Name: Izolacja i badanie biofizyczne skórek owocowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: Poznaj metody izolacji i charakteryzacji skórek owocowych pomidora przy użyciu spektroskopii NMR i mikroskopii sił atomowych. Techniki te umożliwiają badanie struktury biopolimerów roślinnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była finansowana ze środków Narodowej Fundacji Nauk USA (U.S. National Science Foundation) w ramach grantów nr MCB-0741914 i MCB-0843627; dodatkowe wsparcie infrastrukturalne dla The City College of New York zapewniły Narodowe Instytuty Zdrowia (National Institutes of Health) w ramach grantu 2 G12 RR03060-26 z Narodowego Centrum Zasobów Badawczych (National Center for Research Resources). Wyrażamy wdzięczność grupie J.K.C. Rose z Katedry Biologii Roślin Uniwersytetu Cornella za udostępnienie kutykul pomidora M82 (typ dziki) i CM15 (mutant). Dziękujemy dr. Spyrosowi Monastiriotisowi z grupy Inżynierii Chemicznej prof. Alexandra Couzisa w CCNY za nieocenioną pomoc w eksperymentach AFM. Dziękujemy pani Lauren Goharze za wsparcie w zakresie projektowania graficznego.

1. Enzymatyczna izolacja kutykuli pomidora5
<ol>
 <li>Umieścić kilka pomidorów handlowych lub hodowlanych w misce. Obrać skórkę z owoców w dużych fragmentach; odrzucić tkankę wewnętrznego perykarpium. Przemyć skórki pomidorów wodą dejonizowaną i przechowywać je pod wodą w zlewce.</li>
 <li>Przygotować 50 mM bufor octanu sodu o pH 4,0 (w 31 °C), wsypując 1,22 g trihydratu octanu sodu (Mr. 136,08 g/mol) i dodając 2,34 ml lodowatego kwasu octowego (17,485 M) do zlewki, uzupełniając 200 ml wody dejonizowanej, a następnie regulując pH do 4,0 w temperaturze 31 °C. Przygotować mieszaninę zawierającą 4 ml pektynazy (EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, TCI America), 0,2 g celulazy (EC 232.734.4; 1,3 units/mg ciała stałego, Sigma Aldrich) oraz 13 mg NaN3, a następnie dodać 196 ml buforu octanu sodu do mieszaniny enzymów, aby otrzymać 200 ml końcowego koktajlu enzymatycznego.5 Całkowicie zanurzyć obraną skórkę pomidora w koktajlu enzymatycznym i inkubować w 31 °C przez 24 godziny przy stałym wytrząsaniu (G24 Environmental Incubator Shaker; New Brunswick Scientific Co.).</li>
 <li>Zebrać skórki pomidorów za pomocą sitka kuchennego lub lejka Büchnera i przemyć je wodą dejonizowaną. Następnie umieścić je w suszarce próżniowej w temperaturze pokojowej na jedną godzinę. Przechowywać wysuszone skórki pomidorów w opisanej i zakrytej butelce do późniejszych procedur usuwania wosku.</li>
</ol>
2. Całkowite odtłuszczanie metodą ekstrakcji Soxhleta6
<ol>
 <li>Sprzęt używany do całkowitego odtłuszczania składa się ze źródła ciepła (płaszcza grzejnego i regulatora Variac), kolby okrągłodennej służącej jako zbiornik z rozpuszczalnikiem, ekstraktora Soxhleta, spiekanego szklanego tygla lub jednorazowego tygla do ekstrakcji, ziaren wrzutek oraz chłodnicy (patrz Rys. 1). Należy pamiętać, że wąskie ramię syfonu (części 6 i 7 na Rys. 1) jest bardzo delikatne i podatne na uszkodzenia, co wymaga ostrożnego obchodzenia się z nim.</li>
 <li>Umieść 0,5-1 g skórki pomidora (uzyskanej w kroku 1.) w moździerzu i rozetrzyj próbkę tłuczkiem na gruby proszek, chyba że próbki mają zostać wykorzystane do pomiarów AFM (Sekcja 5). Wypełnij spiekanый szklany lub jednorazowy tygiel próbką mniej więcej do połowy i za pomocą pęsety ostrożnie umieść go u podstawy kolumny ekstrakcyjnej.</li>
 <li>Zamocuj chłodnicę i owiń ją folią aluminiową. Podgrzewaj rozpuszczalnik w postaci metanolu (klasy ACS) w obecności kilku ziaren wrzutek, aż zacznie łagodnie wrzeć i nastąpi cofanie się skroplonej cieczy na ściankach kolby. Przykryj zbiornik z rozpuszczalnikiem zarówno watą szklaną, jak i folią aluminiową. Kontroluj proces przez godzinę, regulując napięcie Variaca tak, aby w zbiorniku gromadziła się około jedna kropla na sekundę, a syfonowanie w aparacie Soxhleta następowało w momencie wypełnienia tygla.</li>
 <li>Kontynuuj proces ekstrakcji przez 12 h, a następnie obniż płaszcz grzejny i pozwól aparatowi ostygnąć. Zdejmij ekstraktor wraz ze zbiornikiem jako jedną całość, aby zutylizować rozpuszczalnik. Za pomocą pęsety podnieś tygiel tuż poniżej szyjki kolumny ekstrakcyjnej, odlej z niego nadmiar rozpuszczalnika i połóż tygiel na czystej powierzchni. Przechyl kolumnę ekstrakcyjną, aby umożliwić odpływ cieczy do kolby poniżej. Odłącz kolbę i wlej odpady do oznakowanego pojemnika na zużyte rozpuszczalniki.</li>
 <li>Powtórz kroki 2.3 i 2.4 dla kolejnych rozpuszczalników o stopniowo zmniejszającej się polarności, np. chloroformu i heksanu, przez 12 h w każdym przypadku.</li>
 <li>Pozostaw próbkę kutyny pomidorowej do wyschnięcia wewnątrz tygla, dmuchając na nią strumieniem azotu lub umieszczając ją w suszarce próżniowej w temperaturze pokojowej. Na koniec zmierz masę suchej próbki i przechowuj ją w temperaturze pokojowej w słoiku z nakrętką uszczelnionym paraf സിനിമem.</li>
</ol>
3. Selektywna izolacja wosków epikutikularnych i intrakutikularnych3,4
<ol>
 <li>Najpierw całe pomidory (inna partia pomidorów niż opisana w punkcie 1) należy umyć wodą destylowaną. Osuszyć je ręcznikami papierowymi oraz chusteczkami Kimwipes, a następnie położyć szypułkami do dołu na kawałku folii aluminiowej.</li>
 <li>Całe pomidory należy pokryć 120% (w/w, stosunek masowy) wodnym roztworem gumy arabskiej, nakładając go od góry ku dołowi, i pozostawić na około godzinę do wyschnięcia gumy arabskiej na skórce owocu, aż powstanie cienka błona. Błonę tę należy usunąć za pomocą pęsety, uważając, aby nie przebić skórki pomidora. Procedurę należy powtórzyć jeszcze raz.</li>
 <li>Błony należy dodać do probówek zawierających mieszaninę chloroformu i wody w stosunku 1:1 (v/v) i mieszać przez trzy minuty. Po intensywnym wstrząsaniu i rozdzieleniu faz należy odpipetować frakcje chloroformowe i odparować je w oddzielnych, otwartych probówkach, aby uzyskać wosk epikutykularny. Pomidory pozostaną nienaruszone fizycznie. Należy zanurzyć je w chloroformie na dwie minuty w temperaturze pokojowej i zebrać wosk intrakutykularny po odparowaniu rozpuszczalnika. Następnie pomidory należy obrać ze skórki i poddać obróbce enzymatycznej (za pomocą celulazy i pektynazy w buforze octanu sodu), aby usunąć odpowiednio celulozę i pektynę (jak opisano w punkcie 1).</li>
 <li>W razie potrzeby należy przeprowadzić całkowite odtłuszczanie tych enzymatycznie wyizolowanych kutykul za pomocą ekstrakcji w aparacie Soxhleta (patrz krok 2), stosując trzy rozpuszczalniki o różnej polarności (odpowiednio metanol, chloroform i heksan).</li>
</ol>
4. Charakterystyka molekularna kutyny z owoców pomidora za pomocą spektroskopii jądrowego rezonansu magnetycznego w stanie ciało z magicznym kątem obrotu i polaryzacją krzyżową (CPMAS ssNMR)6
<ol>
 <li>Umieścić 4-6 mg całkowicie odwoskowanych kutykul pomidora (kuty n) w rotorze z cyrkonu fastMAS o średnicy 1,6 mm, używając dołączonego przez dostawcę narzędzia do pakowania. (Odpowiednie są zarówno zmielone odwoskowane kutykule pomidora, jak i bardzo małe kawałki kutykul częściowo odwoskowanych). Należy upewnić się, że próbka jest zapakowana w rotor równomiernie, ale nie zbyt ciasno. Po założeniu górnej pokrywki, pomalować połowę pokrywki czarnym markerem, aby ułatwić pomiar prędkości wirowania.</li>
 <li>Dostroić shimming spektrometru NMR w celu uzyskania minimalnej szerokości linii widma w połowie wysokości oraz skalibrować szerokości impulsów 90 ° dla protonów (1H) i węgla (13C), używając związku standardowego, takiego jak adamantan.</li>
 <li>Używając glicyny lub glutaminy jako związków modelowych, uzyskać maksymalną intensywność sygnału poprzez optymalizację wszystkich parametrów (poziomy mocy dopasowania Hartmanna-Hahna, czas kontaktu 1H - 13C, siła heterojądrowego rozsprzęgania 1H) eksperymentu polaryzacji krzyżowej z wirowaniem pod magicznym kątem (CPMAS). Dla widm rejestrowanych przy częstotliwości 1H wynoszącej 600 MHz zalecane warunki obejmują częstotliwość wirowania 10 kHz lub 15 kHz, 3-sekundową przerwę między akwizycjami oraz heterojądrowe rozsprzęganie protonów SPINAL7 przy natężeniu pola magnetycznego odpowiadającym częstotliwości 185 kHz.</li>
 <li>Wsunąć rotor z kuty ną do sondy, a następnie umieścić sondę w magnesie. Stopniowo zwiększać prędkość wirowania do 10 kHz, aby sprawdzić prawidłowość zapakowania próbki i stabilność rotora. Zweryfikować końcową stabilność wirowania rotora z dokładnością do ±20 Hz.</li>
 <li>Iteracyjnie regulować kondensatory strojenia i dopasowania sondy, aby osiągnąć minimalne odbicie mocy dla częstotliwości NMR zarówno 1H, jak i 13C. Ustawić temperaturę eksperymentu na 25 °C (lub temperaturę pokojową).</li>
 <li>Rozpocząć zoptymalizowany wcześniej eksperyment CPMAS, odpowiadający warunkowi dopasowania Hartmanna-Hahna wyznaczonemu dla częstotliwości wirowania 10 kHz.</li>
 <li>Zarejestrować 4096 przejściowych sygnałów, poddać widmo obróbce poprzez wykładnicze (Lorentzowskie) poszerzenie linii o 50-100 Hz i przeprowadzić transformację Fouriera w celu wygenerowania widma NMR intensywności sygnału w funkcji przesłonięcia chemicznego (ppm).</li>
 <li>Odnieść przesunięcia chemiczne 13C zewnętrznie, używając adamantanu ustawionego na 38,4 ppm (grupa -CH2-)8 jako standardu.</li>
