Name: Obrazowanie przyżyciowe grasicy myszy za pomocą mikroskopii 2-fotonowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Poznaj metodę obrazowania przyżyciowego grasicy myszy za pomocą mikroskopii 2-fotonowej. Technika ta umożliwia badanie dynamiki i interakcji tymocytów podczas rozwoju komórek T in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować dr. Davidowi Olivieri za krytyczną recenzję niniejszego manuskryptu, dr. Nuno Moreno za pomoc logistyczną przy budowie uchwytu dla zwierząt oraz mat grzewczych, a także dr. Vijayowi K. Kuchroo za uprzejme przekazanie myszy Foxp3-KIgfp/gfp. Praca ta jest finansowana przez „Fundação para Ciência e Tecnologia” (FCT, Portugalia), grant nr PTDC/EBB-BIO/115514/2009.

1. Przygotowanie zwierząt
Ważne uwagi: zawiesiny komórek szpiku kostnego (BM) oraz przeszczepy grasicy przeprowadzano w warunkach aseptycznych. Zawiesiny BM przygotowywano w komorach laminarnych w pomieszczeniu do hodowli komórkowej, natomiast przeszczepy grasicy wykonywano w sali operacyjnej znajdującej się w naszym zwierzęciu. Aby zachować i zagwarantować te warunki aseptyczne, nie było nam dozwolone rejestrować materiałów wideo w tych miejscach. Jednak wszystkie materiały chirurgiczne zostały autoklawowane, a stół operacyjny uprzednio oczyszczony preparatem Virkon (Pharmacal Research Laboratories Inc.) oraz 70% etanolem. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) i były zgodne z dyrektywami Federacji Europejskich Stowarzyszeń Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (FELASA). Numer zatwierdzenia to AO10/2010. Wszystkie eksperymenty obrazowe były procedurami terminalnymi, a zwierzęta zostały poddane eutanazji natychmiast po zakończeniu akwizycji obrazów.
Szczegółowa procedura przedstawia się następująco:
<ol>
 <li>Naświetl (za pomocą irradiatora γ) 8-tygodniowe myszy Nude dawką 900 rads, aby zniszczyć endogenne prekursory krwiotwórcze w szpiku kostnym (BM). Po napromieniowaniu zwróć zwierzęta do klatek do czasu przygotowania komórek szpiku dawcy do wstrzyknięcia dożylnego i dalszej rekonstytucji BM. Przeszczep szpiku przeprowadzono 1 h po napromieniowaniu.</li>
 <li>Wyodrębnij zwierzęta dawców szpiku. Kości piszczelowe i udowe kończyn tylnych jednego zwierzęcia są zazwyczaj wystarczające do rekonstytucji do 3 zwierząt biorców. Po eutanazji za pomocą CO2, usuń kończyny tylne, a następnie usuń skórę i mięśnie z kości.</li>
 <li>Odetnij zamknięty koniec każdej kości i wypłucz go PBS (lub RPMI) lub rozgnieć je wszystkie w moździerzu z tłuczkiem, dodając 2 ml PBS (lub RPMI), aby wydobyć szpik kostny.</li>
 <li>Rozbij strukturę szpiku do postaci zawiesiny jednokomórkowej poprzez wielokrotną, energiczną aspirację za pomocą pipety P1000. Alternatywnie można kilkukrotnie przepuścić szpik przez igłę strzykawki 21G. Odwiruj (400g, 5 min, R.T.), ponownie zawieś komórki w PBS i wstrzyknij dożylnie napromieniowanym biorcom Nude. W naszych eksperymentach użyto szpiku z myszy Foxp3-KIgfp/gfp, w których wszystkie limfocyty T regulacyjne (Tregs) będą wykazywać ekspresję GFP1.</li>
 <li>Przyjęcie szpiku dawcy następuje w pierwszych dniach po transferze, ponieważ zwierzęta bez rekonstytucji BM nie przeżywają dłużej niż 14 dni. Należy jednak odczekać od 4 do 6 tygodni, aby umożliwić pełną regenerację wszystkich komponentów szpiku. Do wody dodano Bactrim (Roche) (2 mg/ml) w pierwszym tygodniu po napromieniowaniu, aby zmniejszyć ryzyko infekcji bakteryjnych.</li>
 <li>Transplantacja grasicy embrionalnej została już opisana2. W skrócie: rozpocznij rozmnażanie izogenicznych par myszy i codziennie sprawdzaj obecność czopa nasiennego (dowód kopulacji). Oddziel samice z czopem i poddaj je eutanazji CO2 w 15. dniu ciąży (obserwacja czopa to 1. dzień ciąży). Usuń embriony i grasice. Umieść embrionalne grasice w zimnym PBS do czasu transferu.</li>
