Name: Eksperymentalny system do badania mechanotransdukcji w komórkach płuc płodu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek nabłonkowych typu II i fibroblastów z płuc płodowych myszy oraz system in vitro do badania mechanotransdukcji. Technika ta pozwala analizować różnicowanie komórek pod wpływem bodźców mechanicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez grant NIH HD052670.

1. Powlekanie płytek białkami ECM
<ol>
	<li>W warunkach sterylnych wymieszać 120 μg lamininy z 12 ml zimnego sterylnego 1X PBS na każdą płytkę.</li>
	<li>Przygotować niepotraktowane płytki Bioflex i dodać 2 ml roztworu do każdej studni (końcowe stężenie lamininy wynosi 2 μg/cm2). Alternatywnie można zastosować inne białka ECM, takie jak kolagen typu I [10 μg/cm2], fibronektyna [5 μg/cm2], witronektyna [0,5 μg/cm2] lub elastyna [10 μg/cm2]. Technika powlekania jest analogiczna do opisanej dla lamininy. Należy upewnić się, że studnie są całkowicie pokryte roztworem.</li>
	<li>Owiniąć płytki folią i pozostawić na płaskiej powierzchni w temperaturze 4°C przez noc, aby umożliwić adsorpcję lamininy do dna studni. W tych warunkach płytki można przechowywać przez co najmniej tydzień, zachowując prawidłową funkcjonalność ECM.</li>
	<li>Następnego dnia, w warunkach sterylnych, wypłukać studnie 3 razy za pomocą 1X PBS.</li>
	<li>Do każdej studni dodać 1 ml 1% BSA w 1X PBS i inkubować w temperaturze 37°C przez 1 h w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania na membranach.</li>
	<li>Wypłukać płytki 3 razy za pomocą 1X PBS, aby usunąć niezaadsorbowane białka.</li>
	<li>Przechowywać płytki w temperaturze 37°C w medium DMEM do momentu wyizolowania komórek w kroku 2.14.</li>
</ol>
2. Izolacja komórek nabłonkowych typu II płuc płodowych gryzoni
Dzień przed izolacją należy przygotować autoklawowane kubki z sitami o różnych rozmiarach oczek nylonowych.
<ol>
	<li>Pobrać płuca płodowe z ciężarnych myszy/szczurów w 17-19 dniu ciąży (E17-19). Przenieść tkankę do probówki stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej medium DMEM i umieścić na lodzie.</li>
	<li>Przygotować bufor do trawienia w probówce stożkowej o pojemności 50 ml: (10 ml). Dla tej objętości wykorzystuje się tkankę płuc z około 20 płodów myszy/szczura. 
	8,5 ml DMEM 
	0,5 ml 500mM HEPES pH 7,4 
	5 mg kolagenazy 1 
	5 mg kolagenazy 1A 
	1 ml surowicy kurzej, inaktywowanej ciepłem</li>
	<li>Wymieszać dokładnie do całkowitego rozpuszczenia wszystkich składników i przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,2 mikrona w sterylnej komorze laminarnej. Umieścić probówkę stożkową z buforem do trawienia w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.</li>
	<li>Usunąć medium DMEM z probówki stożkowej z kroku 2.1 i przenieść tkankę do sterylnej płytki Petriego.</li>
	<li>Dokładnie posiekać płuca sterylnymi nożyczkami lub żyletką, tak aby kawałki tkanki miały mniej niż 1 mm, a następnie przenieść tkankę do probówki stożkowej zawierającej uprzednio ogrzany bufor do trawienia z kroku 2.3.</li>
	<li>Strawić tkankę poprzez wielokrotne pipetowanie: 
	100 razy pipetą 10 ml 
	100 razy pipetą 5 ml 
