Name: Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Poznaj analizę pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków przy użyciu cytometrii przepływowej z zastosowaniem BRDU i jodku propidyny. Ta metoda umożliwia precyzyjne określenie proporcji komórek w fazach G1, S i G2/M.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować Kanadyjskim Instytutom Badań nad Zdrowiem (CIHR) oraz Kanadyjskiemu Towarzystwu Walki z Rakiem za finansowanie badań nad cyklem komórkowym w ich laboratorium. MJC jest laureatem stypendium MD/PhD przyznanego przez CIHR. MJC i MA są członkami programu szkoleniowego CaRTT.

1. Znakowanie i fiksacja komórek
<ol>
	<li>Na 1 godzinę przedy zbieraniem komórek dodać 1 μL odczynnika do znakowania proliferacji komórek (BrdU) na każdy mL pożywki hodowlanej (rozcieńczenie 1 do 1000). Czas znakowania może wymagać wydłużenia w przypadku wolniej rosnących komórek.</li>
	<li>Aby zebrać komórki, odessać pożywkę hodowlaną i dokładnie przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). Powtórzyć czynność, aby całkowicie usunąć pozostałości pożywki.</li>
	<li>Przemyć hodowle szybko po raz trzeci za pomocą PBS zawierającego 3mM EDTA, a następnie dokładnie odessać roztwór.</li>
	<li>Do każdej płytki dodać niewielką objętość PBS zawierającego 3mM EDTA (optymalnie 0,5 mL dla płytki o średnicy 6 cm). Inkubować w temperaturze 22°C przez około 5 minut w celu odlepienia komórek. Przenieść zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 mL.</li>
	<li>Wirować komórki przy 500 x g przez 5 minut do czasu powstania osadu, usunąć nadsącz i dokładnie resuspendować w 100 μL PBS.</li>
	<li>Utrwalić komórki, dodając po kroplach 5 mL 95% EtOH podczas mieszania na wortexie. Na tym etapie komórki można przechowywać w temperaturze 4°C przez co najmniej miesiąc.</li>
</ol>
2. Denaturacja i barwienie BrdU oraz DNA
<ol>
	<li>Odwiruj komórki przy 500 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy i usunąć 95% EtOH. Resuspenduj w 1 mL 2N HCl i 0,5% Tx-100, dodając roztwór kroplami podczas mieszania w wortexie. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Odwiruj w ten sam sposób, co w sekcji 2.1, i ostrożnie odessij nadosad, ponieważ na tym etapie komórki tworzą bardzo luźny osad. Delikatnie resuspenduj w 1 mL 0,1M NaB4O7 (pH 8,5) i inkubuj przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwiruj komórki zgodnie z opisem w sekcji 2.1 i resuspenduj w 0,5 mL roztworu przeciwciał (PBS zawierający 1% BSA i 0,2% Tween-20) z przeciwciałami mysimi anty-BrdU w rozcieńczeniu 1 do 50. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Ponownie odwiruj komórki i resuspenduj w 50 mL roztworu przeciwciał zawierającego królicze przeciwciała wtórne anty-mysie sprzężone z FITC w rozcieńczeniu 1 do 25. Inkubuj przez 30 minut na blacie laboratoryjnym, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Odwiruj komórki po raz ostatni i resuspenduj w 0,5 mL roztworu jodku propidyny i RNazy (roztwór PI-RNAse, PBS z 1% BSA, 10 mg/mL jodku propidyny, 0,25 mg/mL RNazy A) i inkubuj w ciemności w temperaturze 37°C przez 30 minut. Alternatywnie RNA można trawić przez noc w temperaturze 4°C w ciemności.</li>
	<li>Przepuść roztwór przez sito do komórek, aby usunąć agregaty, i zbierz pojedyncze komórki do odpowiedniej probówki w celu analizy na cytometrze przepływowym. Próbki powinny być ponownie chronione przed bezpośrednią ekspozycją na światło.</li>
</ol>
3. Analiza metodą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Komórki należy analizować za pomocą standardowego cytometru przepływowego, który umożliwia odróżnienie dubletów (dwóch komórek przechodzących przez celę przepływową jako jedna) i posiada odpowiednią zdolność detekcji jodku propidyny oraz FITC. Pojedyncze komórki w tej aplikacji cytometrii przepływowej można wykryć poprzez bramkowanie zdarzeń na podstawie populacji rozproszenia przedniego (forward scatter) i bocznego (side scatter) oraz wykorzystując właściwości barwienia DNA jodkiem propidyny. Wygląd wykresu kropkowego służącego do dyskryminacji dubletów różni się w zależności od cytometru przepływowego i zależy od właściwości barwienia jodkiem propidyny; w celu konfiguracji dyskryminatora dubletów w analizie należy skonsultować się z lokalnym ośrodkiem cytometrii przepływowej. Zasadniczo, w asynchronicznie proliferującej populacji komórek, pojedyncze komórki stanowią zazwyczaj dwa najliczniejsze piki (DNA 2N i 4N) na wykresie dyskryminacji dubletów i wokół nich należy wyznaczyć bramkę. Pozwoli to na zaznaczenie zdarzeń pojedynczych komórek, które będą wykorzystywane we wszystkich poniższych analizach.</li>
	<li>Pierwszą analizowaną próbką powinna być asynchronicznie proliferująca hodowla, służąca jako kontrola pozytywna dla barwienia i konfiguracji cytometru przepływowego. Należy dostosować czułość fotopowielaczy dla barwienia jodkiem propidyny w taki sposób, aby piki 2N i 4N dla pojedynczych komórek były wyśrodkowane na wartościach 200 i 400 (jednostki arbitralne) na osi X. Często barwimy dużą ilość takich komórek, aby upewnić się, że wszystkie parametry cytometru przepływowego zostały odpowiednio dostrojone bez zużycia całej tej próbki. Kontrola pozytywna jest również pomocna dla nowych użytkowników w zapoznaniu się z obsługą cytometru przepływowego.</li>
	<li>Należy dostosować czułość fotopowielacza dla detekcji FITC tak, aby populacje G1 i G2/M znajdowały się powyżej poziomu tła. Komórki pozytywne pod kątem BrdU powinny być około 10 razy jaśniejsze, a oś Y powinna być wyświetlana w skali logarytmicznej. Czasami pomocne jest uwzględnienie kontroli negatywnej dla barwienia BrdU (poprzez zastąpienie przeciwciał anty-BrdU niespecyficznym IgG w kroku 2.3 powyżej), aby wyraźnie odróżnić komórki zabarwione pozytywnie.</li>
