Name: Pomiar szybkich przepływów wapnia w kardiomiocytach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Poznaj metodę pomiaru szybkich przepływów wapnia w żywych kardiomiocytach przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia analizę sygnałów wapniowych o różnej skali czasowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była finansowana z grantów National Institutes of Health nr 2R01 GM53132 oraz P50 GM071558.

1. Obciążanie komórek wskaźnikami wapnia
<ol>
 <li>Wysiać komórki do szalek MatTek z szklanym dnem o średnicy 35 mm (lub innych komór obserwacyjnych z szklanym dnem).</li>
 <li>W przypadku użycia pierwotnych miocytów, pokryć komory lamininą (10 μg/ml) na jeden dzień przed wysiewem. Wysiać miocyty sercowe (izolowane od dorosłych psów, noworodków szczurów lub innych organizmów) w buforze KB (bufor Tyrode'a z odwróceniem potasu: 35 mmol/L HEPES, 140 mmol/L KCl, 8 mmol/L KHCO3, 2 mmol/L MgCl2 oraz 0,4 mmol/L KH2PO4, pH 7,5), a następnie stopniowo zamienić go na pożywkę M199 uzupełnioną o 15% płodowej surowicy bydlęcej, 1% streptomycyny i 0,5% gentamycyny; inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2.</li>
 <li>Inkubować komórki z calcium green AM (1-5 μM; Molecular Probes) lub dowolnym innym wybranym wskaźnikiem wapnia przez 30-45 min w temperaturze pokojowej. Przykryć szalkę folią aluminiową, aby zapobiec fotowyblakaniu barwnika.</li>
 <li>Przemyć komórki trzykrotnie pożywką Leibovitz15 z dodatkiem 14 mM EGTA (jeśli eksperymenty są prowadzone w warunkach niskiego stężenia wapnia) lub dowolną odpowiednią pożywką do obrazowania.</li>
 <li>Inkubować przez kolejne 30-45 minut w pożywce Leibovitz15 zawierającej 14 mM EGTA.</li>
 <li>W przypadku badania efektów inhibitorów (np. inhibitora PLC U73122 w stężeniu 10 μM), dodać je podczas drugiej inkubacji.</li>
</ol>
2. Mikroiniekcja komórek
<ol>
 <li>Kultywuj kardiomiocyty w szalkach MatTek z szklanym dnem (lub innych komorach do obserwacji) przez 24 h.</li>
 <li>Wymień medium na bezfenolowe Leibovitz-15 z 14 mM EGTA (kardiomiocyty muszą być wstrzykiwane w medium wolnym od wapnia, pozostałe komórki mogą być wstrzykiwane w medium zawierającym wapń).</li>
 <li>Przygotuj roztwór do mikroiniekcji – w naszych badaniach zastosowano peptyd, który eliminuje oddziaływania Gαq – caveolae. Należy pamiętać, że do komórki wstrzykiwana jest jedynie niewielka objętość (˜fL), dlatego należy stosować odpowiednio skoncentrowane roztwory stokowe. Użyliśmy 2 μM tego peptydu, Cav3-scaffold, z DAPI w medium wolnym od wapnia. DAPI to niebieski barwnik, który barwi jądro komórkowe i pozwala na identyfikację komórek poddanych mikroiniekcji. DAPI nie zakłóca fluorescencji wielu wskaźników wapnia. Ilość DAPI jest zmienna; zazwyczaj stosujemy ilość wystarczającą do wizualizacji jądra (0,5 i 2 μM).</li>
 <li>Przygotuj roztwór kontrolny zawierający DAPI – sam barwnik śledzący.</li>
 <li>Do mikroiniekcji użyj igieł samodzielnie dociąganych lub dostępnych komercyjnie. Przećwicz wstrzykiwanie barwnika, aby określić właściwe parametry igły. Zauważamy, że różne komórki mogą wymagać różnych średnic igieł i różnych ciśnień mikroiniekcji.</li>
 <li>Użyj zautomatyzowanego systemu do mikroiniekcji, na przykład InjectMan NI2 z pompą FemtoJet firmy Eppendorf. Ustaw ciśnienie iniekcji Pi na 90 hPa oraz ciśnienie kompensacyjne Pc na 45 hPa. Ustaw czas iniekcji t na 0,7 s. W razie potrzeby ponownie dostosuj parametry iniekcji.</li>
 <li>Wykonaj mikroiniekcje na mikroskopie odwróconym (np. Zeiss Axiovert 200M) wyposażonym w obiektyw do kontrastu fazowego o dużej odległości roboczej (na przykład obiektyw powietrzny 40x fazy 2).</li>
 <li>Wstrzyknij roztwór do jak największej liczby komórek w szybkim tempie. Obejrzyj wstrzyknięte komórki w kontraście fazowym, aby wybrać komórki żywotne.</li>
</ol>
3. Badania ko-immunofluorescencyjne
<ol>
 <li>Przemyć komórki dwukrotnie PBS i utrwalić 3,7% paraformaldehydem przez 30 minut. W razie potrzeby komórki można stymulować przed utrwaleniem.</li>
 <li>Przemyć utrwalone komórki trzykrotnie PBS, a następnie inkubować z 0,2% NP40 w PBS przez 5 minut.</li>
 <li>Zablokować miejsca nieswoistego wiązania, używając PBS zawierającego 4% surowicy koziej (lub innej odpowiedniej surowicy) przez 1 godzinę.</li>
 <li>Inkubować komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym w odpowiednim rozcieńczeniu z 1% surowicą kozią w PBS przez 1 godzinę.</li>
 <li>Przemyć komórki trzykrotnie przez 10 minut roztworem 150 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,6, a następnie dodać znakowane fluorescencyjnie przeciwciało wtórne, takie jak przeciwciało wtórne Alexa-Fluor-488 anty-królicze lub Alexa-Fluor-647 anty-mysie rozcieńczone 1:1000 w 1% surowicy koziej w PBS (należy pamiętać, że przy wykrywaniu dwóch różnych białek przeciwciała pierwszorzędowe muszą być wytworzone w różnych gatunkach, a przeciwciała wtórne muszą być skierowane przeciwko odpowiednim gatunkom).</li>
