Name: Spektralne obrazowanie konfokalne fluorescencyjnie znakowanych receptorów nikotynowych u myszy knock-in z przewlekłym podawaniem nikotyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Poznaj spektralne obrazowanie konfokalne receptorów nikotynowych w mózgu myszy z przewlekłym podawaniem nikotyny. Ta metoda umożliwia precyzyjną analizę zmian receptorów na poziomie subkomórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Anthony Renda otrzymał wsparcie w ramach University of Victoria Graduate Fellowship Award. Badania te były finansowane z grantu Discovery Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, nagrody NARSAD Young investigator Award (dla R.N.), funduszy Victoria Foundation - Myre and Winifred Sim Fund, grantu Canadian Foundation for Innovation, British Columbia Knowledge Development Fund oraz grantu Research Tools and Instrumentation Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. Dziękujemy Jillian McKay, Christinie Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald oraz Danielowi Morgado za doskonałą opiekę nad myszami.

<ol><li>Perry, D. C., Davila-Garcia, M. I., Stockmeier, C. A., Kellar, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+nicotinic+receptors+in+brains+from+smokers%3A+membrane+binding+and+autoradiography+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Increased nicotinic receptors in brains from smokers: membrane binding and autoradiography studies.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 1545-1552 (1999).</li>
<li>Schwartz, R. D., Kellar, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+cholinergic+receptor+binding+sites+in+the+brain%3A+regulation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nicotinic cholinergic receptor binding sites in the brain: regulation in vivo.</a> Science. 220, 214-216 (1983).</li>
<li>Marks, M. J., Burch, J. B., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chronic+nicotine+infusion+on+tolerance+development+and+nicotinic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of chronic nicotine infusion on tolerance development and nicotinic receptors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 226, 817-8125 (1983).</li>
<li>Carlezon, W. A. J., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+GluR1+in+the+midbrain%3A+a+trigger+for+sensitization+to+drugs+of+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of GluR1 in the midbrain: a trigger for sensitization to drugs of abuse.</a> Trends Neurosci. 25, 610-615 (2002).</li>
<li>Fitzgerald, L. W., Ortiz, J., Hamedani, A. G., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+of+abuse+and+stress+increase+the+expression+of+GluR1+and+NMDAR1+glutamate+receptor+subunits+in+the+rat+ventral+tegmental+area%3A+common+adaptations+among+cross-sensitizing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drugs of abuse and stress increase the expression of GluR1 and NMDAR1 glutamate receptor subunits in the rat ventral tegmental area: common adaptations among cross-sensitizing agents.</a> J. Neurosci. 16, 274-2782 (1996).</li>
<li>Saal, D., Dong, Y., Bonci, A., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+of+abuse+and+stress+trigger+a+common+synaptic+adaptation+in+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drugs of abuse and stress trigger a common synaptic adaptation in dopamine neurons.</a> Neuron. 37, 577-5782 (2003).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Nashmi, R., Dickinson, M. E., McKinney, S., Jareb, M., Labarca, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+%CE%B14%CE%B22+nicotinic+acetylcholine+receptors+assessed+with+functional+fluorescently+labeled+subunits%3A+effects+of+localization%2C+trafficking%2C+and+nicotine-induced+upregulation+in+clonal+mammalian+cells+and+in+cultured+midbrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assembly of α4β2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons.</a> J. Neurosci. 23, 11554-11567 (2003).</li>
<li>Nashmi, R., Xiao, C., Deshpande, P., McKinney, S., Grady, S. R., Whiteaker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+nicotine+cell+specifically+upregulates+functional+%C3%8E%C2%B14%2A+nicotinic+receptors%3A+basis+for+both+tolerance+in+midbrain+and+enhanced+long-term+potentiation+in+perforant+path%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic nicotine cell specifically upregulates functional Î±4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path.</a> J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).</li>