	<li>Należy dostosować kompensację między jodkiem propidyny a FITC w taki sposób, aby pojedyncze zdarzenia zarejestrowane przez cytometr przepływowy tworzyły łuk w kształcie podkowy, od G1 w lewym dolnym rogu, przez fazę S, aż do prawego dolnego rogu dla G2/M. Zasady i zastosowanie cytometrii przepływowej oraz odniesienia do konkretnych aplikacji zostały szerzej omówione w następującej literaturze2.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Dla każdej próbki należy zebrać od 5 000 do 10 000 zdarzeń pojedynczych komórek w pożądanym zakresie zawartości DNA, aby mieć pewność, że populacja komórek w hodowli została dokładnie przebadana.</li>
	<li>Po pomiarze zawartości jodu propidyniowego i BrdU komórki muszą zostać przypisane do faz G1, S lub G2/M. Należy to zrobić poprzez wyznaczenie bram wokół dwóch populacji negatywnych pod kątem BrdU, wycentrowanych na wartościach 200 i 400 (odpowiednio dla G1 i G2/M). Wszystko powyżej tych obszarów powinno zostać objęte jedną bramą mierzącą fazę S (Rys. 1A). Procent komórek w każdej bramie reprezentuje względną liczbę komórek w fazach G1, S i G2/M (Rys. 1B).</li>
</ol>
5. Alternatywny protokół analizy cyklu komórkowego w mieszanej populacji komórek
<ol>
	<li>Ten alternatywny protokół jest najbardziej przydatny w sytuacjach, gdy transfekcja wektorów ekspresyjnych rutynowo skutkuje niskim odsetkiem komórek wykazujących ekspresję interesującego produktu genu lub gdy selekcja czystej populacji komórek za pomocą leków jest niepraktyczna. Prowadzi to do sytuacji, w której stosunkowo niewielka proporcja interesujących komórek jest zanieczyszczona dużą populacją komórek nietransdukowanych. W takim przypadku należy przeprowadzić ko-transfekcję plazmidów ekspresujących interesujący gen lub shRNA wraz z plazmidem ekspresującym marker do wykrywania komórek transfekowanych za pomocą cytometrii przepływowej, taki jak zakotwiczony w błonie GFP3 lub obcy marker powierzchni komórkowej, np. CD194 lub CD205.</li>
	<li>Na potrzeby niniejszego protokołu jako przykład posłuży barwienie CD20, jednak barwienie CD19 przebiega w sposób niemal identyczny. W przypadku transfekcji CD20 nie ma potrzeby znakowania BrdU; należy po prostu zebrać komórki zgodnie z opisem w krokach od 1.2 do 1.5 powyżej i zabarwić je, dodając 20 μL przeciwciał anty-CD20 koniugowanych z FITC do komórek w temperaturze 4°C przez 20 minut w ciemności. Komórki należy utrwalić zgodnie z opisem w kroku 1.6. Komórki można ponownie przechowywać przez co najmniej miesiąc w temperaturze 4°C w ciemności. W przypadku wykrywania GFP należy pominąć etap barwienia przeciwciałami, a następnie utrwalić i przechowywać komórki zgodnie z opisem.</li>
	<li>Rehydratyzować komórki poprzez wirowanie w wirówce przy 500 x g przez 5 minut i ponowne zawieszenie w 5 mL PBS zawierającego 1% BSA.</li>
	<li>Ponownie odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut i zawiesić je w 0,5 mL roztworu jodku propidyny i RNazy, zgodnie z opisem w sekcji 2.5 powyżej.</li>
	<li>Następnie postępować zgodnie z instrukcjami przygotowania komórek w punkcie 2.6 oraz instrukcjami analizy w punktach 3.1 i 3.2.</li>
	<li>Dostosować czułość fotopowielacza dla detekcji FITC w taki sposób, aby niezabarwione komórki znajdowały się powyżej tła. Idealnie komórki CD20-FITC dodatnie powinny być od 10X do 100X intensywniej zabarwione niż tło, a oś Y tego wykresu powinna być przedstawiona w skali logarytmicznej (Rys. 2A). Do wyświetlenia na histogramie jodku propidyny względem liczby komórek, jak pokazano na Rys. 2C, należy wybrać komórki CD20 dodatnie, które są 10X jaśniejsze od tła (i mają barwienie jodkiem propidyny między 200 a 400). Dla linii komórkowych eksponujących markery, które łatwo barwią się intensywnie (tj. 10X do 100X powyżej tła), próg odcięcia dla CD20 dodatnich należy ustawić na poziomie 10X tła. Włączenie słabiej zabarwionych komórek zwiększa zmienność w tych eksperymentach, prawdopodobnie dlatego, że interesujący gen jest w tych komórkach również słabo ekspresowany. Dla linii komórkowych, które dają jedynie słabo zabarwione komórki CD20 dodatnie (tj. mniej niż 10X tła), wyznaczenie progu odcięcia należy przeprowadzić z wykorzystaniem kontroli negatywnej składającej się z zabarwionych na CD20, nietransfekowanych komórek.</li>
	<li>Dla każdej próbki należy zebrać co najmniej 1000 zdarzeń CD20 dodatnich. Eksperymenty z liczbą zdarzeń mniejszą niż 1000 będą wykazywać wysoką zmienność. Pakiety oprogramowania takie jak ModFit LT (Verity Software), Multi Cycle AV (Phoenix Flow Systems) oraz Flow Jo (Tree Star) wykorzystują matematyczne oszacowania populacji G1, S i G2/M, które wpływają na kształt krzywej na histogramach, takich jak te przedstawione na Rys. 2B i C.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Przedstawiamy trzy przykłady eksperymentalnych analiz cyklu komórkowego z wykorzystaniem naszych metod. Pierwszy z nich wykorzystuje retrowirusową ekspresję inhibitora kinazy zależnej od cyklin p27KIP1 w zarodkowych fibroblastach mysich. Dwadzieścia cztery godziny po zakończeniu selekcji lekiem w celu wyłonienia zainfekowanych wirusem komórek, komórki poddano pulsowemu znakowaniu BrdU przez jedną godzinę. W tym eksperymencie ektopowa ekspresja inhibitora służy do zatrzymania proliferacji komórek (Ryc. 3A i B). Jak pokazano na Ryc. 3B, w odpowiedzi na p27 w bramce fazy S widoczna jest niewielka liczba zdarzeń BrdU-dodatnich. Podobnie, procent komórek w fazie S dla komórek wykazujących ekspresję p27 jest bardzo niski, co przedstawiono na Ryc. 3C. Ten rodzaj analizy okazał się bardzo skuteczny w charakteryzowaniu defektów kontroli cyklu komórkowego w komórkach pochodzących z różnych szczepów myszy z celowanym nokautem genów6, 7, 8.
W drugim eksperymencie nietransformowane komórki nabłonka gruczołu mlekowego (MCF10A) poddano działaniu cytokiny hamującej wzrost, czynnika wzrostu TGF-beta 1 (TGF-β1), przez 24 godziny. Bezpośrednio przed zebraniem komórki znakowano BrdU przez cztery godziny. Jak pokazano na Ryc. 4, znakowanie BrdU w komórkach w fazie S jest znacznie ograniczone przez sygnalizację TGF-β1; specyficzność naszego barwienia została również potwierdzona za pomocą negatywnej kontroli z użyciem IgG (Ryc. 4C). Ilościowe określenie różnych faz cyklu komórkowego potwierdza, że TGF-β1 hamuje przede wszystkim proliferację w fazie G1 cyklu komórkowego, co prowadzi do akumulacji komórek w tej fazie.
