (MW-H2O) dla heksozy (glikozylacja). Określenie typu modyfikacji wraz z analizą korelacji specyficzności tkanek pomaga w przewidywaniu ścieżki metabolicznej. Bazy danych ogólnych ścieżek metabolicznych, takie jak baza KEGG (<a href="http://www.genome.jp/kegg/" target="_blank">http://www.genome.jp/kegg/</a>) i PlantCyc (<a href="http://plantcyc.org/" target="_blank">http://plantcyc.org/</a>), są bardzo skuteczne w przewidywaniu interesującej badacza ścieżki metabolicznej.</li>
</ol>
6. Przygotowanie listy genów z identyfikatorami genów ortologicznych Arabidopsis
<ol>
	<li>Pobierz listę identyfikatorów genów z bazy danych genomicznych.</li>
	<li>W przypadku, gdy rośliną docelową nie jest Arabidopsis, dodaj identyfikatory genów Arabidopsis dla genów ortologicznych.</li>
	<li>Przygotuj listę genów w analizowanym szlaku. Adnotacje danych dotyczących szlaków u Arabidopsis oraz danych o rodzinach genów są dostępne na stronie TAIR (<a href="http://www.arabidopsis.org/" target="_blank">http://www.arabidopsis.org/</a>). Jeśli przygotowano listę ortologicznych genów Arabidopsis, można je następnie połączyć.</li>
</ol>
7. Analiza genów współwyrażanych
<ol>
	<li>Przetestuj przygotowaną listę identyfikatorów genów, aby znaleźć najlepszą bazę danych dla badanej ścieżki, sprawdzając korelację przy użyciu znanych par genów w interesującej Cię ścieżce (Tabela II). Jeśli baza danych koekspresji lub baza danych ekspresji genów nie jest dostępna dla badanej rośliny, należy użyć bazy danych koekspresji Arabidopsis wraz z listą ortologicznych genów Arabidopsis. W przypadku jęczmienia, ryżu, topoli, pszenicy, lucerny i soi można zastosować analizę koekspresji dla tych gatunków roślin (Tabela II).</li>
	<li>Zbuduj szkielet docelowej sieci koekspresji w oparciu o połączenia znanych genów w interesującej Cię ścieżce.</li>
	<li>Dodaj skorelowane geny kandydackie (r&lt;0.4~0.90, w przybliżonym zakresie wartości współczynnika pomiędzy połączeniami znanych genów w interesującej Cię ścieżce) i sprawdź ich adnotacje genowe w przewidywanych rodzinach w odniesieniu do połączeń tej sieci, aby wyłonić najlepsze geny kandydackie (Rycina 3). Próg wartości współczynnika powinien być dostosowany do struktury sieci i gęstości skorelowanych genów.</li>
	<li>Utwórz listę genów, które można wytypować jako wyspecjalizowane w badanej ścieżce.</li>
	<li>Sprawdź ekspresję genów kandydackich w zależności od specyfiki organów oraz odpowiedzi na stres.</li>
</ol>
8. Integracja wszystkich informacji w celu przewidywania nowych szlaków
<ol>
	<li>Dodaj dobrze scharakteryzowane geny, które zostały wykorzystane do zapytań w analizie koekspresji, do przewidywanego szlaku metabolicznego.</li>
	<li>Zidentyfikuj niecharakteryzowane elementy w tym szlaku, na przykład niecharakteryzowane etapy enzymatyczne, białka transportowe i czynniki transkrypcyjne.</li>
	<li>Przewiduj najbardziej odpowiednią adnotację genów dla tych brakujących, niecharakteryzowanych etapów.</li>
	<li>Połącz wyniki profilowania metabolitów i geny kandydackie ekspresji genów in silico w oparciu o przewidywany szlak.</li>
	<li>Rozmieść geny kandydackie na przewidywanym szlaku zgodnie z funkcją genu, na przykład: acetylotransferazę dla metabolitu acetylowanego, glikozylotransferazę dla glikozydów, P450 dla związku utlenionego. Analiza drzewa filogenetycznego sekwencji aminokwasowych jest przydatna dla niektórych szerokich rodzin genów, takich jak P450 i glikozylotransferazy.</li>
	<li>Sprawdź spójność specyfiki tkankowej lub odpowiedzi na stres pomiędzy akumulacją metabolitów a poziomem ekspresji genów kandydackich.</li>
	<li>Sprawdź powiązania z innym metabolizmem w celu zapewnienia substratów oraz genów odpowiedzialnych za odpowiedź na stres.</li>
</ol>
9. Eksperymenty w celu identyfikacji genów z wykorzystaniem biozasobów
<ol>
	<li>Sprawdzić dostępność zasobów biologicznych w celu ułatwienia przeprowadzenia eksperymentu służącego identyfikacji genów kandydujących.</li>
	<li>Przeprowadzić eksperyment w celu identyfikacji funkcji genu z wykorzystaniem zasobów biologicznych, takich jak biblioteka mutantów KO oraz pełnowymiarowa biblioteka cDNA. W przypadku najlepszych genów kandydujących wynikających z przewidywań należy przeprowadzić eksperymenty służące funkcjonalnej identyfikacji genów, obejmujące przygotowanie roślin z nadekspresją i mutantów z nokautem, testy enzymatyczne oraz testy wiązania promotora. Analizę białka rekombinowanego w celu charakterystyki właściwości białka oraz przygotowanie roślin z nadekspresją najlepiej przeprowadzić po potwierdzeniu profilu metabolitów przy użyciu mutanta KO, ponieważ przygotowanie białka rekombinowanego oraz klonowanie genów do transformacji zajmuje znacznie więcej czasu.</li>
</ol>
