Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków

Celem tej procedury jest możliwość określenia proporcji komórek w różnych fazach cyklu komórkowego. Osiąga się to poprzez najpierw dodanie odczynnika znakującego proliferację komórek BRDU do żywotnej kultury komórkowej w celu włączenia do nowo zsyntetyzowanego DNA, a następnie barwienia, BRDU w komórkach, które włączyły odczynniki, a następnie DNA jest barwione jodkiem propidyny. Ostatnim krokiem jest ocena proporcji komórek w różnych fazach cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej.

Ostatecznie rozkład cyklu komórkowego populacji komórek eksperymentalnych można zobrazować za pomocą analizy cytometrii przepływowej komórek znakowanych BRDU. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak inkorporacja tri do tymianku i liczenie scyntylacyjne, jest to, że dzięki znakowaniu BRD można określić proporcję komórek w każdej fazie cyklu komórkowego. Wizualna demonstracja tego komunikatu ma kluczowe znaczenie, ponieważ inne zestawy do analizy cytometrycznej są trudne do wyjaśnienia bez towarzyszących obrazów różnych parametrów, które należy dostosować.

Procedurę zademonstrują dwaj doktoranci z mojego laboratorium, Matt Chii i ja Miri. Dodać BRDU w rozcieńczeniu od 1 do 1000 do eksperymentalnych kultur komórkowych, inkubować przez godzinę w celu zebrania komórek, odessać pożywkę, a następnie dokładnie umyć komórki dwukrotnie PBS w celu usunięcia wszelkich śladów pożywki. Tym razem za pomocą PBS uzupełnionego trzema milimolowymi EDTA, ponownie szybko przepłucz kultury, a następnie dokładnie odessaj roztwór P-B-S-E-D-T-A w celu odłączenia komórek.

Dodaj około 0,5 mililitra P-B-S-E-D-T-A do każdej sześciocentymetrowej płytki hodowlanej i inkubuj szalki w temperaturze 22 stopni Celsjusza przez około pięć minut. Następnie przenieś kultury komórkowe z każdej płytki do pojedynczych stożkowych probówek o pojemności 15 mililitrów. Teraz odwiruj komórki przy 500-krotności grawitacji przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie usuń supinat, a następnie ponownie zawieś komórki w 100 mikrolitrach PBS.

Na koniec napraw komórki, dodając kroplami pięć mililitrów 95% etanolu, jednocześnie wirując centryfuzję komórek pod 500-krotnością grawitacji przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ponownie usuń etanol i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze dwóch normalnych HCL zawierających 0,5% Triton X 100, dodając roztwór do komórek w sposób kroplowy podczas wirowania, a następnie inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po osadzeniu komórek należy ponownie zassać supernatant S, zachowując szczególną ostrożność, ponieważ na tym etapie komórki tworzą bardzo luźne osady.

Następnie delikatnie ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze 0,1 mola sodu i ponownie inkubować komórki. Teraz ponownie osadź komórki i tym razem inkubuj je w 0,5 mililitra roztworu przeciwciał zawierającego mysie przeciwciała anty BRDU, rozcieńczonego od jednego do 50 po ponownym opluwaniu komórek. Zawiesić tę osadkę w 50 mikrolitrach roztworu przeciwciała zawierającego sprzężone przeciwciała drugorzędowe królika anty-US ZI, rozcieńczone jeden do 25.

Następnie inkubuj komórki w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu komórek w ostatnim czasie, inkubuj je w 0,5 mililitra roztworu jodku propidyny i RNA w ciemności w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Na koniec przepuść strawiony roztwór komórkowy przez sitko do komórek, aby usunąć agregaty.

Następnie przenieś pojedyncze komórki do odpowiedniej probówki w celu pobrania próbki na cytometrze przepływowym w celu asynchronicznie proliferujących populacji komórek, takich jak pokazana. W tym przykładzie umieść bramkę wokół dwóch najliczniejszych pików na wykresie dyskryminującym dublet, aby wybrać zdarzenia z pojedynczej komórki do całej późniejszej analizy. Następnie przeanalizuj asynchronicznie rozmnażającą się próbkę kultury, aby posłużyła jako kontrola pozytywna do barwienia i ustawienia parametrów cytometru przepływowego.