<li>Dickinson, M. E., Bearman, G., Tilie, S., Lansford, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-spectral+imaging+and+linear+unmixing+add+a+whole+new+dimension+to+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Multi-spectral imaging and linear unmixing add a whole new dimension to laser scanning fluorescence microscopy.</a> BioTechniques. 31, 1272-1278 (2001).</li>
<li>Nashmi, R., Fraser, S. E., Lester, H., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNashmi%2C+R+%22Molecular+imaging%3A+fret+microscopy+and+spectroscopy%22">Molecular imaging: fret microscopy and spectroscopy</a>. Periasamy, A., Day, R. N. , Oxford University Press. 180-192 (2005).</li>
<li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+un-mixing+enables+improved+FRET+efficiency+with+a+novel+GFP2-YFP+FRET+pair%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair.</a> FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).</li>
<li>Larson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nikon+C1si+combines+high+spectral+resolution%2C+high+sensitivity%2C+and+high+acquisition+speed%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">The Nikon C1si combines high spectral resolution, high sensitivity, and high acquisition speed.</a> Cytometry A. 69, 825-8234 (2006).</li>
<li>Melvin, N. R., Sutherland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+caveats+of+standard+immunohistochemical+procedures%3A+implications+for+optical+disector-based+designs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative caveats of standard immunohistochemical procedures: implications for optical disector-based designs.</a> J. Histochem. Cytochem. 58, 577-5784 (2010).</li>
<li>Jones, I. W., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+doesn%27t+nicotinic+ACh+receptor+immunoreactivity+knock+out%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Why doesn't nicotinic ACh receptor immunoreactivity knock out.</a> Trends Neurosci. 28, 343-345 (2005).</li>
<li>Moser, N., Mechawar, N., Jones, I., Gochberg-Sarver, A., Orr-Urtreger, A., Plomann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+suitability+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+standard+immunodetection+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Evaluating the suitability of nicotinic acetylcholine receptor antibodies for standard immunodetection procedures.</a> J. Neurochem. , (2007).</li>
<li>Whiteaker, P., Cooper, J. F., Salminen, O., Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Brown, R. W., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolabeling+demonstrates+the+interdependence+of+mouse+brain+a4+and+b2+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunit+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Immunolabeling demonstrates the interdependence of mouse brain a4 and b2 nicotinic acetylcholine receptor subunit expression.</a> The Journal of Comparative Neurology. 499, 1016-1038 (2006).</li>
<li>Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Whiteaker, P., Salminen, O., Brown, R. W. B., Cooper, J., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+nicotinic+acetylcholine+receptor+protein+underlies+chronic+nicotine-induced+up-regulation+of+nicotinic+agonist+binding+sites+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Increased nicotinic acetylcholine receptor protein underlies chronic nicotine-induced up-regulation of nicotinic agonist binding sites in mouse brain.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. , 337-3187 (2011).</li>
<li>Marks, M. J., Rowell, P. P., Cao, J. Z., Grady, S. R., McCallum, S. E., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+acetylcholine-stimulated+86%5BRb%5D%2B+efflux+and+125%5BI%5D-epibatidine+binding+sites+in+C57BL%2F6+mouse+brain+are+differentially+affected+by+chronic+nicotine+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Subsets of acetylcholine-stimulated 86[Rb]+ efflux and 125[I]-epibatidine binding sites in C57BL/6 mouse brain are differentially affected by chronic nicotine treatment.</a> Neuropharmacology. 46, 1141-1157 (2004).</li>