10. Reprezentatywne wyniki
Procedura analizy zintegrowanej opisana w niniejszym protokole oferuje wiele możliwości w zależności od określonego celu eksperymentalnego oraz wyboru kombinacji biologicznych i analitycznych. Dobór procedur i projekt eksperymentalny powinny zostać przeprowadzone odpowiednio na podstawie docelowego szlaku, związków oraz gatunku rośliny. Strategia integracji opisana w tym protokole koncentruje się na adnotacji funkcji genów roślin oraz odkrywaniu nowych funkcji genów przy efektywnym wykorzystaniu kilku zasobów biologicznych i danych. Oczekiwany rezultat obiecuje dostarczenie jedynie w przypadku jednoznacznej predykcji. Fakt ten wskazuje, że jeśli profile kombinacji nie dostarczą wystarczających dowodów, eksperyment nie powinien zostać rozpoczęty. Z tego powodu w każdym przypadku dodatkowe eksperymenty wstępne, takie jak ukierunkowane profilowanie ekspresji genów za pomocą RT-PCR, mogą wesprzeć predykcję funkcji genu. Dokładność i poprawność predykcji korelują dodatnio z różnicami jakościowymi oraz liczbą wariantów kombinacji. Ponadto odpowiedni kandydaci i wiarygodne wyniki mogą wynikać jedynie z dokładnej predykcji szlaków. Adnotacja piku powinna być przeprowadzana poprzez kombinację kilku podejść, na przykład przegląd literatury, referencyjny ekstrakt roślinny, analizę MSn, specyficzność organową oraz analizę mutantów 13.
<img alt="Schemat analizy funkcji genów: koekspresja, profilowanie metabolitów, przewidywanie szlaków." src="/files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przegląd przebiegu eksperymentalnego adnotacji genów z zastosowaniem podejścia kombinowanego. W niektórych przypadkach projekty rozpoczynają się od odkrycia nowego piku wykrywanego w specyficznych warunkach lub tkankach oraz chęci zrozumienia jego roli w metabolizmie. W innych sytuacjach celem projektu jest identyfikacja genu lub odkrycie kluczowych czynników regulacyjnych, takich jak czynniki transkrypcyjne. Projekt eksperymentu powinien zostać zaplanowany w oparciu o zestaw danych wykazujący wyraźne różnice w poziomach metabolitów w docelowym szlaku, z wykorzystaniem szerokiego zakresu próbek tkanek z różnych organów, roślin o zróżnicowanym wzroście lub roślin narażonych na warunki stresowe, oraz poddaniem materiału profilowaniu metabolitów. Rośliny mutantowe i transgeniczne, a także materiał hodowlany zawierający QTL, stanowią również odpowiedni materiał genetyczny do tych badań. Przewidywanie nowych szlaków powinno być przeprowadzane ostrożnie, przy dokładnej adnotacji piku i zastosowaniu podejścia kombinowanego z różnymi typami metabolotypów, takimi jak specyfika organów i odpowiedzi na stres, zgodnie z danymi ekspresji genów w analizowanym szlaku. W ostatnim kroku należy przeprowadzić profilowanie metabolitów i transkryptów, co w połączeniu z analizą in silico zasobów sieciowych oraz charakterystyką ekspresji genów via ekspresja heterologiczna in vitro, doprowadzi ostatecznie do potwierdzenia genu kandydata oraz wyjaśnienia jego funkcji i pozycji w szlaku metabolicznym. Skróty: QTL, loci cech ilościowych.
<img alt="Schemat analizy metabolomicznej; proces detekcji/adnotacji/identyfikacji pików, powiązania z ekspresją genów." src="/files/ftp_upload/3487/3487fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Schemat kombinowanego podejścia do adnotacji pików. Procedura identyfikacji i adnotacji pików z wykorzystaniem związku wzorcowego, porównanie typu dzikiego i mutantów z nokautem, wielowymiarowa spektrometria mas piku docelowego w odniesieniu do widm mas czystych związków z baz danych 12. Skróty: DB, baza danych; KO, nokaut; 1-D, jednowymiarowy; 2-D, dwuwymiarowy; NMR, magnetyczny rezonans jądrowy; IR, podczerwień; MSn, wielostopniowa spektrometria mas.
<img alt="Schemat sieci regulacji genów; klastry antocyjanów i flawonoli; wizualizacja interakcji genetycznych." src="/files/ftp_upload/3487/3487fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Przykład analizy sieci koregulacji szlaku biosyntezy antocyjanów. Analizy koekspresji przeprowadzono za pomocą PRIMe (<a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a>) w oparciu o zestaw danych ATTEDII wersja 3 8,2 z wykorzystaniem programu Pajek (<a href="http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/" target="_blank">http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/</a>). Do tworzenia połączeń w sieci wykorzystano korelacje dodatnie (r&lt;0.5). Czerwone węzły: dwanaście genów enzymatycznych szlaku antocyjanów (At5g13930, CHS, TT4, syntaza chalkonu; At3g55120, CHI, TT5, izomeraza chalkonu; At3g51240, F3H, TT6, flawanonowa 3-hydroksylaza; At5g07990, F3'H, TT7, flawonoidowa 3'-hydroksylaza; At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, flawonoidowa 