Name: Przygotowanie nienaruszonych krążków międzykręgowych ogona bydlęcego do hodowli narządów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Poznaj metodę izolacji nienaruszonych krążków międzykręgowych z ogona bydlęcego do hodowli narządów. Technika ta umożliwia badania mechanobiologii i inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt ten był wspierany przez Szwajcarską Narodową Fundację Naukową (Swiss National Science Foundation, SNF # 310030-127586/1).

1. Pobieranie krążków międzykręgowych
<ol>
	<li>Cały ogon bydlęcy pozyskuje się z lokalnej rzeźni, jeśli to możliwe bez skóry, ponieważ jej obecność zwiększa ryzyko kontaminacji (Rys. 2).</li>
	<li>Przygotować dużą deskę do krojenia oraz sterylną stację roboczą i narzędzia na wierzchu deski (Rys. 2).</li>
	<li>Pod sterylnym dygestorium z laminarnym przepływem powietrza przygotować sterylną gazę zwilżoną 0,9% chlorkiem sodu zawierającym 55mM cytrynianu sodu i umieścić ją w każdym dołku płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Przygotować miednicę i rozcieńczyć roztwór Betadiny z wodą z kranu w stosunku 1:100.</li>
	<li>Zanurzyć cały ogon bydlęcy w miednicy z 1% roztworem Betadiny na 5 min.</li>
	<li>Krótko osuszyć ogon sterylną gazą i umieścić go na steryjnej stacji roboczej.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć mięśnie wokół ogona za pomocą ostrza skalpela nr 22.</li>
	<li>Odciąć części ogona, które nie są potrzebne, zazwyczaj oba końce ogona, które zawierają odpowiednio bardzo duże i bardzo małe IVD (Rys. 3).</li>
	<li>Dalej przyciąć mięśnie i ścięgna wokół IVD, używając ostrza skalpela nr 10. Należy uważać, aby nie przeciąć zewnętrznego pierścienia krążka.</li>
	<li>Zaznaczyć przednią część IVD chirurgicznym markerem do skóry (krok ten jest opcjonalny, pomaga wyznaczyć środek rotacji osiowej w naszym bioreaktorze).</li>
	<li>Zlokalizować punkt połączenia IVD z kręgiem, delikatnie poruszając ogonem. Wyczuć granicę między IVD a kością tępą stroną ostrza skalpela. Miejsce rozdzielenia powinno znajdować się 1-2 mm od IVD w stronę kręgu. Umieścić wykonany na zamówienie przemysłowy uchwyt ostrza w miejscu rozdzielenia (Rys. 4).</li>
	<li>Rozdzielić IVD i kręg, uderzając w górę wykonanego na zamówienie przemysłowego uchwytu ostrza (Rys. 3).</li>
	<li>Powtórzyć czynność po drugiej stronie połączenia IVD-kręg.</li>
	<li>Owiąć wyizolowany IVD sterylną gazą zwilżoną 0,9% chlorkiem sodu zawierającym 55mM cytrynianu sodu.</li>
	<li>Kontynuować izolację IVD do pożądanej liczby próbek (zazwyczaj można pozyskać około 6 próbek o średnicy od 10-20 mm).</li>
	<li>Podłączyć system płukania strumieniowego (Zimmer, inc.) do sterylnego roztworu Ringer'a z mleczanem; worki 5L są praktyczną wielkością (alternatywnie sterylny PBS lub 0,9% roztwór soli fizjologicznej).</li>
	<li>Przytrzymać IVD pęsetą i wypłukać strumieniowo obie strony powierzchni płytki granicznej za pomocą systemu płukania strumieniowego Zimmer Pulsavac (Rys. 1C). Strumień powinien być skierowany na powierzchnię płytki granicznej pod kątem od 30 - 60° przez około 30 s na każdą stronę (Rys. 1 i 7).</li>
	<li>Umieścić IVD z powrotem w płytce 6-dołkowej i owinąć zwilżoną gazą podczas płukania strumieniowego kolejnej próbki krążka.</li>
	<li>IVD są gotowe do hodowli organowej i dalszych zastosowań (np. oceny żywotności komórek, obciążenia mechanicznego, hodowli organowej) (Rys. 1D).</li>
</ol>
2. Reprezentatywne wyniki
