Izolacja i badanie biofizyczne kutykuli owoców

W niniejszym doświadczeniu wykorzystano techniki biofizyczne do oceny zdolności sieciowania polimeru kutykularnego pomidora oraz do monitorowania selektywnego usuwania wosków epikutykularnych i intrakutykularnych z kutykul owoców. Izolację kutykuli z całego owocu osiągnięto poprzez obróbkę enzymatyczną skórki pomidora i przylegających ścian komórkowych. W drugim kroku zastosowano ekstrakcję w celu całkowitego odtłuszczenia kutykuli owocu, aby uzyskać charakterystykę molekularną wyizolowanej kutyny.

Analizę biopoliestru przeprowadzono za pomocą magnetycznego rezonansu jądrowego w fazie stałej. Spektroskopowa analiza NMR w fazie stałej wykazała, że w kutynie z kutykul owoców pomidora typu dzikiego oraz modyfikowanych genetycznie występują różnice w względnych proporcjach utlenionych fragmentów allofatycznych zdolnych do tworzenia wiązań sieciujących. Alternatywnie, cały owoc pokrywa się gumą arabską, a następnie usuwa skórkę, aby pozbyć się wosków epikutykularnych, po czym zanurza się go w chloroformie w celu usunięcia wosków intrakutykularnych z kutykuli owocu.

Następnie kutykule częściowo pozbawione wosków, wyizolowane tą samą metodą enzymatyczną co skórki pomidora, są badane przy użyciu NMR w stanie ciało oraz mikroskopii sił atomowych. Ostatecznie sekwencyjne usuwanie wosków epikutykularnych i intrakutykularnych jest widoczne poprzez obserwację stopniowo zmniejszającego się piku wosku w widmach NMR oraz zmian w profilu powierzchni kutykuli owocu obserwowanych podczas równoległego obrazowania AFM. Organy roślin nadziemne są chronione przez zespół biopoliestrowych wosków nazywany kutykulą. Przedstawimy protokoły służące do oceny selektywnego usuwania wosków wewnętrznych i zewnętrznych z kutykul owoców pomidora z wykorzystaniem magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie ciało oraz mikroskopii sił atomowych.

Metody te mogą być również wykorzystane do oceny zdolności sieciowania zmodyfikowanych materiałów kutykularnych. Procedury zostaną zaprezentowane przez trzech członków grupy: dr Ishish Chatterjee, doktorantkę Shantani Sarkar oraz byłą uczennicę szkoły średniej Julię Tik. Dodatkową demonstratorką jest dr Olivia Nisau, pracownik postdoktorski w laboratorium naszego kolegi z wydziału inżynierii chemicznej, dr Alexandra S. Aby rozpocząć enzymatyczną izolację skórki pomidora, należy umieścić trzy owoce komercyjne lub hodowlane w misce, obrać skórkę w dużych fragmentach i usunąć wewnętrzną tkankę perykarpium.

Następnie należy opłukać skórki pomidorów wodą dejonizowaną i przechowywać je pod wodą w zlewce, całkowicie zanurzając obrane skórki w koktajlu enzymatycznym przygotowanym zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Inkubować w temperaturze 31°C przez 24 godziny przy ciągłym wytrząsaniu. Zebrać skórki pomidorów za pomocą lejka Büchnera lub sitka kuchennego i opłukać je wodą dejonizowaną.

Po umieszczeniu skórek w piecu próżniowym w temperaturze pokojowej na jedną godzinę, wysuszone skórki można przechowywać w oznakowanej i zakręconej butelce. Do późniejszych procedur usuwania wosków napełnić do połowy szklaną lub jednorazową probówkę typu thimble próbką kutykuli pomidora, używając pęsety, aby ostrożnie umieścić ją u podstawy kolumny ekstrakcyjnej stosowanej w ekstrakcji Soxhleta. Następnie należy przygotować aparat Soxhleta, stosując metanol jako rozpuszczalnik, zgodnie z opisem w protokole pisemnym.