3-O-glukozylotransferaza; At5g17220, AtGSTF12, TT19; At5g42800, DFR, TT3, reduktaza dihydroflawonolu; At4g22880, ANS/LDOX, TT18, syntaza antocyjanidyn; At4g14090, A5GT, antocyjanowa 5-O-glukozylotransferaza; At5g54060, A3G2"XT, domniemana antocyjanowa 3-O-glukozydowa 2"-O-ksylozylotransferaza; At3g29590, A5GMaT, antocyjanowa 5-O-glukozydowa 6'''-O-malonylotransferaza; At1g03940, A3GCouT, antocyjanowa 3-O-glukozydowa 6"-O-p-kumarojlotransferaza) oraz dwa czynniki transkrypcyjne odpowiedzialne za produkcję antocyjanów (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2) zostały wykorzystane do wyszukiwania genów kandydatów. Geny kandydaty zidentyfikowano poprzez wyszukiwanie metodą „iloczynu zbiorów” (intersection of sets) z wartością progową współczynnika r&gt;0.50, zapytaniem o iloczyn zbiorów wszystkich analizowanych genów (czternaście genów biosyntezy antocyjanów). Sieć koekspresji, obejmująca skorelowane geny kandydaty (68 genów) oraz geny analizowane (14 genów), została zrekonstruowana poprzez wyszukiwanie metodą „połączeń zbiorów” (interconnection of sets) przy r&gt;0.50 z wykorzystaniem bazy danych PRIMe. Pliki wyjściowe sformatowane jako pliki „.net” z bazy PRIMe oraz sieci zostały wykreślone za pomocą oprogramowania Pajek. Niebieski węzeł oznacza geny kandydaty, które wykazały korelację z genami antocyjanów.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>gatunki</td>
			<td>Główny metabolit wtórny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana</td>
			<td>Glukozynolan, flawonol, antocyjan, pochodna sinapoilowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Populus trichocarpa</td>
			<td>Flawonol, antocyjan, pochodna salicylanu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitis vinifera</td>
			<td>Flawonol, antocyjan, tanina, stilben</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solanum lycopersicum</td>
			<td>flawonol, antocyjan, glikoalkaloid, związki pochodne kwasu chlorogenowego,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotiana tabacum</td>
			<td>flawonol, antocyjan, nikotynamid, związki pochodne kwasu chlorogenowego, cukier acylowany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oryza sativa</td>
			<td>glikoflawona, antocyjan, pochodne steroli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zea mays</td>
			<td>glikoflawona, antocyjan, benzoksazinon, pochodne steroli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicago truncatula</td>
			<td>izoflawona, antocyjan, saponina,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lotus japonica</td>
			<td>izoflawona, flawonol, antocyjan, saponina,</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela I. Główne metabolity wtórne u modelowych gatunków roślin.
<table border="1">
	<tbody >
		<tr>
			<td>Baza danych koekspresji</td>
			<td>Adres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Międzygatunkowe bazy roślin</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COP</td>
			<td><a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlaNet</td>
			<td><a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatunki roślin</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATEED-II</td>
			<td><a href="http://atted.jp/" target="_blank">http://atted.jp/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAR</td>
			<td><a href="http://142.150.214.117/welcome.htm" target="_blank">http://142.150.214.117/welcome.htm</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COP</td>
			<td><a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneCAT</td>
			<td><a href="http://genecat.mpg.de/" target="_blank">http://genecat.mpg.de/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACT</td>
			<td><a href="http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser" target="_blank">http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AthCoR@CSB.DB</td>
			<td><a href="http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html" target="_blank">http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CressExpress</td>
			<td><a href="http://cressexpress.org/" target="_blank">http://cressexpress.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMe</td>
			<td><a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oryza sativa </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiceArrayNet</td>
			<td><a href="http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/" target="_blank">http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rice Array Database</td>
			<td><a href="http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml" target="_blank">http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela II. Dostępna baza danych ekspresji genów do analizy koekspresji in silico.