 <li>Inkubować w temperaturze 37°C przez 1 godzinę, a następnie przemyć trzykrotnie TBS.</li>
 <li>Obserwować komórki w buforze TBS lub innym odpowiednim medium do obserwacji.</li>
</ol>
4. Szybkie obrazowanie wapnia
<ol>
 <li>Należy użyć konfokalnego mikroskopu skaningowego (np. Fluoview 1000 Olympus).</li>
 <li>Należy zastosować obiektyw o wysokiej aperturze numerycznej.</li>
 <li>Należy ustawić parametry akwizycji. W przypadku użycia calcium green należy zastosować wzbudzenie 488 nm oraz filtry emisyjne long pass 515.</li>
 <li>Należy dostosować czas piksela – dla szybkich pomiarów stężenia wapnia ustawić go na 2 μs/pixel.</li>
 <li>Należy ustawić powiększenie obrazu tak, aby uzyskać rozmiar piksela od 0,05 do 0,3 μm.</li>
 <li>Należy wybrać linię z wybranej komórki w konkretnym obszarze.</li>
 <li>W oknie sterowania czasem należy wybrać akwizycję czasową dla co najmniej 1500 skanów (aby uzyskać pożądany zakres czasowy odpowiedzi – 1,3 ms/line pozwoliłoby uzyskać 2 sekundy).</li>
 <li>Należy zarejestrować odczyt tła przed stymulacją.</li>
 <li>Komórki należy stymulować 5 μM karbacholu i natychmiast rozpocząć rejestrację danych. Komórki powinny znajdować się w 1 mL pożywki Leibovitz15; należy przygotować 10 μM karbacholu w pożywce Leibovitz15 i delikatnie dodać 1 mL do naczynia.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
 <li>Wyodrębnij intensywności dla każdego piksela z zarejestrowanego obrazu. Zapisz dane o intensywności w formie tabeli przy użyciu oprogramowania Fluoview 1000.</li>
 <li>Zaimportuj dane o intensywności do programu Sigmaplot lub podobnego programu do analizy danych i pogrupuj dane w ˜9-40 przedziałów (biny). Porównaj wyniki z eksperymentami kontrolnymi oraz szumem elektronicznym.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Obrazowanie komórek przeprowadzono przy użyciu skaningowego mikroskopu konfokalnego LSM510 (Zeiss, Jena, Niemcy) wyposażonego w wieloliniowe wzbudzenie laserowe oraz obiektyw apochromatyczny z imersją wodną 40x/1.2 NA. Na Rys. 1 (czerwony) przedstawiono rozkład kaweol w utrwalonych i barwionych przeciwciałem przeciwko kaweolinie-3 kardiomiocytach komór komory serca dorosłego psa; kaweolina-3 jest głównym białkiem strukturalnym kaweol w tych komórkach 9. Kaweolinę-3 oznakowano immunochemicznie fluorophorem Alexa-647 i wzbudzano linią 633-nm lasera He:Ne. Obrazy rejestrowano przy użyciu filtra emisyjnego LP650 nm. Rozkład kaweoliny-3 porównano z Gαq, która została oznakowana immunochemicznie Alexa-488 (zielony). Alexa-488 wzbudzano linią 488nm lasera argonowo-jonowego, a obraz rejestrowano przy użyciu filtra emisyjnego BP505-530nm. W tych pomiarach kolokalizacji oba fluorofory wzbudzano sekwencyjnie, korzystając z akwizycji Multi Track. Procedura ta minimalizuje przesłuchy między kanałami (cross-talk). Analizę danych pod kątem kolokalizacji przeprowadzono przy użyciu oprogramowania AIM dostarczanego z Zeiss LSM510-Meta. Jak widać, oba białka są kolokalizowane.
Aby określić, w jaki sposób sprzężenie kaweoliny-3 z Gαq wpływa na sygnały wapniowe, przeprowadziliśmy badania obrazowania wapnia przy użyciu systemu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego (Fluoview, Olympus, Tokyo, Japonia) sprzężonego z mikroskopem odwróconym (IX70, Olympus) z obiektywem 40x (UPlanApo, Olympus, apertura numeryczna 1,3), choć pomiary te można było przeprowadzić również na systemach Zeis opisanych powyżej. Do tych pomiarów komórki obciążono barwnikiem Ca2+ Green. Barwnik wzbudzano laserem argonowym 488nm, a obrazy gromadzono za pomocą filtra emisyjnego LP515. Klatki obrazów zbierano w odstępach 500 ms. Wartości intensywności dla każdego piksela wyekstrahowano przy użyciu oprogramowania Olympus oraz programu ImageJ. Tryb skanowania liniowego (line scan) wykorzystano do analizy ilościowej szybszych przejściów Ca2+ oraz iskier wapniowych (Ca2+ sparks). Rozmiar piksela zastosowany w niniejszym badaniu wynosił 0,1-0,3 μm. Szybkość skanowania liniowego wynosiła około kilkuset μs na linię. Na Rys. 2 przedstawiamy skan liniowy kardiomiocytu obciążonego Ca2+ Green, w którym czas przebywania piksela wynosił 2 μs, a czas linii 142 μs. Obraz składa się z 1200 linii.
