Izolacja i oczyszczanie kinezyny z zarodków Drosophila

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie aktywnej kinezyny o pełnej długości z zarodków drosophila do badań biofizycznych pojedynczych cząsteczek. Pierwszym etapem zabiegu jest pobranie zarodków i pokrycie ich wybielaczem. Następnie powlekane zarodki są homogenizowane, a lizaty klarowane.

Następnie mikrotubule są polimeryzowane w oczyszczonym zarodku, lizat i kinezyna są stabilnie wiązane z mikrotubulami. Na koniec kompleks mikrotubul kinezyny ulega sedymentacji, a kinezyna jest uwalniana z mikrotubul. Ostatecznie zdolność kinezyny do chodzenia wzdłuż mikrotubul można ocenić w teście kulkowym pojedynczej cząsteczki przy użyciu pułapki optycznej.

Protokół ten jest modyfikacją protokołu opracowanego przez bi Saxtona do oczyszczania kinezyny Drosophila. Jednym z wyzwań, przed którymi staje wielu początkujących biofizyków, jest zapotrzebowanie na funkcjonalne białko. Fizycy zazwyczaj nie są przeszkoleni w wytwarzaniu białek, więc opracowujemy ten protokół, aby spróbować wyjaśnić jasno i łatwo, jak to się dzieje, że można oczyścić białko, aby biofizycy mieli łatwe źródło kinezyny.

Kinezyna jest interesująca, ponieważ jest enzymem mechanologicznym, więc nie tylko jest białkiem, ale chodzi i wywiera siłę, i jest bardzo małą nanomaszyną lub silnikiem molekularnym, i chcielibyśmy zrozumieć, jak to działa, a ten protokół umożliwi ludziom lepsze zrozumienie tego. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej materii będą miały trudności z uzyskaniem wystarczającej liczby zarodków do tego protokołu oczyszczania. Można to osiągnąć poprzez staranne utrzymywanie muszek, aby uzyskać 58 miseczek do składania z około 10 gramów zarodków, otrzymamy około 200 mikrogramów kinezyny pod koniec tego protokołu.

Jeśli muchy nie leżą dobrze, możesz zebrać trzy zestawy talerzy zbiorczych, talerzy na noc i przechowywać w temperaturze czterech stopni. Alternatywnie możesz wykonać każde lizaty, każdy nocny sklep zbiorczy przy minus 80 przez maksymalnie jeden miesiąc i przejść dalej. Kontynuuj z protokołem, gdy tylko będziesz miał wystarczającą ilość BR osiem.

Muchy najlepiej świecą między drugim a dniem życia, od dwóch do 10 dni, a zdolność opóźniania zmniejsza się po 15 dniach. Aby przygotować kubki na muchy, zacznij od użycia markera, aby zrobić kontury po bokach 100-mililitrowych zlewek trikornowych, używając podgrzewanego ostrza, wytnij otwory. Użyj lepkiej taśmy gorylowej, aby zakryć otwory nylonową siatką.

Po amplifikacji około 50 fiolek much do maksymalnej pojemności, przerzuć amplifikowane muchy do pustej plastikowej fiolki, aż osiągną jeden cal wysokości fiolek. Przenieś muchy do miseczek na muchy, ciągle stukając kubkami o powierzchnię, aby zapobiec ucieczce much. Przykryj każdą filiżankę płytką agarową zawierającą pastę drożdżową i inkubuj muchy w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin.

Aby ustabilizować, zbierz płytki agarowe na noc z 50 filiżanek i użyj czystego pędzla i bieżącej wody. Umyj zawartość talerzy w łapaczu sitowym. Przepłucz zarodki dużą ilością wody, aż cała pasta drożdżowa zostanie zmyta.

Następnie, aby usunąć powłokę, zanurz zarodki w 50% wybielaczu na trzy minuty. Następnie użyj wody destylowanej, aby dokładnie spłukać zarodki, aż stracą zapach wybielacza. Osusz siatkę z zarodkami, wielokrotnie umieszczając ją na złożonym ręczniku papierowym.

Przenieś zarodki do czystego naczynia wagowego i zapisz wagę. Homogenizuj zarodki, umieszczając je najpierw w homogenizatorze tanecznym z 1,5 objętości lodowatego buforu ekstrakcyjnego. Wykonaj pięć uderzeń tłuczkiem, a następnie przelej homogenat do czystych probówek wirówkowych.