Dostosuj czułość rurki fotopowielacza do barwienia jodkiem propidyny tak, aby dwa piki N i cztery N z pojedynczych komórek były wyśrodkowane na dowolnych jednostkach 200 i 400 na osi x. Następnie dostosuj czułość rurki powielacza zdjęć wykrywającej FXI tak, aby ujemne komórki FXI znajdowały się powyżej poziomów tła. Komórki BRDU dodatnie powinny być około 10 razy jaśniejsze, a oś x powinna być wyświetlana w skali logarytmicznej.

Pojedyncze zdarzenia, które są rejestrowane przez cytometr przepływowy, tworzą łuk w kształcie podkowy od jednej fazy G w lewym dolnym rogu do fazy S, a następnie z powrotem w dół do prawej dolnej fazy dla fazy G two M. Jak widać na tym reprezentatywnym rysunku, zbierz od 5 000 do 10 000 zdarzeń pojedynczych komórek, aby osiągnąć pożądany zakres zawartości DNA. Po zmierzeniu jodku propydu i zawartości BRDU, przypisz komórki do fazy G jeden s lub G dwie MPH z bramkami wokół dwóch ujemnych populacji BRDU wyśrodkowanych na 200 dla G jeden i 400 dla G dwa M. Uwzględnij wszystkie zdarzenia powyżej tych dwóch pól w jednej bramce do pomiaru fazy S, procent komórek w każdej bramce będzie reprezentował względną liczbę komórek w fazach G jeden s i G dwie M, jak pokazano na tym wykresie słupkowym dla poprzedniego wykresu rozrzutu.

Po wybarwieniu w celu uzyskania markera komórkowego będącego przedmiotem zainteresowania w tym przykładzie CD 20 odwiruj komórki pod ciśnieniem 500 razy większym niż grawitacja przez 10 minut w temperaturze 22 stopni Celsjusza, a następnie ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach PBS uzupełnionych 1% BSA. Po ponownym granulowaniu komórek pod 500-krotnością grawitacji przez pięć minut w temperaturze pokojowej użyj 0,5 mililitra roztworu jodku propidyny i RNA, aby nawodnić komórki. Następnie wybarwić i przetrawić komórki, jak pokazano, teraz bramkują dwa n i cztery końcowe piki pojedynczej komórki, a następnie dostosuj czułość rurki fotopowielacza do wykrywania FXI tak, aby niebarwione komórki znajdowały się powyżej poziomów tła.

Idealnie, dodatnie ogniwa CD 20 FXI będą od 10 do 100 razy intensywniej wybarwione niż tło. Ponownie oś x powinna być wyświetlana jako skala skali logarytmicznej. Na koniec wybierz komórki dodatnie CD 20, które są 10 razy jaśniejsze niż poziomy tła i z barwieniem jodkiem propydu od 200 do 400 do wyświetlenia w histogramie jodku propidyny w funkcji liczby komórek, jak pokazano na tym przykładowym rysunku, zbierz co najmniej 1000 dodatnich zdarzeń CD 20 dla każdej próbki, aby ograniczyć zmienność na tym rysunku.

Wyświetlana jest trójwymiarowa analiza cytometryczna cytometrii przepływowej komórek barwiących jodku propidyny i BRDU. Należy zauważyć, że komórki z dwiema zawartościami n i czterema NDNA są wyśrodkowane nad znacznikami 200 i 400 na skali osi X. W przypadku intensywności barwienia jodkiem propidyny, intensywność barwienia BRDU mierzy się w skali logarytmicznej.

Na osi Y zwróć uwagę na położenie bramek używanych do ilościowego oznaczania komórek w fazach G jeden s i G dwie M cyklu komórkowego. Względna proporcja komórek w każdej z bramek G jeden s i G dwie M z poprzedniego rysunku są pokazane tutaj. Tutaj propidyum, jodek i CD 20.

Pokazano barwienie z mieszaniny komórek, z których niektóre wykazują ektopową ekspresję CD 20 i PRB. Zauważ, że komórki z dwoma n i czterema NDNA, najliczniejszymi populacjami, są wyśrodkowane nad znacznikami 200 i 400 na osi x. Pozycja dodatniego chodu CD 20 wybiera komórki, które są zabarwione co najmniej 10 razy jaśniej niż tło.

Ten histogram przedstawia liczbę komórek w porównaniu z barwieniem jodkiem propidyny dla komórek ujemnych CD 20 z poprzedniego wykresu rozrzutu, które asynchronicznie proliferują na tym histogramie, pokazano komórki CD 20 dodatnie z wcześniejszego wykresu rozrzutu CD 20, które zostały wywołane do zatrzymania z ekspresją p rrb i zawierają komórki o głównie dwóch zawartości NDNA. Dane te pokazują, że zatrzymaną subpopulację można odróżnić od innych komórek w kulturze przy użyciu tej techniki barwienia. Na kolejnych trzech rysunkach przedstawiono dane z analizy cytometrii przepływowej retrowirusowej ekspresji zależnego od cyklin inhibitora kinazy P 27 KIP one w mysich fibroblastach embrionalnych.

Jodek propidyny, analiza BRDU została wykorzystana do pomiaru faz cyklu komórkowego w asynchronicznie proliferującej populacji komórek, które zostały transdukowane pustym wektorem retrowirusowym P babe, jak pokazano tutaj. Niewiele pozytywnych zdarzeń BRDU było widocznych w bramce fazy S w odpowiedzi na P 27. Zwróć też uwagę na większą intensywność zdarzeń w bramkach G jeden i G two M.

Podobnie, odsetek komórek w fazie S dla komórek wykazujących ekspresję P 27 jest dość niski, jak pokazano na tym rysunku. Ten rodzaj analizy okazał się bardzo skuteczny w charakteryzowaniu deficytów kontroli cyklu komórkowego w komórkach pochodzących z różnych szczepów myszy docelowych genowo. Na tych dwóch następnych rycinach nieuformowane komórki nabłonka pamięci traktowano cytokiną hamującą wzrost TGF beta one przez 24 godziny.

Jak pokazano na pierwszym rysunku, znakowanie BRDU w komórkach fazy S jest znacznie zmniejszone przez sygnalizację TGF beta one. Zwróć uwagę na akumulację komórek głównie w pierwszej fazie cyklu komórkowego G, jak widać w środkowym panelu. Kwantyfikacja różnych faz cyklu komórkowego potwierdza, że TGF beta one przede wszystkim hamuje proliferację w pierwszej fazie cyklu komórkowego, prowadząc do akumulacji w tej fazie.

W tej ostatniej serii analiz eksperymentalnych, z niedoborem PRB, dwie komórki SAS transfekowano wektorem ekspresyjnym CMV CD 20 i CMV RB lub CMV beta GAL jako kontrolą. Ten pierwszy rysunek pokazuje rozkład cyklu komórkowego komórek transfekowanych w kontroli ujemnej w porównaniu z ich dystrybucją po 72 godzinach ekspresji PRB. Zauważ, że prawie wyłączna obecność piku dwóch N w prawym panelu w tym końcowym dopasowaniu krzywej figury przez oprogramowanie wielocyklowe ujawniła, że komórki gromadziły się głównie w jednej fazie G po ekspresji PRB.

Podczas gdy populacje w fazach s i G dwie M były stosunkowo zubożone. Po opanowaniu technika ta może zostać zaadaptowana do badania innych markerów cyklu komórkowego, takich jak histony fosforylowe w milach na godzinę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić rozkład cyklu komórkowego populacji komórek.

Nie zapominaj, że dwa normalne kwasy solne to i propidyczny. Jodek jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym. Mogą być niebezpieczne w.

Podczas stosowania tych chemikaliów należy zawsze zachować środki ostrożności.