W naszym ostatnim przykładzie komórki SaOS-2 z niedoborem pRB zostały przetransfekowane wektorem ekspresyjnym CMV-CD20 oraz albo CMV-RB, albo CMV-β-Gal jako kontrolą. Trzy dni po transfekcji komórki zostały zebrane, zabarwione i utrwalone. Analizę cytometryczną tych komórek przedstawiono na Rys. 5. Przedstawiono na nim rozkład cyklu komórkowego w komórkach przetransfekowanych kontrolą negatywną (Rys. 5A) w porównaniu z rozkładem po 72 godzinach ekspresji pRB (Rys. 5B). Po dopasowaniu krzywej za pomocą oprogramowania Multi Cycle, bezpośrednie porównanie proporcji faz cyklu komórkowego przedstawiono na Rys. 5C. Wykazuje to akumulację komórek w fazie G1 po ekspresji pRB oraz względne zmniejszenie liczby komórek w fazach S i G2/M. Wykorzystaliśmy warianty tego testu do szeroko zakrojonych badań nad mechanizmami zatrzymania w fazie G19, 10, 11, 12, 13.
Przykłady te demonstrują, w jaki sposób można mierzyć kontrolę cyklu komórkowego w odpowiedzi na różne bodźce lub manipulacje komórkowe. Podejście to może zatem zostać dostosowane do wielu zastosowań wymagających pomiaru fazy cyklu komórkowego w eksperymentach z wykorzystaniem hodowli komórkowych.
<img alt="Analiza cyklu komórkowego: wykres kropkowy z BrdU-FITC i jodkiem propidyny, wykres słupkowy procentowego udziału faz komórkowych." src="/files/ftp_upload/3491/3491fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Ilościowe określenie faz cyklu komórkowego za pomocą połączonego barwienia jodkiem propidyny i BrdU (PI-BrdU). (A) Ten panel przedstawia trójwymiarową cytometrię przepływową komórek barwionych jodkiem propidyny i BrdU. Należy zauważyć, że komórki o zawartości DNA 2N i 4N są wyśrodkowane nad znacznikami 200 i 400 na skali osi X dla intensywności barwienia jodkiem propidyny. Intensywność barwienia BrdU jest mierzona w skali logarytmicznej na osi Y. Zwróć uwagę na położenie bram użytych do ilościowego oznaczenia komórek w fazach G1, S i G2/M cyklu komórkowego. (B) Na tym wykresie przedstawiono względną proporcję komórek w każdej z bram G1, S i G2/M z panelu A.
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej; analiza transfekcji CD20, pRB; wykres liczby komórek względem jodku propidium." src="/files/ftp_upload/3491/3491fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Ilościowe oznaczenie faz cyklu komórkowego w wybranych komórkach przy użyciu jodku propidium i markera powierzchniowego CD20. (A) Ten panel przedstawia barwienie jodkiem propidium i CD20 dla mieszaniny komórek, z których niektóre ektopowo ekspresują CD20 i pRB. Należy zauważyć, że komórki z zawartością DNA 2N i 4N (najliczniejsze populacje) są wycentrowane nad znacznikami 200 i 400 na osi X. Położenie bramki CD20 + wybiera komórki, które są zabarwione co najmniej 10X jaśniej niż tło. (B) Przedstawiono wykres liczby komórek względem intensywności barwienia jodkiem propidium dla komórek CD20-ujemnych z panelu A, które proliferują asynchronicznie. (C) Analogiczny wykres przedstawiono dla komórek CD20-dodatnich z panelu A, u których wywołano zatrzymanie cyklu poprzez ekspresję pRB i które zawierają głównie komórki o treści DNA 2N. Dowodzi to, że przy użyciu tej techniki barwienia można odróżnić zatrzymaną subpopulację od pozostałych komórek w tej hodowli.
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej; BrdU-FITC vs jodek propidyny; analiza cyklu komórkowego; porównanie danych." src="/files/ftp_upload/3491/3491fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Hamowanie proliferacji komórek przez p27KIP1. (A) Analiza PI-BrdU służy do pomiaru faz cyklu komórkowego w asynchronicznie proliferującej populacji komórek transdukowanych pustym wektorem retrowirusowym pBABE. (B) Analogiczna analiza komórek transdukowanych pBABE-p27. Zwróć uwagę na brak komórek w fazie S oraz większą intensywność zdarzeń w bramkach G1 i G2/M. (C) Ilościowe oznaczenie komórek w poszczególnych fazach cyklu komórkowego w asynchronicznie proliferujących komórkach kontrolnych oraz komórkach wykazujących ekspresję p27.
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej z BrdU-FITC, jodkiem propidyny; analiza cyklu komórkowego komórek niepoddanych działaniu czynnika oraz TGF-β1." src="/files/ftp_upload/3491/3491fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Hamowanie proliferacji komórek przez TGF-β1 (A) Analiza PI-BrdU asynchronicznie proliferujących komórek MCF10A. (B) Analiza komórek traktowanych 100 pM TGF-β1 przez 24 godziny. Zwróć uwagę na akumulację komórek głównie w fazie G1 cyklu komórkowego. (C) Walidacja barwienia BrdU poprzez zastąpienie przeciwciała pierwszorzędowego anty-BrdU nieswoistą kontrolą IgG w asynchronicznie proliferujących komórkach. (D) Graficzna kwantyfikacja poszczególnych faz cyklu komórkowego z paneli A i B.
<img alt="Wykresy analizy cyklu komórkowego pokazujące barwienie jodkiem propidyny dla CD20+ β-Gal i pRB, liczbę komórek, fazy." src="/files/ftp_upload/3491/3491fig5.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Hamowanie proliferacji komórek przez pRB. (A) Przedstawiono liczbę komórek w stosunku do barwienia jodkiem propidyny w komórkach transfekowanych CD20 i ß-gal. Jest to istotna kontrola, ponieważ transfekcja może częściowo synchronizować komórki, sprawiając, że populacja nietransfekowana (komórki CD20-) staje się niewłaściwą kontrolą dla transfekowanej subpopulacji. Komórki transfekowane muszą być porównywane z innymi komórkami transfekowanymi w analogiczny sposób. (B) Wykres liczby komórek w stosunku do barwienia jodkiem propidyny dla komórek transfekowanych CD20 i pRB. Zwróć uwagę na niemal wyłączną obecność piku 2N. (C) Graficzna reprezentacja proporcji faz cyklu komórkowego wyznaczonych z A i B przy użyciu metod dopasowania krzywych w oprogramowaniu Multi Cycle.