Każda linia skanu odpowiada fluktuacji intensywności Ca2+ Green, składającej się z 71 punktów pobranych w zakresie 142 μs, i może służyć jako szybki odczyt odpowiedzi wapniowych. Na przykład na rys. 3 przedstawiamy aktywność Ca2+ pojedynczej linii pojedynczego kardiomiocyta, mierzoną jako intensywność fluorescencji Ca2+ Green w funkcji czasu w sekundach przed (góra) i po (dół) dodaniu 5 μM karbacholu, który zwiększa poziom wewnątrzkomórkowego Ca2+ poprzez aktywność Gαq-PLCβ. Po uśrednieniu wielu linii stymulacja karbacholem powoduje ˜1,8-krotny wzrost intensywności Ca2+ Green. Ze względu na zmienność warunków eksperymentalnych (temperatura pokojowa, moc lasera, odpowiedź detektora, rozkład barwnika itp.), wzrost ten może nie być widoczny w pojedynczych skanach liniowych. Mimo że wartości intensywności (wartości na osi y) są podobne, wyraźnie widać, że wykres stymulowany karbacholem na dole ma znacznie szersze piki, odpowiadające bardziej trwałym poziomom wapnia, niż wąskie piki fluktuacji widoczne przed stymulacją. To poszerzenie i względny wzrost intensywności maskują małe, wolniejsze oscylacje. Naszym celem jest lepsze rozróżnienie między tymi różnymi pozornymi typami fluktuacji wapnia.
Kolejny przykład tych szybkich fluktuacji wapnia przedstawiono na Ryc. 4. Górny wykres pokazuje surowe dane liniowe dla stymulowanych kardiomiocytów komorowych (kolor czerwony), a czarną linią zaznaczono średnią z 3 śladów liniowych. Aby określić w jakim stopniu fluktuacje wapnia były pośredniczone przez oddziaływania Gαq - kaveolina3, przeprowadzono mikroiniekcję peptydu destabilizującego oddziaływania kaveolina-3 - Gαq (tj. peptydu Cav3), co eliminuje dłuższy prąd Ca2+; dane te przedstawiono kolorem niebieskim (zauważamy, że od intensywności sygnału peptydu Cav3 odjęto wartość 500, aby oba ślady były lepiej rozróżnialne).
Kolumny surowych danych z naszych plików Excel zaimportowaliśmy do programu Sigmaplot (Jandel, Inc.) i przeprowadziliśmy analizę histogramową. W tej analizie liczba zdarzeń jest grupowana w równą liczbę przedziałów (koszy), aby utworzyć histogram. Szerokość przedziału reprezentuje równy odstęp czasu. Intensywności są wprowadzane do poszczególnych przedziałów czasowych w taki sposób, aby wysokość danego przedziału odpowiadała liczbie wystąpień danej intensywności w określonym oknie czasowym. Ponieważ ten rodzaj analizy zależy wyłącznie od zbierania danych z taką samzą częstotliwością skanowania, wiele przebiegów można analizować jednocześnie. Dodatkowo analiza ta nie jest wrażliwa na różnice w poziomach barwnika, mocy lasera itp., a szum elektroniczny i tło występują w bardzo krótkich skalach czasowych i są widoczne jedynie w pierwszych 1-2 przedziałach.
Odpowiadające surowym danym histogramy z Rys. 4 przedstawiono na dole strony. Histogram dla komórek kontrolnych jest rozłożony na dużą liczbę przedziałów odpowiadających szerokiemu rozkładowi czasowemu, co obrazuje czerwona linia (linia ta służy jedynie jako pomoc wizualna i nie zakłada żadnego modelu). W przeciwieństwie do tego, przedziały dla odpowiedzi komórek, w których interakcja Gαq-Cav3 została przerwana przez peptyd, ograniczają się do wąskiego rozkładu przedziałów, co sugeruje, że obecność peptydu eliminuje przepływy o dłuższym czasie trwania. Mikroiniekcja peptydu kontrolnego, który nie przerywa interakcji Gαq-Cav3, daje histogram podobny do komórek niepoddanych iniekcji8.
Na rys. 5 porównujemy szybkie fluktuacje intensywności Ca2+Green w dorosłych kardiomiocytach komorowych psa (lewo) oraz w świeżych, niestymulowanych kardiomiocytach neonatalnych szczura, które nie posiadają kaweol (prawo). W tym przypadku odpowiadające im histogramy intensywności z okresu 3 minut zostały pogrupowane w przedziały o szerokości 35, aby uwidocznić wolniejsze zdarzenia wapniowe. Należy zauważyć, że kardiomiocyty neonatalne wykazują szybkie fluktuacje na płaskiej linii bazowej, co wskazuje na brak wolniejszej aktywności Ca2+, podczas gdy w przypadku komórek dorosłych widoczna jest bardziej ustrukturyzowana linia bazowa. Różnice te są najlepiej widoczne na histogramach.
<img alt="Mikroskopia kolokalizacji Gαq i kaweol; obraz fluorescencyjny pokazujący interakcję białek." src="/files/ftp_upload/3505/3505fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Obrazy dorosłych kardiomiocytów komorowych psa pokazujące rozkład Gαq znakowanego immunofluorescencyjnie Alexa-488, gdzie Alexa-488 był wzbudzany linią lasera argonowego 488nm, a obraz zapisano przy użyciu filtra emisyjnego BP505-530nm. W prawym górnym rogu znajduje się ten sam obraz przedstawiający lokalizację kaweoliny-3 znakowanej immunofluorescencyjnie Alexa-647, wzbudzanej linią 633-nm lasera He:Ne i zapisanej przy użyciu filtra emisyjnego LP650 nm. Na dole po lewej znajduje się obraz scalony, na którym kolokalizacja jest widoczna w kolorze pomarańczowym, z powiększonym fragmentem obrazu po prawej stronie.