	100 razy pipetą Pasteura</li>
	<li>Odwirować homogenat przy 1 300 rpm przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć nadosad przez aspirację i resuspender osad zawierający komórki w 15 ml DMEM z dodatkiem 20% FBS.</li>
	<li>Przygotować lejki filtrujące z nylonowych sit o rozmiarach oczek 100, 30 i 15 mikronów i umieścić je na sterylnych zlewkach o pojemności 150 ml.</li>
	<li>Dodać homogenat komórkowy z kroku 2.8 i sekwencyjnie przefiltrować przez sita 100, 30 i 15 mikronów.</li>
	<li>Zebrać skupione komórki niefiltrowane z sit 30- i 15-mikronowych po kilku płukaniach medium DMEM z dodatkiem 10% FBS, aby ułatwić filtrację komórek nieepithelialnych.</li>
	<li>Odrzucić filtrat z sita 15-mikronowego, który zawiera głównie fibroblasty.</li>
	<li>Dalsze oczyszczanie komórek typu II poprzez inkubację komórek z kroku 2.11 w kolbach 75 cm2 przez 30 min (około 10 ml zawiesiny komórkowej na kolbę).</li>
	<li>Zebrać nadosad i odwirować przy 1 300 rpm przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć nadosad przez aspirację i resuspender osad zawierający komórki w bezzsrótkowym medium DMEM. Objętość resuspensji zależy od ilości przetworzonej tkanki. Przesiewamy równowartość komórek uzyskanych z jednego płodu do każdej studni (2 ml), aby następnego dnia uzyskać konfluencję na poziomie 60-70%.</li>
	<li>Wysiać zawiesinę komórkową na płytki Bioflex z sześcioma studniami, uprzednio pokryte lamininą lub fibronektyną.</li>
</ol>
3. Izolacja fibroblastów płuc płodu gryzonia
<ol>
	<li>Należy postępować zgodnie z opisanymi powyżej krokami izolacji komórek typu II aż do punktu 2.11.</li>
	<li>Przenieść filtrat z siatki 15 µm (bez uprzedniego płukania; przybliżona objętość wynosi 10-15 ml) na naczynia o powierzchni 75 cm2 i inkubować w temperaturze 37°C przez 30-60 min, aby umożliwić adhezję fibroblastów.</li>
	<li>Odessać supernatant, zastąpić go pożywką DMEM bez surowicy i inkubować przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia zebrać komórki za pomocą 0,25% (w/v) trypsyny w 0,4 mM EDTA i wysiać je na płytki Bioflex pokryte uprzednio fibronektyną.</li>
</ol>
4. System eksperymentalny do stymulacji mechanicznej komórek płuc
<ol>
	<li>Wysiać komórki (około 50% konfluencji) na płytki hodowlane Bioflex w bezserowym medium DMEM (2 ml/dołek) i pozostawić do przyczepienia i rozprzestrzenienia się na co najmniej 6 h przed rozpoczęciem doświadczeń. Zazwyczaj w naszym laboratorium komórki utrzymuje się w hodowli przez około 24 h przed zastosowaniem naprężenia mechanicznego. Jeśli do doświadczeń wymagana jest określona liczba komórek, po izolacji komórki typu II utrzymuje się w kolbach 75-cm2 z bezserowym medium DMEM, a następnego dnia komórki są trypsynizowane, liczone, a następnie wysiewane.</li>
	<li>Następnego dnia medium zastępuje się świeżym bezserowym DMEM (2 ml/dołek), a płytki Bioflex montuje się w urządzeniu do naprężania Flexcell FX-5000 Strain Unit. Monowarstwy przed rozpoczęciem doświadczeń nie powinny przekraczać 80% konfluencji.</li>
	<li>Do membran przyłożone zostaje naprężenie równoosiowe. Schemat naprężenia jest różny w zależności od symulowanych sił mechanicznych in vivo (patrz dyskusja).</li>