<ol><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 5573-5573 (1983).</li>
<li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: an introduction.</a> Methods. Mol. Biol. 699, 1-1 (2011).</li>
<li>Kalejta, R. F., Brideau, A. D., Banfield, B. W., Beavis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integral+membrane+green+fluorescent+protein+marker%2C+Us9-GFP%2C+is+quantitatively+retained+in+cells+during+propidium+iodide-based+cell+cycle+analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">An integral membrane green fluorescent protein marker, Us9-GFP, is quantitatively retained in cells during propidium iodide-based cell cycle analysis by flow cytometry.</a> J. Exp. Cell. Res. 248, 322-322 (1999).</li>
<li>Qin, X. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+E2F-1+is+a+downstream+target+of+RB+action%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor E2F-1 is a downstream target of RB action.</a> Molecular and Cellular Biology. 15, 742-742 (1995).</li>
<li>van den Heuvel, S., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+cyclin-dependent+kinases+in+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control.</a> Science. 262, 2050-2050 ( ).</li>
<li>Henley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cancer+derived+mutation+in+the+retinoblastoma+gene+with+a+distinct+defect+for+LXCXE+dependent+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell.+Int%22%5BJournal%5D)">A cancer derived mutation in the retinoblastoma gene with a distinct defect for LXCXE dependent interactions.</a> Cancer Cell. Int. 10, 8-8 (2010).</li>
<li>Francis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+connection+between+pRB+and+transforming+growth+factor+beta+in+growth+inhibition+and+mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A functional connection between pRB and transforming growth factor beta in growth inhibition and mammary gland development.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 4455-4455 (2009).</li>
<li>Isaac, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein+regulates+pericentric+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein regulates pericentric heterochromatin.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 3659-3659 (2006).</li>
<li>Julian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+E2F1-specific+binding+domain+in+pRB+and+its+implications+for+apoptotic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Characterization of an E2F1-specific binding domain in pRB and its implications for apoptotic regulation.</a> Oncogene. 27, 1572-1572 (2008).</li>
<li>Hirschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overlapping+kinase+and+phosphatase+docking+site+regulates+activity+of+the+retinoblastoma+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An overlapping kinase and phosphatase docking site regulates activity of the retinoblastoma protein.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1051-1051 (2010).</li>
<li>Dick, F. A., Dyson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pRB+contains+an+E2F1-specific+binding+domain+that+allows+E2F1-induced+apoptosis+to+be+regulated+separately+from+other+E2F+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">pRB contains an E2F1-specific binding domain that allows E2F1-induced apoptosis to be regulated separately from other E2F activities.</a> Mol. Cell. 12, 639-639 (2003).</li>
<li>Dick, F. A., Sailhamer, E., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+of+the+pRB+pocket+reveals+that+cell+cycle+arrest+functions+are+separable+from+binding+to+viral+oncoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis of the pRB pocket reveals that cell cycle arrest functions are separable from binding to viral oncoproteins.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 3715-3715 (2000).</li>
<li>Dick, F. A., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+regions+of+the+pRB+pocket+domain+affect+its+inactivation+by+human+papillomavirus+E7+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Three regions of the pRB pocket domain affect its inactivation by human papillomavirus E7 proteins.</a> J. Virol. 76, 6224-6224 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