<li>King, S. L., Caldarone, B. J., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta2-subunit-containing+nicotinic+acetylcholine+receptors+are+critical+for+dopamine-dependent+locomotor+activation+following+repeated+nicotine+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Beta2-subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors are critical for dopamine-dependent locomotor activation following repeated nicotine administration.</a> Neuropharmacology. 47, 132-139 (2004).</li>
<li>Robinson, S. F., Marks, M. J., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbred+mouse+strains+vary+in+oral+self-selection+of+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Inbred mouse strains vary in oral self-selection of nicotine.</a> Psychopharmacology (Berl). 124, 332-339 (1996).</li>
<li>Sparks, J. A., Pauly, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+continuous+oral+nicotine+administration+on+brain+nicotinic+receptors+and+responsiveness+to+nicotine+in+C57Bl%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Effects of continuous oral nicotine administration on brain nicotinic receptors and responsiveness to nicotine in C57Bl/6 mice.</a> Psychopharmacology (Berl). , 141-145 (1999).</li>
<li>Rahman, S., Zhang, J., Engleman, E. A., Corrigall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroadaptive+changes+in+the+mesoaccumbens+dopamine+system+after+chronic+nicotine+self-administration%3A+a+microdialysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuroadaptive changes in the mesoaccumbens dopamine system after chronic nicotine self-administration: a microdialysis study.</a> Neuroscience. 129, 415-4124 (2004).</li>
<li>Picciotto, M. R., Zoli, M., Rimondini, R., Lena, C., Marubio, L. M., Pich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+receptors+containing+the+%C3%8E%C2%B22+subunit+are+involved+in+the+reinforcing+properties+of+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine receptors containing the Î²2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine.</a> Nature. 391, 173-177 (1998).</li>
<li>Fowler, C. D., Lu, Q., Johnson, P. M., Marks, M. J., Kenny, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habenular+%CE%B15+nicotinic+receptor+subunit+signalling+controls+nicotine+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Habenular α5 nicotinic receptor subunit signalling controls nicotine intake.</a> Nature. 471, 597-601 (2011).</li>
<li>Maskos, U., Molles, B. E., Pons, S., Besson, M., Guiard, B. P., Guilloux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+reinforcement+and+cognition+restored+by+targeted+expression+of+nicotinic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors.</a> Nature. 436, 103-107 (2005).</li>
<li>Matta, S. G., Balfour, D. J., Benowitz, N. L., Boyd, R. T., Buccafusco, J. J., Caggiula, A. R., Craig, C. R., Collins, A. C., Damaj, M. I., Donny, E. C., Gardiner, P. S., Grady, S. R., Heberlein, U., Leonard, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+nicotine+dose+selection+for+in+vivo+research%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Guidelines on nicotine dose selection for in vivo research.</a> Psychopharmacology. 190, 269-319 (2007).</li>
<li>Lang, T., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+clusters+at+nanoscale+resolution%3A+more+than+pretty+pictures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Membrane protein clusters at nanoscale resolution: more than pretty pictures.</a> Physiology (Bethesda). 25, 116-1124 (2010).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Wykorzystanie fluorescencyjnego receptora w modelu mysim typu knock-in do określenia ilości i lokalizacji konkretnego kanału jonowego niesie ze sobą szereg zalet. W przeciwieństwie do białek takich jak aktyna, która jest powszechnie ekspresyjna we wszystkich komórkach, kanały jonowe występują w znacznie mniejszej liczbie, a ich ekspresja różni się w zależności od podtypów neuronów, co utrudnia dokładną analizę za pomocą tradycyjnych technik immunohistochemicznych. Produkt genu α4YFP jest ekspresowany na poziomach WT, po...

