Adnotacja funkcji genów roślin poprzez zintegrowaną genomikę, metabolomikę i informatykę

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest odkrycie i charakterystyka nowej funkcji genów poprzez adnotację genów z wykorzystaniem połączonej analizy profilowania metabolitów oraz analizy koekspresji. Osiąga się to poprzez zaplanowanie eksperymentu z uwzględnieniem konkretnych szlaków metabolicznych i gatunków roślin. W drugim kroku stosuje się podejścia analityczne w celu zrekonstruowania całego szlaku metabolicznego w oparciu o struktury chemiczne wykrytych związków.

Następnie struktura przewidywanej ścieżki zostaje zintegrowana z analizą koekspresji w celu zawężenia listy genów kandydackich, które potencjalnie wskazują na kluczowe geny metabolizmu. Ostatecznie wyniki uzyskuje się poprzez przeprowadzenie minimalnych zestawów eksperymentów z wydajnym wykorzystaniem kilku zasobów biologicznych w celu charakterystyki funkcjonalnej identyfikacji genów. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas po znalezieniu bardzo wysokiej korelacji genów cystycznych Abosi OID w bazie danych koekspresji o nazwie ate.

Uznano, że strategia ta jest jednym z najszybszych sposobów na znalezienie funkcji nowych genów przy wykorzystaniu ogólnodostępnych baz danych i efektywnym użyciu zasobów biologicznych. Aby rozpocząć ekstrakcję, należy zebrać materiał roślinny i natychmiast zamrozić go w ciekłym azocie. Po zamrożeniu należy sproszkować materiał roślinny za pomocą młyna mieszalnikowego, przenieść alikwoty zamrożonego materiału do probówek EOR o pojemności 2 ml, a następnie dodać do probówki metalową kulkę.

Dodaj 250 µL buforu do ekstrakcji na każde 50 mg próbki. Bufor do ekstrakcji zawiera standard wewnętrzny do normalizacji. Następnie homogenizuj zamrożony proszek w młynku mieszalnikowym przez dwie minuty.

Przy częstotliwości 25 odwiruj próbkę z prędkością 12 000 RPM przez 10 minut. Następnie przenieś nadsącz do filtra wirówkowego. Po przeprowadzeniu drugiej serii wirowania przenieś nadsącz do nowej probówki typu einor.

Następnie przygotuj układ HPLC, sprawdzając w pierwszej kolejności, czy temperatura termostatu kolumny wynosi 35 °C, a temperatura tacy na próbki 10 °C. Skonfiguruj parametry spektrometrii mas oraz sprawdź stan próżni i kapilary grzejnej. Wykonaj kalibrację nadmiaru ładunku detektora MS poprzez infuzję mieszaniny roztworu kalibracyjnego.

Użyj aplikacji do automatycznej kalibracji w oprogramowaniu. Następnie przenieś 50 µl ekstraktów do szklanej fiolki. W przypadku HPLC wykonaj co najmniej pięć wtrysków buforu do ekstrakcji przed przeprowadzeniem analizy pierwszej próbki, zgodnie z opisem w procedurze pisemnej.

Po skonfigurowaniu narzędzia do analizy spektrometrii mas należy wybrać dane do przetworzenia. Przygotuj tabelę wykrytych pików będących przedmiotem zainteresowania, zgodnie z klasą związków wskazaną w protokole pisemnym. Na tym etapie zidentyfikuj piki poprzez koewolucję ze związkami wzorcowymi, a następnie opisz wykryte piki, wykorzystując analizę Ms.MS, literaturę, przegląd oraz wyszukiwanie w bazach danych metabolitów.

Przewidywanie szlaków powinno opierać się na strukturach chemicznych poprzez powiązanie funkcji enzymatycznej w szlaku metabolicznym. Z tego powodu kroki te powinny być prowadzone w oparciu o precyzyjną identyfikację wykrytych związków. Bazy danych ogólnych szlaków metabolicznych, takie jak baza KEGG oraz PlantACT, są bardzo skuteczne w przewidywaniu analizowanego szlaku metabolicznego.

Aby przygotować listę genów z ortologami Arabidopsis wraz z ich identyfikatorami (ID), należy najpierw pobrać listę identyfikatorów genów z bazy danych genomicznych. W przypadku, gdy rośliną docelową nie jest Arabidopsis, należy dodać identyfikatory genów ortologicznych Arabidopsis. Następnie należy sporządzić listę genów w analizowanym szlaku.

Adnotacje danych dotyczących szlaków metabolicznych oraz danych o rodzinach genów Arabidopsis są dostępne na stronie internetowej TAAR. Listy genów ortologicznych Arabidopsis można następnie połączyć. Przeprowadź analizę sieci koekspresji, wykorzystując przygotowaną listę identyfikatorów genów do przeszukania najodpowiedniejszej bazy danych pod kątem przewidywanego szlaku.

Sprawdzenie korelacji znanych par genów w analizowanym szlaku. W przypadku braku dostępności bazy danych koekspresji lub bazy danych ekspresji genów, w analizowanym planie należy wykorzystać bazę danych koekspresji Arabidopsis wraz z listą autologicznych genów Arabidopsis.

Następnie należy skonstruować szkielet docelowej sieci koekspresji. W oparciu o połączenia znanych genów w analizowanej ścieżce, dodaje się skorelowane geny kandydackie i sprawdza ich adnotację genową w przewidywanych rodzinach w obrębie połączeń tej sieci, aby wyłonić najlepszego kandydata.

Próg wartości współczynnika dla genów powinien być dostosowany do struktury sieci oraz gęstości powiązanych genów. Następnie należy sporządzić listę genów, które można zawęzić do tych wyspecjalizowanych w analizowanej ścieżce sygnałowej. Wykorzystując tę listę, należy sprawdzić ekspresję genów w odniesieniu do specyfiki narządowej oraz odpowiedzi na stres w przypadku genów kandydatów.

Rozpocznij integrację informacji poprzez dodanie do przewidywanej ścieżki metabolicznej dobrze scharakteryzowanych genów, które zostały wykorzystane do zapytań w analizie koekspresji. Przeprowadź przegląd literatury, aby sprawdzić, czy niecharakteryzowane fragmenty tej ścieżki są nowością, w tym niecharakteryzowane etapy enzymatyczne, białka transportowe oraz czynniki transkrypcyjne. Na tym etapie przewidź najodpowiedniejszą adnotację genową dla tych brakujących, niecharakteryzowanych etapów.

Połączenie wyników profilowania metabolomów z genami kandydackimi z analizy ekspresji genów in silico, opierając się na przewidywanej ścieżce metabolicznej. Następnie należy rozmieścić geny kandydackie na przewidywanej ścieżce zgodnie z ich funkcją. Przykładowo: acetylotransferazy dla metabolitów acylowanych, glikozylotransferazy dla glikozydów oraz P450 dla związków utlenionych.

Sprawdź spójność specyfiki tkankowej lub odpowiedzi na stres pomiędzy akumulacją metabolitów a poziomem ekspresji genów w przypadku genów kandydackich. Przeanalizuj również powiązania z innymi szlakami metabolicznymi w celu dostarczenia substratów oraz z genami odpowiedzialnymi za odpowiedź na stres. W końcowym etapie przeprowadź eksperyment w celu identyfikacji funkcji genów, wykorzystując biozasoby, takie jak biblioteka mutantów z nokautem oraz biblioteka pełnowymiarowych cDNA.

Oto przykład analizy sieci koregulacji szlaku biosyntezy antocyjanów. Analizy koekspresji przeprowadzono z wykorzystaniem indeksu koekspresji PRAM w oparciu o zbiór danych w wersji trzeciej przy użyciu programu PX; jako węzły czerwone przedstawiono 12 genów enzymatycznych szlaku antocyjanów oraz dwa czynniki transkrypcyjne odpowiedzialne za produkcję antocyjanów, które posłużyły do poszukiwania genów kandydatów. Sieć koekspresji obejmująca 68 skorelowanych genów kandydatów i 14 genów zapytań została zrekonstruowana poprzez wzajemne powiązania w wyszukiwaniu zbiorów przy użyciu bazy danych Prime, co pozwoliło na wygenerowanie plików wyjściowych T net, które następnie zwizualizowano za pomocą oprogramowania PX.

Niebieskie węzły wskazują geny kandydackie, które skorelowały z genami antocyjanów po ich rozwoju. Strategia ta dostarczy nam cennych wskazówek do przewidywania nowych funkcji genów w metabolizmie roślin.