 <li>Aby przeprowadzić transplantację grasicy, znieczul myszy Nude będące biorcami BM ketaminą (120 μg/g masy ciała myszy) / ksylazyną (16 μg/g masy ciała myszy) i utrzymuj je na podgrzewaczce w temperaturze 37°C aż do utraty przytomności.</li>
 <li>Chirurgicznie odsłoń nerkę, aby przeprowadzić transplantację grasicy. Najpierw przemyj skórę preparatem ChloraPrep (Carefusion Inc.) i 70% etanolem. Następnie wykonaj 1 cm nacięcie na skórze boczno-grzbietnej części ciała zwierzęcia, 2 mm poniżej ostatniego żebra piersiowego.</li>
 <li>Otwórz jamę otrzewną i wyciągnij z niej nerkę. Wykonaj małe, powierzchowne nacięcie w torebce nerki za pomocą ostrza skalpela. Używając pincety z bardzo cienką końcówką, utwórz kieszonkę pod torebką nerki myszy biorcy i wprowadź do niej do 4 płatów grasicy.</li>
 <li>Włóż nerkę z powrotem na miejsce, zaszyj jamę otrzewną jednym lub dwoma szwami, a następnie zamknij skórę myszy, stosując tę samą metodę szycia. Alternatywnie można zastosować klej chirurgiczny.</li>
 <li>Bezpośrednio po zakończeniu operacji wstrzyknij podskórnie lek przeciwbólowy (Butorfanol w dawce 5 mg/kg), aby uniknąć bólu zwierzęcia, i utrzymuj zwierzęta na podgrzewaczce, aż zaczną budzić się z narkozy. Myszy są trzymane indywidualnie przez pierwsze 3 dni po transplantacji, aby zapobiec usuwaniu szwów przez współlokatorów z klatki. Usuń szwy po 1 tygodniu.</li>
 <li>Myszy Nude nie posiadają limfocytów T. Można zatem ocenić przyjęcie przeszczepu grasicy, monitorując odsetek limfocytów T CD4+ lub CD8+ we krwi. Raz w tygodniu, 2 tygodnie po transplantacji grasicy, pobierz krew od zwierząt i zabarw ją przeciwciałami monoklonalnymi (MAbs) anty-CD4 i anty-CD8. Gdy stosunek CD4:CD8 wynosi około 2:1, przeszczepiona grasica jest w pełni funkcjonalna (Rycina 1).</li>
</ol>
2. Pozyskiwanie obrazów intravitalnych
Przygotuj wcześniej wszystkie niezbędne materiały i odstaw je na bok.
<ol>
 <li>Zanurzyć zwierzęta w narkozie za pomocą ketaminy/ksylazyny (dawki takie same jak opisane w punkcie 1.5) i umieścić je na macie grzewczej o temperaturze 37°C. Wstrzyknąć dożylnie 100 μl dekstranu znakowanego izotiocyjanianem rodaminy B (20 mg/ml w PBS), aby umożliwić późniejszą wizualizację przepływu krwi. </li>
 <li>Odsłonić nerkę zawierającą przeszczepiony grasiczkę zgodnie z protokołem opisanym wcześniej w punkcie 1.6.</li>
 <li>Aby zapobiec powrotowi nerki na jej pierwotną pozycję, zszyć boczne brzegi nacięcia skóry. </li>
 <li>Umieścić kawałek nasączonej PBS waty na górnej części narządu, aby utrzymać go w wilgoci.</li>
 <li>Położyć matę grzewczą na podstawie uchwytu dla zwierząt (Rycina 2A). </li>
 <li>Umieścić zwierzę na macie grzewczej w uchwycie, narządem do góry (Rycina 2B).</li>
 <li>Unieruchomić narząd z obu stron za pomocą zacisku wykonanego z cienkiej folii aluminiowej (Rycina 2C). </li>
 <li>Zamknąć uchwyt dla zwierząt i umieścić górną sondę grzewczą jak najbliżej tkanki (Rycina 2D). Sonda ta stale mierzy temperaturę narządu i przesyła te informacje do grzałki w celu regulacji prądu elektrycznego, utrzymując temperaturę na poziomie 37°C.</li>
 <li>Usunąć nasączoną PBS watę i nałożyć na preparat niskotopliwą agarozę (2% w PBS) o temperaturze 30°C. </li>
 <li>Przykryć cały preparat górną grzałką (Rycina 2E). W otworze grzałki znajduje się szkiełko podstawowe izolujące agarozę od obiektywu (Rycina 2F). Monitorować narkozę myszy i co 40 min podawać połowę dawki wspomagającej. Po pozyskaniu obrazów uśmiercić zwierzę za pomocą CO2.</li>
 </ol>
 Uwaga: zdjęcia klipsa z folii aluminiowej i górnego grzejnika przedstawiono na rysunku 3.
 