<ol><li>Aharoni, A., Keizer, L. C. P., Bouwmeester, H. J., Sun, Z. K., Alvarez-Huerta, M., Verhoeven, H. A., Blaas, J., van Houwelingen, A., De Vos, R. C. H., van der Voet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAAT+gene+involved+in+strawberry+flavor+biogenesis+by+use+of+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">SAAT gene involved in strawberry flavor biogenesis by use of DNA microarrays.</a> Plant Cell. 12, 647-661 (2000).</li>
<li>Akiyama, K., Chikayama, E., Yuasa, H., Shimada, Y., Tohge, T., Shinozaki, K., Hirai, M. Y., Sakurai, T., Kikuchi, J., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRIMe%3A+a+Web+site+that+assembles+tools+for+metabolomics+and+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22In+Silico+Biol%22%5BJournal%5D)">PRIMe: a Web site that assembles tools for metabolomics and transcriptomics.</a> In Silico Biol. 8, 339-345 (2008).</li>
<li>Araujo, W. L., Ishizaki, K., Nunes-Nesi, A., Larson, T. R., Tohge, T., Krahnert, I., Witt, S., Obata, T., Schauer, N., Graham, I. A., Leaver, C. J., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+2-Hydroxyglutarate+and+Isovaleryl-CoA+Dehydrogenases+as+Alternative+Electron+Donors+Linking+Lysine+Catabolism+to+the+Electron+Transport+Chain+of+Arabidopsis+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of the 2-Hydroxyglutarate and Isovaleryl-CoA Dehydrogenases as Alternative Electron Donors Linking Lysine Catabolism to the Electron Transport Chain of Arabidopsis Mitochondria.</a> Plant Cell. 22, 1549-1563 (2010).</li>
<li>De Vos, R. C. H., Moco, S., Lommen, A., Keurentjes, J. J. B., Bino, R. J., Hall, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untargeted+large-scale+plant+metabolomics+using+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Untargeted large-scale plant metabolomics using liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nat. Protoc. 2, (2007).</li>
<li>Hirai, M. Y., Sugiyama, K., Sawada, Y., Tohge, T., Obayashi, T., Suzuki, A., Araki, R., Sakurai, N., Suzuki, H., Aoki, K., Goda, H., Nishizawa, O. I., Shibata, D., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omics-based+identification+of+Arabidopsis+Myb+transcription+factors+regulating+aliphatic+glucosinolate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Omics-based identification of Arabidopsis Myb transcription factors regulating aliphatic glucosinolate biosynthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6478-6483 (2007).</li>
<li>Mutwil, M., Klie, S., Tohge, T., Giorgi, F. M., Wilkins, O., Campbell, M. M., Fernie, A. R., Usadel, B., Nikoloski, Z., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PlaNet%3A+Combined+Sequence+and+Expression+Comparisons+across+Plant+Networks+Derived+from+Seven+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">PlaNet: Combined Sequence and Expression Comparisons across Plant Networks Derived from Seven Species.</a> Plant Cell. 23, 895-910 (2011).</li>
<li>Mutwil, M., Ruprecht, C., Giorgi, F. M., Bringmann, M., Usadel, B., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Wiring+of+Cell+Wall-Related+Genes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Wiring of Cell Wall-Related Genes in Arabidopsis.</a> Molecular Plant. 2, 1015-1024 (2009).</li>
<li>Obayashi, T., Kinoshita, K., Nakai, K., Shibaoka, M., Hayashi, S., Saeki, M., Shibata, D., Saito, K., Ohta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATTED-II%3A+a+database+of+co-expressed+genes+and+cis+elements+for+identifying+co-regulated+gene+groups+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ATTED-II: a database of co-expressed genes and cis elements for identifying co-regulated gene groups in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 35, D863-D869 (2007).</li>
<li>Ogata, Y., Suzuki, H., Sakurai, N., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CoP%3A+a+database+for+characterizing+co-expressed+gene+modules+with+biological+information+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CoP: a database for characterizing co-expressed gene modules with biological information in plants.</a> Bioinformatics. 26, 1267-1268 (2010).</li>
<li>Persson, S., Wei, H. R., Milne, J., Page, G. P., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+required+for+cellulose+synthesis+by+regression+analysis+of+public+microarray+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of genes required for cellulose synthesis by regression analysis of public microarray data sets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8633-8638 (2005).</li>
<li>Tohge, T., Yonekura-Sakakibara, K., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytochemical+genomics+in+Arabidopsis+thaliana%3A+A+case+study+for+functional+identification+of+flavonoid+biosynthesis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Pure+and+Applied+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phytochemical genomics in Arabidopsis thaliana: A case study for functional identification of flavonoid biosynthesis genes.</a> Pure and Applied Chemistry. 79, 811-823 (2007).</li>
<li>Tohge, T., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+resources+for+mass-spectrometry-based+metabolomics%3A+A+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Web-based resources for mass-spectrometry-based metabolomics: A user's guide.</a> Phytochemistry. 70, 450-456 (2009).</li>