 <li>Zwiększyć częstotliwość wirowania rotora do 15 kHz i powtórzyć pomiar CPMAS (kroki 4.6-4.8) zgodnie z warunkiem dopasowania Hartmanna-Hahna wyznaczonym dla tej drugiej częstotliwości wirowania.</li>
 <li>Powtórzyć eksperymenty CPMAS (kroki 4.1-4.9) z próbkami naturalnych (woskowych) i częściowo odwoskowanych kutykul owoców.</li>
</ol>
5. Badanie powierzchni kutykuli pomidora za pomocą mikroskopii sił atomowych (Digital Instruments Nanoscope IIIa; procedury mogą się nieznacznie różnić w zależności od modelu mikroskopu)6
<ol>
 <li>Włącz skaningowy mikroskop sondowy (SPM) (Ryc. 2) i upewnij się, że przełącznik trybu mikroskopu jest ustawiony na tryb kontaktowej mikroskopii sił atomowych (AFM).</li>
 <li>Ręcznie podnieś głowicę SPM, obracając dwa przednie pokrętła regulacyjne. Odłącz uchwyt sondy AFM od głowicy SPM, odkręcając śrubę mocującą z tyłu głowicy.</li>
 <li>Za pomocą pęsety usuń istniejącą dźwignię AFM z uchwytu, a następnie ostrożnie wyjmij z opakowania nową dźwignię z azotku krzemu (sondę AFM) i zamontuj ją w miejsce starej. Użyj mikroskopu świetlnego, aby zweryfikować, czy nowo zainstalowana dźwignia AFM nie jest uszkodzona.</li>
 <li>Przymocuj próbkę kutykuli pomidora (fragment częściowo odtłuszczonej kutykuli pomidora o wymiarach ok. 10 mm x 10 mm) do dysku ze stali nierdzewnej (podkładki na próbkę) za pomocą taśmy dwustronnej. Użyj mikroskopu świetlnego, aby sprawdzić, czy powierzchnia kutykuli pozostała płaska i gładka po umieszczeniu próbki na podkładce.</li>
 <li>Umieść podkładkę z próbką kutykuli pomidora na obszarze magnetycznym na górze skanera SPM.</li>
 <li>Wyreguluj dwa przednie ręczne śruby nastawcze skanera w górę, obracając pokrętła; ustaw zmotoryzowaną tylną śrubę nastawczą na poziomie zbliżonym do dwóch przednich śrub. Upewnij się, że wszystkie trzy śruby są ustawione wystarczająco wysoko, aby uniknąć złamania sondy AFM podczas umieszczania uchwytu w głowicy SPM.</li>
 <li>Włóż ponownie uchwyt sondy do głowicy SPM i zabezpiecz go, dokręcając śrubę mocującą z tyłu głowicy.</li>
 <li>Po włączeniu lasera ustaw plamkę lasera na dźwigni AFM, korzystając z centralnego (y) i prawego (x) pokręteł regulacji lasera na górze głowicy. Monitoruj odbitą wiązkę lasera na kartce papieru, aby ustawić plamkę lasera dokładnie na końcu dźwigni AFM.</li>
 <li>Iteracyjnie reguluj pozycję ruchomego lustra za pomocą pokręteł regulacji fotodetektora, aby uzyskać maksymalny sygnał (sygnał SUM), zapewniając tym samym równomierny odbiór odbitej wiązki lasera przez cztery kwadranty fotodetektora.</li>
 <li>Obniż sondę AFM, cofając przednie śruby regulacyjne oraz zmotoryzowaną tylną śrubę nastawczą skanera SPM, monitorując wizualnie zbliżanie się sondy AFM do powierzchni próbki za pomocą mikroskopu odwróconego. Upewnij się, że wszystkie trzy śruby znajdują się na tym samym poziomie, aby uniknąć artefaktów wynikających z obrazowania przechylonej próbki. Przybliż sondę do próbki, ale nie na tyle blisko, aby sonda dotknęła lub przebiła powierzchnię próbki.</li>
 <li>Na tym etapie światło lasera odbite od dźwigni AFM odbije się od ruchomego lustra do fotodetektora. Dla trybu kontaktowego AFM z sondą z azotku krzemu ustaw napięcie sygnału wyjściowego (Vertical Deflection) na -2 V dla Setpoint 0 V oraz sygnał różnicowy (DIFF Signal – różnica pionowa/pozioma) na 0 V poprzez regulację pozycji lustra.</li>
 <li>W oprogramowaniu Nanoscope kliknij ikonę mikroskopu i wybierz odpowiedni profil (Contact mode AFM).</li>
 <li>W panelu „Scan Controls Settings” ustaw szybkość skanowania i rozmiar skanowania, np. rozmiar skanowania 10 micron i szybkość skanowania 2 Hz.</li>
 <li>Pozwól sondzie AFM zetknąć się z powierzchnią próbki, klikając ikonę engage-tip. Poprzez sterowanie zmotoryzowaną tylną śrubą podstawy SPM, program obniży teraz sondę, aż zetknie się ona z powierzchnią próbki. Proces skanowania rozpocznie się automatycznie po pomyślnym zetknięciu sondy.</li>
 <li>Monitoruj proces skanowania, korzystając z trybów obrazowania (image) i oscyloskopu (scope) oprogramowania, iteracyjnie dostosowując parametry takie jak setpoint, wzmocnienie całkujące, wzmocnienie proporcjonalne, rozmiar skanowania, szybkość skanowania, liczbę linii oraz liczbę próbek na linię, aby uzyskać obrazy o najwyższej rozdzielczości. Rozpocznij skanowanie z dużym zakresem osi z (data scale); następnie ostrożnie zmniejszaj wartość skali danych, aby uzyskać najlepszy kontrast cech powierzchni na obrazie. Minimalizuj występowanie białych obszarów na zeskanowanym obrazie, które wskazują, że wysokość cech powierzchni przekracza dostępny zakres osi z.</li>
 <li>Zapisz obraz, aby utrwalić plik danych; następnie przetwórz dane za pomocą funkcji spłaszczania (flattening), aby usunąć artefakty obrazu wynikające z dryftu skanera w pionie (Z), wygięć obrazu oraz przesunięcia pionowego między liniami skanowania;9 na koniec oblicz średnią chropowatość. Po zapisaniu danych wycofaj sondę AFM, odwracając działanie sterowanego komputerowo silnika śruby, który służył do jej zbliżenia. Przetwarzanie obrazów może być wykonywane w trybie analizy obrazów offline i/lub przy użyciu innego komputera.</li>
 <li>Użyj przednich dolnych szarych metalowych pokręteł uchwytu sondy, aby zmienić pozycje x i y obszaru skanowania; następnie powtórz pomiar w pięciu miejscach próbki, aby sprawdzić powtarzalność, wymieniając dźwignię AFM w przypadku pogorszenia jakości obrazu.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Analiza przesunięć chemicznych widm CPMAS 13C NMR (Rys. 3) pozwoliła zidentyfikować główne grupy funkcyjne obecne w całkowicie odwoskowanej kutykuli pomidora (kutynie). Stwierdzono, że kluczowe fragmenty węglowe w biopoliestrze kutynowym to alifaty długołańcuchowe (0-45 ppm), alifaty utlenione (45-110 ppm), aromaty i związki z wielokrotnymi wiązaniami (110-160 ppm) oraz grupy karbonylowe (160-220 ppm). Utlenione fragmenty alkilowe (CHO + CH2O) odgrywają kluczową rolę w tworzeniu wiązań kowalencyjnych między jednostkami monomerowymi biopolimeru kutynowego, kształtując tym samym architekturę molekularną macierzy kutyny. Różnice w względnych polach piku zaobserwowane w obszarze widma między 45 a 100 ppm sugerują, że kutyna mutanta posiada stosunkowo większy udział tworzących sieciowania fragmentów strukturalnych CHO w porównaniu do kutyny typu dzikiego; dokładne pomiary ilościowe z wykorzystaniem metod NMR z bezpośrednią polaryzacją (DPMAS)5 potwierdzają ten wniosek (dane nie zostały przedstawione).
Widma CPMAS 13C NMR wykazały również stopniowo zmniejszający się pik wosków przy 31 ppm (Ryc. 4), co wskazuje na sekwencyjne usuwanie wosków epikutykularnych i intrakutykularnych z kompozytu kutyna-wosk przy jednoczesnym zachowaniu głównej architektury chemicznej biopolimeru kutyny. Równoległa analiza obrazów AFM (Ryc. 5) ujawniła nieregularności powierzchni wynikające z etapowej ekstrakcji wosków epikutykularnych i intrakutykularnych z kutykuli owocu, co sygnalizuje zmiany w organizacji struktury kutykularnej.
<img alt="Schemat zestawu do ekstrakcji Soxhleta z opisanymi elementami służącymi do wydajnej ekstrakcji ciało stałe-ciecz." src="/files/ftp_upload/3529/3529fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Ekstraktor Soxhleta (źródło obrazu: Wikipedia).
<img alt="Układ mikroskopii sondy skaningowej oraz schemat przedstawiający komponenty do analizy powierzchni w nanoskali." src="/files/ftp_upload/3529/3529fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. A) Mikroskop sondy skaningowej. B) Głowica SPM (zaadaptowano z podręcznika szkoleniowego AFM dostarczonego przez Digital Instruments).
<img alt="Wykres spektroskopii NMR porównujący przesunięcia chemiczne ^13C odmian pomidora M82 i CM15." src="/files/ftp_upload/3529/3529fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Widma 150 MHz CPMAS 13C NMR kutykul (kutyn) z w pełni odwoskowanych, czerwonych, dojrzałych owoców pomidora typu dzikiego (M82) oraz mutantów (CM15) wykazują rezonanse z przesunięciami chemicznymi odpowiadającymi grupom funkcyjnym sieciowanego poliestru opartego na kwasach hydroksy tłuszczowych, a także niektóre grupy z wielokrotnymi wiązaniami. Wszystkie widma zarejestrowano przy częstotliwości wirowania 10 kHz.
<img alt="Wykres widma NMR przedstawiający proces usuwania wosku; piki wskazują przesunięcia chemiczne w analizie zawartości wosku." src="/files/ftp_upload/3529/3529fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Widma 150 MHz 13CCPMAS NMR kutykuli komercyjnych czerwonych, dojrzałych owoców pomidora wykazują zmiany składu po sekwencyjnym usuwaniu wosków epikutykularnych i intrakutykularnych, odpowiednio poprzez mechaniczną ekstrakcję gumą arabską oraz dwuminutową kąpiel w chloroformie. Wszystkie widma zarejestrowano przy częstotliwości wirowania 15 kHz.
<img alt="Analiza chropowatości powierzchni; wykresy 3D; chropowatość RMS; wpływ usuwania wosku na teksturę powierzchni." src="/files/ftp_upload/3529/3529fig5.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Obrazy AFM i szacunki chropowatości dla częściowo odwoskowanych kutykul komercyjnych pomidorów opisanych na Rycinie 4 po stopniowym usuwaniu wosków epikutykularnych (lewo) i intrakutykularnych (prawo).

<ol><li>Dom#237;nguez, E., Heredia-Guerrero, J. A., Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biophysical+design+of+plant+cuticles%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The biophysical design of plant cuticles: an overview.</a> New Phytologist. 189, 938-949 (2011).</li>
<li>Bargel, H., Koch, K., Cerman, Z., Neinhuis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+of+the+plant+cuticle+and+cuticular+waxes+-+a+smart+material%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships of the plant cuticle and cuticular waxes - a smart material?</a> Functional Plant Biol. 33, 893-910 (2006).</li>
<li>Jetter, R., Schäffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Composition+of+the+Prunus+laurocerasus+Leaf+Surface.+Dynamic+Changes+of+the+Epicuticular+Wax+Film+during+Leaf+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chemical Composition of the Prunus laurocerasus Leaf Surface. Dynamic Changes of the Epicuticular Wax Film during Leaf Development.</a> Plant Physiol. 126, 1725-1737 (2001).</li>
<li>Vogg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+fruit+cuticular+waxes+and+their+effects+on+transpiration+barrier+properties%3A+functional+characterization+of+a+mutant+deficient+in+a+very-long-chain+fatty+acid+%C3%8E%C2%B2-ketoacyl-CoA+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exper.+Botany%22%5BJournal%5D)">Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid Î²-ketoacyl-CoA synthase.</a> J. Exper. Botany. 55, 1401-1410 (2004).</li>
<li>Isaacson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutin+deficiency+in+the+tomato+fruit+cuticle+consistently+affects+resistance+to+microbial+infection+and+biomechanical+properties%2C+but+not+transpirational+water+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cutin deficiency in the tomato fruit cuticle consistently affects resistance to microbial infection and biomechanical properties, but not transpirational water loss.</a> Plant J. 60, 363-377 (2009).</li>
<li>Round, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influence+of+Water+on+the+Nanomechanical+Behavior+of+the+Plant+Biopolyester+Cutin+as+Studied+by+AFM+and+Solid-State+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+J%22%5BJournal%5D)">The Influence of Water on the Nanomechanical Behavior of the Plant Biopolyester Cutin as Studied by AFM and Solid-State NMR.</a> Biophysical J. 79, 2761-2767 (2000).</li>
<li>Fung, B. M., Khitrin, A. K., Ermolaev, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Improved+Broadband+Decoupling+Sequence+for+Liquid+Crystals+and+Solids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">An Improved Broadband Decoupling Sequence for Liquid Crystals and Solids.</a> J. Magn. Reson. 142, 97-101 (2000).</li>
<li>Morcombe, C. R., Zilm, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+shift+referencing+in+MAS+solid+state+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Chemical shift referencing in MAS solid state NMR.</a> J. Magn. Reson. 162, 479-486 (2003).</li>
<li>Fang, S. J., Haplepete, S., Chen, W., Helms, C. R., Edwards, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+atomic+force+microscopy+images+using+spectral+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+App.+Phys%22%5BJournal%5D)">Analyzing atomic force microscopy images using spectral methods.</a> J. App. Phys. 82, 5891-5898 (1997).</li>
<li>Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+lipid+barriers%3A+biosynthesis+of+cutin+and+suberin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin.</a> Trends. Plant Sci. 13, 236-246 (2008).</li>
<li>Stark, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+studies+of+structure+and+dynamics+in+fruit+cuticle+polyesters%5BTitle%5D)+AND+%22Solid+State+Nucl.+Mag%22%5BJournal%5D)">NMR studies of structure and dynamics in fruit cuticle polyesters.</a> Solid State Nucl. Mag. 16, 37-45 (2000).</li>
<li>Schaefer, J., Stejskal, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon-13+nuclear+magnetic+resonance+of+polymers+spinning+at+the+magic+angle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Amer.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Carbon-13 nuclear magnetic resonance of polymers spinning at the magic angle.</a> J. Amer. Chem. Soc. 98, 1031-1032 (1976).</li>
<li>Sachleben, J. R., Chefetz, B., Deshmukh, A., Hatcher, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-State+NMR+Characterization+of+Pyrene-Cuticular+Matter+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Envir.+Sci.+%26+Tech%22%5BJournal%5D)">Solid-State NMR Characterization of Pyrene-Cuticular Matter Interactions.</a> Envir. Sci. & Tech. 38, 4369-4376 (2004).</li>
<li>Zlotnik-Mazori, T., Stark, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+studies+of+cutin%2C+an+insoluble+plant+polyester%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance studies of cutin, an insoluble plant polyester.</a> Macromolecules. 21, 2412-2417 (1988).</li>
<li>Stark, R. E., Garbow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+relaxation+studies+of+plant+polyester+dynamics.+2.+Suberized+potato+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance relaxation studies of plant polyester dynamics. 2. Suberized potato cell wall.</a> Macromolecules. 25, 149-154 (1992).</li>
<li>Bennett, A. E., Rienstra, C. M., Auger, M., Lakshmi, K. V., Griffin, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteronuclear+Decoupling+in+Rotating+Solids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Heteronuclear Decoupling in Rotating Solids.</a> J. Chem. Phys. 103, 6951-6958 (1995).</li>
<li>Metz, G., Wu, X. L., Smith, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ramped-Amplitude+Cross-Polarization+in+Magic-Angle-Spinning+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Ser.+A%22%5BJournal%5D)">Ramped-Amplitude Cross-Polarization in Magic-Angle-Spinning NMR.</a> J. Magn. Reson. Ser. A. 110, 219-227 (1994).</li>
<li>Peersen, O. B., Wu, X. L., Smith, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+CP-MAS+Signals+by+Variable-Amplitude+Cross-Polarization+-+Compensation+for+Inhomogeneous+B-1+Fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Ser.+A%22%5BJournal%5D)">Enhancement of CP-MAS Signals by Variable-Amplitude Cross-Polarization - Compensation for Inhomogeneous B-1 Fields.</a> J. Magn. Reson. Ser. A. 106, 127-131 (1994).</li>
<li>lessandrini, A., Facci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM%3A+a+versatile+tool+in+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Sci.+%26+Tech%22%5BJournal%5D)">AFM: a versatile tool in biophysics.</a> Measurement Sci. & Tech. 16, 10-1088 (2005).</li>
<li>Benítez, J. J., Matas, A. J., Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+the+plant+biopolyester+cutin+by+AFM+and+spectroscopic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of the plant biopolyester cutin by AFM and spectroscopic techniques.</a> J. Struct. Biol. 147, 179-184 (2004).</li>
<li>Koch, K., Neinhuis, C., Ensikat, H. J., Barthlott, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self+assembly+of+epicuticular+waxes+on+living+plant+surfaces+imaged+by+atomic+force+microscopy+%28AFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exper.+Bot%22%5BJournal%5D)">Self assembly of epicuticular waxes on living plant surfaces imaged by atomic force microscopy (AFM).</a> J. Exper. Bot. 55, 711-718 (2004).</li>
<li>Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM%3A+A+Nanotool+in+Membrane+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">AFM: A Nanotool in Membrane Biology.</a> Biochemistry. 47, 7986-7998 (2008).</li>
<li>Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Applications+of+Atomic+Force+Microscopy+to+Vision+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisane tutaj protokoły umożliwiają szczegółową charakterystykę molekularną i mikroskalową złożonego, trudnego do obróbki materiału roślinnego bez konieczności destrukcyjnego rozkładu chemicznego. Aby zbadać mieszanie biopoliestru kutynowego z różnymi lipidami (woskami), które kontrolują organizację strukturalną kompleksu kutykularnego,10 przeprowadzono i monitorowano procedury selektywnego usuwania wosków epikutykularnych i intrakutykularnych z heterogenicznej mieszaniny kutykularnej. Do oceny ekstrakcji molekularnych składników wosku wykorzystano spektroskopię NMR 13C w fazie stałej, a mikroskopia sił atomowych posłużyła do zbadania towarzyszących zmian chropowatości powierzchni.6,11 W celu porównania zdolności do tworzenia wiązań krzyżowych kutyn z owoców pomidora typu dzikiego oraz mutantów z pojedynczą mutacją genową, wykorzystano również spektroskopię NMR 13C w fazie stałej do oszacowania względnej liczby grup chemicznych CHO i CH2O.
Warto zwrócić uwagę na kilka cech konstrukcyjnych tego protokołu. Ponieważ materiały woskowe obejmują szeroki zakres lipidów, w celu całkowitego odtłuszczenia niezbędne jest traktowanie kutykuli owoców serią rozpuszczalników o różnych polarnościach. Ponadto czas odtłuszczania może wynosić od 8 do 24 godzin, w zależności od charakteru próbek kutykuli. Aby spójnie ekstrahować woski epikutykularne z nienaruszonej kutykuli owoców, konieczne jest równomierne nałożenie powłoki adhezyjnej na powierzchnię.
NMR 13C CPMAS w fazie stałej12 jest szybką metodą jakościową służącą do identyfikacji różnych komponentów strukturalnych wysoce heterogennych i nierozpuszczalnych biopolimerów roślinnych przy zachowaniu ich natywnych właściwości fizycznych;13 tradycyjne NMR w fazie ciekłej może być również wykorzystane do charakterystyki ekstraktów mieszanin woskowych. Jeśli wymagana jest ilościowa ocena grup funkcyjnych w nienaruszonych polimerach roślinnych,5 jako metoda uzupełniająca powinno być zastosowane wysokowiernościowe NMR 13C z bezpośrednią polaryzacją i wirowaniem pod kątem magicznym (DPMAS)5,14. Dokładne oznaczenie ilościowe grup funkcyjnych wymaga starnej optymalizacji czasów relaksacji, długości impulsów wzbudzenia oraz mocy sprzęgania heterojądrowego.15 Sprzęganie heterojądrowe może być ustawione dla natężenia pola 1H w zakresie od 50 kHz do 185 kHz przy użyciu metodologii TPPM16 lub SPINAL7. Oprócz tych parametrów czułość pomiarów CPMAS zależy od czasu spin-lock oraz warunku dopasowania Hartmanna-Hahna.15 Zamiast tradycyjnego CPMAS można zastosować technikę CP z rampą amplitudy (RAMP-CP), aby zmaksymalizować wydajność polaryzacji krzyżowej poprzez liniową (~20-50 %) lub styczną zmianę amplitudy 1H przy zachowaniu stałej amplitudy natężenia pola 13C podczas okresu spin-lock (lub odwrotnie).17,18 Przeprowadzenie pomiarów CPMAS przy co najmniej dwóch różnych częstotliwościach wirowania rotora jest niezbędne do odróżnienia pasm bocznych wirowania od głównych pików widma.
Równoległe pomiary AFM przeprowadzone w trybie kontaktowym umożliwiają bezpośrednie obrazowanie stanu powierzchni kutykuli z wysoką prędkością skanowania i wysoką rozdzielczością,19 na przykład podczas sekwencyjnego usuwania składników woskowych. Praca AFM w trybie stukowym (bezkontaktowym) może być stosowana jako alternatywa do charakterystyki powierzchni delikatnych „miękkich” materiałów roślinnych, co pozwala uniknąć możliwych uszkodzeń spowodowanych siłami bocznymi (ścinającymi) i zdrapywaniem powierzchni próbki.5,20 W obu przypadkach sekwencyjna akwizycja wielu obrazów tego samego miejsca na powierzchni służy do zidentyfikowania ewentualnych uszkodzeń powierzchni wynikających z „oddziaływań sonda-powierzchnia” podczas pomiarów AFM.6,21 Dla uzyskania optymalnej powtarzalności należy stosować sondy AFM o stałych sprężystości odpowiednich dla miękkich powierzchni kutykularnych oraz zachować stałą temperaturę i wilgotność.6,15,20 Podczas gdy NMR w stanie stałym oferuje profil molekularny średnich właściwości ansamblowych (objętościowych) kutykul owoców pomidora, obrazowanie sił atomowych stanowi komplementarną nieinwazyjną metodę 22,23 śledzenia topografii powierzchni tych niezwykle złożonych zespołów makromolekularnych.1,2