3. Akwizycja obrazowania dwufotonowego
 Użyliśmy pionowego mikroskopu dwufotonowego „Prairie Ultima X-Y”. Nasz system jest wyposażony w laser Ti:Szafir, cztery górne PMT do jednoczesnej akwizycji z maksymalnie 4 kanałów oraz obiektyw imersyjny wodny 20x.
 <ol>
 <li>Włącz laser ti:szafirowy oraz cały system mikroskopowy. </li>
 <li>Zamontuj lustra dichroiczne i zestawy filtrów zgodnie z pożądanymi długościami fal. W naszym przypadku zastosowano uchwyt Olympus-BX2 Chroma zawierający lustro dichroiczne 565 nm, jeden filtr 525/50 nm (dla sygnału Foxp3-GFP) oraz jeden filtr 595/50 nm (dla sygnału Dextran-Rhodamine-B wewnątrz naczyń krwionośnych). Wykorzystano zakres długości fal lasera od 880 do 900 nm. </li>
 <li>Zamocuj uchwyt dla zwierzęcia w mikroskopie, podłącz i włącz wszystkie grzałki, wlej wodę do otworu górnej grzałki, ostrożnie zanurz obiektyw w wodzie i ustaw ostrość na naczynie lub komórki GFP-Tregs. </li>
 <li>Korzystając z zewnętrznego sterowania mikroskopem w osiach x,y,z, szybko przeszukaj tkankę w celu zlokalizowania obszaru zainteresowania. </li>
 <li>Dostrój wzmocnienie (gain) w PMT, aby zoptymalizować separację kolorów i zminimalizować moc lasera niezbędną do uzyskania wystarczającego sygnału powyżej tła. Staraj się używać minimalnej mocy lasera, aby uniknąć fotouszkodzeń tkanki. </li>
 <li>Po zlokalizowaniu obszarów zainteresowania rozpocznij obrazowanie time-lapse. W naszym przypadku typowy protokół akwizycji 5D (x, y, z, t oraz kolor) polega na pozyskiwaniu sekwencyjnych obrazów objętości tkanki o głębokości 50 μm, podzielonej na kroki z o wielkości 4.0 μm, przy wymiarach x i y wynoszących 140 μm każdy. Pozyskanie każdej objętości trwa około 30 sekund. Zatem 60 akwizycji zajmie około 30 min obrazowania. </li>
 <li>Prześlij dane na serwer instytucjonalny i użyj oprogramowania ImageJ, Imaris lub Volocity do wielowymiarowego renderowania i śledzenia komórek. </li>
 </ol>
4. Reprezentatywne wyniki
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej, stosunki CD4/CD8 i ekspresja CD25/CD44; próbki typu dzikiego w porównaniu z przeszczepionymi." src="/files/ftp_upload/3504/3504fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Akceptacja i funkcja grasicy zarodkowej. Po regeneracji szpiku kostnego (BM), grasice zarodkowe przeszczepiono zwierzętom z odtworzonym szpikiem kostnym; dwa tygodnie po transplantacji grasicy myszy te poddawano pobraniu krwi raz w tygodniu w celu monitorowania odsetka podtypów limfocytów T poprzez barwienie przeciwciałami monoklonalnymi (MAbs) anty-CD4 lub anty-CD8. Uznaliśmy, że grasica została pomyślnie zaakceptowana u zwierząt, u których stosunek CD4:CD8 wynosił około 1,5-2,0:1 (A). Aby potwierdzić jej funkcjonalność, uśmiercono część zwierząt z przeszczepioną grasicą i porównano odsetek różnych subpopulacji tymocytów z myszami typu dzikiego (WT) (B). Odsetki subpopulacji podwójnie ujemnych (DN; tymocyty CD4-CD8-) (poprzez barwienie przeciwciałami MAbs anty-CD25 i anty-CD44), podwójnie dodatnich (DP; tymocyty CD4+CD8+) oraz pojedynczo dodatnich (SP) tymocytów CD4+ lub CD8+ były podobne u tych zwierząt.
<img alt="Ustawienie uchwytu dla zwierzęcia do badania przeszczepionego grasicy; obejmuje podkładkę grzejną, aluminiowy zacisk, mikroskop." src="/files/ftp_upload/3504/3504fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Montaż uchwytu dla zwierzęcia. Po głębokim znieczuleniu zwierzę umieszcza się na podkładce grzejnej, uprzednio zamontowanej na stole uchwytu dla zwierzęcia (A). Nerka zawierająca przeszczepioną grasicę jest skierowana ku górze (B). Zacisk z folii aluminiowej delikatnie obejmuje całą nerkę (C), aby utrzymać ją w miejscu. Wstawka na Rys. 1C szczegółowo przedstawia zacisk. Następnie montuje się górną część uchwytu dla zwierzęcia (D). Nasączoną PBS watę usuwa się z powierzchni narządu, zastępując ją ciepłą agarozą niskotopliwą, a następnie dodaje górny grzejnik (E). Na koniec cały zestaw przenosi się pod mikroskop, który tutaj jest reprezentowany przez obiektyw (F).
<img alt="Układy ogniw elektrochemicznych do testowania materiałów; widoczne elektrody i uchwyty próbek." src="/files/ftp_upload/3504/3504fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Szczegóły elementów uchwytu. Na zdjęciach przedstawiono zacisk z folii aluminiowej (A) utrzymujący nerkę (B). Zaznaczono również obszar, w którym znajduje się przeszczepiony grasica. Wskazuje on w przybliżeniu miejsce nacięcia torebki grasicy i wykonania kieszonki do umieszczenia grasicy embrionalnej. Górne szkiełko kryjące grzałki (C) zostało przymocowane silikonem do jego dolnej części (D).
Film 1. Obrazowanie intravitalne tymocytów Foxp3-GFP+ wewnątrz grasicy, w której podczas całego procesu utrzymywano fizjologiczne poziomy natlenienia i temperatury (37°C). Zwróć uwagę na przepływ krwi i ruch Tregs. Prędkości te można zmierzyć i porównać z opublikowanymi danymi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3504/3504movie1.avi">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.</a>
Film 2. Obrazowanie intravitalne komórek Treg wewnątrz grasicy; obrazy zostały zarejestrowane w temperaturze 30°C. Zwróć uwagę na brak ruchu oraz okrągły kształt komórek pomimo utrzymanego przepływu krwi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3504/3504movie2.avi">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.</a>