<li>Tohge, T., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+genetic+diversity%2C+informatics+and+metabolomics+to+facilitate+annotation+of+plant+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Combining genetic diversity, informatics and metabolomics to facilitate annotation of plant gene function.</a> Nature Protocols. 5, 1210-1227 (2010).</li>
<li>Tohge, T., Kusano, M., Fukushima, A., Saito, K., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+metabolic+programs+following+exposure+of+plants+to+UV-B+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Behav%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and metabolic programs following exposure of plants to UV-B irradiation.</a> Plant Signal Behav. 6, Forthcoming (2011).</li>
<li>Tohge, T., Ramos, M. S., Nunes-Nesi, A., Mutwil, M., Giavalisco, P., Steinhauser, D., Schellenberg, M., Willmitzer, L., Persson, S., Martinoia, E., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+storage+metabolome%3A+profiling+the+barley+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Towards the storage metabolome: profiling the barley vacuole.</a> Plant Physiol. , (2011).</li>
<li>Yonekura-Sakakibara, K., Tohge, T., Matsuda, F., Nakabayashi, R., Takayama, H., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Inoue, E., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+flavonol+profiling+and+transcriptome+coexpression+analysis+leading+to+decoding+gene-metabolite+correlations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive flavonol profiling and transcriptome coexpression analysis leading to decoding gene-metabolite correlations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 2160-2176 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Biorąc pod uwagę, że technologie transkryptomiczne i metabolomiczne są stosowane od kilku lat, proces integracji danych w celu adnotacji genów wspomaganej metabolomiką zazwyczaj rozpoczyna się od identyfikacji nowego piku reprezentującego nieznany metabolit. Fakt ten prowadzi do następnego etapu, którym jest ocena wariancji ilościowej pików metabolitów lub nowych genów kandydackich, które uznaje się za odpowiedzialne za ich biosyntezę. Strategia opisana w niniejszym protokole napotyka jednak trzy główne problemy: i) trudność w adnotacji pików, ii) złożoność przewidywania szlaków, iii) rozdzielczość informacji o genach oraz jakość danych o ekspresji genów. Aby rozwiązać pierwszy problem, adnotację pików należy przeprowadzić poprzez współelucję związków wzorcowych lub podejście kombinatoryczne z wykorzystaniem informacji z analizy MSn, ekstraktów referencyjnych, analizy mutantów, wyszukiwania w bazach danych metabolitów oraz przeglądu literatury (Rysunek 2, 12). W odniesieniu do drugiego problemu, przewidywanie szlaków jest możliwe jedynie po prawidłowej adnotacji pików. Niemniej jednak profilowanie metabolitów w zależności od specyfiki tkankowej może również wspierać adnotację pików, ponieważ akumulacja metabolitów powinna być skorelowana z ekspresją powiązanych genów. Dlatego połączenie profili z różnych tkanek i warunków wzrostu może być pomocne w rozwiązaniu tego drugiego problemu. Trzeci problem dotyczący rozdzielczości informacji o genach zależy od postępów w sekwencjonowaniu danych. W przypadku rośliny modelowej, której sekwencja genomu nie została ukończona, przydatna jest analiza koekspresji z wykorzystaniem genów ortologicznych u innych roślin modelowych. Szczegółowe porównanie dopasowania oraz analiza drzew filogenetycznych sekwencji aminokwasów mogą pomóc w powiązaniu organizmów modelowych z innymi gatunkami.
Niniejszy protokół jest odpowiedni dla wszystkich szlaków metabolicznych. Jest on najskuteczniejszy w analizie metabolizmu pośredniego i wtórnego, w których udowodniono występowanie silnej kontroli transkrypcyjnej 1,5,11,16. W niektórych przykładach analiza koekspresji została pomyślnie przeprowadzona w odniesieniu do asymilacji siarki, genów β-oksydacji, degradacji rozgałęzionych aminokwasów, rozkładu chlorofilu i katabolizmu lizyny 3, metabolizmu ściany komórkowej 10,7 oraz kaskady sygnalizacji świetlnej 14. Adnotacja funkcji genów poprzez połączenie genomiki, metabolomiki i informatyki służy nie tylko do identyfikacji genów biosyntetycznych i bezpośrednich regulatorów w postaci czynników transkrypcyjnych, ale także do zrozumienia procesów fizjologicznych i odpowiedzi organizmu (patrz przykład na Rysunku 3. 14).
Aby rozszerzyć tę metodę z roślin modelowych na gatunki uprawne, potężnym podejściem w badaniu ogólnego metabolizmu jest porównywanie metaboliczne między różnymi gatunkami roślin. Na przykład, jeśli ten sam związek zostanie wykryty u różnych gatunków roślin i zostaną zidentyfikowane w nich geny ortologiczne, analiza koekspresji międzygatunkowej z wykorzystaniem genów ortologicznych może dostarczyć silnych dowodów na poparcie postawionej hipotezy. Podejście to można zastosować w przypadku Arabidopsis, topoli, lucerny oraz ważnych roślin uprawnych, takich jak jęczmień, ryż, pszenica i soja, przeprowadzając analizę koekspresji gatunków roślin (6, PlaNet: <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/</a>,; 9, COP: <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/</a>; patrz przykład, 15).