Pomiarami wyników służącymi do oceny prawidłowego przygotowania krążka międzykręgowego może być eksperyment dyfuzyjny, w którym barwnik fluorescencyjny o niskiej masie cząsteczkowej (np. procion red) jest przygotowany jako roztwór 1% w PBS2. Następnie IVD pozostawia się w co najmniej 100 mL roztworu barwnika, pozwalając na jego pasywną dyfuzję do IVD przez 24h w warunkach swobodnego pęcznienia. IVD jest następnie błyskawicznie zamrażane w ciekłym azocie, doprowadzane do temperatury pokojowej i odwadniane poprzez serię przeniesień do acetonu (początkowo schłodzonego do -80 °C, następnie do -20 °C, potem do 4 °C i na koniec do temperatury pokojowej). Krążek można następnie zatopić w polimetakrylanie metylu (PMMA) i pociąć ostrym ostrzem w celu uzyskania przekrojów o grubości 100 μm. Przekroje te można oglądać za pomocą dowolnego standardowego mikroskopu w świetle przechodzącym, lecz preferencyjnie przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej, ponieważ procion red emituje czerwoną fluorescencję (Ryc. 5-6). Belki kostne powierzchni kostnej wydają się bardzo czyste po etapie płukania strumieniowego (Ryc. 7).
Parametrami warunkującymi sukces hodowli organów są przede wszystkim brak kontaminacji, utrzymana żywotność komórek (Ryc. 8-9), wysokość krążka oraz ogólna „integralność krążka”, oceniana na podstawie przekrojów histologicznych i barwienia safraniną O/fast green lub hematoksyliną Meyera 3. Opracowaliśmy protokoły i makra opublikowane w innych opracowaniach4,5 w celu barwienia żywej tkanki krążka oraz skanowania żywotności komórek w 3D z wykorzystaniem konfokalnego mikroskopu skaningowego oraz zestawu do barwienia żywe/martwe (Molecular Probes, Invitrogen, Basel, Szwajcaria). Opracowaliśmy ponadto makro i rutynę do automatycznego liczenia komórek w celu oszacowania ich żywotności w tkance 3D lub nośnikach 3D przy użyciu platformy NIH ImageJ4-6. Zaproponowano alternatywne protokoły określania żywotności komórek krążka poprzez wstępne trawienie sekwencyjne macierzy zewnątrzkomórkowej za pomocą pronazy i kolagenazy typu 2, a następnie barwienie zawiesiny komórkowej7. Wcześniejsza wersja protokołu obejmowała etap inkubacji w PBS zawierającym dziesięciokrotnie większe stężenie penicyliny/streptomycyny przez 10 min po pobraniu krążków, przed rozpoczęciem hodowli organów. Wprowadzenie etapu płukania strumieniem wody sprawia, że krok ten staje się zbędny, gdyż płukanie wydaje się korzystniejsze dla celów hodowlanych.
<img alt="Schemat budowy kręgosłupa, przepływ składników odżywczych, pęknięcie krążka, układ hodowli organów, metody badawcze." src="/files/ftp_upload/3490/3490fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przegląd kroków metodologicznych przygotowania bydlęcych krążków międzykręgowych z odcinka kośćca z nienaruszonymi płytkami granicznymi i cienką warstwą (1-2 mm) kości. A) Schematyczny widok krążka międzykręgowego (IVD) i jego dróg odżywiania. B) Procedura wycinania IVD za pomocą dostosowanego uchwytu z ostrzem i przemysłowego ostrego noża. C) Etap płukania strumieniowego w celu zapewnienia wysokiej żywotności komórek i umożliwienia wymiany składników odżywczych przy zachowaniu płytek granicznych i 1-2 mm kości po obu stronach. D) Ostatecznie IVD może być hodowany w komorze na próbki bioreaktora lub wykorzystany w dowolnej aplikacji analitycznej.
<img alt="Analiza wzrostu kości; obraz anatomiczny i zdjęcie rentgenowskie kręgów ogonowych z zaznaczonymi płytkami wzrostu." src="/files/ftp_upload/3490/3490fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. GÓRA: Ogon bydlęcy o pełnej długości (idealnie pozyskany w ciągu 2-3 godzin po uboju, aby zapewnić wysoką żywotność komórek). DÓŁ: Obraz rentgenowski ogona bydlęcego w wieku około 6 miesięcy, ilustrujący obecność płytek wzrostu (GP), wtórnego ośrodka kostnienia, pomiędzy kostnymi płytkami krańcowymi (EP) a trzonami kręgów (VB).
<img alt="Proces stabilizacji kości; zestaw sprzętu (A), zacisk na kości (B), urządzenie do testowania siły (C)." src="/files/ftp_upload/3490/3490fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. A) Narzędzia do sekcji ogona bydlęcego w warunkach sterylnych. B) Dostosowany uchwyt ostrza do wycinania segmentów ruchowych z ogona bydlęcego podczas przecinania krążka międzykręgowego. C) Widok boczny dostosowanego uchwytu ostrza ze standardowym ostrzem przemysłowym (Lutz, Niemcy).