<ol><li>Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441, 235-238 (2006).</li>
<li>Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamsdell%2C+F+%22Current+protocols+in+immunology%22">Current protocols in immunology</a>. Coligan, J. E. , (2006).</li>
<li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4%2B+T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).</li>
<li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li>
<li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4%2B+T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).</li>
<li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li>
<li>Hugues, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+T+cell+dynamics+in+lymph+nodes+during+the+induction+of+tolerance+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity.</a> 5, 1235-1242 (2004).</li>
<li>Tang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+regulatory+T+cell+control+of+autoimmune+responses+in+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice.</a> Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).</li>
<li>Le Borgne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature immunology. 10, 823-830 (2009).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+Imaging+of+Leukocyte+Homing+and+Migration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo.</a> J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).</li>
<li>Barretto, R. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17, 223-228 (2011).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W niniejszej pracy przedstawiliśmy procedury obrazowania dwufotonowego tymocytów wewnątrz żywego zwierzęcia. Opisaliśmy również parametry, które należy starannie kontrolować, takie jak zachowanie przepływu krwi oraz utrzymanie temperatury organu podczas procedur obrazowania. Niemniej jednak, mimo starannych wysiłków w celu stabilizacji organu, mogą wystąpić artefakty ruchowe, takie jak „dryfowanie organu”. Korekcja obrazu a posteriori może zostać przeprowadzona za pomocą algorytmów opracowanych specjalnie w tym celu. Dalsza analiza obrazów może również stać się podstawą do opracowania nowych protokołów dążących do zminimalizowania błędów.
Gruczoł grasicy jest organem, w którym powstają wszystkie limfocyty T, dlatego jest to miejsce, na którym immunolodzy zainteresowani zrozumieniem generowania limfocytów T γδ, CD4 lub CD8 skupiają swoją uwagę. Większość badań dotyczących limfocytów T opiera się na różnicach w liczbie i/lub stabilności tych komórek po różnych manipulacjach in vitro/in vivo. Jednak dopiero dzięki wizualizacji in vivo mogliśmy zaobserwować interakcje między komórkami układu odpornościowego zaangażowanymi w utrzymanie homeostazy3-7. Zatem obserwacja tymocytów in vivo jest prawdopodobnie jedną z najważniejszych brakujących informacji pozwalających lepiej zrozumieć biologię limfocytów T. Intrawitalna TPM dostarcza szczegółowego obrazu ruchów i interakcji limfocytów T, a w niniejszej pracy demonstrujemy, w jaki sposób można ją wykorzystać do szczegółowych badań tymocytów. Każda technika ma jednak swoje ograniczenia. Choć obrazowanie intrawitalne jest najdokładniejszym systemem odzwierciedlającym zachowanie komórek wewnątrz organizmu, prawdą jest również, że pozyskiwanie obrazów z eksplantowanych organów jest mniej pracochłonne i było wykorzystywane do gromadzenia istotnych informacji o układzie odpornościowym8,9. Ponadto nie można zaprzeczyć, że metody obrazowania intrawitalnego wymagają zabiegu chirurgicznego w celu odsłonięcia tkanek i naczyń krwionośnych u znieczulonych zwierząt, co samo w sobie może spowodować zmianę fizjologii całego organu10. Niemniej jednak istnieją metody nieinwazyjne, które eliminują artefakty spowodowane procedurą chirurgiczną11, a opracowywane są nowe metody, które pozwalają na lepsze wcześniejsze przygotowanie zwierząt12. W związku z tym nowe procedury i narzędzia chirurgiczne zminimalizują lub ominą obecne ograniczenia obrazowania intrawitalnego, stając się coraz bardziej dostępne dla społeczności naukowej.
Wykazaliśmy, że opisana przez nas metoda jest wykonalna i pozwala na rejestrację wszystkich zastosowanych manipulacji systemowych in vivo, takich jak podawanie leków. W związku z tym sugerujemy stosowanie tej metody wraz z dostępnymi już technikami ex vivo w celu uzupełnienia i wzmocnienia dalszych badań dotyczących rozwoju tymocytów.