W naszym doświadczeniu sukces w stosowaniu tych technik zależy od kilku kluczowych kontroli i warunków eksperymentalnych. Jedną z nich jest ustalenie kontroli asynchronicznie proliferujących do wykorzystania w tych doświadczeniach. Kontrola ta służy trzem istotnym celom. Po pierwsze, zapewnia ona, że warunki hodowli zastosowane dla wszystkich próbek eksperymentalnych są odpowiednie do podtrzymania ciągłej proliferacji w przypadku braku traktowania. Próbka ta służy również jako kontrola pozytywna dla metodologii barwienia, aby upewnić się, że komórki BrdU-dodatnie lub CD20-dodatnie mogą zostać wykryte, gdy są obecne. Wreszcie, próbka ta jest wykorzystywana do kalibracji cytometru przepływowego. Próbkę kontrolną tę można wykorzystać do dostrojenia intensywności barwienia jodkiem propidium, aby wykryć komórki 2N i 4N odpowiednio przy wartościach 200 i 400. Ponadto czułość detekcji BrdU lub CD20 można dostosować tak, aby sygnały negatywne i pozytywne były wycentrowane, jak pokazano na Rysunkach 1A i 2A. Gdy wszystkie próbki mają podobne stężenie komórek w roztworze PI-RNase, konieczność wprowadzania korekt w ustawieniach cytometru podczas analizy kolejnych próbek jest minimalna. Jest to istotne z powodów przedstawionych na Rys. 4B i 5B, gdzie silna akumulacja w fazie G1 tworzy w zasadzie pojedynczy pik G1, który mógłby zostać błędnie zinterpretowany jako faza G2/M.
Reprezentatywne eksperymenty wskazują również na inne istotne kwestie. Po pierwsze, demonstrują one, że pobieranie i znakowanie BrdU mogą różnić się w zależności od typu komórek. Z tego powodu ważne jest empiryczne określenie długości impulsu oraz warunków barwienia niezbędnych do odpowiedniego wykrycia komórek w fazie S. Generalnie typy komórek, które w hodowli ulegają podwojeniu w ciągu 24 godzin lub krócej, mogą zostać znakowane BrdU w ciągu godziny. Wolniej rosnące typy komórek mogą wymagać dłuższych impulsów oraz modyfikacji warunków i czasu barwienia przeciwciałami. Komórki MCF10A są w tym względzie doskonałym przykładem, ponieważ były one znakowane BrdU przez cztery godziny i barwione dwukrotnym standardowym stężeniem przeciwciał przez cztery razy dłuższy czas. Badacze powinni uważać, aby czas znakowania BrdU nie przekroczył 6 godzin, nawet w przypadku bardzo wolno rosnących komórek, ponieważ może to błędnie doprowadzić do włączenia komórek w fazie G2/M do populacji w fazie S. Po drugie, porównując efekty ekspresji p27KIP1 z efektami TGF-β1, wyraźnie widać, że p27 może indukować akumulację w fazie G1 lub G2/M, podczas gdy sygnalizacja TGF-β1 indukuje zatrzymanie w fazie G1. Tradycyjne metody wykrywania proliferacji, takie jak wbudowywanie 3H-tymidyny i liczenie scyntylacyjne, nie są w stanie rozróżnić tych możliwości.
W naszym alternatywnym protokole demonstrujemy wykrywanie subpopulacji komórek w większej populacji nietransfekowanej. Ważne jest, aby empirycznie określić najbardziej odpowiedni reporter do wykrywania komórek transfekowanych. Z naszego doświadczenia wynika, że niektóre typy komórek słabo eksponują markery powierzchniowe lub mogą&prime;nie transportują ich prawidłowo do błony plazmatycznej, co skutkuje brakiem możliwości wykrycia komórek transfektowanych. Podobnie nie wszystkie komórki tolerują formę GFP związaną z błoną. Wybór najodpowiedniejszego reporteru powinien nastąpić po ocenie wydajności transfekcji reportera oraz względnej intensywności ekspresji w porównaniu z nietransfektowanymi kontrolami. W idealnym przypadku heterologiczna ekspresja tych cząsteczek będzie dobrze tolerowana, co sugeruje, że markery mają niewielki lub żaden wpływ na rozkład cyklu komórkowego.
Jednym z ograniczeń tego rodzaju podejść w cytometrii przepływowej jest fakt, że pozwalają one jedynie na ustalenie względnej liczebności poszczególnych faz cyklu komórkowego w stosunku do siebie nawzajem. Z tego powodu nie jest jednoznaczne, czy ekspresja p27 przedstawiona na rysunku 3 rzeczywiście indukuje zatrzymanie w fazach G1 i G2/M, czy jedynie spowalnia przejście przez te fazy w porównaniu z fazą S. Możliwości te można badać dalej, traktując równoległą próbkę komórek inhibitorem mitozy, takim jak nocodazole, lub inhibitorem G1/S, takim jak afidikolina. Ponieważ leki te wywołują dominujące zatrzymanie odpowiednio w fazie M lub wczesnej fazie S, komórki proliferujące powoli będą gromadzić się w punkcie zatrzymania indukowanego przez lek. Na przykład komórki zatrzymane w fazie G1 z powodu ekspresji pRB pozostaną w fazie G1 mimo zastosowania nocodazole, podczas gdy komórki kontrolne będą gromadzić się w fazie M13.
Wszystkie te podejścia eksperymentalne razem stanowią elastyczną metodologię, którą można zastosować w szerokim zakresie zagadnień badawczych dotyczących cyklu komórkowego ssaków. Pozwalają one na łatwe wykrywanie zmian w przebiegu cyklu komórkowego oraz ilościowe określanie różnic w porównaniu z grupami kontrolnymi.