	<li>Jako kontrolę stosuje się komórki hodowane równolegle na membranach nierozciągniętych.</li>
	<li>Po zakończeniu doświadczeń monowarstwy można poddać analizie w celu zbadania zmian w ekspresji genów (na przykład białka surfaktantu C) za pomocą real-time PCR, ilości białek za pomocą Western blot itp. Monowarstwy można również utrwalić do badań immunocytochemicznych. W tej technice, po utrwaleniu, membrany silastyczne są wycinane z płytek i montowane na szkiełkach przedmiotowych przy użyciu 10-20 μl wody jako środka montującego, przed permeabilizacją i inkubacją z przeciwciałami. Nadpłyn może być również wykorzystany do badania obecności czynników wzrostu, cytokin itp.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Rycina 1 i Rycina 2 przedstawiają reprezentatywne zdjęcia w kontraście fazowym komórek typu II z płodu myszy w 18. dniu embrionalnym (E18), wyizolowanych przy użyciu techniki opisanej w niniejszym manuskrypcie.
Rysunek 3 wykazuje, że naprężenie mechaniczne indukuje różnicowanie płodowych komórek nabłonkowych typu II, przy zastosowaniu białka surfaktantu C jako markera.
<img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig1.jpg" alt="Obraz mikroskopowy proliferacji komórkowej przedstawiający tworzenie kolonii w analizie hodowli tkankowej." data-altupdatedat="1787630408000"> 
Rysunek 1. Reprezentatywna fotografia w kontraście fazowym wykonana bezpośrednio po izolacji, przedstawiająca skupioną strukturę komórek typu II płodu.
<img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig2.jpg" alt="Wzrost komórek pod mikroskopem, obraz mikroskopowy, hodowla komórkowa, badanie biologiczne, analiza komórkowa." data-altupdatedat="1787630408000"> 
Rysunek 2. Komórki nabłonka typu II płodu E18 zostały wyizolowane zgodnie z opisem i wysiane na płytki bioflex pokryte lamininą. Zdjęcie wykonano następnego dnia, po utrwaleniu nienapiętych komórek w paraformaldehydzie. Czystość komórek określono na 90 ± 5% na podstawie analizy mikroskopowej morfologii komórek nabłonka oraz immunobarwienia na SP-C.
<img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig3.jpg" alt="Analiza ekspresji białka, ekspresja mRNA SP-C, wykres słupkowy, obrazy mikroskopowe, kontrola vs. rozciąganie." data-altupdatedat="1787630408000"> 
Rysunek 3. Płodowe komórki nabłonkowe typu II poddano 5% cyklicznemu odkształceniu przy 40 cyklach/min przez 16h. A) Northern blot ekspresji mRNA białka surfaktantu C (SP-C), wykazujący, że odkształcenie indukuje różnicowanie komórek typu II na różnych podłożach ECM. Znaki +/- oznaczają odpowiednio ekspozycję lub brak ekspozycji na odkształcenie. Dane przedstawiono jako średnia +/- SEM, n=3; * P&lt;0.05. B) Obrazy fluorescencyjnej immunocytochemii obrazujące poziomy białka SP-C (kolor zielony) w płodowych komórkach typu II poddanych lub nie (kontrola) odkształceniu mechanicznemu. Jądra komórkowe wybarwiono dapi (kolor niebieski). Pasek skali, 10 μm. C) Wyniki Western blot z trzech eksperymentów wykazujące, że rozciąganie mechaniczne zwiększa poziom białka SP-C. N=3; * P&lt;0.05.