<img alt="Schemat struktury kręgu i próbka pokazująca kręg, IVD, płytkę wzrostu i miejsce rozdzielenia." src="/files/ftp_upload/3490/3490fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Rysunek i zdjęcie bydlęcego ogona po usunięciu otaczających mięśni i więzadeł, ilustrujące miejsca rozdzielenia w celu wycięcia segmentów ruchomych. Częściowy kręg powinien zostać „pęknięty” za pomocą specjalnie wykonanego uchwytu ostrza, najlepiej w odległości 1-2 mm od chrzęstnych płytek granicznych, aby zapewnić pełną powierzchnię kości.
<img alt="Porównanie próbek tkanki szkieletowej; pomiar, analiza; eksperyment z podziałką liniową." src="/files/ftp_upload/3490/3490fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Prezentacja skuteczności oczyszczania podczas etapu przemywania strumieniowego przed (A) i po (B). Zwróć uwagę na czyste powierzchnie kostne segmentów krążków międzykręgowych po procedurze natryskowej.
<img alt="Schemat analizy histologicznej obrazujący wzrost kości, przedstawiający kostnienie pierwotne i wtórne." src="/files/ftp_upload/3490/3490fig6.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Eksperyment dyfuzji z wolnym pęcznieniem świeżo przygotowanych wyciętych krążków międzykręgowych (IVDs) z ogona bydlęcego, pozostawionych na 24 godziny w 1% roztworze procion red, wykazujący efekt blokady przez płytkę wzrostu. Cyfrowy obraz RTG w widoku strzałkowym IVD nadal zawierającego płytkę wzrostu oraz obraz mikroskopii fluorescencyjnej drugiej warstwy kości w przekroju strzałkowym eksplantu krążka międzykręgowego z ogona bydlęcego z chrzęstną i kostną płytką graniczną po 24h wolnej dyfuzji. GP: płytka wzrostu, 2ndry CO: wtórne centrum kostnienia.
<img alt="Analiza histologiczna, krążek międzykręgowy. Obraz mikroskopowy przedstawia szczegóły jądra miażdżystego i pierścienia włóknistego." src="/files/ftp_upload/3490/3490fig7.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Eksperyment swobodnego pęcznienia świeżo przygotowanych wyciętych krążków międzykręgowych (IVDs) z ogona bydlęcego, pozostawionych na 24 godziny w 1% roztworze Procion Red, wykazujący efekt oczyszczający zabiegu płukania strumieniowego. Sagitalne grube przekroje (~100 mm) wyciętych bydlęcych IVDs z płytkami granicznymi o grubości ~1,5 mm, które poddano płukaniu strumieniowemu (lewa strona) oraz strona kontrolna bez zabiegu (prawa strona) – płukanie strumieniowe. Wstawka przedstawia wzór natrysku, który został zastosowany z systemu opracowywania ran Zimmer podczas 24-godzinnych eksperymentów swobodnej dyfuzji w eksplantach krążków międzykręgowych bydlęcych w 1% Procion Red.
<img alt="Wyniki testu żywotności komórek, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, porównanie w czasie, dni od 0 do 14." src="/files/ftp_upload/3490/3490fig8.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Obrazy Live/Dead będące projekcjami stosów obrazowania konfokalnego ( ̃250μm), wykonane z segmentów krążka międzykręgowego bydła przygotowanych metodą jet-lavage i utrzymywanych w stanie swobodnego pęcznienia odpowiednio przez 0 i 14 dni w obrębie jądra miażdżystego (NP), wewnętrznego pierścienia włóknistego (IA) oraz zewnętrznego pierścienia włóknistego (OA). Komórki zielone = komórki żywe barwione calcein AM (acetyl methylester), komórki czerwone = jądra komórek martwych barwione etydyną homodimerem-1.
<img alt="Wykres żywotności komórek dysku międzykręgowego w czasie; porównanie NP i AF; procenty żywotności." src="/files/ftp_upload/3490/3490fig9.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9. Żywotność komórek dysku międzykręgowego oceniana za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej na żywej tkance i skanowania stosów 3D. Żywotność komórek jądra miażdżystego (NP) oraz pierścienia włóknistego (AF) w ciągu 21 dni hodowli w warunkach swobodnego pęcznienia. (Średnia ± SEM, N=6) Różnice statystyczne między grupami badano za pomocą nieparametrycznego testu sum rang Kruskala-Wallisa. W NP stwierdzono istotne różnice między dniem 21 a wszystkimi pozostałymi punktami czasowymi. W AF istotne różnice stwierdzono między dniem 7 a dniem 0. (* p &lt; 0.05, ** p &lt; 0.01).