<table><tbody><tr><td>Odczynik do znakowania proliferacji komórek</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN201</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-BrdU</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-mysie koniugowane z FITC</td><td>Vector Laboratories</td><td>FI-2000</td><td></td></tr><tr><td>Filtry do szczepów komórkowych</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-CD20</td><td>BD Biosciences</td><td>347673</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Multi Cycle</td><td>Phoenix Flow Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Regulacja proliferacji komórek ma kluczowe znaczenie dla morfogenezy tkanek podczas rozwoju organizmów wielokomórkowych. Co więcej, utrata kontroli nad proliferacją komórek leży u podstaw patologii takich chorób jak nowotwory. W związku z tym istnieje ogromna potrzeba możliwości badania proliferacji komórek i ilościowego określania proporcji komórek w każdej fazie cyklu komórkowego. Równie istotne jest jednoznaczne zidentyfikowanie komórek replikujących swoje DNA w obrębie większej populacji. Ponieważ komórka&prime;Ponieważ decyzja o proliferacji zapada w fazie G1 bezpośrednio przed rozpoczęciem syntezy DNA i przejściem przez pozostałe etapy cyklu komórkowego, detekcja syntezy DNA na tym etapie pozwala na jednoznaczne określenie statusu regulacji wzrostu w eksperymentach z kulturami komórkowymi.
Zawartość DNA w komórkach można łatwo określić ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej komórek barwionych jodkiem propidyny, będącym fluorescencyjnym barwnikiem interkalującym DNA. Podobnie, aktywną syntezę DNA można określić ilościowo poprzez hodowlę komórek w obecności radioaktywnej tymidyny, zebranie komórek i pomiar wbudowania radioaktywności w frakcję nierozpuszczalną w kwasach. Posiadamy duże doświadczenie w analizie cyklu komórkowego i rekomendujemy inne podejście. Badamy proliferację komórek za pomocą barwienia bromodeoksyurydyną/fluorodeoksyurydyną (w skrócie BrdU), które wykrywa wbudowanie tych analogów tyminy w nowo zsyntetyzowane DNA. Znakowanie i barwienie komórek BrdU w połączeniu z barwieniem całkowitego DNA jodkiem propidyny oraz analizą za pomocą cytometrii przepływowej1 zapewnia najdokładniejszy pomiar liczby komórek w różnych fazach cyklu komórkowego. Jest to nasza preferowana metoda, ponieważ łączy wykrywanie aktywnej syntezy DNA, poprzez barwienie BrdU z użyciem przeciwciał, z pomiarem całkowitej zawartości DNA za pomocą jodku propidyny. Pozwala to na wyraźne oddzielenie komórek w fazie G1 od wczesnej fazy S, lub późnej fazy S od fazy G2/M. Ponadto podejście to może być wykorzystane do badania wpływu wielu różnych bodźców komórkowych i czynników farmakologicznych na regulację progresji przez te różne fazy cyklu komórkowego.
W niniejszym raporcie opisujemy metody znakowania i barwienia hodowli komórkowych oraz ich analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Przedstawiamy również przykłady eksperymentalne pokazujące, w jaki sposób metoda ta może być wykorzystana do pomiaru efektów sygnałów hamujących wzrost pochodzących z cytokin, takich jak TGF-β1, oraz inhibitorów proliferacji, takich jak inhibitor kinazy zależnej od cyklin p27KIP1. Uwzględniliśmy także alternatywny protokół umożliwiający analizę pozycji w cyklu komórkowym subpopulacji komórek w obrębie większej hodowli5. W tym przypadku demonstrujemy, jak wykryć zatrzymanie cyklu komórkowego w komórkach transfekowanych genem retinoblastomy, nawet gdy stanowią one niewielką mniejszość w porównaniu do komórek nietransfekowanych w tej samej hodowli. Przykłady te ilustrują liczne sposoby wykorzystania i adaptacji barwienia DNA oraz cytometrii przepływowej do badania fundamentalnych kwestii kontroli cyklu komórkowego ssaków.