<table><tbody><tr><td>mini pompy osmotyczne</td><td><a href="http://www.alzet.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Alzet</a></td><td>model 2002</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>S5819</td><td></td></tr><tr><td>(-)-nikotyny wodorowinian winianu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5260</td><td></td></tr><tr><td>krople do oczu</td><td>Novartis AG</td><td>Tear-Gel</td><td></td></tr><tr><td>klej Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>heparyna sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Invitrogen</td><td>70011</td><td></td></tr><tr><td>ketamina</td><td>Wyeth Animal Health</td><td>0856-4403-01</td><td></td></tr><tr><td>chlorowodorek medatomidyny</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td>1950673</td><td></td></tr><tr><td>igła motylkowa 23G</td><td>BD Biosciences</td><td>367253</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>plastikowa forma do zatapiania</td><td>VWR international</td><td>18986-1</td><td></td></tr><tr><td>medium montażowe O.C.T.</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>EMD Millipore</td><td>475904</td><td>pH 8.5</td></tr></tbody></table>

spektralne obrazowanie konfokalne nikotynowych receptorów znakowanych fluorescencyjnie u myszy typu knock-in z przewlekłą podażą nikotyny

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Kanały jonowe sterowane ligandami w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) są zaangażowane w liczne schorzenia o poważnych konsekwencjach medycznych i społecznych. Na przykład uzależnienie od nikotyny poprzez palenie tytoniu jest główną przyczyną przedwczesnych zgonów na całym świecie (World Health Organization) i prawdopodobnie wynika ze zmiany rozmieszczenia kanałów jonowych w mózgu1. Przewlekła ekspozycja na nikotynę, zarówno u gryzoni, jak i u ludzi, prowadzi do zwiększenia liczby nikotynowych receptorów acetylocholiny (nAChRs) w tkance mózgowej1-3. Podobnie zmiany w glutaminergicznych kanałach GluN1 lub GluA1 są powiązane z wywoływaniem uczulenia na inne substancje uzależniające, takie jak kokaina, amfetaminy i opiaty4-6.

W konsekwencji zdolność do mapowania i ilościowego określania wzorców dystrybucji i ekspresji specyficznych kanałów jonowych jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów uzależnień. Badania nad efektami poszczególnych leków w specyficznych obszarach mózgu zostały rozwinięte dzięki wprowadzeniu takich technik, jak ligandy promieniotwórcze. Jednakże niska rozdzielczość przestrzenna wiązania ligandów promieniotwórczych uniemożliwia ilościowe określenie kanałów jonowych sterowanych ligandami w specyficznych podtypach neuronów.

Genetycznie kodowane reportery fluorescencyjne, takie jak zielone białko fluorescencyjne (GFP) i jego liczne warianty kolorystyczne, zrewolucjonizowały dziedzinę biologii7. Poprzez genetyczne znakowanie białka endogennego reporterem fluorescencyjnym możliwe jest wizualizowanie białek in vivo7-10. Jedną z zalet znakowania białek sondą fluorescencyjną jest wyeliminowanie konieczności stosowania przeciwciał, które wiążą się z problemami nieswoistości oraz dostępności do białka docelowego. Wykorzystaliśmy tę strategię do fluorescencyjnego znakowania nAChR, co umożliwiło badanie montażu receptorów przy użyciu transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) w transfektowanych komórkach hodowlanych11. Niedawno zastosowaliśmy metodę knock-in w celu stworzenia myszy z podjednostkami α4 nAChR znakowanymi żółtym białkiem fluorescencyjnym (α4YFP), co pozwoliło na precyzyjną kwantyfikację receptorów ex vivo z rozdzielczością submikrometrową w neuronach OUN za pomocą spektralnej mikroskopii konfokalnej12. Celowana fluorescencyjna mutacja knock-in jest wprowadzana do locus endogennego i znajduje się pod kontrolą jego natywnego promotora, co zapewnia prawidłowe poziomy ekspresji i regulacji receptora w porównaniu do receptorów nieznakowanych u myszy typu dzikiego. Podejście knock-in można rozszerzyć na fluorescencyjne znakowanie innych kanałów jonowych, co stanowi potężną metodę wizualizacji i kwantyfikacji receptorów w OUN.

W niniejszej pracy opisujemy metodologię ilościowego określania zmian w ekspresji nAChR w konkretnych neuronach OUN po chronicznej ekspozycji na nikotynę. Nasze metody obejmują implantację mini-pomp osmotycznych, fiksację poprzez perfuzję wewnątrzsercową oraz obrazowanie i analizę fluorescencyjnie znakowanych podjednostek receptorów nikotynowych u myszy knock-in α4YFP (Ryc. 1). Zoptymalizowaliśmy technikę fiksacji, aby zminimalizować autofluorescencję utkanek mózgu. Szczegółowo opisujemy metodologię obrazowania z wykorzystaniem spektralnego mikroskopu konfokalnego w połączeniu z algorytmem liniowego rozdzielania widm (spectral unmixing) w celu odjęcia sygnału autofluorescencji, co pozwala na dokładne uzyskanie sygnału fluorescencji α4YFP. Na koniec przedstawiamy wyniki wywołanej chroniczną nikotyną upregulacji receptorów α4YFP w przyśrodkowej drodze perforującej hipokampa.