<img alt="Obrazowanie wapnia w kardiomiocytach, mikroskopia fluorescencyjna, pokazująca zieloną fluorescencję wapnia." src="/files/ftp_upload/3505/3505fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Obrazowanie wapnia w żywym, dorosłym kardiomiocycie komorowym psa obciążonym barwnikiem Ca2+ Green. Obraz wykonano przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego z obiektywem 40x, wykorzystując laser argonowy 488nm oraz filtr emisji LP515. Obraz składa się z 1200 linii, czas ekspozycji piksela wynosił 2 μs, a rozmiar piksela 0.1 μm.
<img alt="Wykres intensywności optycznej stymulowanej i niestymulowanej; wykres danych dla analizy odpowiedzi fotonicznej." src="/files/ftp_upload/3505/3505fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. GÓRA: Fluktuacje intensywności śladu liniowego z żywego, dorosłego kardiomiocyta komorowego psa obciążonego Ca2+ Green i obrazowanego zgodnie z opisem, oraz DÓŁ: ta sama komórka stymulowana poprzez dodanie 5 μM karbacholu.
<img alt="Aktywność wapnia w kardiomiocytach; zawiera histogramy z analizą danych kontrolnych i dla peptydu Cav3." src="/files/ftp_upload/3505/3505fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. GÓRA Przykład zapisów liniowych z żywego, dorosłego kardiomiocytu komorowego psa załadowanego barwnikiem Ca2+ Green (czerwony), wykonanych w czasie 180 ms, gdzie średnia z 3 zapisów przedstawiona jest czarną linią, w porównaniu do komórki po mikroiniekcji peptydu zaburzającego oddziaływanie Gαq-kaweolina 3 (czerwony), gdzie średnia z trzech zapisów przedstawiona jest w kolorze czarnym. Zauważamy, że dla ułatwienia wizualizacji od dolnego zestawu danych odjęto 400 jednostek intensywności. Dolne panele to odpowiadające im histogramy danych pogrupowanych w koszyki (biny), zgodnie z opisem w tekście, gdzie numer koszyka jest dowolny, a liczba zliczeń w koszyku (lub po prostu liczba zliczeń) odpowiada całkowitej intensywności w tym konkretnym koszyku. Zaznaczamy, że czerwone i niebieskie linie naniesione na histogramach kontrolnych (lewo) i peptydowych (prawo) służą ułatwieniu identyfikacji i porównania danych; nie przyjęto przy tym żadnego modelu.
<img alt="dane dla niestymulowanych miocytów; wykresy intensywności w funkcji czasu oraz histogramy; analiza wykresów; analiza biologiczna" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Poniżej przedstawiono fluktuacje intensywności Ca2+Green w dorosłych kardiomiocytach komorowych psa (lewo) oraz świeżych, niestymulowanych kardiomiocytach noworodka szczura pozbawionych kaweoli (prawo) wraz z odpowiadającymi im histogramami.