<ol><li>Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+organ+culture+of+the+bovine+intervertebral+disc%3A+effects+of+vertebral+endplate+and+potential+for+mechanobiology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa++1976%29%22%5BJournal%5D)">In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies.</a> Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).</li>
<li>Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+intervertebral+disc+with+injected+bone+marrow-derived+stromal+cells%3A+a+feasibility+study+using+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Spine.+J%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture.</a> Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).</li>
<li>Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Response+of+the+Intervertebral+Disc+to+Repetitive+Short+Term+Cyclic+Torsion%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion.</a> Spine (Phila Pa 1976). , (2011).</li>
<li>Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-Jünger, S., Grad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+imaging+protocols+for+live%2Fdead+staining+in+three-dimensional+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers.</a> Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).</li>
<li>Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+three+techniques+to+determine+cell+viability+in+3D+tissues+or+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).</li>
<li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasband%2C+WS+%22ImageJ%22">ImageJ</a>. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).</li>
<li>Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+novel+intervertebral+disc%2Fendplate+culture+model%3A+analysis+of+an+ex+vivo+in+vitro+whole-organ+rabbit+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system.</a> Spine. 31, 2918-2925 (2006).</li>
<li>Gantenbein, B., Grünhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+organ+culturing+system+for+intervertebral+disc+explants+with+vertebral+endplates%3A+a+feasibility+study+with+ovine+caudal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs.</a> Spine. 31, 2665-2673 (2006).</li>
<li>Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervertebral+disc+cell+response+to+dynamic+compression+is+age+and+frequency+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent.</a> J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).</li>
<li>Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compression+effects+on+intervertebral+disc+mechanics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology.</a> Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).</li>
<li>Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intact+intervertebral+disc+organ+culture+system+in+which+degeneration+can+be+induced+as+a+prelude+to+studying+repair+potential%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential.</a> European Spine Journal. , 1-11 (2011).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Pierwszym krokiem do pomyślnej hodowli organów jest upewnienie się, że eksplant nie jest zanieczyszczony. Przed rozpoczęciem procedury należy zdjąć skórę z ogona. Każdy włos zwierzęcy wniesiony do sterylnego laboratorium może stanowić problem w kontekście kontaminacji. Ogon bydlęcy powinien być idealnie jak najświeższy (wpływa to na początkową żywotność komórek). Ponadto, w celu dalszego zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia, zaleca się etap mycia betadyną. Zamiast używania specjalnie wykonanego uchwytu do ostrza i młotka...