<table><tbody><tr><td>Woda destylowana klasy ULC/MS </td><td>BIOSOLVE</td><td>23214102</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl (ACN) klasy ULC/MS </td><td>BIOSOLVE</td><td>01204102</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (MeOH) klasy ULC/MS </td><td>BIOSOLVE</td><td>13684102</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrawkowy (HCOOH) klasy ULC/MS do chromatografii cieczowej </td><td>BIOSOLVE</td><td>06914131</td><td></td></tr><tr><td>Związki wzorcowe </td><td>EXTRASYNTHESE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System liniowej pułapki jonowej (IT) ESI-MS FINNIGAN-LTQ </td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System HPLC Surveyor </td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolumna analityczna Luna C18(2), średnica 2,0 mm, długość 150 mm, wielkość porów 100 &amp;#197; i sferyczne cząstki 3 mm </td><td>Phenomenex</td><td>00F-4251-B0</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Xcalibur </td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

adnotacja funkcji genów roślin poprzez zintegrowaną genomikę, metabolomikę i informatykę

Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Biorąc pod uwagę stale rosnącą liczbę gatunków roślin modelowych, dla których dostępne są kompletne sekwencje genomów, oraz obfitość zasobów biologicznych, takich jak mutanty z nokautem genów, akcesje dzikie i zaawansowane populacje hodowlane, rośnie obciążenie związane z funkcjonalną adnotacją genów. W niniejszym protokole przedstawiono adnotację funkcji genów roślin za pomocą połączonej analizy koekspresji genów, metabolomiki i informatyki (Rycina 1). Podejście to opiera się na teorii wykorzystania genów docelowych o znanej funkcji w celu identyfikacji nieadnotowanych genów, które prawdopodobnie biorą udział w określonym procesie metabolicznym, wraz z identyfikacją związków docelowych za pomocą metabolomiki. Przedstawiono strategie stosowania tych informacji w populacjach generowanych zarówno przez podejścia genetyki w przód (forward genetics), jak i genetyki wstecznej (reverse genetics), mimo że żadna z nich nie jest wolna od trudności. W konsekwencji podejście to może być również wykorzystane do charakterystyki nieznanych pików reprezentujących nowe lub specyficzne metabolity wtórne w ograniczonych tkankach, gatunkach roślin lub przy określonym traktowaniu stresowym, co obecnie stanowi istotne wyzwanie w zrozumieniu metabolizmu roślin.