Wyznaczanie pozycji w cyklu komórkowym populacji komórek lub zrozumienie wpływu sygnałów na proliferację można łatwo zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, stosując niniejszy protokół. Przedstawiamy proste podejście eksperymentalne do barwienia komórek i ilościowego określania ich pozycji w cyklu komórkowym.

Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków

Regulacja proliferacji komórek ma kluczowe znaczenie dla morfogenezy tkanek podczas rozwoju organizmów wielokomórkowych. Ponadto utrata kontroli nad...

Celem niniejszej procedury jest umożliwienie określenia proporcji komórek w różnych fazach cyklu komórkowego. Osiąga się to poprzez wprowadzenie odczynnika znakującego proliferację komórek BRDU do żywej hodowli komórkowej w celu jego wbudowania w nowo syntetyzowane DNA, a następnie zabarwienie BRDU w komórkach, które wbudowały odczynniki; po tym DNA jest barwione jodkiem propidium. Ostatnim krokiem jest ocena proporcji komórek w różnych fazach cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej.Ostatecznie rozkład cyklu komórkowego w populacji komórek doświadczalnych można zwizualizować za pomocą analizy cytometrycznej komórek znakowanych BRDU. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak wbudowywanie tymidyny i liczniki scyntylacyjne, jest możliwość określenia proporcji komórek w każdej fazie cyklu komórkowego. Wizualna prezentacja tego zagadnienia jest kluczowa, ponieważ ustawienia analizy cytometrycznej są trudne do wyjaśnienia bez towarzyszących obrazów różnych parametrów, które wymagają dostrojenia.Procedurę zademonstrują dwaj studenci studiów magisterskich z mojego laboratorium, Matt Chii oraz ja, Miri. Do eksperymentalnych kultur komórkowych dodać BrdU w rozcieńczeniu 1:1000, inkubować przez jedną godzinę, a następnie zebrać komórki, odsysając pożywkę hodowlaną i dokładnie płucząc komórki dwukrotnie buforem PBS, aby usunąć wszelkie pozostałości pożywki. Tym razem, używając PBS uzupełnionego o 3 mM EDTA, szybko wypłukać kultury jeszcze raz, a następnie dokładnie odessać roztwór PBS-EDTA, aby odlepić komórki.Dodaj około 0,5 ml PBSE-EDTA do każdej sześciocentymetrowej płytki hodowlanej i inkubuj płytki w temperaturze 22 °C przez około pięć minut. Następnie przenieś hodowle komórkowe z każdej płytki do osobnych stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Odwiruj komórki przy 500 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie usuń nadsącz i resuspenderuj komórki w 100 µl PBS.Na koniec utrwalone komórki, dodając kroplami 5 ml 95% etanolu podczas mieszania w wortexie, a następnie odwiruj komórki przy 500 ×g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie usuń etanol i resuspenduj osad w 1 ml 2N HCl zawierającego 0,5% Triton X 100, dodając roztwór do komórek kroplami podczas mieszania w wortexie, a następnie inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po ponownym odwirowaniu komórek odessaj supernatant, zachowując szczególną ostrożność, ponieważ na tym etapie komórki tworzą bardzo luźny osad.Następnie delikatnie resuspenduj osad w 1 ml 0,1 M tetraboranu sodu i ponownie inkubuj komórki. Teraz ponownie odwiruj komórki i tym razem inkubuj je w 0,5 ml roztworu przeciwciał zawierającego przeciwciała mysie anty-BRDU rozcieńczone 1:50. Po ponownym odwirowaniu komórek resuspenduj osad w 50 µl roztworu przeciwciał zawierającego koniugowane wtórne przeciwciała królicze anty-US ZI rozcieńczone 1:25.Następnie inkubuj komórki w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po ostatnim odwirowaniu komórek inkubuj je w 0,5 ml roztworu jodku propidyny i RNA w ciemności w temperaturze 37°C przez 30 minut. Na koniec przefiltruj zawiesinę trawionych komórek przez sito komórkowe, aby usunąć agregaty.Następnie przenieś pojedyncze komórki do odpowiedniej probówki w celu pobrania próbki przez cytometr przepływowy dla asynchronicznie proliferujących populacji komórek, takich jak ta przedstawiona. W tym przykładzie wyznacz bramkę wokół dwóch najwyższych pików na wykresie dyskryminacji dubletów, aby wybrać zdarzenia pojedynczych komórek do wszystkich kolejnych analiz. Następnie przeanalizuj próbkę z asynchronicznie proliferującej hodowli, która będzie służyć jako kontrola pozytywna dla barwienia i konfiguracji parametrów cytometru przepływowego.Dostosuj czułość lampy fotopowielacza dla barwienia jodkiem propidyny tak, aby piki 2N i 4N z pojedynczych komórek były wycentrowane na wartościach 200 i 400 jednostek arbitralnych na osi x. Następnie dostosuj czułość lampy fotopowielacza detekcyjnego FXI w taki sposób, aby komórki FXI-ujemne znajdowały się powyżej poziomu tła. Komórki BrdU-dodatnie powinny być około 10 razy jaśniejsze, a oś x powinna być wyświetlana w skali logarytmicznej.Pojedyncze zdarzenia rejestrowane przez cytometr przepływowy tworzą łuk w kształcie podkowy, biegnący od fazy G1 w lewym dolnym rogu, przez fazę S, aż do prawego dolnego rogu dla fazy G2/M. Jak pokazano na tej reprezentatywnej rycinie, należy zebrać od 5 000 do 10 000 zdarzeń pojedynczych komórek, aby uzyskać pożądany zakres zawartości DNA. Po pomiarze zawartości jodku propidium i BrdU, przypisz komórki do fazy G1, S lub G2/M, stosując bramki wokół dwóch populacji negatywnych pod kątem BrdU, wycentrowanych na wartości 200 dla G1 i 400 dla G2/M. Uwzględnij wszystkie zdarzenia powyżej tych dwóch obszarów w jednej bramce służącej do pomiaru fazy S; procent komórek w każdej bramce będzie reprezentować względną liczbę komórek w fazach G1, S i G2/M, co przedstawiono tutaj na wykresie słupkowym dla poprzedniego wykresu rozrzutu.Po barwieniu na wybrany marker komórkowy, w tym przykładzie CD 20, odwiruj komórki z prędkością 500 ×g przez 10 minut w temperaturze 22 °C, a następnie resuspenduj osad w 5 mL PBS uzupełnionego o 1% BSA. Po ponownym odwirowaniu komórek z prędkością 500 ×g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, użyj 0,5 mL roztworu jodku propidyny i RNA do rehydratacji komórek. Następnie zabarw i poddaj komórki trawieniu, a następnie wyznacz bramki dla pików pojedynczych komórek 2n i 4n, a następnie dostosuj czułość fotopowielacza dla detekcji FXI tak, aby niezabarwione komórki znajdowały się powyżej poziomu tła.W idealnym przypadku komórki CD 20 FXI dodatnie powinny być barwione od 10 do 100 razy intensywniej niż tło. Ponownie, oś x powinna być wyświetlana w skali logarytmicznej. Na koniec należy wybrać komórki CD 20 dodatnie, których jasność jest 10 razy większa niż poziom tła i które wykazują barwienie jodem propidyny w zakresie od 200 do 400, aby wyświetlić je na histogramie liczby komórek w stosunku do barwienia jodem propidyny, jak pokazano tutaj na przykładowej rycinie; należy zebrać co najmniej 1000 zdarzeń CD 20 dodatnich dla każdej próbki, aby ograniczyć zmienność na tej rycinie.Przedstawiono trójwymiarową analizę cytometryczną przepływową komórek barwionych jodkiem propidialnym i BrdU. Należy zauważyć, że komórki o zawartości DNA 2n i 4n są wycentrowane nad znacznikami 200 i 400 na skali osi X. Dla intensywności barwienia jodkiem propidialnym intensywność barwienia BrdU jest mierzona w skali logarytmicznej.Na osi Y należy zwrócić uwagę na położenie bram użytych do ilościowego oznaczenia komórek w fazach G1 oraz G2/M cyklu komórkowego. Przedstawiono tutaj względną proporcję komórek w każdej z bram G1 oraz G2/M z poprzedniej figury. Tutaj: jodek propydyny i CD 20.Przedstawiono barwienie mieszaniny komórek, z których niektóre ektopowo wykazują ekspresję CD 20 i PRB. Należy zauważyć, że komórki z 2n i 4n DNA, będące najliczniejszymi populacjami, są wyśrodkowane nad oznaczeniami 200 i 400 na osi x. Pozycja bramki dla komórek CD 20 dodatnich wybiera komórki, których barwienie jest co najmniej 10-krotnie silniejsze niż tło.Ten histogram przedstawia liczbę komórek w zależności od barwienia jodkiem propidialnym dla komórek CD 20-ujemnych z poprzedniego wykresu rozrzutu, które proliferują asynchronicznie. W tym histogramie pokazano komórki CD 20-dodatnie z wcześniejszego wykresu rozrzutu CD 20, których zatrzymanie cyklu komórkowego zostało wywołane ekspresją p rrb i które zawierają komórki głównie z zawartością 2N DNA. Dane te wykazują, że za pomocą tej techniki barwienia można odróżnić zatrzymaną subpopulację od pozostałych komórek w hodowli. Na kolejnych trzech rysunkach przedstawiono dane z analizy cytometrycznej przepływowej retrowirusowej ekspresji inhibitora kinazy zależnej od cyclin P 27 KIP 1 w zarodkowych fibroblastach myszy.Do pomiaru faz cyklu komórkowego w asynchronicznie proliferującej populacji komórek transdukowanych pustym wektorem retrowirusowym P babe, jak pokazano tutaj, wykorzystano analizę jodeczku propidyny i BrdU. W bramce fazy S w odpowiedzi na P 27 odnotowano niewiele zdarzeń pozytywnych pod kątem BrdU. Zwróćmy również uwagę na większą intensywność zdarzeń w bramkach G1 oraz G2/M.Podobnie, odsetek komórek w fazie S dla komórek wykazujących ekspresję P 27 jest dość niski, co przedstawiono na tym schemacie. Ten rodzaj analizy okazał się bardzo skuteczny w charakteryzowaniu deficytów kontroli cyklu komórkowego w komórkach pochodzących z różnych szczepów myszy z celowanym knockoutem genów. Na następnych dwóch rycinach przedstawiono nieukształtowane komórki nabłonka pamięci poddane działaniu cytokiny hamującej wzrost TGF beta one przez 24 godziny.Jak pokazano na pierwszej rycinie, znakowanie BrdU w komórkach w fazie S jest znacznie ograniczone przez sygnalizację TGF beta one. Należy zwrócić uwagę na akumulację komórek głównie w fazie G1 cyklu komórkowego, co widać na środkowym panelu. Ilościowe określenie poszczególnych faz cyklu komórkowego potwierdza, że TGF beta one hamuje proliferację przede wszystkim w fazie G1 cyklu komórkowego, co prowadzi do akumulacji w tej fazie.W tej ostatniej serii analiz eksperymentalnych komórki SAS two pozbawione PRB zostały przetransfekowane wektorem ekspresyjnym CMV CD 20 oraz odpowiednio CMV RB lub CMV beta GAL jako kontrolą. Pierwsza rycina przedstawia rozkład cyklu komórkowego komórek przetransfekowanych kontrolą negatywną w porównaniu z ich rozkładem po 72 godzinach ekspresji PRB. Należy zwrócić uwagę na niemal wyłączną obecność piku 2N na prawym panelu; dopasowanie krzywej za pomocą oprogramowania multi-cycle w tej końcowej figurze wykazało, że po ekspresji PRB komórki gromadziły się głównie w fazie G1.Podczas gdy populacje w fazach s oraz G2/M były stosunkowo uszczuplane. Po opanowaniu ta technika może zostać dostosowana do badania innych markerów cyklu komórkowego, takich jak fosforylowane histony w mph. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, w jaki sposób określać rozkład cyklu komórkowego w populacji komórek.Należy pamiętać, że kwas solny jest żrący, a jodek propidyny jest potencjalnym kancerogenem. Mogą one stanowić zagrożenie w przypadku kontaktu.Podczas pracy z tymi odczynikami należy zawsze zachować środki ostrożności.