<table><tbody><tr><td>Dekstran znakowany rodaminą B izotiocyjanianem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9379</td><td>przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 20 mg/ml</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop dwufotonowy</td><td>Prairie Technologies Inc.</td><td>Prairie Ultima X-Y</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser Ti:Szafir</td><td>Coherent, Inc.</td><td>Chameleon Ultra Family</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw imersyjny 20x/1.00 NA</td><td>Olympus Inc.</td><td>XLUMPLFLN 20XW</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt (filtry/lustro dichroiczne)</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td></td><td></td><td>91018 BX2 (U-MF2)</td></tr><tr><td>Filtr 525 nm/50</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET525/50m</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr 595 nm/50</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET595/50m</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne 565 nm</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td></td><td></td><td>565dcxr</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Imaris</td><td>Bitplane AG Inc.</td><td>Imaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer Inc.</td><td>Volocity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH, USA</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie przyżyciowe grasicy myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Mikroskopia dwufotonowa (TPM) umożliwia obrazowanie głębokich obszarów wewnątrz tkanek i narządów. W połączeniu z rozwojem nowych narzędzi stereotaktycznych i procedur chirurgicznych, TPM staje się potężną techniką identyfikacji „nisz” wewnątrz narządów oraz dokumentowania „zachowań” komórkowych u żywych zwierząt. Choć obrazowanie intravitalne dostarcza informacji najlepiej oddających rzeczywiste zachowanie komórek wewnątrz narządu, jest ono bardziej pracochłonne i wymagające technicznie pod względem niezbędnego sprzętu i procedur niż alternatywne obrazowanie ex vivo. W związku z tym opisujemy procedurę chirurgiczną oraz nowy „stereotaktyczny” uchwyt do narządów, który pozwala nam śledzić ruchy komórek Foxp3+ w obrębie grasicy.
Foxp3 jest głównym regulatorem generowania regulacyjnych limfocytów T (Tregs). Ponadto komórki te można klasyfikować według ich pochodzenia: tzn. Tregs różnicujące się w grasicy nazywa się „naturalnie występującymi Tregs” (nTregs), w przeciwieństwie do Tregs konwertowanych obwodowo (pTregs). Chociaż w literaturze opisano znaczną ilość badań dotyczących fenotypu i fizjologii tych limfocytów T, bardzo niewiele wiadomo o ich oddziaływaniach in vivo z innymi komórkami. Niedobór ten może wynikać z braku technik pozwalających na przeprowadzenie takich obserwacji. Protokół opisany w niniejszej pracy stanowi rozwiązanie tego problemu.
Nasz protokół polega na wykorzystaniu myszy nude, które nie posiadają endogennego tymusu z powodu punktowej mutacji w sekwencji DNA, która upośledza różnicowanie niektórych komórek nabłonkowych, w tym komórek nabłonkowych tymusu. Myszy nude poddano naświetlaniu gamma, a następnie zrekonstruowano za pomocą szpiku kostnego (BM) pochodzącego od myszy Foxp3-KIgfp/gfp. Po regeneracji szpiku (6 tygodni), każdemu zwierzęciu wykonano przeszczep embrionalnego tymusu do torebki nerki. Po przyjęciu przeszczepu tymusu (6 tygodni), zwierzęta zanieczulono; nerkę z przeszczepionym tymusem odsłonięto, zamocowano w naszym uchwycie do organów i utrzymano w warunkach fizjologicznych w celu obrazowania in vivo za pomocą TPM. Wykorzystujemy to podejście do badania wpływu leków na generowanie limfocytów T regulatorowych.