Opracowaliśmy nową technikę kwantyfikacji zmian receptorów nikotynowych acetylocholiny w obrębie regionów podkomórkowych specyficznych podtypów neuronów OUN, aby lepiej zrozumieć mechanizmy uzależnienia od nikotyny, wykorzystując kombinację podejść, w tym znakowanie receptora białkiem fluorescencyjnym metodą knock-in oraz spektralną mikroskopię konfokalną.

Spektralne obrazowanie konfokalne nikotynowych receptorów znakowanych fluorescencyjnie u myszy typu knock-in z przewlekłą podażą nikotyny

Kanały jonowe sterowane ligandami w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) są zaangażowane w liczne schorzenia o poważnych konsekwencjach medycznych i społecznych. Dla...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie zmian w receptorach nikotynowych znakowanych fluorescencyjnie w mózgu myszy poddanych przewlekłej aplikacji nikotyny. Osiąga się to poprzez implantację minipomp osmotycznych wypełnionych solą fizjologiczną lub nikotyną u myszy z knockinem alpha four YFP. Po zakończeniu leczenia myszy są utrwalane poprzez perfuzję wewnątrzsercową, a następnie przygotowuje się kriostatyczne przekroje mózgu.Następnie obrazy mózgów z nałożoną szkiełkiem nakrywkowym są rejestrowane przy użyciu mikroskopii spektralnej i konfokalnej. Ostatnim etapem procedury jest liniowe odmieszanie spektralne oraz analiza poziomów ekspresji alpha four YFP. Ostatecznie wyniki wykazują zdolność mikroskopii konfokalnej spektralnej oraz liniowego odmieszania do dokładnego ilościowego określenia zwiększonej ekspresji podjednostek nikotynowych receptorów acetylocholiny alpha four YFP z rozdzielczością submikronową w neuronach mózgu myszy poddanych przewlekłemu działaniu nikotyny.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak znakowanie przeciwciałami lub radioligandami, jest to, że Y FPS jest kodowany genetycznie, aby być przyłączonym do

spectral-confocal-imaging-fluorescently-tagged-nicotinic-receptors

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Obrazowanie spektralne konfokalne fluorescencyjnie oznaczonych receptorów nikotyny u myszy knock-in z przewlekłym podawanie nikotyny

Ten film pokazuje, jak aktywacja nikotynowych receptorów acetylocholiny w brzusznym hipokampie myszy za pośrednictwem nikotyny powoduje trwałą sygnalizację wapniową wzdłuż aksonów.

Obrazowanie sygnalizacji wapniowej indukowanej nikotyną wzdłuż brzusznych aksonów hipokampa w kokulturach synaptycznych

W tym artykule opisujemy użyteczną metodę badania funkcji kanałów jonowych bramkowanych ligandem w neuronach ostro izolowanych wycinków mózgu.  Metoda ta polega na użyciu mikropipety wypełnionej lekiem do miejscowego nakładania leków na neurony zarejestrowane przy użyciu standardowych technik patch clamp.

Lokalne zastosowanie leków do badania funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy

Opracowaliśmy genowo-chimeryczny preparat brzusznego obwodu hipokamp – półleżący in vitro, który umożliwia bezpośrednie obrazowanie na żywo w celu analizy presynaptycznych mechanizmów transmisji synaptycznej za pośrednictwem nikotynowych receptorów acetylocholiny (nAChR). Preparat ten zapewnia również pouczające podejście do badania pre- i postsynaptycznych mechanizmów plastyczności synaptycznej.

Obrazowanie na żywo indukowanej nikotyną sygnalizacji wapnia i uwalniania neuroprzekaźników wzdłuż brzusznych aksonów hipokampa

Tutaj prezentujemy nowatorskie podejście do obrazowania Ca2+ za pomocą bioluminescencyjnego reportera. Podejście to wykorzystuje stopiony konstrukt GFP-aequorin, który wiąże się z Ca2+ i emituje światło, eliminując potrzebę wzbudzenia światła. Co istotne, metoda ta pozwala na długie, ciągłe obrazowanie, dostęp do głębokich struktur mózgu i wysoką rozdzielczość czasową.