analysis-of-cell-cycle-position-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Śledzenie subtelnych zmian w progresji i kinetyce etapów cyklu komórkowego można przeprowadzić, stosując połączenie metabolicznego znakowania kwasów nukleinowych BrdU oraz barwienia całkowitej genomowej DNA jodeczkiem propidyny. Metoda ta eliminuje konieczność chemicznej synchronizacji dzielących się komórek, zapobiegając tym samym wprowadzaniu nieswoistych uszkodzeń DNA, które z kolei wpływają na przebieg cyklu komórkowego.

Pomiar kinetyki progresji cyklu komórkowego z wykorzystaniem znakowania metabolicznego i cytometrii przepływowej

Przejście z metafazy do anafazy jest inicjowane poprzez zależną od kompleksu anafazy-promującego (APC/C) ubikwitynację i następującą po niej degradację cykliny B. W niniejszej pracy opracowaliśmy system, który po zastosowaniu znakowania metodą pulse-chase umożliwia monitorowanie proteolizy cykliny B w całych populacjach komórek oraz ułatwia wykrywanie interferencji wywołanej przez punkt kontrolny mitozy.

Badanie proteolizy cykliny B na poziomie pojedynczej komórki w populacjach całych komórek

miRNA lub mikroRNA są kluczowymi regulatorami postępu cyklu komórkowego. Ten film opisuje analizę cyklu komórkowego opartą na cytometrii przepływowej komórek raka płuc transfekowanych miRNA w celu zbadania wpływu miRNA na regulację cyklu komórkowego. Hamowanie proliferacji poprzez zatrzymanie progresji cyklu komórkowego wykazało, że może być obiecującym podejściem do leczenia raka.

Analiza cyklu komórkowego: podejście do badania regulacji cyklu komórkowego komórek raka płuc transfekowanych miRNA

Ten protokół opisuje wykorzystanie wychwytu bromodeoksyurydyny (BrdU), aby umożliwić czasowe śledzenie komórek, które były w fazie S w określonym momencie. Dodanie barwników DNA i znakowanie przeciwciałami ułatwia szczegółową analizę losów komórek fazy S w późniejszym czasie.

Czasowe śledzenie progresji cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej bez konieczności synchronizacji

Zgłaszamy dwa protokoły synchronizacji komórek, które dostarczają kontekstu do badania zdarzeń związanych z określonymi fazami cyklu komórkowego. Pokazujemy, że to podejście jest przydatne do analizy regulacji określonych genów w niezakłóconym cyklu komórkowym lub po ekspozycji na czynniki wpływające na cykl komórkowy.

Badanie ekspresji genów regulowanej cyklem komórkowym za pomocą dwóch uzupełniających się protokołów synchronizacji komórek

Przedstawiamy protokół podwójnej synchronizacji komórek HeLa z tymidyną, a następnie analizę za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta jest kluczem do uzyskania dużej liczby komórek, które przechodzą synchronicznie z fazy S do mitozy, umożliwiając badania nad mitotycznymi rolami wielofunkcyjnych białek, które również pełnią funkcje interfazowe.

Połączenie mitotycznej synchronizacji komórek i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania roli wielofunkcyjnych białek cyklu komórkowego podczas mitozy

Opisano metodę opartą na obrazowaniu, która może być użyta do identyfikacji fazy S i analizy dynamiki cyklu komórkowego w hermafrodytycznej linii zarodkowej C. elegans przy użyciu analogu tymidyny EdU. Ta metoda nie wymaga transgenów i jest kompatybilna z barwieniem immunofluorescencyjnym.

Analiza cyklu komórkowego w linii zarodkowej C. elegans z analogiem tymidyny EdU

Ten protokół opisuje, jak izolować keratynocyty skóry od modeli mysich, barwić przeciwciałami znakowanymi metalem oraz analizować barwione komórki za pomocą cytometrii masowej w celu profilowania wzorca ekspresji interesujących białek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Izolacja i barwienie keratynocytów skóry myszy do specyficznej dla cyklu komórkowego analizy ekspresji białek komórkowych za pomocą cytometrii masowej

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Długoterminowe Imaging komórkach ssaków przy dużym polu Mikroskopia

Poznaj analizę pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków przy użyciu cytometrii przepływowej z zastosowaniem BRDU i jodku propidyny. Ta metoda umożliwia precyzyjne określenie proporcji komórek w fazach G1, S i G2/M.

Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów