Name: Izolacja i oczyszczanie kinezyny z zarodków Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj izolację aktywnej kinezyny z zarodków Drosophila dla badań biofizycznych pojedynczych cząsteczek. Ta metoda umożliwia ocenę ruchu kinezyny wzdłuż mikrotubul.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Szczególne podziękowania kierujemy do Kris Ngai oraz Jasona Del Rio za wsparcie i pomoc w realizacji tego projektu. Praca ta była finansowana z grantu RO1 GM070676 przyznanego SPG.

Szczepy much można zakupić i namnożyć w laboratorium. W zależności od liczby otrzymanych probówek z hodowlą Drosophila, należy często „przesadzać” (flip) kulturę, gdy probówki osiągną maksymalną pojemność. Namnażanie trwa do momentu zapełnienia około 50 probówek z hodowlą Drosophila. Następnie przygotowuje się „kubki do much” z zlewkami trójkątnych o pojemności 100 ml (przygotowanie kubków do much omówiono w następnej sekcji). Po 24 godzinach należy wykorzystać embriony z tych kubków do zaszczepienia nowych probówek z hodowlą Drosophila z przymocowaną na dnie pożywką dla much. W temperaturze pokojowej czas wzrostu embrionów Drosophila od stadium embrionów nocnych do w pełni wyrośniętych much wynosi około 8,5 dnia. Zaszczepione embriony wykluwają się po 12-15 godzinach w pierwszym stadium larwalnym. Larwy rosną przez około 4 dni, przechodząc dwukrotnie linienie do drugiego i trzeciego stadium larwalnego, odpowiednio 24 i 48 godzin po wykluciu. Następnie larwy zamykają się w pupariach i przechodzą 4-dniową metamorfozę, aż do wyjścia z poczwarki 1. Należy pozostawić muchy na około dwa do trzech dni w probówkach z hodowlą Drosophila, aby zwiększyć ich liczbę w każdej z nich. Po zapełnieniu 400 probówek dostępna będzie wystarczająca liczba much dla pięćdziesięciu kubków do składania jaj (około 1000 samic na kubek). Muchy potrzebują czasu na aklimatyzację w nowym środowisku. Zazwyczaj mija około dwóch dni od przeniesienia do kubków, zanim będą gotowe do zbioru. Codzienna wymiana płytek z agarem pozwoli utrzymać kubki w czystości, co wydłuży życie much. (W celu pogłębienia wiedzy na temat pielęgnacji i namnażania Drosophila, prosimy zapoznać się z publikacją D. B. Roberts' Drosophila: A Practical Approach 2).
Dobrym źródłem pozyskiwania dużych ilości zarodków Drosophila są klatki populacyjne 3, które są dostępne w sprzedaży. Sposób montażu i utrzymania klatek populacyjnych opisano w rozdziałach 5 i 7 książki Drosophila Melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology4. Klatki populacyjne są jednak kosztowne i trudne w utrzymaniu. Ponieważ w klatkach populacyjnych może znajdować się bardzo duża liczba much, do ich przenoszenia i karmienia niezbędne jest zastosowanie dwutlenku węgla. Jak wspomniano wcześniej, dwutlenek węgla pogarsza stan zdrowia much, co skutkuje mniejszą liczbą składanych jaj. W mniejszej skali można wykorzystać zlewki trójkątne o pojemności 100 ml. Przy użyciu pięćdziesięciu zlewek 100 ml można uzyskać 9 g zdechorionowanych zarodków. W celu usunięcia martwych much, niewykorzystanej pasty drożdżowej oraz innych zanieczyszczeń stworzyliśmy dwuwarstwowe sitko o różnych rozmiarach oczek. Pierwsze sito wyłapuje niepożądane materiały, takie jak martwe muchy, pozwalając jednocześnie na przejście zarodków (rozmiar porów 350 micron). Druga część zawiera siatkę (rozmiar porów 120 microns), która ma za zadanie zatrzymać zarodki Drosophila, podczas gdy pozostałe zanieczyszczenia przechodzą przez siatkę.
1. Przygotowanie probówek z muchami i zbieranie embrionów
<ol>
 <li> Przenieś rozmnożone muchy z wielu probówek do pustej plastikowej probówki, aż ich ilość osiągnie wysokość jednego cala. Następnie przenieś te muchy do 100 ml kubka do zbierania jaj (zlewka trójnogiego z nylonowymi okienkami z siatki). Podczas przenoszenia much lekko opukuj kubek o twardą powierzchnię, aby zapobiec ich ucieczce. Przykryj kubek szalką Petriego z agarem zawierającym pastę drożdżową i pozostaw na 24-48 h w celu stabilizacji.</li>
 <li> Zbierz szalki z agarem z pięćdziesięciu kubków z muchami i wypłucz zawartość szalek do łapacza z sita, używając czystego pędzla i bieżącej wody. Przepłucz embriony w sicie obfitą ilością wody, aż cała pasta drożdżowa zostanie wypłukana.</li>
 <li> Przeprowadź dechorionację oczyszczonych embrionów poprzez zanurzenie ich w 50% bleach przez 3 min.</li>
 <li> Płucz obficie wodą destylowaną, aż embriony przestaną pachnieć wybielaczem. Następnie osusz siatkę z embrionami, kilkukrotnie przykładając ją do złożonego w kostkę ręcznika papierowego. Przenieś embriony do czystej probówki i zapisz ich wagę.</li>
</ol>
2. Homogenizacja i klarowanie zarodków
<ol>
 <li> Umieścić embriony pozbawione chorionu w homogenizatorze Dounce wraz z 1,5-krotnością objętości lodowatego buforu do ekstrakcji. </li>
 <li> Wykonać 5 ruchów luźnym tłuczkiem. Homogenizat rozdzielić na alikwoty do czystych probówek wirówkowych. Wirować przy 15 000 g przez 40 min w temperaturze 4 °C. </li>
 <li> Ostrożnie zebrać klarowny nadsącz, pomijając górną białą warstwę lipidową oraz dolny osad. </li>
 <li> Przenieść nadsącz do czystych probówek wirówkowych i wirować przy 50 000 g przez 30 min w temperaturze 4 °C. </li>
 <li> Otrzymany nadsącz po wirowaniu wysokoprędkościowym, zebrany w opisany wyżej sposób, można wykorzystać natychmiast lub zamrozić szokowo i przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy. </li>
</ol>
3. Polimeryzacja mikrotubul i wiązanie kinezyny
<ol>
 <li> rozmrozić zamrożony supernatant po wirowaniu przy wysokiej prędkości do temperatury pokojowej. Aby polimeryzować mikrotubule, dodać GTP (0.3 mM) oraz taksol (20 μM) i delikatnie mieszać w temperaturze pokojowej przez 20 min w wytrząsace obrotowej. </li>
 <li> Aby związać kinezynę, dodać 2.5 mM niehydrolizowalnego analogu ATP – 5'-adenyloimidodifosforanu (AMPPNP), a następnie mieszać przez 10 min w temperaturze pokojowej w wytrząsace obrotowej. </li>
</ol>
4. Sedymentacja różnicowa mikrotubul i kinezyny
<ol>
 <li> Osadź próbkę przez równą objętość poduszki sacharozowej (20% sacharozy i 10 μM taxolu w buforze do ekstrakcji) poprzez wirowanie przy 23,000 g (rotor sw41ti, TLS-55) przez 30 min w temperaturze 4 °C. </li>
 <li> Przemyj osad poprzez resuspensję w objętości stanowiącej 10% pierwotnej objętości homogenatu w buforze do ekstrakcji zawierającym 10 μM taxolu i 75 mM NaCl. </li>
 <li> Powtórz sedymentację z kolejną równą objętością poduszki sacharozowej, zgodnie z krokiem 4.1. </li>
 <li> Resuspenduj osad z przemywania solnego w 5% buforze do ekstrakcji z dodatkiem 20 μM taxolu, 75 mM NaCl, 10 mM MgSO4 oraz 10 mM ATP. </li>
 <li> Wirowuj przy 120,000 g (rotor sw41ti: 31,000 rpm, TLS-55: 42,000 rpm) przez 20 min w temperaturze 4 °C. Zbierz nadsącz (frakcja kinezyn). </li>
 <li> Przeprowadź filtrację odśrodkową przy 14,000 g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Odzyskaj skoncentrowaną próbkę i powtórz filtrację z nowym filtrem w opisany wyżej sposób przez 30 minut, a następnie zbierz skoncentrowaną próbkę. </li>
 <li> Wykonaj analizę białek w celu określenia stężenia. W skrócie, różne stężenia znanego białka (albuminy surowicy bydlęcej; BSA) zmieszano ze znaną objętością odczynnika Bradforda i zmierzono gęstość optyczną przy długości fali 595nm. Następnie sporządzono krzywą wzorcową gęstości optycznej w zależności od stężenia, aby obliczyć nieznane stężenie oczyszczonej frakcji kinezyn, wykorzystując gęstość optyczną tej próbki zmierzoną w warunkach analogicznych do próbek wzorcowych BSA. Wykonano również elektroforezę w żelu oraz western blotting z użyciem znanej ilości oczyszczonej kinezyny. </li>
 <li> Rozdziel frakcję kinezyn na małe alikwoty o pożądanym stężeniu i zamroź gwałtownie w ciekłym azocie w celu przechowywania w temperaturze -80 °C. </li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Pełnej długości funkcjonalna kinezyna została oczyszczona z embrionów Drosophila. Rysunek 1 przedstawia żel barwiony srebrem, pokazujący poszczególne frakcje podczas oczyszczania. Ścieżka 1 to próbka nad supernatantu po wirowaniu z wysoką prędkością w celu klarowania (krok 2.5), ścieżka 2 to próbka osadu po klarowaniu, ścieżka 3 to próbka supernatantu po pierwszej sedymentacji na poduszce sacharozowej (krok 4.1), ścieżka 4 to próbka osadu po pierwszej sedymentacji, ścieżka 5 to próbka supernatantu po drugiej sedymentacji (krok 4.3), ścieżka 6 to próbka osadu po drugiej sedymentacji, ścieżka 7 to próbka osadu z końcowej sedymentacji (krok 4.5), ścieżka 8 to próbka oczyszczonej kinezyny, ścieżka 9 to próbka przefiltrowanej kinezyny, a ścieżka 10 to marker. Skoncentrowany prążek w ścieżkach 8 i 9 przy około 115 kD to ciężki łańcuch kinezyny 1, co jest zgodne z Rysunkiem 1, ścieżką 8 w pracy Saxtona opublikowanej w 1988 roku5. Rysunek 2 przedstawia western blot frakcji oczyszczonej kinezyny wykrytej przy użyciu przeciwciała przeciwko ciężkiemu łańcuchowi kinezyny. Przeciwciało AKINO1-A nie wykazuje istotnych reakcji krzyżowych z innymi członkami rodziny kinezyn 6. Należy zauważyć, że choć niniejszy protokół pozwala na uzyskanie dobrego źródła funkcjonalnej kinezyny i frakcja jest wzbogacona w kinezynę-1, prawdopodobnie występują w niej zanieczyszczenia, w tym potencjalnie inne kinezyny i białka motorowe. Usunęliśmy szereg mniejszych zanieczyszczeń poprzez filtrację. W kwestii usuwania innych białek motorowych, czego nie da się osiągnąć wyłącznie na podstawie wielkości, proces oczyszczania jest podobny do metod stosowanych przez innych badaczy kinezyny 7 i uważamy, że większość aktywnego motoru to kinezyna-1, jednak bardziej zaawansowane oczyszczanie pozwoliłoby na usunięcie potencjalnych zanieczyszczeń motorowych, tak jak zrobili to Cole et al8 oraz Saxton et al.9 
Procesywność kinezyny oceniono za pomocą testu wiązania pojedynczych cząsteczek do mikrotubul in vitro, zgodnie z bardziej szczegółowym opisem w książce Scholeya zatytułowanej „Motility Assay for Motor Proteins”10. W skrócie, kulki polistyrenowe z pojedynczym aktywnym motorem doprowadzono do kontaktu z mikrotubulą w obecności nasycającego stężenia (1 mm) ATP. Motor przyłączył się do mikrotubuli i zaczął oddalać się od centrum pułapki laserowej. Po osiągnięciu zdefiniowanego przesunięcia kulki z centrum pułapki (100 nm) moc wiązki laserowej została automatycznie wyłączona, co umożliwiło motorowi ruch wzdłuż mikrotubuli bez obciążenia. Film przedstawia kulkę o średnicy 500 nm z pojedynczą kinezyną poruszającą się wzdłuż mikrotubuli. Długość ekranu wideo odpowiada 20 μm. Rysunek 3 przedstawia zmierzony rozkład długości przebiegu dla pojedynczych, pełnowymiarowych cząsteczek kinezyny Drosophila, oczyszczonych zgodnie z przedstawionym tutaj protokołem. Dopasowanie wykładnicze do rozkładu wskazuje średnią długość przebiegu pojedynczej kinezyny wynoszącą odpowiednio 1,55 ± 0,1 μm dla próbki filtrowanej i 1,28 ± 0,12 μm dla próbki niefiltrowanej.
<img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig1.jpg" alt="Wynik elektroforezy żelowej; prążki białkowe; markery masy cząsteczkowej; analiza rozdziału białek." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Żel barwiony srebrem frakcji oczyszczonych: Próbki z każdej frakcji naniesiono na żel 10%. W każdej studni załadowano 10 μg białka. Ścieżka 1: próbka nadpływu po wirowaniu z dużą prędkością po klarowaniu (krok 2.5), ścieżka 2: próbka osadu po klarowaniu, ścieżka 3: próbka nadpływu po pierwszej sedymentacji na poduszce sacharozowej (krok 4.1), ścieżka 4: próbka osadu po pierwszej sedymentacji, ścieżka 5: próbka nadpływu po drugiej sedymentacji (krok 4.3), ścieżka 6: próbka osadu po drugiej sedymentacji, ścieżka 7: próbka osadu z końcowej sedymentacji (krok 4.5), ścieżka 8: oczyszczona próbka kinezyny, ścieżka 9: kinezyna przefiltrowana przy użyciu wirówkowego filtra Amicon ultra 0.5 ml z odcięciem 100 kD (Millipore, USA). Niebieskie strzałki wskazują białka, których ilość uległa zmniejszeniu, a czerwona strzałka wskazuje stężenie kinezyny w wyniku etapu filtracji wirowej zastosowanego w niniejszym protokole. 
<img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig2.jpg" alt="Wynik elektroforezy żelowej białka kinezyny, wizualizacja prążka białkowego do badań molekularnych." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Oczyszczona frakcja KHC poddana immunoblottingowi z przeciwciałem anty-kinezynowym: Oczyszczoną próbkę kinezyny poddano elektroforezie żelowej i przeniesiono (na membranę nitrocelulozową), a następnie inkubowano z przeciwciałem pierwszorzędowym AKINO1-A (1:1,000 w TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, po czym inkubowano z przeciwciałem wtórnym osioł-anty-królik (1:10,000 w TBST) przez godzinę w temperaturze pokojowej. Do wykrycia przedstawionego powyżej sygnału kinezyny użyto zestawu ECL (chemiluminescencyjnego). 
<img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig3.jpg" alt="Wykresy histogramów długości i prędkości ruchu przedstawiające analizę danych SEM, z dopasowaniem krzywych." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Długość ruchu i prędkość pojedynczej pełnowymiarowej kinezyny Drosophila: (A) i (B) Długość ruchu i prędkość przefiltrowanej próbki kinezyny. (C) i (D) Długość ruchu i prędkość nieprzefiltrowanej próbki kinezyny. 
Rycina 4. Film przedstawiający ruch kinesyny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3501/3501movie4.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.

<ol><li>Ashburner, M., Thompson, J. N. The laboratory culture of Drosophila 2A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22The+genetics+and+biology+of+Drosophila%22">The genetics and biology of Drosophila</a>. Ashburner, M., Wright, T. R. F. , Academic Press. 1-81 (1978).</li>
<li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoberts%2C+DB+%22Drosophila%3A+A+Practical+Approach%22">Drosophila: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (1998).</li>
<li>Kunert, N., Brehm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+production+of+Drosophila+Embryosand+Chromatographic+Purification+of+Native+Protein+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 359(2008).</li>
<li>Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+Practical+Uses+in+Cell+and+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, (1994).</li>
<li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+kinesin%3A+Characterization+of+microtubule+motility+and+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109(1988).</li>
<li>Shubeita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1098 (2008).</li>
<li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+Velocity+Measured+for+Single+Kinesin+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules.</a> Cell. 77, 773(1994).</li>
<li>Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22Slow%22+Homotetrameric+Kinesin-related+Motor+Protein+Purified+from+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos.</a> J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).</li>
<li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Analysis+of+Microtuble+Motor+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Melanogaster.+Bloomington%3A+Academic%22%5BJournal%5D)">Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins.</a> Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279(1994).</li>
<li>Scholey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+Assay+for+Motor+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Motility Assay for Motor Proteins.</a> Methods in Cell Biology. 39, 138(1993).</li>
<li>Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+kinesin+from+bovine+brain+and+assay+of+microtubule-stimulated+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Enzymology. 196, 157(1991).</li>
<li>Aizawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+Family+in+Murine+Nerwous+System%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinesin Family in Murine Nerwous System.</a> The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).</li>
<li>Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+dynein+tail+mutation+impairs+motor+processivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity.</a> Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Mózg bydlęcy jest najczęściej stosowanym materiałem wyjściowym 11 do oczyszczania pełnowymiarowej kinezyny, choć wykorzystywano również mózg myszy 12. Dużą wadą stosowania mózgu bydlęcego jako źródła kinezyny jest dostępność świeżego materiału wyjściowego: rzeźnie są zazwyczaj niedostępne, a mózg musi być niezwykle świeży, aby uzyskać aktywną kinezynę. Ponadto skuteczne są jedynie mózgi młodych krów. Wreszcie, manipulacje genetyczne u krów nie są obecnie realną opcją, w związku z czym można badać je...