<ol><li>Cheng, H., Lederer, M. R., Lederer, W. J., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sparks+and+%5BCa2%2B%5Di+waves+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium sparks and [Ca2+]i waves in cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 270, 148-159 (1996).</li>
<li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Calcium Sparks.</a> Physiol. Rev. 88, 1491-1545 (2008).</li>
<li>Rebecchi, M. J., Pentyala, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+control+of+phosphoinositide-specific+phospholipase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Physiol.Rev%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and control of phosphoinositide-specific phospholipase.</a> C. Physiol.Rev. 80, 1291-1335 (2000).</li>
<li>Suh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+roles+of+phosphoinositide-specific+phospholipase+C+isozymes%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+reports%22%5BJournal%5D)">Multiple roles of phosphoinositide-specific phospholipase C isozymes.</a> BMB reports. 41, 415-434 (2008).</li>
<li>Schlegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crowded+little+caves%3A+structure+and+function+of+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Signal%22%5BJournal%5D)">Crowded little caves: structure and function of caveolae.</a> Cell. Signal. 10, 457-463 (1998).</li>
<li>Anderson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+caveolae+membrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The caveolae membrane system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 199-225 (1998).</li>
<li>Sengupta, P., Philip, F., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-1+alters+Ca2%2B+signal+duration+through+specific+interaction+with+the+G%7Balpha%7Dq+family+of+G+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Caveolin-1 alters Ca2+ signal duration through specific interaction with the G{alpha}q family of G proteins.</a> J. Cell. Sci. 121, 1363-1372 (2008).</li>
<li>Guo, Y., Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Ca2%2B+Activity+in+Cardiomyocytes+through+Caveolae-G%5Balpha%5Dq+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical.+Journal%22%5BJournal%5D)">Modulation of Ca2+ Activity in Cardiomyocytes through Caveolae-G[alpha]q Interactions.</a> Biophysical. Journal. 100, 1599-1607 (1016).</li>
<li>Rybin, V. O., Xu, X., Lisanti, M. P., Steinberg, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+targeting+of+beta+-adrenergic+receptor+subtypes+and+adenylyl+cyclase+to+cardiomyocyte+caveolae.+A+mechanism+to+functionally+regulate+the+cAMP+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential targeting of beta -adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase to cardiomyocyte caveolae. A mechanism to functionally regulate the cAMP signaling pathway.</a> J. Biol. Chem. 275, 41447-41457 (2000).</li>
<li>Tovey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+puffs+are+generic+InsP3-activated+elementary+calcium+signals+and+are+downregulated+by+prolonged+hormonal+stimulation+to+inhibit+cellular+calcium+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium puffs are generic InsP3-activated elementary calcium signals and are downregulated by prolonged hormonal stimulation to inhibit cellular calcium responses.</a> J. Cell. Sci. 114, 3979-3989 (2001).</li>
<li>Lohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ignition+of+Calcium+Sparks+in+Arterial+and+Cardiac+Muscle+Through+Caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Ignition of Calcium Sparks in Arterial and Cardiac Muscle Through Caveolae.</a> Circ. Res. 87, 1034-1039 (2000).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opracowaliśmy metodę obrazowania i izolowania szybkich sygnałów wapniowych w żywych kardiomiocytach. Chociaż warunki eksperymentalne tych pomiarów były wcześniej stosowane w innych układach komórkowych10, jak i w kardiomiocytach11, zastosowanie histogramów i analizy przedziałowej (bin analysis) pozwala na pozyskanie danych z wielu zdarzeń Ca2+. Szybsze zdarzenia można łatwo odizolować od wolniejszych, a następnie dostosować modele w celu zrozumienia ich mechanizmów. Hodowla kardiomiocytów...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar szybkich przepływów jonów wapnia w kardiomiocytach