Monitoruj proces przez godzinę, regulując napięcie w wariaku tak, aby w zbiorniku gromadziła się około jedna kropla na sekundę i następował proces syfonowania wewnątrz urządzenia. Gdy tuleja zostanie wypełniona, po 12-godzinnej ekstrakcji, pozwól aparatowi ostygnąć, następnie obniż płaszcz grzejny i wyjmij ekstraktor wraz ze zbiornikiem jako jedną jednostką, aby zutylizować rozpuszczalnik po ekstrakcji. Przechyl kolumnę, aby umożliwić spłynięcie zawartości przez syfon do kolby znajdującej się poniżej.

Używając pęsety, podnieś tygielek tak, aby znajdował się tuż poniżej szyjki kolumny ekstrakcyjnej. Odlej z niego nadmiar rozpuszczalnika, a następnie umieść tygielek na czystej powierzchni. Odłącz kolbę i wlej odpady do odpowiednio oznakowanego pojemnika na rozpuszczalniki.

Powtórz procedurę ekstrakcji dla kolejnych rozpuszczalników o stopniowo malejącej polarności, takich jak chloroform i taksan, przez 12 godzin dla każdego z nich. Po wysuszeniu próbki skórki pomidora zmierz jej masę i przechowuj w temperaturze pokojowej w słoiku z zakrętką uszczelnionym parafinią. Aby przygotować próbkę do analizy NMR, umieść od czterech do sześciu miligramów całkowicie odwoskowanej kutyny (skórki pomidora) w 1,6 milimetrowym cyrkonowym rotorze fast MAS, używając do tego narzędzia do pakowania dostarczonego przez producenta.

Po zainstalowaniu górnej nakrętki należy pomalować połowę nakrętki czarnym pisakiem permanentnym, aby umożliwić pomiar prędkości wirowania. Wstępna konfiguracja eksperymentu NMR w stanie stałym jest procesem wymagającym technicznie i powinna być przeprowadzona pod nadzorem doświadczonego personelu. Należy rozpocząć od dostrojenia jednorodności pola magnetycznego i optymalizacji parametrów eksperymentalnych przy użyciu związku modelowego, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Następnie należy włożyć przygotowany i upakowany rotor do głowicy, a następnie umieścić głowicę w magnesie.

Stopniowo zwiększaj prędkość wirowania do 10 kilohertz, aby zweryfikować prawidłowe upakowanie próbki oraz zdolność rotora do stabilnego wirowania z odchyleniem mniejszym niż 20 hertz. Iteracyjnie dostrajaj kondensatory strojące i dopasowujące sondy, aby osiągnąć minimalne odbicie mocy zarówno dla częstotliwości NMR protonów, jak i węgla 13. Ustaw temperaturę eksperymentu na 25 degrees Celsius.

Rozpocznij zoptymalizowany eksperyment CPMA odpowiadający warunkom dopasowania protonowo-węglowego według metody Hartmana-Hana, wyznaczonym dla częstotliwości wirowania 10 kHz, po zarejestrowaniu 4 096 przejściach. Przetwórz widmo, stosując wykładnicze poszerzenie linii w zakresie od 50 do 100 Hz, a następnie wykonaj transformację Fouriera, aby uzyskać widmo NMR przedstawiające intensywność sygnału w funkcji przesłonięcia chemicznego wyrażonego w częściach na milion. Przesunięcia chemiczne węgla 13 odnieś zgodnie z opisem w tekście.

Zwiększyć częstotliwość obrotową rotora do 15 kHz i powtórzyć pomiar C-P-M-A-S odpowiadający warunkowi dopasowania Hartmana-Hana, wyznaczonemu podczas analizy przesunięcia chemicznego przy częstotliwości obrotowej drabiny dla widm C-P-M-A-S 13C NMR. Zidentyfikowano główne grupy funkcyjne obecne w całkowicie odwoskowanej kutykuli pomidora: długołańcuchowe PHA, utlenione PHA, związki wielowiązowe i aromatyczne oraz wydajności węglowe. Utlenione PHA odgrywają kluczową rolę w tworzeniu połączeń kowalencyjnych między jednostkami monomerycznymi biopolimeru kutyny, formując tym samym architekturę molekularną macierzy kutyny.