<table><tbody><tr><td>Świeża tkanka krążka międzykręgowego bydła z ogonów bydlęcych, z lokalnej rzeźni (najlepiej w ciągu kilku godzin po śmierci i bez skóry).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>System Pulsavac Plus AC</td><td>Zimmer inc., Switzerland</td><td>00-5150-486-01</td><td>Najlepsza wydajność z końcówką typu hip-spray i z zasilaczem AC (wersja z pakietem 8 baterii AA d&amp;#8211;różnie również działa, ale jest mniej wygodna)</td></tr><tr><td>Dysza rozproszona o wysokiej wydajności z osłoną przed rozbryzgami, długość 12,7cm</td><td>Zimmer inc., Switzerland</td><td>00-5150-175-00</td><td>Dostępnych jest kilka końcówek natryskowych; tę przetestowaliśmy pomyślnie</td></tr><tr><td>Ostrza skalpela nr 22 i nr 10</td><td>Swann-Morton</td><td>#10: 0201 #22: 0208</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyty ostrzy skalpela nr 3 i nr 4</td><td>Hausmann, Germany</td><td>#3: 06.103.00 #4: 06.104.00</td><td></td></tr><tr><td>Przemysłowe ostrze Lutz</td><td>Lutz, Germany</td><td>1022.0884</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowo-solny (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże DMEM (Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td> Roztwór Ringer&amp;rsquo;a z mleczanem (bez glukozy)</td><td>Bichsel, Switzerland</td><td>133 0002</td><td></td></tr><tr><td>Płytka wielodobowa 6-dołkowa</td><td>Techno Plastic Products</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Betadyny</td><td>Mundipharma, Switzerland</td><td>10055025</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgiczny marker do skóry</td><td>Porex Surgical, Switzerland</td><td>9560</td><td></td></tr><tr><td>Duża deska do cięcia</td><td></td><td></td><td>Możliwa dowolna marka</td></tr></tbody></table>

przygotowanie nienaruszonych krążków międzykręgowych z ogona bydlęcego do hodowli organowej

Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

Krążek międzykręgowy (IVD) jest stawem kręgosłupa łączącym kręg z kręgiem. Jego funkcją jest przekazywanie obciążeń kręgosłupa oraz zapewnianie mu elastyczności. Składa się z trzech części: najgłębiej położonego jądra miażdżystego (NP) otoczonego pierścieniem włóknistym (AF) oraz dwóch chrzęstnych płyt końcowych, które łączą NP i AF z trzonem kręgu po obu stronach. Ból dyskogenny, prawdopodobnie spowodowany chorobą zwyrodnieniową krążków międzykręgowych (DDD) oraz przepuklinami krążków, został zidentyfikowany jako główny problem w naszym nowoczesnym społeczeństwie. Aby badać możliwe mechanizmy degeneracji IVD, systemy hodowli organów in vitro z żywymi komórkami krążka są niezwykle atrakcyjne. Hodowla in vitro nienaruszonych wołowych krążków międzykręgowych ogonowych stała się istotnym systemem modelowym, który pozwala na badanie aspektów mechanobiologicznych w dobrze kontrolowanym środowisku fizjologicznym i mechanicznym. Wołowe IVD z ogona można stosunkowo łatwo pozyskać w większej liczbie, a są one bardzo podobne do ludzkich IVD lędźwiowych pod względem gęstości komórek, populacji komórkowej i wymiarów. Jednak wcześniejsze techniki pobierania wołowych IVD ogonowych, zachowujące płytki chrzęstne i kostne, okazywały się nieskuteczne po 1-2 dniach hodowli, ponieważ drogi odżywiania były ewidentnie zablokowane przez skrzepy krwi. IVD są największymi organami beznaczyniowymi, w związku z czym dostarczanie składników odżywczych do komórek w NP zależy wyłącznie od dyfuzji poprzez wypustki kapilarne z przyległego trzonu kręgu. Obecność fragmentów kostnych i skrzepów krwi na powierzchniach płyt końcowych może utrudniać dyfuzję składników odżywczych do centrum krążka i zagrażać żywotności komórek. Nasza grupa opracowała stosunkowo szybki protokół „wyłuskiwania” (crack-out) IVD z ogona przy niskim ryzyku kontaminacji. Jesteśmy w stanie upaśmiennić świeżo przecięte powierzchnie kostnych płyt końcowych, używając chirurgicznego systemu płukania strumieniowego, który usuwa skrzepy krwi i pozostałości po cięciu, a także bardzo efektywnie przywraca drogę dyfuzji składników odżywczych do centrum IVD. Należy unikać obecności płytek wzrostu po obu stronach kości kręgu i usunąć je przed rozpoczęciem hodowli. W tym filmie przedstawiamy kluczowe kroki podczas przygotowania i demonstrujemy sposób na pomyślną hodowlę organu, utrzymującą wysoką żywotność komórek przez 14 dni w warunkach hodowli z wolnym pęcznieniem. Czas hodowli można przedłużyć, jeśli możliwe jest utrzymanie odpowiedniego środowiska mechanicznego przy użyciu bioreaktora z obciążeniem mechanicznym. Technika zaprezentowana w tym materiale może zostać rozszerzona na inne gatunki zwierząt, takie jak izolacja ogonowych i lędźwiowych IVD u świń, owiec i królików.