Opracowaliśmy nowe narzędzia laboratoryjne i protokoły do obrazowania intravitalnego grasicy. Nasza technika powinna pomóc w identyfikacji „nisz” w obrębie grasicy, w których zachodzi rozwój limfocytów T.

Obrazowanie przyżyciowe grasicy myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Mikroskopia dwufotonowa (TPM) umożliwia obrazowanie głębokich obszarów wewnątrz tkanek i organów. W połączeniu z rozwojem nowych systemów stereotaktycznych...

Mikroskopia dwufotonowa umożliwia akwizycję obrazów w obszarach położonych głęboko wewnątrz organów. Wzbudzenie białek fluorescencyjnych w mikroskopii dwufotonowej następuje, gdy dwa fotony o zbliżonej energii oddziałują z cząsteczką, wywołując wzbudzenie równoważne absorpcji pojedynczego fotonu o dwukrotnie większej energii. W związku z tym w mikroskopie dwufotonowym stosuje się lasery podczerwone, co pozwala na obrazowanie w grubych tkankach przy jednoczesnym zminimalizowaniu fotobleachingu i fotouszkodzeń.Ponadto, ponieważ wzbudzenie jest ograniczone do płaszczyzny ogniskowej, nie występuje fluorescencja poza ogniskiem. W połączeniu z nowymi narzędziami stereotaktycznymi i procedurami chirurgicznymi staje się to potężną techniką dokumentowania zachowań komórkowych u żywych zwierząt. W niniejszej pracy mikroskopia dwufotonowa została wykorzystana do uzyskania obrazów intravitalnych grasicy.W tym narządzie zachodzi dojrzewanie limfocytów T, w związku z czym technika ta może być przydatna w badaniach nad rozwojem tymocytów. Przejdźmy teraz do protokołów. W pierwszej kolejności, aby przygotować zwierzęta, należy napromieniować ośmiotygodniowe zwierzęta nude dawką 900 rads. Po napromieniowaniu należy umieścić zwierzęta z powrotem w klatce do czasu transferu szpiku kostnego.Aby przygotować zawiesinę szpiku kostnego, po eutanazji myszy dawców za pomocą dwutlenku węgla i usunięciu kończyn tylnych, należy usunąć skórę i mięśnie z kości, a następnie umieścić je w PBS. Przenieść kości do nowej szalki Petriego zawierającej PBS. Odciąć końce kości.Napełnij strzykawkę roztworem PBS i wypłucz kości, używając igły o rozmiarze 25 G. Alternatywnie, przenieś kości do moździerza i rozetrzyj je tłuczkiem, a następnie zhomogenizuj szpik kostny poprzez energiczne pipetowanie i wiruj zawiesinę przez pięć minut przy 400 G. Resus.Zawiesić komórki w PBS i wstrzyknąć dożylnie naświetlonej myszy. W ciągu pierwszych dni po transferze dochodzi do pewnego rozmięku szpiku kostnego. W przypadku braku rekonstytucji, myszy zaczynają ginąć 10 dni po napromieniowaniu.Należy jednak odczekać od sześciu do ośmiu tygodni, aby uznać, że organizmy zwierząt w pełni się zrekonstytuowały. Kontynuując przygotowanie zwierząt: od czterech do sześciu tygodni po transferze szpiku kostnego zostanie przeprowadzony przeszczep zarodkowego grasicy, aby umożliwić obserwację tymocytów in vivo.Najpierw, po eutanazji ciężarnych samic w 15. dniu ciąży przy użyciu dwutlenku węgla i pobraniu embrionów, należy usunąć grasicę z każdego embrionu i umieścić ją na płytce z zimnym PBS do momentu użycia. Znieczulić zwierzęta biorcze ketaminą oraz ksylazyną i utrzymać je na podkładce grzewczej. Gdy zwierzę zostanie głęboko znieczulone, należy przemyć dany obszar etanolem. Przeciąć skórę, przeciąć błonę otrzewną, a następnie zlokalizować i odsłonić nerkę.Po odsłonięciu nerki należy wykonać niewielkie nacięcie w torebce nerki i stworzyć pod nią kieszonkę. Do wnętrza tej kieszonki wprowadza się embrionalny tymus. Na koniec nerkę umieszcza się w pierwotnym położeniu, a następnie zamyka jamę otrzewną oraz skórę.W przypadku nałożenia szwów zwierzę musi otrzymać leki przeciwbólowe i zostać umieszczone na podkładce grzewczej do czasu wybudzenia z narkozy. Stosunek komórek CD4+ do komórek CD8+ można monitorować w odstępach tygodniowych poprzez analizę próbek krwi. Zwierzęta z wynikiem stosunku w okolicach 1,521 zaakceptowały grasicę.Procentowy udział populacji tyreocytów