<table><tbody><tr><td>Agar (ziarnisty)</td><td>Fisher Scientific</td><td>1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza (D-glukoza) bezwodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>BD Biosciences</td><td>35 1007</td><td>Typ 60x15mm &lt;br/&gt;(poliestrowe) 20/opakowanie</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; probówki hodowlane</td><td>UCI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zlewka stożkowa</td><td>Econo Lab Inc.</td><td>B700-100</td><td>Objętość: 100ml, &lt;br/&gt;rozmiar: 58x72mm</td></tr><tr><td>Drożdże</td><td>Red Star</td><td>2751</td><td></td></tr><tr><td>Siatka nylonowa</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-102</td><td>Wielkość porów 120 mikronów </td></tr><tr><td>Siatka nylonowa</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>06-350/35</td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108321-27-3</td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108321-27-3</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>MgS0&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (bezwodny)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;amp;N4=103476-89-7&amp;amp;D7=0&amp;amp;D10=&amp;amp;N25=0&amp;amp;N1=S_ID&amp;amp;ST=RS&amp;amp;F=PR">103476-89-7&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Aprotonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;amp;N4=9087-70-1&amp;amp;D7=0&amp;amp;D10=&amp;amp;N25=0&amp;amp;N1=S_ID&amp;amp;ST=RS&amp;amp;F=PR">9087-70-1&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>TAME</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>178403-8</td><td></td></tr><tr><td>STI</td><td>Calbiochem</td><td>65635</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;amp;N4=36051-31-7&amp;amp;D7=0&amp;amp;D10=&amp;amp;N25=0&amp;amp;N1=S_ID&amp;amp;ST=RS&amp;amp;F=PR">36051-31-7&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Taxol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33069-62-4</td><td></td></tr><tr><td>Analog ATP 5&amp;rsquo;-adenylyloimidodifosforan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3605-31-7</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74804-12-9</td><td></td></tr><tr><td>Odśrodkowe filtry Amicon Ultra: 0,5 mL, próg odcięcia 100kD, opakowanie 8 sztuk</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510008</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i oczyszczanie kinezyny z embrionów drosophila