Niniejszy protokół przedstawia technikę pobierania kręgów szyjnych z krążków międzykręgowych bydła do hodowli organów in vitro.

Przygotowanie nienaruszonych krążków międzykręgowych z ogona bydlęcego do hodowli organowej

Dyski międzykręgowe (IVD) są stawami kręgosłupa łączącymi poszczególne kręgi. Ich funkcją jest przekazywanie obciążeń kręgosłupa oraz zapewnienie...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie nienaruszonych krążków międzykręgowych z ogona bydlęcego do hodowli i innych zastosowań analitycznych; w naszym przypadku do przygotowania krążków międzykręgowych do hodowli w bioreaktorze z zastosowaniem złożonego obciążenia mechanicznego. Cel ten osiąga się poprzez uprzednią dezynfekcję ogona cielęcego, a następnie usunięcie mięśni w celu uzyskania wyraźnego wglądu w struktury kostne i krążki międzykręgowe. Następnie, przy użyciu specjalistycznego narzędzia do cięcia, wycina się pojedynczy krążek międzykręgowy, pozostawiając po obu stronach dwa do trzech milimetrów przytwierdzonego fragmentu kręgu.Trzecim krokiem jest oczyszczenie powierzchni kostnych krążka międzykręgowego za pomocą systemu płukania strumieniowego (jet lavage), aby zapewnić dyfuzję małych cząsteczek, takich jak glukoza, do centrum krążka międzykręgowego. Ostatnim krokiem jest umieszczenie krążka międzykręgowego w buforze stabilizującym lub owinięcie go w sterylną gazę, aby utrzymać go w stanie wilgotnym do dalszych zastosowań. Ostatecznie sukces procedury ocenia się za pomocą barwienia żywe/martwe, aby sprawdzić obecność żywych komórek 14 lub 21 dni po rozpoczęciu hodowli krążka międzykręgowego.Poniższy protokół ma na celu pokazanie, w jaki sposób można konserwować segmenty krążka międzykręgowego do hodowli organowej, co może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu mechanobiologii i inżynierii tkankowej. Istnieje konkretny powód, dla którego krążek z ogona bydlęcego stał się pewnego rodzaju systemem modelowym w inżynierii tkankowej. Po pierwsze, gęstość komórek jest bardzo zbliżona i bardzo niska, podobnie jak w ludzkim jądrze miażdżystym.Po drugie, w populacji komórek nie występują komórki sznura, co jest bardzo podobne do sytuacji u ludzi. Po trzecie, wymiary oraz skład biochemiczny są również bardzo zbliżone do stanu u ludzi. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ odróżnienie płytki granicznej kości od kości kręgu jest utrudnione, co w konsekwencji utrudnia potwierdzenie obecności płytki wzrostowej chrząstki.Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy poszukiwaliśmy szybkiej i sterylnej techniki izolacji odwracalnego krążka z płytką graniczną do indywidualnej hodowli. Wizualna demonstracja tych metod jest istotna, ponieważ zlokalizowanie miejsca cięcia jest trudne, gdyż znajduje się ono zaledwie milimetr od płytki kostnej. Najpierw należy pozyskać cały ogon bydlęcy z lokalnej rzeźni.W idealnym przypadku ogon powinien zostać pobrany nie później niż cztery godziny po śmierci, z usuniętą skórą. Ponieważ obecność skóry zwiększa ryzyko kontaminacji, należy upewnić się, że wszystkie narzędzia wykorzystywane w procesie sekcji są sterylne. Należy również przygotować sterylną stację roboczą, umieszczając autoklawowaną deskę do cięcia na powierzchni roboczej.Następnie, pracując w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy zwilżyć kawałek sterylnej gazy 0,9% sterylnym roztworem chlorku sodu zawierającym 55 mM cytrynianu sodu. Umieść kawałek nasączonej gazy w każdym dołku płytki sześciodołkowej. Następnie napełnij czystą miednicę roztworem Betadinu w rozcieńczeniu 1:100 w wodzie z kranu i zanurz ogon w roztworze na pięć minut.Po namoczeniu odetnij ogon. Krótko osusz go sterylną gazą i umieść na sterylnej stacji roboczej. Najpierw za pomocą skalpela nr 20 lub nr 22 usuń mięśnie z okolic ogona. Następnie użyj gilotyny, aby odciąć niepotrzebne części ogona, zazwyczaj z proksymalnego i dystalnego końca, które zawierają odpowiednio stosunkowo duże i bardzo małe krążki międzykręgowe.Następnie za pomocą skalpela nr 10 przytnij mięśnie i ścięgna wokół dysków międzykręgowych. W razie potrzeby zachowaj ostrożność, aby nie przeciąć zewnętrznego pierścienia włóknistego dysków. W celu orientacji zaznacz stronę przednią dysku międzykręgowego za pomocą chirurgicznego markera do skóry.Następnie delikatnie przesuń ogon, aby zlokalizować krążek międzykręgowy i punkt połączenia z kręgiem. Używając tępej strony ostrza skalpela, wyznacz granicę między krążkiem międzykręgowym a kością. Następnie zlokalizuj miejsce rozcięcia, które powinno znajdować się od 1 do 2 mm od krążka międzykręgowego w kierunku kręgu.Umieść wykonany na zamówienie przemysłowy uchwyt ostrza w miejscu przecinania. Schemat ten wyraźnie pokazuje miejsce przecinania. Przetnij dysk międzykręgowy i kręgi, uderzając młotkiem w górną część przemysłowego uchwytu ostrza. Następnie przesuń uchwyt ostrza na drugą stronę połączenia dysku międzykręgowego z kręgami i uderz z tej strony połączenia, aby uwolnić dysk międzykręgowy.Następnie szybko wyizoluj krążki międzykręgowe za pomocą sterylnej gazy zwilżonej 0,9% chlorkiem sodu zawierającym 55 mM cytrynianu sodu. Powtórz proces, aby uzyskać pożądaną liczbę krążków międzykręgowych. Z jednego ogona zazwyczaj można uzyskać około sześciu krążków o średnicy od 10 do 20 mm.Po pobraniu wszystkich dysków odwracalnych, podłącz system płukania strumieniowego do trzy litrowego worka z jałowym roztworem Lactated Ringer, jałowym PBS lub 0,9% jałową solą fizjologiczną. Następnie przytrzymaj dysk odwracalny pęsetą i przemyj strumieniowo obie strony powierzchni płytki granicznej przez 30 sekund z każdej strony, trzymając końcówkę urządzenia pod kątem od 30 do 60 stopni w stosunku do powierzchni płytki granicznej; obraz