Odwirować homogenat w temperaturze 15 000 G przez 40 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie zebrać klarowną ciecz sklarowaną nad osadem bez górnej białej warstwy lipidowej lub dolnej osadki. Przenieść go do czystych probówek wirówkowych i odwirować w temperaturze 50 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zużyj supernatant natychmiast lub pstryknij, zamroź go i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby rozpocząć test kinazy i wiązania. W przypadku zamrożenia należy rozpocząć od rozmrożenia supernatantu o dużej prędkości do temperatury pokojowej i polimeryzacji mikrotubul, łącząc jeden mililitr supernatantu z jednym mikrolitrem 0,3 molowego GTP i dwoma mikrolitrami 10-milimolowego taksolu. Delikatnie mieszać w temperaturze pokojowej przez 20 minut w obracającym się wytrząsarce.

Następnie zwiąż kinezynę z mikrotubulami, dodając 2,5 milimola niezhydrolizowanego analogu A TP A-M-P-P-N-P i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 10 minut w obracającym się osadzie wytrząsarki, mikrotubule w kinezynie przez równą objętość sacharozy przez odchylenie odśrodkowego przy 23 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przemyć osad buforem ekstrakcyjnym zawierającym 10 mikromolowy taksol i 75-milimolowy chlorek sodu. Powtórzyć sedymentację z innym resusem poduszki sacharozowej o równej objętości.

Zawiesić osad z płukania solą w 5% buforze ekstrakcyjnym zawierającym 20 mikromolowych taksoli 75 milimolowych chlorków sodu, 10 milimolowych siarczanów magnezu i 10 milimolowych A TP. Osadzać próbkę w temperaturze 120 000 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zbierz kinezynę zawierającą infraction supernat. Przeprowadzić filtrację odśrodkową przy 14 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odzyskać zagęszczoną próbkę i przy użyciu nowego filtra powtarzać filtrację przez 30 minut. Zebrać zagęszczoną próbkę i oznaczyć zawartość białka w celu oznaczenia stężenia białka i błyskawicznego zamrożenia w ciekłym azocie. Następnie przechowuj go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Rysunek ten przedstawia zabarwiony srebrem żel z frakcji zebranych podczas kinazy i oczyszczania, pasów pierwszy i drugi, to odpowiednio supernatant o dużej prędkości i osad. Po wyjaśnieniu, pas od trzeciego do szóstego reprezentuje supernatanty i granulki odpowiednio po pierwszej i drugiej poduszce sacharozy. Blaine seven to osad po końcowej sedymentacji.

Ósemka i dziewiątka Lane'a to oczyszczona i końcowa przefiltrowana kinaza i próbki pokazujące 115 kilodaltonową kinazę i łańcuch ciężki. Jednym z pokazanych tutaj jest western blot oczyszczonej infekcji kinazy wykryty przy użyciu przeciwciała o łańcuchu ciężkim kinazyny. Przeciwciało, A-K-I-N-O one A nie reaguje znacząco krzyżowo z innymi członkami rodziny kinezyny.

Proces kinezyny oceniano za pomocą testu wiązania mikrotubul pojedynczej cząsteczki in vitro, opisanego bardziej szczegółowo w pisemnym protokole. Ten film pokazuje koralik o średnicy 500 nanometrów z pojedynczym silnikiem kinezynowym chodzący wzdłuż mikrotubul. Długość ekranu wideo wynosi 20 mikronów.

Rysunek ten przedstawia zmierzony rozkład długości serii dla pojedynczych, oczyszczonych cząsteczek kinezyny Drosophila o pełnej długości. Wykładnicze dopasowanie do rozkładu zapewnia średnią długość przebiegu pojedynczej kinezyny jako 1,55 plus minus 0,1 mikrona i 1,28 plus minus 0,12 mikrona odpowiednio dla próbek filtrowanych i niefiltrowanych. Po opanowaniu tego protokołu można go ukończyć w ciągu siedmiu godzin.

Począwszy od etapu mycia zarodków, najważniejszym krokiem końcowym jest potwierdzenie funkcjonalności oczyszczonego centa w naszym laboratorium. Dokonano tego przy użyciu testu pojedynczej cząsteczki B z wykorzystaniem systemu pułapek optycznych. W tych eksperymentach z pojedynczą cząsteczką zwykle mierzyliśmy właściwości biofizyczne oczyszczonego kinanu, takie jak prędkość podróży silnika i wytwarzanie siły.

Te zmierzone wartości parametrów mogą stanowić bezpośredni dowód na funkcjonalność kinonu. Po zapoznaniu się z tym protokołem, powinieneś mieć całkiem dobre pojęcie o tym, jak oczyścić kinezynę Drosophila na całej długości za pomocą łańcuchów świetlnych z zarodków Drosophila, i powinien to być bardzo przydatny proces, który umożliwi Ci badanie kinezyny. Kinezyna jest białkiem motorycznym, a jej niewydolność jest zaangażowana w wiele neurodegeneracji, więc wiele badań mechanistycznych powinno pomóc nam zrozumieć związek między mechanistycznym związkiem między chorobą a funkcjami motorycznymi.