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Białka motoryczne transportują ładunki wzdłuż mikrotubul, dostarczając je do konkretnych lokalizacji wewnątrzkomórkowych. Ponieważ zakłada się, że zaburzenia transportu leżą u podstaw wielu chorób neurodegeneracyjnych, zrozumienie transportu motorowego opartego na mikrotubulach oraz jego regulacji prawdopodobnie doprowadzi w przyszłości do opracowania lepszych metod terapeutycznych. Kinezyna-1 jest eukariotycznym białkiem motorycznym, które porusza się w kierunku anterogradnym (do końca plusowego) wzdłuż mikrotubul (MTs), a proces ten jest napędzany hydrolizą ATP. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół oczyszczania w celu izolacji aktywnej kinezyny o pełnej długości z embrionów Drosophila, co umożliwia połączenie genetyki Drosophila z biofizycznymi badaniami pojedynczych cząsteczek. Rozpoczynając od około 50 pojemników do składania jaj, zawierających około 1000 samic w każdym, przeprowadzono nocne zbiory. Uzyskano w ten sposób około 10 ml upakowanych embrionów. Embriony poddano dechorionacji podchlorynem (uzyskując około 9 g embrionów), a następnie homogenizacji. Po rozbiciu homogenat został sklarowany poprzez wirowanie z niską prędkością, a następnie centryfugację z wysoką prędkością. Sklarowany supernatant potraktowano GTP i taksolem w celu polimeryzacji MTs. Kinezynę unieruchomiono na spolimeryzowanych MTs poprzez dodanie analogu ATP, 5'-adenylyloimidodifosforanu w temperaturze pokojowej. Po związaniu kinezyny mikrotubule osadzono za pomocą centryfugacji z wysoką prędkością przez poduszkę sacharozową. Osad mikrotubul ponownie zawieszono, a proces ten powtórzono. Na koniec dodano ATP, aby uwolnić kinezynę z MTs. Następnie centryfugacja z wysoką prędkością spowodowała osadzenie MTs, pozostawiając kinezynę w supernatancie. Kinezynę tę poddano filtracji odśrodkowej przy użyciu filtra z progiem odcięcia 100 KD w celu dalszego oczyszczania, a następnie podzielono na alikwoty, zamrożono gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywano w -80 °C. Elektroforezę w żelu SDS oraz western blotting przeprowadzono z użyciem oczyszczonej próbki. Aktywność motorową oczyszczonych próbek przed i po końcowym etapie filtracji odśrodkowej oceniono za pomocą testu pojedynczych cząsteczek mikrotubul in vitro. Frakcje kinezyny przed i po filtracji odśrodkowej wykazały procesywność, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami w literaturze. Trwają dalsze eksperymenty w celu oceny interakcji między kinezyną a innymi białkami związanymi z transportem.

Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji aktywnej, pełnowymiarowej kinezyny z embrionów Drosophila do biofizycznych badań pojedynczych cząsteczek. Przedstawiamy sposób zbierania embrionów, przygotowania lizatu embrionalnego, a następnie polimeryzacji mikrotubul (MT). Kinezynę oczyszcza się poprzez jej unieruchomienie na mikrotubulach, odwirowanie kompleksów kinezyna-MT, a następnie uwolnienie kinezyny z mikrotubul poprzez dodanie ATP.

Izolacja i oczyszczanie kinezyny z embrionów Drosophila

Białka motorowe przemieszczają ładunki wzdłuż mikrotubul i transportują je do konkretnych lokalizacji wewnątrzkomórkowych. Ponieważ zakłada się, że zaburzenia transportu leżą u podstaw...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie aktywnej, pełnowymiarowej kinezyny z embrionów drosofili do biofizycznych badań pojedynczych cząsteczek. Pierwszym krokiem procedury jest zebranie embrionów i ich potraktowanie podchlorynem sodu. Następnie potraktowane embriony są homogenizowane, a lizaty oczyszczane.Następnie w oczyszczonym embrionie polimeryzuje się mikrotubule, a kinezyna wiąże się z nimi stabilnie. Na koniec kompleks kinezyny z mikrotubulami jest sedymentowany, a kinezyna zostaje uwolniona z mikrotubul. Ostatecznie zdolność kinezyny do przemieszczania się wzdłuż mikrotubul może zostać oceniona w teście pojedynczych cząsteczek z użyciem koralików i pułapki optycznej.Niniejszy protokół jest modyfikacją metody opracowanej przez bi Saxton w celu oczyszczania kinezyny z Drosophila. Jednym z wyzwań, z jakimi mierzy się wielu początkujących biofizyków, jest potrzeba uzyskania funkcjonalnego białka. Fizycy zazwyczaj nie są szkoleni w zakresie otrzymywania białek, dlatego opracowaliśmy ten protokół, aby w jasny i prosty sposób przedstawić proces oczyszczania białek, tak aby biofizycy mieli łatwy dostęp do kinezyny.Kinezyna jest interesująca, ponieważ jest enzymem mech

isolation-and-purification-of-kinesin-from-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja i oczyszczanie kinezyn z zarodków Drosophila

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji i oczyszczania neuronów obwodowych Drosophila z wykorzystaniem strategii szybkiego sortowania komórek wspomaganego magnetycznymi kulkami. RNA uzyskane z wyizolowanych komórek może być bezpośrednio wykorzystane w dalszych analizach, w tym w badaniach mikromacierzy.

Izolacja i oczyszczanie neuronów obwodowych Drosophila za pomocą sortowania magnetycznego z użyciem kulek

Opisujemy metodę rozdzielania organelli według gęstości w żywych embrionach Drosophila. Embriony są zatapiane w agarze i poddawane wirowaniu. Technika ta pozwala na powtarzalne rozdzielenie głównych organelli wzdłuż osi przednio-tylnej embrionu. Metoda ta ułatwia przeprowadzanie eksperymentów kolokalizacyjnych i pozwala na uzyskanie frakcji organelli do analizy biochemicznej oraz eksperymentów z transplantacją.

In-vivo wirowanie zarodków Drosophila

Wieloskładnikowe kompleksy białkowe odgrywają kluczową rolę podczas funkcjonowania i rozwoju komórek. W tym miejscu opisujemy metodę stosowaną do izolowania natywnych kompleksów białkowych z zarodków Drosophila po sieciowaniu in vivo, a następnie oczyszczeniu usieciowanych kompleksów w celu późniejszej analizy strukturalno-funkcjonalnej.<br...