ten przedstawia efekt oczyszczania za pomocą płukania strumieniowego. Górny rząd dysków przedstawia dyski odwracalne przed czyszczeniem, natomiast dolny rząd pokazuje te same dyski po czyszczeniu.Po wypłukaniu pierwszego krążka międzykręgowego należy owinąć go wilgotną gazą, wypłukując w międzyczasie pozostałe krążki międzykręgowego. Po wypłukaniu krążki międzykręgowe są gotowe do hodowli organowej. Dodatkowo, podczas pracy w komorze z laminarnym przepływem powietrza, można przeprowadzić eksperyment dyfuzyjny w celu oceny poprawności przygotowania krążków międzykręgowych.Przygotować 40 ml sterylnej pożywki DMEM zawierającej 5% płodowej surowicy cielęcej na jeden krążek międzykręgowy. Przenieść pożywkę do zlewki, a następnie zanurzyć w niej pojedynczy krążek międzykręgowy. Umieścić zlewkę na platformie wytrząsowej w inkubatorze do hodowli tkankowych ustawionym na 37 °C i 5% carbon dioxide.Dyski międzykręgowe można hodować w ten sposób przez około 14 dni. Zastosowanie tych specjalnie wykonanych komór do próbek zapewnia odpowiednie obciążenie mechaniczne, co umożliwia wydłużenie czasu hodowli. W pierwszej kolejności przygotować, jak wcześniej, 40 mililitrów sterylnej pożywki DMEM zawierającej 5% płodowej surowicy cielęcej na każdy dysk.Następnie umieść odwracalny dysk w jednej z wykonanych na zamówienie komór hodowlanych i dodaj 40 milliliters świeżo przygotowanej pożywki. Zamknij komorę w dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Umieść wykonaną na zamówienie komorę z próbką w inkubatorze do hodowli tkankowych.Obciąż komorę zgodnie z powierzchnią krążków. Najpierw przygotuj 100 mililitrów 1% roztworu barwnika fluorescencyjnego, np. proso red w PBS, na jeden krążek międzykręgowy. Następnie zanurz krążek w roztworze i inkubuj przez noc w tych samych warunkach.W przypadku hodowli z wolnym pęcznieniem, po inkubacji krążek należy gwałtownie zamrozić w ciekłym azocie, a następnie zanurzyć w acetonie o temperaturze -80 °C. Następnie dysk międzykręgowy powoli doprowadza się do temperatury pokojowej poprzez 24-godzinne inkubacje w acetonie w temperaturach -20 °C, 4 °C, a na koniec w acetonie w temperaturze pokojowej. Po przywróceniu dysku do temperatury pokojowej, należy go całkowicie zatopić w polimetakrylanie metylu na okres od jednego do dwóch tygodni, zgodnie ze standardowymi procedurami.Po pełnym zatopieniu dysk jest obrabiany poprzez wycinanie ostrym ostrzem i polerowanie szlifierką. Po obróbce za pomocą mikroskopii można ocenić dyfuzję pro cy red w całym dysku. Przedstawione obrazy ukazują wyniki eksperymentu dyfuzji w warunkach swobodnego pęcznienia.Panel C przedstawia przegląd rentgenowski odwracalnego krążka z dwiema kostnymi płytkami końcowymi przygotowanymi naszą metodą. Na górnej stronie obraz z mikroskopii fluorescencyjnej pokazuje miejsce, w którym płytka wzrostowa nie została usunięta. Można zauważyć, że dyfuzja czerwonego barwnika fluorescencyjnego jest blokowana przez obecność płytki wzrostowej oznaczonej jako gp, która działa zatem jako bariera dla barwienia głębszych warstw chrzęstnej płytki końcowej i odwracalnego krążka.Płytka wzrostowa znajduje się pomiędzy pierwotnym a wtórnym ośrodkiem kostnienia oznaczonym jako co. Jeśli płytka wzrostowa została pomyślnie usunięta, czerwony barwnik fluorescencyjny może swobodnie dyfundować do jądra miażdżystego oznaczonego jako np. Obrazy te demonstrują efekt oczyszczania podczas zabiegu płukania strumieniowego.Przekroje strzałkowe mają grubość około 100 mikronów, a kostne płytki graniczne mają grubość około 1,5 milimetra. W tym przypadku krążek międzykręgowy został poddany zabiegowi przemywania strumieniowego, a dyfuzja barwnika jest widoczna w całej płytce granicznej. Jednakże barwnik nie dyfunduje w stopniu znacznym po stronie kontrolnej, gdzie zabieg przemywania strumieniowego nie został wykonany.Tutaj widzimy obrazy z konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego (barwienie żywe/martwe), wykonane z segmentów krążka międzykręgowego bydlęcego przygotowanych metodą przemywania strumieniowego i utrzymywanych w warunkach swobodnego pęcznienia; procesy bieguna jądra są oznaczone jako np, wewnętrzny pierścień włóknisty jako IA, a zewnętrzny pierścień włóknisty jako oa. Zielone obszary to żywe komórki zabarwione octanem acetylometylu kalcjum, a czerwone obszary to jądra martwych komórek zabarwione akrydyną. Obrazy z tych samych obszarów pokazują, że po 14 dniach w warunkach swobodnego pęcznienia pozostaje wysoka liczba żywych komórek, co wskazuje zielona fluorescencja.Wykres ten przedstawia żywotność komórek obszaru jądra miażdżystego oraz pierścienia włóknistego dysków międzykręgowych w ciągu 21-dniowego okresu hodowli; wyniki przedstawiono jako średnią plus lub minus błąd standardowy średniej dla sześciu próbek. Różnice statystyczne między grupami badano przy użyciu nieparametrycznych testów sum rang Wilcoxona.W jądrze miażdżystym stwierdzono istotne różnice między dniem 21. a wszystkimi pozostałymi punktami czasowymi, natomiast w pierścieniu włóknistym istotne różnice wystąpiły między dniem siódmym a dniem zerowym. Po przeprowadzeniu tej procedury warunki hodowlane mogą zostać zmodyfikowane w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak wpływ obciążenia mechanicznego, czynników odżywczych lub czynników wzrostu na postęp tej degeneracji lub regeneracji. Nasz protokół przyspiesza technikę pozyskiwania próbek, dzięki czemu możliwe jest uzyskanie interpretowalnych segmentów krążka międzykręgowego do zastosowań w inżynierii tkankowej, pomiarów fizjologicznych lub mechanobiologii. W metodach tradycyjnych stosuje się analizę histologiczną, piłę taśmową lub technikę zużycia, które wymagają około dwóch godzin więcej niż nasz protokół.