In vivo (in vivo) Funkcjonalne obrazowanie mózgu oparte na bioluminescencyjnym wskaźniku wapnia GFP-aequorin

Ten artykuł przedstawia metodę badania nikotynowych receptorów acetylocholiny (nAChR) w wycinkach mózgu myszy poprzez uwalnianie nikotyny. W połączeniu z jednoczesnym rejestrowaniem za pomocą klamry krosowej i 2-fotonowej laserowej mikroskopii skaningowej, odblokowanie nikotyny łączy funkcję receptora nikotynowego z morfologią komórki, zapewniając głębsze zrozumienie neurobiologii cholinergicznej.

Badanie funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy za pomocą laserowej fotolizy fotoaktywowanej nikotyny

Multipleksowa hybrydyzacja in situ (ISH) została wykorzystana do jednoczesnej wizualizacji transkryptów dla dwóch receptorów sprzężonych z białkiem G i jednego czynnika transkrypcyjnego w całym kompleksie zwoju błędnego dorosłej myszy. Protokół ten może być wykorzystany do generowania dokładnych map profili transkrypcyjnych neuronów doprowadzających nerwy błędnego.

Wykrywanie ekspresji receptora sprzężonego z białkiem G w mysich neuronach doprowadzających nerwu błędnego za pomocą hybrydyzacji Multiplex In Situ

Ten protokół opisuje metodę analizy morfometrycznej połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i STED, która jest używana do ilościowego określania zmian patologicznych w mysich modelach SMA i CMS związanych z ColQ.

Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej

Protokół ten opisuje ekspresję i ilościową liczbę podjednostek receptorów acetylocholinowych neuronów za pomocą linii komórkowej Neuro-2a ssaków. Znaczniki fluorescencyjne wrażliwe na pH oraz mikroskopia konfokalna umożliwiają precyzyjną ocenę lokalizacji receptorów w błonie plazmatycznej w porównaniu do tych wyrażanych w neutralnych pH-przedziałach wewnątrzkomórkowych, ułatwiając badania transportu nAChR i modulacji farmakologicznej.

Lokalizacja błony plazmatycznej i wewnątrzkomórkowych receptorów nikotynowej acetylocholiny za pomocą obrazowania ilościowego w komórkach ssaków

W niniejszym protokole aktualizujemy opis ostatnich postępów w obrazowaniu sygnałów Ca2+ w neuronach znakowanych GFP w skrawkach tkanki mózgowej z wykorzystaniem czerwonego fluorescencyjnego wskaźnika Ca2+.

Obrazowanie odpowiedzi wapniowych w neuronach z etykietą GFP w skrawkach mózgu myszy z obszaru podwzgórza

Tutaj opisujemy adaptację protokołów używanych do indukowania plastyczności homeostatycznej w neuronach do badania plastyczności receptorów sprzężonych z białkiem G astrocytów. Metoda ta, ostatnio wykorzystana do badania zmian w mGluR grupy astrocytarnej I u młodych myszy, może być stosowana do pomiaru skalowania różnych astrocytarnych GPCR w tkance dorosłych myszy in situ i in vivo oraz do lepszego zrozumienia wrażliwości receptorów astrocytarnych na zmiany aktywności neuronalnej.

Indukowanie plastyczności receptorów astrocytarnych poprzez manipulację szybkością odpalania neuronów

Poznaj spektralne obrazowanie konfokalne receptorów nikotynowych w mózgu myszy z przewlekłym podawaniem nikotyny. Ta metoda umożliwia precyzyjną analizę zmian receptorów na poziomie subkomórkowym.

Spektralne obrazowanie konfokalne fluorescencyjnie znakowanych receptorów nikotynowych u myszy knock-in z przewlekłym podawaniem nikotyny (Wideo) | JoVE Journal

Spektralne obrazowanie konfokalne nikotynowych receptorów znakowanych fluorescencyjnie u myszy typu knock-in z przewlekłą podażą nikotyny

Przeglądaj więcej filmów