<ol><li>Sanchez-Esteban, J., Tsai, S. W., Sang, J., Qin, J., Torday, J. S., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mechanical+forces+on+lung-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of mechanical forces on lung-specific gene expression.</a> Am. J. Med. Sci. 316, 200-204 (1998).</li>
<li>Sanchez-Esteban, J., Cicchiello, L. A., Wang, Y., Tsai, S. W., Williams, L. K., Torday, J. S., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch+promotes+alveolar+epithelial+type+II+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch promotes alveolar epithelial type II cell differentiation.</a> J. Appl. Physiol. 91, 589-595 (2001).</li>
<li>Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+stretch+inhibits+cell+proliferation+and+induces+apoptosis+in+fetal+rat+lung+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).</li>
<li>Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+stretch+inhibits+cell+proliferation+and+induces+apoptosis+in+fetal+rat+lung+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).</li>
<li>Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Gruppuso, P. A., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch+induces+fetal+type+II+cell+differentiation+via+an+epidermal+growth+factor+receptor-extracellular-regulated+protein+kinase+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch induces fetal type II cell differentiation via an epidermal growth factor receptor-extracellular-regulated protein kinase signaling pathway.</a> Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 30, 76-83 (2004).</li>
<li>Wang, Y., Maciejewski, B. S., Lee, N., Silbert, O., McKnight, N. L., Frangos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-induced+fetal+type+II+epithelial+cell+differentiation+is+mediated+via+cAMP-PKA-dependent+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Strain-induced fetal type II epithelial cell differentiation is mediated via cAMP-PKA-dependent signaling pathway.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 291, L820-L827 (2006).</li>
<li>Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Filardo, E. J., Rubin, L. P., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+%7Bbeta%7D1%2C+%7Balpha%7D6%2C+and+%7Balpha%7D3+contribute+to+mechanical+strain-induced+differentiation+of+fetal+lung+type+II+epithelial+cells+via+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Integrins {beta}1, {alpha}6, and {alpha}3 contribute to mechanical strain-induced differentiation of fetal lung type II epithelial cells via distinct mechanisms.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 290, L343-L350 (2006).</li>
<li>Wang, Y., Maciejewski, B. S., Soto-Reyes, D., Lee, H. S., Warburton, D., Sanchez-Esteban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch+promotes+fetal+type+II+epithelial+cell+differentiation+via+shedding+of+HB-EGF+and+TGF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch promotes fetal type II epithelial cell differentiation via shedding of HB-EGF and TGF-alpha.</a> J. Physiol. 587, 1739-1753 (2009).</li>
<li>Wang, Y., Maciejewski, B. S., Drouillard, D., Santos, M., Hokenson, M. A., Hawwa, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+caveolin-1+in+mechanotransduction+of+fetal+type+II+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A role for caveolin-1 in mechanotransduction of fetal type II epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 298, L775-L783 (2010).</li>
<li>Lee, H. S., Wang, Y., Maciejewski, B. S., Esho, K., Fulton, C., Sharma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-10+protects+cultured+fetal+rat+type+II+epithelial+cells+from+injury+induced+by+mechanical+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-10 protects cultured fetal rat type II epithelial cells from injury induced by mechanical stretch.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 294, L225-L232 (2008).</li>
<li>Hawwa, R. L., Hokenson, M. A., Wang, Y., Huang, Z., Sharma, S., Sanchez-Esteban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+inhibits+inflammatory+cytokines+released+by+fetal+mouse+lung+fibroblasts+exposed+to+mechanical+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Pulmonology%22%5BJournal%5D)">IL-10 inhibits inflammatory cytokines released by fetal mouse lung fibroblasts exposed to mechanical stretch.</a> Pediatric Pulmonology. , (2011).</li>
<li>Kitterman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+mechanical+forces+on+fetal+lung+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Perinatol%22%5BJournal%5D)">The effects of mechanical forces on fetal lung growth.</a> Clin. Perinatol. 23, 727-740 (1996).</li>
<li>Harding, R. Fetal breathing movements. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarding%2C+R+%22The+Lung%3A+Scientific+Fountations%22">The Lung: Scientific Fountations</a>. Crystal, R. G., West, J. B., Banes, P. J. , 2nd Ed, Lippincott-Raven. Philadelphia. 2093-2104 (1997).</li>
<li>Harding, R., Liggins, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+thoracic+dimensions+induced+by+breathing+movements+in+fetal+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Fertil.+Dev%22%5BJournal%5D)">Changes in thoracic dimensions induced by breathing movements in fetal sheep.</a> Reprod. Fertil. Dev. 8, 117-124 (1996).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę izolacji płodowych komórek nabłonkowych typu II oraz fibroblastów, a także poddawania ich stymulacji mechanicznej przy użyciu aparatu Flexcell Strain Apparatus. Technika ta została przez nas wykorzystana do oceny różnicowania komórek nabłonkowych 1,2 oraz do badania receptorów i szlaków sygnalizacyjnych aktywowanych przez rozciąganie 3-9. Ponadto metoda ta może być stosowana do badania odpowiedzi komórkowych indukowanych urazem mechanicznym 10,11....