preparation-intact-bovine-tail-intervertebral-discs-for-organ

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przygotowanie nietkniętych byczych międzykręgowych krążków ogonowych do hodowli narządowej

Eksplanty z układu dopaminergicznego śródmózgowia oraz prążkowia są wykorzystywane w teście z matrycą kolagenową do analizy in vitro rozwoju szlaków mezostriatalnych i striatonigralnych. W tym teście wzrost i prowadzenie aksonów mogą być manipulowane oraz kwantyfikowane. Metodę tę można również zmodyfikować w celu oceny innych obszarów lub sygnałów molekularnych.

Disekcja i hodowla eksplantów dopaminergicznych i prążkowiowych myszy w trójwymiarowych testach w matrycy kolagenowej

Ten film pokazuje tworzenie pierwotnych hodowli ludzkich kosmków łożyskowych i narządów dziesiętnych w warunkach ex vivo. Modele te doskonale nadają się do badania patogenezy na styku człowieka z matką i płodem.

Ustanowienie kultur kosmków i narządów dziesiętnych jako modeli ex vivo ludzkiej granicy matczyno-płodowej

Ten film demonstruje metodę tworzenia modelu infekcji w tkankach łożyska w celu badania rozprzestrzeniania się infekcji. Posiew narządów łożyska ex vivo jest zakażony Listeria monocytogenes, fakultatywnym pasożytem wewnątrzkomórkowym. Bakterie atakują trofoblasty kosmkowe (EVT), aby dostać się do tkanki łożyska, a następnie rozmnażają się do innych komórek poprzez rozprzestrzenianie się z komórki na komórkę.

Technika tworzenia modelu infekcji bakteryjnej w hodowli narządów ex vivo

Ten film demonstruje technikę hodowli krążków międzykręgowych bydła w bioreaktorach w celu opracowania trójwymiarowego modelu hodowli narządów. Do krążków międzykręgowych stosuje się określone pożywki pozbawione składników odżywczych i zwyrodnieniowe warunki ciśnienia, naśladując prozapalne i zwyrodnieniowe mikrośrodowisko obserwowane we wczesnym stadium choroby krążka międzykręgowego. Wysokość tarczy jest mierzona po zabiegu w celu przeanalizowania skutków niedoboru składników odżywczych i...

Generowanie modelu hodowli narządów prozapalnych w celu symulacji wczesnej choroby krążka międzykręgowego

Ten film pokazuje rozwój prozapalnego i zwyrodnieniowego modelu hodowli narządów we wczesnym stadium choroby krążka międzykręgowego (IVD) przy użyciu TNF-α. Przedstawiono w nim procedurę wstrzykiwania TNF-α do krążka międzykręgowego i wyjaśniono mechanizmy, za pomocą których TNF-α indukuje stan zapalny i degradację IVD.

Generowanie modelu hodowli narządów w celu symulacji wczesnego stadium choroby krążka międzykręgowego

Hodowla całego narządu krążka międzykręgowego (IVD) zachowuje natywną macierz zewnątrzkomórkową, fenotypy komórkowe i interakcje między komórką a macierzą. W tym miejscu opisujemy system hodowli IVD z wykorzystaniem mysich lędźwiowych i ogonowych IVD w ich funkcjonalnych jednostkach kręgosłupa oraz kilka zastosowań wykorzystujących ten system.

Model hodowli narządowej in vitro mysiego krążka międzykręgowego

Ten protokół przedstawia nowatorski eksperymentalny model prozapalnej, zwyrodnieniowej hodowli narządów bydlęcych do symulacji wczesnego stadium zwyrodnienia krążka międzykręgowego.

Prozapalny, zwyrodnieniowy model hodowli narządów symulujący wczesne stadium choroby krążka międzykręgowego.

Prezentujemy metodę badania przestrzennej organizacji chondrocytów w pierścieniu włóknistym krążka międzykręgowego za pomocą metody optycznego przekroju.

Przekrój optyczny i wizualizacja krążka międzykręgowego od rozwoju embrionalnego do zwyrodnienia

Niniejsze badanie przedstawia nowatorską technikę chirurgiczną implantacji biomimetycznej sztucznej dysku międzykręgowej (BioAID). Metoda zapewnia precyzyjne umieszczenie i stabilność, dążąc do przywrócenia funkcji kręgosłupa szyjnego za pomocą modelu kozy. Technika ta wykazuje obiecujące zastosowanie kliniczne zarówno u pacjentów, jak i u psów cierpiących na mielopatię kręgosłupa szyjnego.

Technika chirurgiczna wszczepienia biomimetycznej sztucznej tarczy międzykręgowej w model zwierzęcy kozy

W tym filmie prezentujemy techniki eksperymentalne wykorzystywane do wytwarzania elastycznych podłoży powleczonych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), które nadają się do hodowli komórkowej oraz pozwalają na zastosowanie mikroskopii sił trakcyjnych i obserwację wpływu sztywności ECM na zachowanie komórek.

Przygotowanie podatnych macierzy do ilościowego pomiaru skurczu komórkowego

Poznaj metodę izolacji nienaruszonych krążków międzykręgowych z ogona bydlęcego do hodowli narządów. Technika ta umożliwia badania mechanobiologii i inżynierii tkankowej.

Przygotowanie nienaruszonych krążków międzykręgowych z ogona bydlęcego do hodowli organowej

Przeglądaj więcej filmów