Połączenie genomiki, analizy koekspresji genów oraz identyfikacji związków docelowych poprzez metabolizm umożliwia funkcjonalną adnotację genów.

Adnotacja funkcji genów roślin poprzez zintegrowaną genomikę, metabolomikę i informatykę

Biorąc pod uwagę stale rosnącą liczbę gatunków roślin modelowych, dla których dostępne są pełne sekwencje genomów, oraz obfitość biozasobów takich jak ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest odkrycie i charakterystyka nowej funkcji genów poprzez adnotację genów z wykorzystaniem połączonej analizy profilowania metabolitów oraz analizy koekspresji. Osiąga się to poprzez zaplanowanie eksperymentu z uwzględnieniem konkretnych szlaków metabolicznych i gatunków roślin. W drugim kroku stosuje się podejścia analityczne w celu zrekonstruowania całego szlaku metabolicznego w oparciu o struktury chemiczne wykrytych związków.Następnie struktura przewidywanej ścieżki zostaje zintegrowana z analizą koekspresji w celu zawężenia listy genów kandydackich, które potencjalnie wskazują na kluczowe geny metabolizmu. Ostatecznie wyniki uzyskuje się poprzez przeprowadzenie minimalnych zestawów eksperymentów z wydajnym wykorzystaniem kilku zasobów biologicznych w celu charakterystyki funkcjonalnej identyfikacji genów. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas po znalezieniu bardzo wysokiej korelacji genów cystycznych Abosi OID w bazie danych koekspresji o nazwie ate.Uznano, że strategia ta jest jednym z najszybszych sposobów na znalezienie funkcji nowych genów przy wykorzystaniu ogólnodostępnych baz danych i efektywnym użyciu zasobów biologicznych. Aby rozpocząć ekstrakcję, należy zebrać materiał roślinny i natychmiast zamrozić go w ciekłym azocie. Po zamrożeniu należy sproszkować materiał roślinny za pomocą młyna mieszalnikowego, przenieść alikwoty zamrożonego materiału do probówek EOR o pojemności 2 ml, a następnie dodać do probówki metalową kulkę.Dodaj 250 µL buforu do ekstrakcji na każde 50 mg próbki. Bufor do ekstrakcji zawiera standard wewnętrzny do normalizacji. Następnie homogenizuj zamrożony proszek w młynku mieszalnikowym przez dwie minuty.Przy częstotliwości 25 odwiruj próbkę z prędkością 12 000 RPM przez 10 minut. Następnie przenieś nadsącz do filtra wirówkowego. Po przeprowadzeniu drugiej serii wirowania przenieś nadsącz do nowej probówki typu einor.Następnie przygotuj układ HPLC, sprawdzając w pierwszej kolejności, czy temperatura termostatu kolumny wynosi 35 °C, a temperatura tacy na próbki 10 °C. Skonfiguruj parametry spektrometrii mas oraz sprawdź stan próżni i kapilary grzejnej. Wykonaj kalibrację nadmiaru ładunku detektora MS poprzez infuzję mieszaniny roztworu kalibracyjnego.Użyj aplikacji do automatycznej kalibracji w oprogramowaniu. Następnie przenieś 50 µl ekstraktów do szklanej fiolki. W przypadku HPLC wykonaj co najmniej pięć wtrysków buforu do ekstrakcji przed przeprowadzeniem analizy pierwszej próbki, zgodnie z opisem w procedurze pisemnej.Po skonfigurowaniu narzędzia do analizy spektrometrii mas należy wybrać dane do przetworzenia. Przygotuj tabelę wykrytych pików będących przedmiotem zainteresowania, zgodnie z klasą związków wskazaną w protokole pisemnym. Na tym etapie zidentyfikuj piki poprzez koewolucję ze związkami wzorcowymi, a następnie opisz wykryte piki, wykorzystując analizę Ms.MS, literaturę, przegląd oraz wyszukiwanie w bazach danych metabolitów.Przewidywanie szlaków powinno opierać się na strukturach chemicznych poprzez powiązanie funkcji enzymatycznej w szlaku metabolicznym. Z tego powodu kroki te powinny być prowadzone w oparciu o precyzyjną identyfikację wykrytych związków. Bazy danych ogólnych szlaków metabolicznych, takie jak baza KEGG oraz PlantACT, są bardzo skuteczne w przewidywaniu analizowanego szlaku metabolicznego.Aby przygotować listę genów z ortologami Arabidopsis wraz z ich identyfikatorami (ID), należy najpierw pobrać listę identyfikatorów genów z bazy danych genomicznych. W przypadku, gdy rośliną docelową nie jest Arabidopsis, należy dodać identyfikatory genów ortologicznych Arabidopsis. Następnie należy sporządzić listę genów w analizowanym szlaku.Adnotacje danych dotyczących szlaków metabolicznych oraz danych o rodzinach genów Arabidopsis są dostępne na stronie internetowej TAAR. Listy genów ortologicznych Arabidopsis można następnie połączyć. Przeprowadź analizę sieci koekspresji, wykorzystując przygotowaną listę identyfikatorów genów do przeszukania najodpowiedniejszej bazy danych pod kątem przewidywanego szlaku.Sprawdzenie korelacji znanych par genów w analizowanym szlaku. W przypadku braku dostępności bazy danych koekspresji lub bazy danych ekspresji genów, w analizowanym planie należy wykorzystać bazę danych koekspresji Arabidopsis wraz z listą autologicznych genów Arabidopsis.Następnie należy skonstruować szkielet docelowej sieci koekspresji. W oparciu o połączenia znanych genów w analizowanej ścieżce, dodaje się skorelowane geny kandydackie i sprawdza ich adnotację genową w przewidywanych rodzinach w obrębie połączeń tej sieci, aby wyłonić najlepszego kandydata.Próg wartości współczynnika dla genów powinien być dostosowany do struktury sieci oraz gęstości powiązanych genów. Następnie należy sporządzić listę genów, które można zawęzić do tych wyspecjalizowanych w analizowanej ścieżce sygnałowej. Wykorzystując tę listę, należy sprawdzić ekspresję genów w odniesieniu do specyfiki narządowej oraz odpowiedzi na stres w przypadku genów kandydatów.Rozpocznij integrację informacji poprzez dodanie do przewidywanej ścieżki metabolicznej dobrze scharakteryzowanych genów, które zostały wykorzystane do zapytań w analizie koekspresji. Przeprowadź przegląd literatury, aby sprawdzić, czy niecharakteryzowane fragmenty tej ścieżki są nowością, w tym niecharakteryzowane etapy enzymatyczne, białka transportowe oraz czynniki transkrypcyjne. Na tym etapie przewidź najodpowiedniejszą adnotację genową dla tych brakujących, niecharakteryzowanych etapów.Połączenie wyników profilowania metabolomów z genami kandydackimi z analizy ekspresji genów in silico, opierając się na przewidywanej ścieżce metabolicznej. Następnie należy rozmieścić geny kandydackie na przewidywanej ścieżce zgodnie z ich funkcją. Przykładowo: acetylotransferazy dla metabolitów acylowanych, glikozylotransferazy dla glikozydów oraz P450 dla związków utlenionych.Sprawdź spójność specyfiki tkankowej lub odpowiedzi na stres pomiędzy akumulacją metabolitów a poziomem ekspresji genów w przypadku genów kandydackich. Przeanalizuj również powiązania z innymi szlakami metabolicznymi w celu dostarczenia substratów oraz z genami odpowiedzialnymi za odpowiedź na stres. W końcowym etapie przeprowadź eksperyment w celu identyfikacji funkcji genów, wykorzystując biozasoby, takie jak biblioteka mutantów z nokautem oraz biblioteka pełnowymiarowych cDNA.Oto przykład analizy sieci koregulacji szlaku biosyntezy antocyjanów. Analizy koekspresji przeprowadzono z wykorzystaniem indeksu koekspresji PRAM w oparciu o zbiór danych w wersji trzeciej przy użyciu programu PX; jako węzły czerwone przedstawiono 12 genów enzymatycznych szlaku antocyjanów oraz dwa czynniki transkrypcyjne odpowiedzialne za produkcję antocyjanów, które posłużyły do poszukiwania genów kandydatów. Sieć koekspresji obejmująca 68 skorelowanych genów kandydatów i 14 genów zapytań została zrekonstruowana poprzez wzajemne powiązania w wyszukiwaniu zbiorów przy użyciu bazy danych Prime, co pozwoliło na wygenerowanie plików wyjściowych T net, które następnie zwizualizowano za pomocą oprogramowania PX.Niebieskie węzły wskazują geny kandydackie, które skorelowały z genami antocyjanów po ich rozwoju. Strategia ta dostarczy nam cennych wskazówek do przewidywania nowych funkcji genów w metabolizmie roślin.