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Kardiomiocyty charakteryzują się wieloma przepływami Ca2+ o różnym czasie trwania, które wspólnie optymalizują funkcję komórek 1,2. Zmiany aktywności Ca2+ w odpowiedzi na czynniki zewnątrzkomórkowe są regulowane głównie przez szlak fosfolipazy Cβ- Gαq zlokalizowany w błonie komórkowej, który jest stymulowany przez takie czynniki jak acetylocholina 3,4. Niedawno odkryliśmy, że domeny białkowe błony komórkowej nazywane kaweolami5,6 mogą zatrzymywać aktywowane Gαq 7. Zatrzymanie to prowadzi do stabilizacji stanu aktywnego Gαq, co skutkuje przedłużonymi sygnałami Ca2+ w kardiomiocytach i innych typach komórek8. Ten zaskakujący wynik odkryliśmy, mierząc dynamiczne odpowiedzi wapniowe w krótkiej skali czasowej w żywych kardiomiocytach. W skrócie, komórki są obciążane fluorescencyjnym wskaźnikiem Ca2+. W naszych badaniach zastosowaliśmy Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.), który wykazuje wzrost intensywności emisji fluorescencji po związaniu jonów wapnia. Intensywność fluorescencji jest następnie rejestrowana przy użyciu trybu skanowania liniowego (line-scan) w konfokalnym mikroskopie laserowym. Metoda ta pozwala na szybką akwizycję przebiegu czasowego intensywności fluorescencji w pikselach wzdłuż wybranej linii, generując kilkaset przebiegów czasowych w skali mikrosekundowej. Te bardzo szybkie przebiegi są przenoszone do programu Excel, a następnie do programu Sigmaplot w celu analizy i są porównywane z przebiegami uzyskanymi dla szumu elektronicznego, wolnego barwnika oraz innych kontroli. Aby przeanalizować odpowiedzi Ca2+ o różnych szybkościach przepływu, przeprowadziliśmy analizę histogramową, w której intensywności pikseli pogrupowano w przedziały czasowe (binning). Binning pozwala nam zgrupować ponad 500 przebiegów skanów i zwizualizować skumulowane wyniki przestrzennie i czasowo na jednym wykresie. Dzięki temu wolne fale Ca2+, które są trudne do rozróżnienia podczas nakładania skanów ze względu na różnice w rozmieszczeniu pików i szum, mogą być łatwo dostrzeżone w histogramach pogrupowanych. Bardzo szybkie przepływy w skali czasowej pomiaru wykazują wąski rozkład intensywności w bardzo krótkich przedziałach czasowych, podczas gdy dłuższe fale Ca2+ wykazują dane pogrupowane o szerokim rozkładzie w dłuższych przedziałach czasowych. Te zróżnicowane rozkłady czasowe pozwalają nam analizować czas występowania przepływów Ca2+ w komórkach oraz określać ich wpływ na różne zdarzenia komórkowe.