<table><tbody><tr><td>Octan sodu trójwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625-500G</td><td></td></tr><tr><td> Pektynaza</td><td>TCI America</td><td>P0026</td><td>EC 3.2.1.15; 10 U ml&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;, przechowywać w lodówce</td></tr><tr><td>Celulaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1184-100KU</td><td>EC232.734.4; 1,3 units/mg, przechowywać w lodówce</td></tr><tr><td>Kwas octowy lodowaty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-100G</td><td>Niezwykle niebezpieczny</td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsarką</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Model No.G24</td><td>MFG No.M1036-000G</td></tr><tr><td>Suszarka próżniowa</td><td>Precision Scientific</td><td>31566</td><td></td></tr><tr><td>Regulator Variac</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygiel szklany spieczony (85 mm/25mm)</td><td>VWR international</td><td>89056</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy tygiel do ekstrakcji (80 mm/25 mm)</td><td>VWR international</td><td>28320</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR international</td><td>EMD-MX0485-7</td><td></td></tr><tr><td>Wata szklana</td><td>VWR international</td><td>RK20789</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>VWR international</td><td>82027-452</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR international</td><td>EM-CX1050-1</td><td></td></tr><tr><td>Heksan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>Azot gazowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR international</td><td>52858</td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki papierowe</td><td>VWR international</td><td>89002-984</td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki Kim wipes</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Guma arabska</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9752</td><td></td></tr><tr><td>Rotor cyrkonowy 1,6 mm fastMAS</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr NMR</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>standard bore magnet</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>Związek wzorcowy dla CPMAS</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49419</td><td>Związek wzorcowy dla CPMAS</td></tr><tr><td>Adamantan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100277</td><td>Do kalibracji impulsu 90&amp;#x00B0; w NMR</td></tr><tr><td>Wielomodalny mikroskop sondy skanującej (Nanoscope IIIA)</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Nanoscope</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td>Wersja 5.30r3sr3 (2005)</td></tr><tr><td>Sonda AFM (nieprzewodząca końcówka z azotku krzemu)</td><td>Veeco Instruments, Inc.</td><td>Model NP-20</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podkładka magnetyczna</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obieraczka do owoców</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lejek B&amp;#252;chnera</td><td>VWR international</td><td>89038</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i badanie biofizyczne kutykuli owoców

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Kutikula, hydrofobowa warstwa ochronna nadziemnych części roślin lądowych, pełni funkcję wszechstronnej bariery obronnej przeciwko różnym stresom biotycznym i abiotycznym, a także reguluje przepływ wody z środowiska zewnętrznego.1 Główną strukturę kutikuli tworzą biopoliester (kutyna) oraz długołańcuchowe kwasy tłuszczowe (woski); integralność funkcjonalna warstwy kutikularnej zależy zarówno od zewnętrznej warstwy „epikutikularnej”, jak i od mieszaniny składającej się z biopolimeru kutyny oraz wosków „intrakutikularnych”.2 W niniejszym opracowaniu opisujemy kompleksowy protokół całkowitej ekstrakcji wosków z kutikul komercyjnych owoców pomidora (Solanum lycopersicum) lub sekwencyjnego i selektywnego usuwania wosków epikutikularnych i intrakutikularnych z kompozytu kutikularnego. Metoda Jettera i Schäffera (2001) została zaadaptowana do stopniowej ekstrakcji wosków epikutikularnych i intrakutikularnych z kutikuli owoców.3,4 W celu monitorowania procesu sekwencyjnego usuwania wosków, równolegle z mikroskopią sił atomowych (AFM) zastosowano spektroskopię NMR 13C w stanie stałym z polaryzacją krzyżową i magicznym kątem obrotu (CPMAS), co pozwoliło na uzyskanie strukturalnych profili materiałów w skali molekularnej, uzupełnionych o informacje na temat topografii i chropowatości powierzchni kutikularnych w skali mikro. Aby ocenić zdolność do sieciowania odwoskowanych kutikul z owoców pomidora typu dzikiego oraz mutantów z pojedynczą mutacją genu, wykorzystano MAS 13C NMR do porównania względnych proporcji utlenionych grup alifatycznych (CHO i CH2O).
Kolejne etapy ekstrakcji Soxhleta z wykorzystaniem zestawu rozpuszczalników o różnej polarności umożliwiają całkowite usunięcie wosków, stanowiąc skuteczną metodę izolacji frakcji woskowych w oparciu o właściwości hydrofobowe ich składników alifatycznych i aromatycznych, przy jednoczesnym zachowaniu struktury chemicznej biopoliestru kutyny. Mechaniczna ekstrakcja wosków epikutykularnych oraz selektywne usuwanie wosków intrakutykularnych, monitorowane za pomocą komplementarnych metod fizycznych, zapewnia bezprecedensowe możliwości badania budowy kutykuli: podejście to pozwala ujawnić organizację supramolekularną i integrację strukturalną różnych typów wosków, architekturę macierzy kutyna-wosk oraz skład chemiczny każdego z komponentów. Ponadto analiza NMR stanu stałego 13C pozwala wykryć różnice w relatywnej liczbie grup chemicznych CHO i CH2O w dojrzałych czerwonych owocach pomidora typu dzikiego oraz mutantów. Techniki NMR stanowią wyjątkowe narzędzia do określania struktury molekularnej materiałów kutykularnych, które są nierozpuszczalne, amorficzne i chemicznie heterogeniczne. Jako nieinwazyjna technika obrazowania selektywnego powierzchniowo, AFM zapewnia skuteczną i bezpośrednią metodę badania organizacji strukturalnej kompleksu kutykularnego w skali od nm do μm.

Nadziemne organy roślin są chronione przez kutykulę, która stanowi supramolekularny kompleks biopoliestru i wosków. Przedstawiamy protokoły monitorowania selektywnego usuwania wosków epikutykularnych i intrakutykularnych z kutykuli owoców pomidora w skalach molekularnej i mikro, odpowiednio za pomocą NMR w stanie stałym oraz mikroskopii sił atomowych, a także oceny zdolności do sieciowania zmodyfikowanych biopoliestrów kutykularnych.

Izolacja i badanie biofizyczne kutykuli owoców

Kutykula, hydrofobowa warstwa ochronna na częściach nadziemnych roślin lądowych, pełni funkcję wszechstronnej bariery obronnej przed różnymi czynnikami biotycznymi i...

W niniejszym doświadczeniu wykorzystano techniki biofizyczne do oceny zdolności sieciowania polimeru kutykularnego pomidora oraz do monitorowania selektywnego usuwania wosków epikutykularnych i intrakutykularnych z kutykul owoców. Izolację kutykuli z całego owocu osiągnięto poprzez obróbkę enzymatyczną skórki pomidora i przylegających ścian komórkowych. W drugim kroku zastosowano ekstrakcję w celu całkowitego odtłuszczenia kutykuli owocu, aby uzyskać charakterystykę molekularną wyizolowanej kutyny.Analizę biopoliestru przeprowadzono za pomocą magnetycznego rezonansu jądrowego w fazie stałej. Spektroskopowa analiza NMR w fazie stałej wykazała, że w kutynie z kutykul owoców pomidora typu dzikiego oraz modyfikowanych genetycznie występują różnice w względnych proporcjach utlenionych fragmentów allofatycznych zdolnych do tworzenia wiązań sieciujących. Alternatywnie, cały owoc pokrywa się gumą arabską, a następnie usuwa skórkę, aby pozbyć się wosków epikutykularnych, po czym zanurza się go w chloroformie w celu usunięcia wosków intrakutykularnych z kutykuli owocu.Następnie kutykule częściowo pozbawione wosków, wyizolowane tą samą metodą enzymatyczną co skórki pomidora, są badane przy użyciu NMR w stanie ciało oraz mikroskopii sił atomowych. Ostatecznie sekwencyjne usuwanie wosków epikutykularnych i intrakutykularnych jest widoczne poprzez obserwację stopniowo zmniejszającego się piku wosku w widmach NMR oraz zmian w profilu powierzchni kutykuli owocu obserwowanych podczas równoległego obrazowania AFM. Organy roślin nadziemne są chronione przez zespół biopoliestrowych wosków nazywany kutykulą. Przedstawimy protokoły służące do oceny selektywnego usuwania wosków wewnętrznych i zewnętrznych z kutykul owoców pomidora z wykorzystaniem magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie ciało oraz mikroskopii sił atomowych.Metody te mogą być również wykorzystane do oceny zdolności sieciowania zmodyfikowanych materiałów kutykularnych. Procedury zostaną zaprezentowane przez trzech członków grupy: dr Ishish Chatterjee, doktorantkę Shantani Sarkar oraz byłą uczennicę szkoły średniej Julię Tik. Dodatkową demonstratorką jest dr Olivia Nisau, pracownik postdoktorski w laboratorium naszego kolegi z wydziału inżynierii chemicznej, dr Alexandra S. Aby rozpocząć enzymatyczną izolację skórki pomidora, należy umieścić trzy owoce komercyjne lub hodowlane w misce, obrać skórkę w dużych fragmentach i usunąć wewnętrzną tkankę perykarpium.Następnie należy opłukać skórki pomidorów wodą dejonizowaną i przechowywać je pod wodą w zlewce, całkowicie zanurzając obrane skórki w koktajlu enzymatycznym przygotowanym zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Inkubować w temperaturze 31°C przez 24 godziny przy ciągłym wytrząsaniu. Zebrać skórki pomidorów za pomocą lejka Büchnera lub sitka kuchennego i opłukać je wodą dejonizowaną.Po umieszczeniu skórek w piecu próżniowym w temperaturze pokojowej na jedną godzinę, wysuszone skórki można przechowywać w oznakowanej i zakręconej butelce. Do późniejszych procedur usuwania wosków napełnić do połowy szklaną lub jednorazową probówkę typu thimble próbką kutykuli pomidora, używając pęsety, aby ostrożnie umieścić ją u podstawy kolumny ekstrakcyjnej stosowanej w ekstrakcji Soxhleta. Następnie należy przygotować aparat Soxhleta, stosując metanol jako rozpuszczalnik, zgodnie z opisem w protokole pisemnym.Monitoruj proces przez godzinę, regulując napięcie w wariaku tak, aby w zbiorniku gromadziła się około jedna kropla na sekundę i następował proces syfonowania wewnątrz urządzenia. Gdy tuleja zostanie wypełniona, po 12-godzinnej ekstrakcji, pozwól aparatowi ostygnąć, następnie obniż płaszcz grzejny i wyjmij ekstraktor wraz ze zbiornikiem jako jedną jednostką, aby zutylizować rozpuszczalnik po ekstrakcji. Przechyl kolumnę, aby umożliwić spłynięcie zawartości przez syfon do kolby znajdującej się poniżej.Używając pęsety, podnieś tygielek tak, aby znajdował się tuż poniżej szyjki kolumny ekstrakcyjnej. Odlej z niego nadmiar rozpuszczalnika, a następnie umieść tygielek na czystej powierzchni. Odłącz kolbę i wlej odpady do odpowiednio oznakowanego pojemnika na rozpuszczalniki.Powtórz procedurę ekstrakcji dla kolejnych rozpuszczalników o stopniowo malejącej polarności, takich jak chloroform i taksan, przez 12 godzin dla każdego z nich. Po wysuszeniu próbki skórki pomidora zmierz jej masę i przechowuj w temperaturze pokojowej w słoiku z zakrętką uszczelnionym parafinią. Aby przygotować próbkę do analizy NMR, umieść od czterech do sześciu miligramów całkowicie odwoskowanej kutyny (skórki pomidora) w 1,6 milimetrowym cyrkonowym rotorze fast MAS, używając do tego narzędzia do pakowania dostarczonego przez producenta.Po zainstalowaniu górnej nakrętki należy pomalować połowę nakrętki czarnym pisakiem permanentnym, aby umożliwić pomiar prędkości wirowania. Wstępna konfiguracja eksperymentu NMR w stanie stałym jest procesem wymagającym technicznie i powinna być przeprowadzona pod nadzorem doświadczonego personelu. Należy rozpocząć od dostrojenia jednorodności pola magnetycznego i optymalizacji parametrów eksperymentalnych przy użyciu związku modelowego, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Następnie należy włożyć przygotowany i upakowany rotor do głowicy, a następnie umieścić głowicę w magnesie.Stopniowo zwiększaj prędkość wirowania do 10 kilohertz, aby zweryfikować prawidłowe upakowanie próbki oraz zdolność rotora do stabilnego wirowania z odchyleniem mniejszym niż 20 hertz. Iteracyjnie dostrajaj kondensatory strojące i dopasowujące sondy, aby osiągnąć minimalne odbicie mocy zarówno dla częstotliwości NMR protonów, jak i węgla 13. Ustaw temperaturę eksperymentu na 25 degrees Celsius.Rozpocznij zoptymalizowany eksperyment CPMA odpowiadający warunkom dopasowania protonowo-węglowego według metody Hartmana-Hana, wyznaczonym dla częstotliwości wirowania 10 kHz, po zarejestrowaniu 4 096 przejściach. Przetwórz widmo, stosując wykładnicze poszerzenie linii w zakresie od 50 do 100 Hz, a następnie wykonaj transformację Fouriera, aby uzyskać widmo NMR przedstawiające intensywność sygnału w funkcji przesłonięcia chemicznego wyrażonego w częściach na milion. Przesunięcia chemiczne węgla 13 odnieś zgodnie z opisem w tekście.Zwiększyć częstotliwość obrotową rotora do 15 kHz i powtórzyć pomiar C-P-M-A-S odpowiadający warunkowi dopasowania Hartmana-Hana, wyznaczonemu podczas analizy przesunięcia chemicznego przy częstotliwości obrotowej drabiny dla widm C-P-M-A-S 13C NMR. Zidentyfikowano główne grupy funkcyjne obecne w całkowicie odwoskowanej kutykuli pomidora: długołańcuchowe PHA, utlenione PHA, związki wielowiązowe i aromatyczne oraz wydajności węglowe. Utlenione PHA odgrywają kluczową rolę w tworzeniu połączeń kowalencyjnych między jednostkami monomerycznymi biopolimeru kutyny, formując tym samym architekturę molekularną macierzy kutyny.Różnice w względnych obszarach piku zaobserwowane w regionie widma między 45 a 100 części na milion sugerują, że zmutowana kutyna posiada stosunkowo duży udział tworzących wiązania krzyżowe motywów strukturalnych CHO w porównaniu z typem dzikim apiny. Aby rozpocząć selektywne wyodrębnianie wosków epikutykularnych i intrakutykularnych.Umyj drugą partię całych pomidorów wodą destylowaną. Osusz je ręcznikami papierowymi oraz chusteczkami Kim wipes i ułóż szypułkami do dołu na kawałku folii aluminiowej. Pomaluj całe pomidory od góry do dołu 120% wodnym roztworem gumy arabskiej.Pozostaw gumę arabską do wyschnięcia na skórce owocu przez jedną godzinę, aż powstanie cienka błona. Usuń tę błonę za pomocą pęsety, unikając przebicia skórki pomidora. Dalsza obróbka błony, opisana w tekście, pozwala na uzyskanie epikutykularnego wosku.Pomidory pozostaną w całości. Zanurzamy je w chloroformie na dwie minuty. W temperaturze pokojowej wosk wewnątrzkutykularny można zebrać po odparowaniu rozpuszczalnika; następnie należy obrać pomidory i poddać je działaniu enzymatycznemu z użyciem celulazy i pektynazy w buforze z octanu sodu, aby usunąć odpowiednio celulozę i pektynę.Następnie można przeprowadzić ekstrakcję salą, zgodnie z wcześniejszym opisem, aby całkowicie odtłuścić pomidory. Eksperymenty C-P-M-A-S można powtórzyć z wykorzystaniem próbek naturalnej oraz częściowo odtłuszczonej kutykuli owoców, zgodnie z opisem w tekście. Konfiguracja mikroskopu sił atomowych jest skomplikowanym procesem i najlepiej wykonać ją pod początkowym nadzorem doświadczonego personelu technicznego. FM rozpoczyna pracę od włączenia skaningowego mikroskopu sondowego (w skrócie SPM) i upewnienia się, że przełącznik trybu mikroskopu jest ustawiony na tryb kontaktowej mikroskopii sił atomowych.Następnie ręcznie podnieś głowicę SPM, obracając dwa regulowane przednie pokrętła. Odłącz uchwyt sondy AFM od głowicy SPM, odkręcając śrubę mocującą znajdującą się z tyłu głowicy. Używając pęsety, wyjmij istniejący wspornik AFM z uchwytu.Następnie ostrożnie wyjmij z opakowania nową dźwignię z końcówką z azotku krzemu i zainstaluj ją w miejsce starej dźwigni. Użyj mikroskopu świetlnego, aby upewnić się, że nowo zainstalowana dźwignia FM nie jest uszkodzona. Przymocuj próbkę kutykuli pomidora do uchwytu na próbkę za pomocą dwustronnej taśmy.Użyj mikroskopu świetlnego, aby upewnić się, że próbka kutykuli pozostaje płaska i gładka. Po umieszczeniu próbki na krążku, przymocowaną do niego próbkę kutykuli pomidora umieść na obszarze magnetycznym w górnej części skanera SPM. Przekręcając pokrętła, ustaw dwa przednie śruby manualne skanera na tyle wysoko, aby uniknąć uszkodzenia końcówki AFM.Po umieszczeniu uchwytu końcówki w głowicy SPM, ustaw zmotoryzowaną śrubę tylną na poziomie zbliżonym do poziomu dwóch pozostałych śrub przednich. Ponownie włóż uchwyt końcówki do głowicy SPM i zabezpiecz go, dokręcając tylną śrubę zaciskową głowicy. Po włączeniu lasera, ustaw plamkę laserową na wsporniku FM, korzystając z centralnego i prawego pokrętła regulacji lasera znajdujących się na górze głowicy.Monitoruj odbitą wiązkę laserową na kartce papieru, aby precyzyjnie ustawić plamkę lasera na końcu wspornika FM. Dostosuj położenie plamki lasera w celu uzyskania maksymalnej sumy sygnału. Reguluj położenie odbitej plamki lasera na fotodetektorze, przesuwając ruchome lustro w płaszczyźnie poziomej i pionowej, aby zapewnić równomierny odbiór światła padającego przez cztery kwadranty.Detektor obniża końcówkę A FM poprzez wycofanie sterowanych przez użytkownika śrub przednich oraz zmotoryzowanej śruby tylnej skanera SPM. Należy wizualnie monitorować zbliżanie się końcówki A FM do powierzchni próbki za pomocą mikroskopu odwróconego. Należy upewnić się, że wszystkie trzy śruby znajdują się na tym samym poziomie.Aby uniknąć artefaktów wynikających z obrazowania przechylonej próbki, zbliż końcówkę do próbki, lecz nie tak blisko, aby dotknęła ona lub przebiła jej powierzchnię. Światło laserowe odbite od wspornika AFM odbije się od ruchomego lustra i trafi do detektora światłoczułego dla trybu kontaktowego AFM z sondą AFM z azotku krzemu. Ustaw napięcie sygnału wyjściowego na minus dwa wolty dla punktu nastawy zero woltów oraz sygnał różnicowy na zero woltów, regulując pozycję lustra.Korzystając z oprogramowania nano scope, kliknij ikonę mikroskopu i wybierz odpowiedni profil. W panelu ustawień sterowania skanowaniem ustaw szybkość oraz obszar skanowania.Pozwól końcówce AFM zetknąć się z powierzchnią próbki, klikając ikonę engage tip. Program, sterując zmotoryzowaną śrubą cofającą podstawy SPM, obniży teraz końcówkę, aż zetknie się ona z powierzchnią próbki. Proces skanowania rozpocznie się automatycznie po pomyślnym zetknięciu się końcówki z próbką.Monitoruj proces skanowania, korzystając z trybów obrazowania i widoku zakresu (scope) oprogramowania, iteracyjnie dostosowując parametry w celu uzyskania obrazów o najwyższej rozdzielczości, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Na przykład, rozpocznij skanowanie z dużą wartością skali danych osi Z. Następnie ostrożnie zmniejszaj wartość skali danych Z, aby uzyskać najlepszy kontrast cech powierzchni na obrazie.Należy zarejestrować obraz, aby zapisać plik danych. Następnie przetworzyć dane, stosując funkcje spłaszczania (flattening), aby usunąć artefakty obrazu wynikające z dryftu pionowego skanera, wygięć obrazu oraz przesunięcia pionowego między liniami skanowania. Na koniec obliczyć średnią chropowatość węgla.Widma 13 C-P-M-A-S-N-M-R wykazały stopniowe zmniejszanie się piku wosku przy 31 parts per million, co wskazuje na sekwencyjne usuwanie wosków epikutykularnych i intrakutykularnych z kompozytu kutykuli i wosku, przy jednoczesnym zachowaniu głównej architektury chemicznej biopolimeru kutyny. Analiza obrazu FM ujawniła nieprawidłowości powierzchni wynikające z etapowej ekstrakcji wosku epikutykularnego i wosku intrakutykularnego z kutykuli owocu, co sygnalizuje zmiany w organizacji kompleksu kutykularnego. Po opanowaniu tej techniki sekwencyjne usuwanie wosków epikutykularnych i intrakutykularnych z kutykuli owoców pomidora może zostać wykonane w ciągu dwóch godzin.Podczas przeprowadzania ekstrakcji w fazie stałej w celu całkowitego usunięcia kutykuli owoców istotne jest zastosowanie zestawu rozpuszczalników o różnej polarności po użyciu węzła kontaktowego. Poniżej przedstawiono protokół FM. Dodatkowe eksperymenty FM mogą zostać wykorzystane do pomiaru elastyczności powierzchni kutykuli.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat systematycznego izolowania składników z kompozytu kutylowo-woskowego oraz przeprowadzania analizy molekularnej i szybkiego badania powierzchni materiałów kutykularnych, odpowiednio z wykorzystaniem MR w stanie stałym oraz FM. Techniki przedstawione w tym filmie umożliwiają badaczom w dziedzinie biologii roślin określenie składu molekularnego i architektury supermolekularnej naturalnych oraz modyfikowanych genetycznie tkanek roślinnych.