Różnice w względnych obszarach piku zaobserwowane w regionie widma między 45 a 100 części na milion sugerują, że zmutowana kutyna posiada stosunkowo duży udział tworzących wiązania krzyżowe motywów strukturalnych CHO w porównaniu z typem dzikim apiny. Aby rozpocząć selektywne wyodrębnianie wosków epikutykularnych i intrakutykularnych.

Umyj drugą partię całych pomidorów wodą destylowaną. Osusz je ręcznikami papierowymi oraz chusteczkami Kim wipes i ułóż szypułkami do dołu na kawałku folii aluminiowej. Pomaluj całe pomidory od góry do dołu 120% wodnym roztworem gumy arabskiej.

Pozostaw gumę arabską do wyschnięcia na skórce owocu przez jedną godzinę, aż powstanie cienka błona. Usuń tę błonę za pomocą pęsety, unikając przebicia skórki pomidora. Dalsza obróbka błony, opisana w tekście, pozwala na uzyskanie epikutykularnego wosku.

Pomidory pozostaną w całości. Zanurzamy je w chloroformie na dwie minuty. W temperaturze pokojowej wosk wewnątrzkutykularny można zebrać po odparowaniu rozpuszczalnika; następnie należy obrać pomidory i poddać je działaniu enzymatycznemu z użyciem celulazy i pektynazy w buforze z octanu sodu, aby usunąć odpowiednio celulozę i pektynę.

Następnie można przeprowadzić ekstrakcję salą, zgodnie z wcześniejszym opisem, aby całkowicie odtłuścić pomidory. Eksperymenty C-P-M-A-S można powtórzyć z wykorzystaniem próbek naturalnej oraz częściowo odtłuszczonej kutykuli owoców, zgodnie z opisem w tekście. Konfiguracja mikroskopu sił atomowych jest skomplikowanym procesem i najlepiej wykonać ją pod początkowym nadzorem doświadczonego personelu technicznego. FM rozpoczyna pracę od włączenia skaningowego mikroskopu sondowego (w skrócie SPM) i upewnienia się, że przełącznik trybu mikroskopu jest ustawiony na tryb kontaktowej mikroskopii sił atomowych.

Następnie ręcznie podnieś głowicę SPM, obracając dwa regulowane przednie pokrętła. Odłącz uchwyt sondy AFM od głowicy SPM, odkręcając śrubę mocującą znajdującą się z tyłu głowicy. Używając pęsety, wyjmij istniejący wspornik AFM z uchwytu.

Następnie ostrożnie wyjmij z opakowania nową dźwignię z końcówką z azotku krzemu i zainstaluj ją w miejsce starej dźwigni. Użyj mikroskopu świetlnego, aby upewnić się, że nowo zainstalowana dźwignia FM nie jest uszkodzona. Przymocuj próbkę kutykuli pomidora do uchwytu na próbkę za pomocą dwustronnej taśmy.

Użyj mikroskopu świetlnego, aby upewnić się, że próbka kutykuli pozostaje płaska i gładka. Po umieszczeniu próbki na krążku, przymocowaną do niego próbkę kutykuli pomidora umieść na obszarze magnetycznym w górnej części skanera SPM. Przekręcając pokrętła, ustaw dwa przednie śruby manualne skanera na tyle wysoko, aby uniknąć uszkodzenia końcówki AFM.

Po umieszczeniu uchwytu końcówki w głowicy SPM, ustaw zmotoryzowaną śrubę tylną na poziomie zbliżonym do poziomu dwóch pozostałych śrub przednich. Ponownie włóż uchwyt końcówki do głowicy SPM i zabezpiecz go, dokręcając tylną śrubę zaciskową głowicy. Po włączeniu lasera, ustaw plamkę laserową na wsporniku FM, korzystając z centralnego i prawego pokrętła regulacji lasera znajdujących się na górze głowicy.

Monitoruj odbitą wiązkę laserową na kartce papieru, aby precyzyjnie ustawić plamkę lasera na końcu wspornika FM. Dostosuj położenie plamki lasera w celu uzyskania maksymalnej sumy sygnału. Reguluj położenie odbitej plamki lasera na fotodetektorze, przesuwając ruchome lustro w płaszczyźnie poziomej i pionowej, aby zapewnić równomierny odbiór światła padającego przez cztery kwadranty.

Detektor obniża końcówkę A FM poprzez wycofanie sterowanych przez użytkownika śrub przednich oraz zmotoryzowanej śruby tylnej skanera SPM. Należy wizualnie monitorować zbliżanie się końcówki A FM do powierzchni próbki za pomocą mikroskopu odwróconego. Należy upewnić się, że wszystkie trzy śruby znajdują się na tym samym poziomie.

Aby uniknąć artefaktów wynikających z obrazowania przechylonej próbki, zbliż końcówkę do próbki, lecz nie tak blisko, aby dotknęła ona lub przebiła jej powierzchnię. Światło laserowe odbite od wspornika AFM odbije się od ruchomego lustra i trafi do detektora światłoczułego dla trybu kontaktowego AFM z sondą AFM z azotku krzemu. Ustaw napięcie sygnału wyjściowego na minus dwa wolty dla punktu nastawy zero woltów oraz sygnał różnicowy na zero woltów, regulując pozycję lustra.

Korzystając z oprogramowania nano scope, kliknij ikonę mikroskopu i wybierz odpowiedni profil. W panelu ustawień sterowania skanowaniem ustaw szybkość oraz obszar skanowania.

Pozwól końcówce AFM zetknąć się z powierzchnią próbki, klikając ikonę engage tip. Program, sterując zmotoryzowaną śrubą cofającą podstawy SPM, obniży teraz końcówkę, aż zetknie się ona z powierzchnią próbki. Proces skanowania rozpocznie się automatycznie po pomyślnym zetknięciu się końcówki z próbką.

Monitoruj proces skanowania, korzystając z trybów obrazowania i widoku zakresu (scope) oprogramowania, iteracyjnie dostosowując parametry w celu uzyskania obrazów o najwyższej rozdzielczości, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Na przykład, rozpocznij skanowanie z dużą wartością skali danych osi Z. Następnie ostrożnie zmniejszaj wartość skali danych Z, aby uzyskać najlepszy kontrast cech powierzchni na obrazie.

Należy zarejestrować obraz, aby zapisać plik danych. Następnie przetworzyć dane, stosując funkcje spłaszczania (flattening), aby usunąć artefakty obrazu wynikające z dryftu pionowego skanera, wygięć obrazu oraz przesunięcia pionowego między liniami skanowania. Na koniec obliczyć średnią chropowatość węgla.

Widma 13 C-P-M-A-S-N-M-R wykazały stopniowe zmniejszanie się piku wosku przy 31 parts per million, co wskazuje na sekwencyjne usuwanie wosków epikutykularnych i intrakutykularnych z kompozytu kutykuli i wosku, przy jednoczesnym zachowaniu głównej architektury chemicznej biopolimeru kutyny. Analiza obrazu FM ujawniła nieprawidłowości powierzchni wynikające z etapowej ekstrakcji wosku epikutykularnego i wosku intrakutykularnego z kutykuli owocu, co sygnalizuje zmiany w organizacji kompleksu kutykularnego. Po opanowaniu tej techniki sekwencyjne usuwanie wosków epikutykularnych i intrakutykularnych z kutykuli owoców pomidora może zostać wykonane w ciągu dwóch godzin.

Podczas przeprowadzania ekstrakcji w fazie stałej w celu całkowitego usunięcia kutykuli owoców istotne jest zastosowanie zestawu rozpuszczalników o różnej polarności po użyciu węzła kontaktowego. Poniżej przedstawiono protokół FM. Dodatkowe eksperymenty FM mogą zostać wykorzystane do pomiaru elastyczności powierzchni kutykuli.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat systematycznego izolowania składników z kompozytu kutylowo-woskowego oraz przeprowadzania analizy molekularnej i szybkiego badania powierzchni materiałów kutykularnych, odpowiednio z wykorzystaniem MR w stanie stałym oraz FM. Techniki przedstawione w tym filmie umożliwiają badaczom w dziedzinie biologii roślin określenie składu molekularnego i architektury supermolekularnej naturalnych oraz modyfikowanych genetycznie tkanek roślinnych.