w przeszczepionym grasicy jest podobny do odsetka stwierdzanego w grasicy endogennej zwierząt kontrolnych. Obrazowanie intravitalne przeszczepionej grasicy będzie wymagało przeprowadzenia ponownego zabiegu chirurgicznego oraz zastosowania naszego urządzenia do unieruchamiania zwierząt. Najpierw należy podać ketaminę, ksylazynę oraz środki znieczulające.Gdy zwierzę straci przytomność, umieść je na podgrzewaczu. Wstrzyknij dożylnie dekstran znakowany izotiocyjanianem Rodina, aby umożliwić późniejszą obserwację przepływu krwi w tkance. Rozetnij skórę i jamę otrzewną, aby odsłonić nerkę z przeszczepionym grasicą, zapobiegając powrotowi nerki na jej pierwotną pozycję.Zamknąć boczny brzeg nacięcia skóry za pomocą szwów. Przenieść zwierzę na podkładkę grzewczą umieszczoną na platformie uchwytu dla zwierzęcia. Ścisnąć obie strony nerki.Użycie zacisku wykonanego z folii aluminiowej. Zamknij uchwyt dla zwierzęcia i umieść grzałkę górną. Umieść sondę jak najbliżej tkanki.Nałóż niskotopiący agar na wierzch preparatu. Przykryj cały preparat grzałką górną. Monitoruj znieczulenie i podawaj dodatkowe dawki środka znieczulającego co 40 minut.Po zakończeniu operacji cały układ zostaje przeniesiony do mikroskopu dwufotonowego w celu dalszej akwizycji obrazów. W naszym przypadku użyliśmy mikroskopu dwufotonowego Prairie Ultima wyposażonego w laser szafirowy tie, cztery detektory PMT oraz obiektyw imersyjny wodny 20 x. Najpierw należy włączyć laser i mikroskop.Następnie należy dodać lustra RIC i zestawy filtrów zgodnie z pożądanymi długościami fal. Umieść zwierzę w mikroskopie. Podłącz wszystkie maty grzewcze do ich sterowników.Nanieś wodę na otwór górnej grzałki, a następnie ostrożnie zanurz obiektyw w wodzie. Ustaw ostrość na naczynia krwionośne lub regiony GFPT za pomocą zewnętrznego kontrolera XY i Z. Szybko zlokalizuj obszar zainteresowania.Dostrój wzmocnienie w PMT, aby zoptymalizować separację kolorów i zminimalizować moc lasera niezbędną do uzyskania wystarczającego sygnału względem tła. Po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania rozpocznij akwizycję obrazowania time-lapse, wykonując sekwencyjne obrazy objętości tkanki o głębokości 50 µm w naszej podstawowej konfiguracji. Nabycie każdej objętości trwa 30 s.W związku z tym czas akwizycji obrazu wynoszący 30 minut zostaje osiągnięty po 60 sekwencyjnych powtórzeniach tej objętości. Film ten przedstawia komórki dodatnie pod kątem GFP wewnątrz grasicy. Należy zwrócić uwagę na ruch komórek oraz przepływ krwi w naczyniach.Jeśli jednak preparat jest niewłaściwy, co w tym przypadku objawia się niską temperaturą organu, komórki przestają się poruszać mimo utrzymującego się przepływu krwi. Opisana tutaj metoda umożliwia obserwację tymocytów in vivo.Metody te powinny być bardzo przydatne dla każdego immunologa zainteresowanego obserwacją dystrybucji i interakcji tymocytów podczas rozwoju limfocytów T; mimo że są one dość proste, należy zwrócić uwagę na kilka kroków, aby uniknąć artefaktów eksperymentalnych. Na przykład, należy zadbać o to, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych, ponieważ zmniejszyłoby to natlenienie tkanki. Ponadto przez cały czas należy utrzymywać temperaturę 37 °C.Wreszcie, uzyskane tutaj wyniki powinny być bardzo przydatne do walidacji wszelkich innych wyników lub danych otrzymanych za pomocą technik x vivo.

intravital-imaging-of-the-mouse-thymus-using-2-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obrazowanie intravitalne grasicy mysich z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Obrazowanie dwufotonowe pozwoliło na odkrycie ruchomości limfocytów oraz oddziaływań komórkowych w obrębie węzła chłonnego w warunkach podstawowych oraz podczas odpowiedzi immunologicznej 1. W niniejszej pracy demonstrujemy adoptywny transfer limfocytów T, izolację węzłów chłonnych oraz obrazowanie ruchomości limfocytów T CD4+ w wypreparowanym węźle chłonnym.