annotation-plant-gene-function-via-combined-genomics-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Współpraca nad analizą funkcji genów roślin poprzez połączenie genomiki, metabolomiki i informatyki

Ten artykuł opisuje zastosowanie nieukierunkowanej metabolomiki, transkryptomiki i wielowymiarowej analizy statystycznej do transkryptów i metabolitów z jagód winogron w celu uzyskania wglądu w koncepcję terroir, tj. wpływ środowiska na cechy jakości jagód.

Koncepcja terroir interpretowana za pomocą metabolomiki i transkryptomiki jagód winogron

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Ten artykuł opisuje procedurę identyfikacji i charakterystyki rodziny genów w winorośli zastosowanej do rodziny Arabidopsis Tóxicos w ligazach ubikwityny Levadura (ATL) E3.

Kompleksowy przepływ pracy do metaanalizy identyfikacji i ekspresji całego genomu rodziny genów ligazy ubikwityny ATL E3 w winorośli

Analiza wielu biomolekuł w całym systemie jest kluczowa dla uzyskania funkcjonalnego i mechanistycznego wglądu w procesy biologiczne. W niniejszym opisano obszerny protokół wysokoprzepustowej ekstrakcji lipidów, metabolitów, białek i skrobi z pojedynczej próbki pobranej z zsynchronizowanej kultury Chlamydomonas.

Multiomiczna metoda ekstrakcji do dogłębnej analizy zsynchronizowanych kultur zielonej algi Chlamydomonas reinhardtii

Protokół eksploracji genomu sterowany spektrometrią mas jest ustanowiony i opisany tutaj. Opiera się na informacjach o sekwencjach genomu i analizie LC-MS/MS i ma na celu ułatwienie identyfikacji cząsteczek ze złożonych ekstraktów mikrobiologicznych i roślinnych.

Eksploracja genomu pod kontrolą spektrometrii mas jako narzędzie do odkrywania nowych produktów naturalnych

Uruchamiając narzędzie do badania asocjacji ścieżek (PAST), czy to za pomocą aplikacji Shiny, czy przez konsolę R, badacze mogą uzyskać głębsze zrozumienie biologicznego znaczenia wyników badania asocjacyjnego całego genomu (GWAS), badając zaangażowane szlaki metaboliczne.

Narzędzie do badania asocjacji szlaków do analiz GWAS informacji o szlakach metabolicznych

W tym protokole prezentujemy zoptymalizowany przepływ pracy, który łączy w sobie efektywne i szybkie przygotowanie wielu próbek. Ponadto udostępniamy przewodnik krok po kroku, jak zmniejszyć odchylenia analityczne w celu wysokoprzepustowej oceny metabolicznych badań GWAS.

Large-Scale Multi-Omimic Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Wytyczne dotyczące przygotowania i normalizacji próbek

Opracowana metoda znakowania 13C6-Glucose w połączeniu z chromatografią cieczową o wysokiej rozdzielczości spektrometrią mas jest wszechstronna i stanowi podstawę do przyszłych badań nad pierwotnymi organami i szlakami zaangażowanymi w syntezę metabolitów wtórnych w roślinach leczniczych, jak również kompleksowe wykorzystanie tych wtórnych metabolitów.

13C6-Znakowanie glukozy związane z LC-MS: Identyfikacja pierwotnych organów roślinnych w syntezie metabolitów wtórnych

Opis metody wyciszania genów indukowanego wirusem (VIGS) w celu obniżenia ekspresji genów u Nicotiana benthamiana oraz pomidora.

Wyciszanie genów indukowane wirusem (VIGS) u Nicotiana benthamiana i pomidora

Przedstawiono metodę izolacji specyficznych typów komórek z materiału roślinnego. Technika ta wykorzystuje transgeniczne linie markerowe wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w określonych typach komórek, dysocjację komórkową oraz sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Dodatkowo opracowano układ hodowlany, który umożliwia poddanie siewek Arabidopsis thaliana obróbce przed sortowaniem komórek.

Sortowanie komórek protoplastów roślinnych metodą fluorescencyjnej aktywacji (FACS)

Poznaj metodę adnotacji funkcji genów roślin poprzez połączenie profilowania metabolitów i analizy koekspresji. Technika ta umożliwia identyfikację kluczowych genów metabolicznych z wykorzystaniem HPLC i sieci koekspresji.

Adnotacja funkcji genów roślin poprzez zintegrowaną genomikę, metabolomikę i informatykę

Przeglądaj więcej filmów