Sieciowanie in vivo w celu wyizolowania kompleksów białkowych z zarodków Drosophila

Tkanki Drosophila często zawierają niejednorodną mieszaninę typów komórek. Aby zbadać ekspresję genów w określonych typach komórek z danej tkanki, jądra mogą być genetycznie znakowane, a następnie izolowane przy użyciu podejścia opartego na powinowactwie. Wyizolowane jądra mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak analiza ekspresji genów i immunoprecypitacja chromatyny.

Izolacja oznaczonych jąder z tkanek Drosophila w oparciu o powinowactwo do analizy ekspresji genów

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) jest w stanie uchwycić specyficzną dla typu komórki translację mRNA. W tym miejscu przedstawiamy pierwszy protokół TRAP poświęcony izolacji mRNA w rzadkich populacjach komórek zarodków Drosophila.

TRAP-rc, Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków Drosophila

Ten protokół opisuje, jak wygenerować linię komórkową Drosophila S2, która jest wrażliwa na małocząsteczkowe inhibitory kinezyny-5. Przedstawiono również zastosowanie tych komórek w teście korekcji błędów opartym na komórkach.

Generowanie "humanizowanej" linii komórkowej Drosophila S2 wrażliwej na farmakologiczne hamowanie kinezyny-5

Tutaj prezentowany jest protokół identyfikacji ładunków Kinesin-1. Bezsilnikowy mutant ciężkiego łańcucha Kinesin-1 (KIF5B) agreguje się w cytoplazmie i indukuje agregację jej ładunków. Oba agregaty są wykrywane pod mikroskopią fluorescencyjną. Podobną strategię można zastosować do identyfikacji ładunków innych białek motorycznych.

Identyfikacja ładunków kinezyny-1 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Celem tego protokołu jest zapewnienie prostego i taniego podejścia do zbierania zarodków Drosophila na średnią skalę (0,5-1 g) i przygotowywania ekstraktów białkowych, które mogą być używane w dalszych zastosowaniach proteomicznych, takich jak spektrometria mas z oczyszczaniem powinowactwa (AP-MS).

Przygotowanie na średnią skalę ekstraktów z zarodków Drosophila do eksperymentów proteomicznych

Celem tego protokołu jest tworzenie zespołów silników molekularnych na nanostrukturach origami DNA i obserwowanie ruchliwości zespołu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem.

Produkcja zespołów motorycznych dyneiny i kinezyny na nanostrukturach DNA origami do obserwacji pojedynczych cząsteczek

Dwukierunkowa mitoza kinezyna-5 Cin8 gromadzi się w klastrach, które rozdzielają się i łączą podczas swojej ruchliwości. Akumulacja w gromadach zmienia również prędkość i kierunkowość Cin8. W tym miejscu opisano protokół oznaczania ruchliwości z oczyszczonym Cin8-GFP oraz analizy właściwości ruchliwych pojedynczych cząsteczek i klastrów Cin8.

Ruchliwość pojedynczych cząsteczek i klastrów dwukierunkowej kinezyny-5 Cin8 oczyszczonej z komórek S. cerevisiae

To badanie szczegółowo opisuje oczyszczanie KIF1A(1-393LZ), członka rodziny kinezyny-3, przy użyciu systemu ekspresji Sf9-bakulowirusa. Analiza in vitro pojedynczych cząsteczek i wielu silników ślizgowych tych oczyszczonych silników wykazała silne właściwości ruchliwości porównywalne z silnikami z lizatu komórkowego ssaków. W ten sposób system Sf9-bakulowirusa jest podatny na ekspresję i oczyszczanie białka motorycznego będącego przedmiotem zainteresowania.

Analiza pojedynczych cząsteczek oczyszczonych superprocesyjnych silników z rodziny Kinesin-3 Sf9

Poznaj izolację aktywnej kinezyny z zarodków Drosophila dla badań biofizycznych pojedynczych cząsteczek. Ta metoda umożliwia ocenę ruchu kinezyny wzdłuż mikrotubul.

Izolacja i oczyszczanie kinezyny z embrionów Drosophila

Przeglądaj więcej filmów