Przedstawiamy metodę izolacji szybkich (mikrosekundowych) zdarzeń wapniowych od wolniejszych przepływów w żywych komórkach z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii skanującej. Metoda ta mierzy fluktuacje intensywności fluorescencji wskaźników wapnia poprzez rejestrację skanów liniowych obejmujących kilkaset pikseli w komórce. Analiza histogramowa pozwala na wyizolowanie skal czasowych różnych przepływów wapnia.

Pomiar szybkich przepływów jonów wapnia w kardiomiocytach

Kardiomiocyty charakteryzują się wieloma przepływami jonów Ca2+ o różnym czasie trwania, które współdziałają w celu optymalizacji funkcji 1,2. Zmiany w aktywności Ca2+ w odpowiedzi na ...

Ogólnym celem tej procedury jest analiza szybkich sygnałów wapniowych o różnym czasie trwania. Osiąga się to poprzez uprawę komórek na szkiełku lub w studzience umożliwiających ich obrazowanie. Następnie komórki są obciążane fluorescencyjnym wskaźnikiem wapnia.Następnie do komórek wstrzykuje się za pomocą mikroiniekcji lek lub inne interesujące białko. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie szybkiego obrazowania fluorescencyjnego przy użyciu mikroskopu konfokalnego. W rezultacie można ocenić odpowiedzi wapniowe w różnych skalach czasowych.Nazywam się ULA Ska. Jestem pracownikiem naukowym w laboratorium dr. Scar. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu sygnalizacji komórkowej, takie jak wpływ konkretnego leku na szlaki mobilizacji wapnia w komórkach.Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapie arytmii serca. Ponieważ przyjmuje się, że arytmie serca wynikają z zaburzeń podstawowych prądów wapniowych, dzień przed rozpoczęciem procedury należy pokryć 35 milimetrowe komory obserwacyjne z szklanym dnem stężeniem 10 µg/ml lamininy. Następnego dnia należy nanieść 1 ml świeżo wyizolowanych komórek zawieszonych w buforze KB do komór na 45 minut. Po przylegnięciu k

measuring-fast-calcium-fluxes-in-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pomiar szybkich przepływów wapnia w kardiomiocytach

Zakres wlotu Ca2+ zależnego od zapasów (SOCE) można monitorować przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca2+. Wygaszanie tych wskaźników przez Mn2+ pozwala na badanie SOCE w hodowlach komórkowych i włóknach mięśni szkieletowych. Opisano również technikę umożliwiającą rozdzielczość przestrzenną i czasową SOCE poprzez obrazowanie konfokalne mechanicznie odskórkowanych włókien mięśniowych.

Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Przedstawiona metoda umożliwia wykrycie funkcjonalnych, efektywnych kardiotropowych autoprzeciwciał w osoczu pacjentów z rozstrzeniowym kardiomiopatią, niezależnie od konkretnego antygenu, poprzez analizę wpływu wyizolowanych immunoglobulin pacjenta na skracanie się komórek oraz wewnątrzkomórkowe przejścia wapniowe w izolowanych kardiomiocytach szczura.