isolation-and-biophysical-study-of-fruit-cuticles

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja i badanie biofizyczne skórek owocowych

Kutykula roślinna to woskowa zewnętrzna powłoka roślin, której główną funkcją jest zapobieganie utracie wody, ale stanowi ona również istotną barierę przeciwko wnikaniu mikroorganizmów patogennych. W tym filmie prezentujemy analizę mutantów kutykuli roślinnej zidentyfikowanych za pomocą metod genetyki forward i reverse.

Wykorzystanie mutantów Arabidopsis eceriferum do badania biosyntezy kutykuli roślinnej

Molimimfa Drosophila służy zarówno jako krew, jak i płyn śródmiąższowy, krążąc po całym ciele podczas stadium larwy i dorosłego osobnika. Ten film opisuje protokół pobierania larw hemolimfy w celu ilościowego określenia krążących komórek.

Przerwanie naskórka: metoda zbierania hemolimfy z larw Drosophila

Udostępniamy technikę zachowania nienaruszonego łyka drzewnego i przygotowania go do obserwacji.  Tworzymy aparat zwany kanapką łyka, który pozwala na wprowadzenie i obserwację stawonogów, drobnoustrojów i innych organizmów zasiedlających tkanki łyka.

Technika badania zbiorowisk stawonogów i mikroorganizmów w tkankach drzew

Poliestry lipidowe stanowią składniki strukturalne dwóch modyfikacji ściany komórkowej, naskórka roślinnego i barier dyfuzyjnych zawierających suberynę. W tym filmie opisujemy metodę depolimeryzacji kutyny z całych zdelipidowanych liści. Metoda ta może być stosowana do badania mutantów upośledzonych w biosyntezie kutyny lub suberyny.

Izolacja i analiza składu monomerów lipidowych poliestrowych naskórków roślin

Idealnym modelem do badania biologii dorosłych komórek macierzystych jest mieszek włosowy myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji różnych populacji mieszków włosowych, komórek macierzystych i keratynocytów naskórka, wykorzystujący trawienie enzymatyczne skóry grzbietowej myszy, a następnie analizę FACS.

Izolowanie komórek macierzystych mieszków włosowych i keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry myszy

Celem tego protokołu jest wyizolowanie keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry dorosłych myszy do różnych dalszych zastosowań, takich jak biologia molekularna, biochemia, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i podstawowe zastosowania in vitro (np. keratynocyty klonogenne).

Izolacja keratynocytów naskórka myszy i ich klonogenna hodowla in vitro

Badanie gojenia się ran związanych z urazami mięśniowo-szkieletowymi często wymaga oceny interakcji in vitro między komórkami Schwanna (SC), keratynocytami i fibroblastami. Protokół ten opisuje izolację, hodowlę i charakterystykę tych pierwotnych komórek z ludzkiego napletka.

Izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych komórek Schwanna, keratynocytów i fibroblastów z ludzkiego napletka

Przedstawiono szybki i skuteczny protokół izolacji kropelek lipidów plastoglobul związanych z różnymi organizmami fotosyntetycznymi. Pomyślne przygotowanie wyizolowanych plastoglobul jest kluczowym pierwszym krokiem, który poprzedza szczegółowe badania molekularne, takie jak analizy proteomiczne i lipidomiczne.

Izolacja kropelek lipidów plastoglobuli z tkanki liści roślin i cyjanobakterii

Przedstawiono protokół dla wygodnej i wysokoprzepustowej izolacji i wzbogacania gruczołowych łodyg główkowatych i siedzących trichomów z Cannabis sativa. Protokół opiera się na suchej, niebuforowej ekstrakcji trichomów przy użyciu wyłącznie ciekłego azotu, suchego lodu i sit nylonowych i nadaje się do ekstrakcji RNA i analizy transkryptomicznej.

Niewodna izolacja i wzbogacenie gruczołowych łodyg główkowatych i włosków siedzących z Cannabis sativa

Obecny artykuł ma na celu dostarczenie szczegółowych i adekwatnych protokołów do izolacji grzybów endofitycznych związanych z roślinami, długoterminowego przechowywania izolatów, charakterystyki morfologicznej i całkowitej ekstrakcji DNA w celu późniejszej identyfikacji molekularnej i analiz metagenomicznych.

Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych

Poznaj metody izolacji i charakteryzacji skórek owocowych pomidora przy użyciu spektroskopii NMR i mikroskopii sił atomowych. Techniki te umożliwiają badanie struktury biopolimerów roślinnych.

Izolacja i badanie biofizyczne kutykuli owoców

Przeglądaj więcej filmów