Disekcja i obrazowanie dwufotonowe obwodowych węzłów chłonnych u myszy

Przedstawiamy szczegółowe instrukcje dotyczące generowania chimer noworodkowych, a także sekcji i przygotowania grasicy do obrazowania ex vivo za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Obrazowanie in situ grasicy myszej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Opisujemy metodę wielokrotnej wizualizacji mikrogleju mysiego oraz monocytów krążących in vivo w czasie liczonym w godzinach, dniach lub tygodniach, z wykorzystaniem transkranialnej mikroskopii dwufotonowej. Demonstrujemy sposób przygotowania okna z cienkiej czaszki, które umożliwia przerywaną obserwację spoczywającego mikrogleju, który może zostać aktywowany poprzez sąsiednią stereotaktyczną iniekcję białka regulatorowego Tat wirusa HIV-1.

Technika cienkiej okienkowej czaszki do przewlekłego obrazowania dwufotonowego in vivo mikrogleju mysiego w modelach neurozapalenia

Source: Nishimura, C.  Kwantyfikacja architektury naczyń mózgowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej w mysim modelu zapalenia nerwów wywołanego wirusem HIV. J. Vis. Exp. (2016). Ten film pokazuje wizualizację in vivo naczyń włosowatych kory mózgowej myszy przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Przedstawiono w nim etapy wstrzykiwania barwnika fluorescencyjnego znieczulonej myszy z cienkim oknem korowym czaszki, przygotowywania zestawu do obrazowania i uzyskiwania szczegółowych obrazów struktur...

 Mikroskopia dwufotonowa do obrazowania in vivo mikrokrążenia mózgu myszy 

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Celem protokołu jest pokazanie podłużnego śledzenia tymocytów w czasie rzeczywistym za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej w implantach grasicy w przedniej komorze oka myszy. Przezroczystość rogówki i unaczynienie przeszczepu pozwala na ciągłe rejestrowanie rekrutacji komórek progenitorowych i wyjścia dojrzałych komórek T.

Śledzenie w czasie rzeczywistym in vivo tymocytów w przedniej komorze oka za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej

W tym badaniu prezentujemy protokół do przeprowadzenia dwufotonowego obrazowania intravital i analizy interakcji komórkowych w mysiej błonie śluzowej tchawicy po zakażeniu wirusem grypy. Protokół ten będzie istotny dla naukowców badających dynamikę komórek odpornościowych podczas infekcji dróg oddechowych.

Obrazowanie interakcji komórkowej w błonie śluzowej tchawicy podczas zakażenia wirusem grypy za pomocą dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Obecny protokół opisuje procedurę radiologii interwencyjnej ustaloną dla iniekcji dograsiczych u myszy, aby uniknąć ryzyka otwartej operacji i poprawić dokładność ślepych iniekcji przezskórnych.

Minimalnie inwazyjna, dokładna i wydajna technika wstrzykiwania dograsiczego u myszy

Tutaj prezentujemy protokół do dożylnego obrazowania przeszczepionego lewego płuca myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Stanowi to cenne narzędzie do badania dynamiki i interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym po przeszczepie płuc u myszy.

Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

Badanie to przedstawia podejście in vivo do obrazowania dwufotonowego do wizualizacji struktur niskoprogowych zakończeń aksonów mechanoreceptorów (LTMR) w skórze przedniej łapy myszy. Wykorzystując powtarzalne, wysokorozdzielcze obrazowanie poszczególnych aksonów, metoda ta stanowi nową platformę do badania struktury i funkcji skórnego obwodu czuciowego podczas rozwoju oraz u dorosłych.

Dwufotonowe obrazowanie wewnątrzżyciowe morfologii aksonów dotykowych u skóry myszy

Poznaj metodę obrazowania przyżyciowego grasicy myszy za pomocą mikroskopii 2-fotonowej. Technika ta umożliwia badanie dynamiki i interakcji tymocytów podczas rozwoju komórek T in vivo.

Obrazowanie przyżyciowe grasicy myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Przeglądaj więcej filmów