Pomiar wpływu przeciwciał na funkcje komórkowe izolowanych kardiomiocytów

Ten film opisuje test oparty na obrazowaniu opartym na mikroskopii konfokalnej, mierzący pobieranie wapnia przez mitochondria w hodowanych komórkach. Test wykorzystuje wrażliwy na wapń barwnik fluorescencyjny Rhod-2/AM do pomiaru mitochondrialnego wapnia w permeabilizowanych komórkach hodowlanych.

Test napływu wapnia w celu pomiaru mitochondrialnego wychwytu wapnia w hodowanych komórkach

Obecnie, większość dostępnych wskaźników wapnia jest używana do ilościowego określania cytoplazmatycznych stanów przejściowych wapnia jako pośrednich miar wapnia uwalnianego z retikulum sarkoplazmatycznego w hodowanych komórkach mięśni gładkich. Protokół ten opisuje użycie specyficznego wskaźnika opartego na FRET, który umożliwia bezpośredni pomiar sygnałów wapniowych w świetle retikulum sarkoplazmatycznego.

Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET

Ten artykuł opisuje protokół, który ocenia zmiany wrażliwości miofilamentu Ca2+ podczas skurczu w izolowanych miocytach serca szczura. Wraz z elektrofizjologią serca, skurczowymi/rozkurczowymi poziomami cytozolu Ca2+ i skurczem/rozluźnieniem, pomiar ten jest niezbędny do wzmocnienia mechanizmów pośredniczących w sprzężeniu pobudzenia-skurczu serca w zdrowych i chorych sercach.

Ocena wrażliwości miofilamentu ca2+ leżącej u podstaw sprzężenia wzbudzenia-skurczu serca

Wewnątrzkomórkowy recykling wapnia odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcji skurczowej i rozkurczowej w kardiomiocytach. W tym miejscu opisujemy protokół oceny rezerwy Ca2 + retikulum sarkoplazmatycznego i rozkurczowej funkcji usuwania wapnia w kardiomiocytach za pomocą systemu obrazowania wapnia.

Ocena rezerwy wapniowej retikulum sarkoplazmatycznego i wewnątrzkomórkowego rozkurczowego usuwania wapnia w izolowanych kardiomiocytach komorowych

Prezentujemy metodologię izolacji mysich miocytów oraz sposób uzyskiwania śladów napięcia lub wapnia jednocześnie ze śladami skracania sarkomeru za pomocą fotometrii fluorescencyjnej z jednoczesnymi cyfrowymi pomiarami geometrii komórek.

Obrazowanie optyczne izolowanych mysich miocytów komorowych

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Opisujemy tutaj, założenie i zastosowanie mysiej linii reporterowej Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (określanej poniżej jako αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) do oceny przeprogramowania serca. Noworodkowe fibroblasty serca (NCF) wyizolowane ze szczepu myszy są przekształcane w indukowane kardiomiocyty (iCM), co pozwala na wygodną i efektywną ocenę skuteczności przeprogramowania i funkcjonalnego dojrzewania iCM poprzez strumień wapnia (Ca2+).

Ocena in vitro przeprogramowania serca poprzez pomiar specyficznego dla serca strumienia wapnia za pomocą reportera GCaMP3

Obecny protokół opisuje całkowicie optyczną kontrolę i obserwację wyzwalanej aktywności komórkowej w kardiomiocytach pochodzących z iPSC (iPSC-CMs) dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i testów toksyczności. Pokazano wieloparametryczną kwantyfikację wzorców fenotypowych w czasie i przestrzeni. Wykazano długoterminowe działanie leków w ciągu godzin lub sekwencyjne pomiary w ciągu kilku dni.

Wysokoprzepustowe sterowanie optyczne i rejestrowanie sygnału wapnia w kardiomiocytach pochodzących z iPSC do badań toksyczności i fenotypowych badań przesiewowych leków

Tutaj opisana jest sprawdzona metoda wykonywania pomiarów kurczliwości i wapnia w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych za pomocą platformy opartej na optyce. Platforma ta umożliwia naukowcom badanie wpływu mutacji i reakcji na różne bodźce w szybki i powtarzalny sposób.

Pomiary parametrów wapnia i kurczliwości w czasie rzeczywistym w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Poznaj metodę pomiaru szybkich przepływów wapnia w żywych kardiomiocytach przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia analizę sygnałów wapniowych o różnej skali czasowej.

Pomiar szybkich przepływów jonów wapnia w kardiomiocytach

Przeglądaj więcej filmów