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kurczęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>Sitka do przesiewania</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-754-25</td><td></td></tr><tr><td>Siatka nylonowa 100 micron</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CMN-100-D</td><td></td></tr><tr><td>Siatka 30 micron</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CMN-30-D</td><td></td></tr><tr><td>Siatka 15 micron</td><td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td><td>NTX15</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen-1</td><td>Collagen Biomed</td><td>PC0701</td><td></td></tr><tr><td>Fibrynektyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Witronektyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V-0132</td><td></td></tr><tr><td>Elastyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-6402</td><td></td></tr><tr><td>Płyta Bioflex</td><td>Flexcell International</td><td>BF-3001U</td><td>Niepowlekana</td></tr><tr><td>Urządzenie do rozciągania Flexcell</td><td>Flexcell International</td><td>FX-5000</td><td></td></tr></tbody></table>

układ eksperymentalny do badania mechanotransdukcji w komórkach płuc płodu

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Siły mechaniczne generowane in utero przez powtarzające się ruchy przypominające oddychanie oraz przez rozciąganie cieczą są kluczowe dla prawidłowego rozwoju płuc. Kluczowym elementem rozwoju płuc jest różnicowanie nabłonkowych komórek pęcherzykowych typu II, które są głównym źródłem surfaktantu płucnego. Komórki te uczestniczą również w homeostazie płynów w świetle pęcherzyków, obronie gospodarza oraz naprawie uszkodzeń. Dodatkowo komórki dystalnego miąższu płuc mogą być bezpośrednio narażone na nadmierne rozciąganie podczas wentylacji mechanicznej po urodzeniu. Jednakże precyzyjne mechanizmy molekularne i komórkowe, dzięki którym komórki płuc wykrywają bodźce mechaniczne, wpływając na rozwój płuc i sprzyjając ich uszkodzeniu, nie są w pełni zrozumiałe. W niniejszej pracy przedstawiamy prostą metodę izolacji komórek typu II i fibroblastów z płodowych płuc gryzoni, zapewniającą wysoką czystość preparatu. Następnie opisujemy system in vitro, Flexcell Strain Unit, służący do dostarczania stymulacji mechanicznej komórkom płodowym, co symuluje siły mechaniczne występujące podczas rozwoju płuc płodu lub w przebiegu uszkodzenia płuc. Ten system eksperymentalny stanowi doskonałe narzędzie do badania mechanizmów molekularnych i komórkowych w komórkach płodowych płuc narażonych na rozciąganie. Wykorzystując to podejście, nasze laboratorium zidentyfikowało kilka receptorów i białek sygnałowych uczestniczących w mechanotransdukcji podczas rozwoju płuc płodu oraz w procesie uszkodzenia płuc.

Siły mechaniczne odgrywają kluczową rolę w rozwoju płuc oraz w ich uszkadzaniu. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji komórek nabłonkowych typu II oraz fibroblastów z płuc płodowych gryzoni i poddawania ich stymulacji mechanicznej przy użyciu systemu in vitro.

Układ eksperymentalny do badania mechanotransdukcji w komórkach płuc płodu

Siły mechaniczne generowane w łonie matki przez powtarzalne ruchy przypominające oddychanie oraz przez rozciąganie płynem są kluczowe dla prawidłowego rozwoju płuc. Kluczowym...

Celem niniejszej procedury jest opis systemu eksperymentalnego do badania transdukcji mechanicznej w komórkach płuc płodu. Jest to realizowane poprzez powlekanie płytek hodowlanych białkami macierzy zewnątrzkomórkowej. Następnie izolowane są komórki nabłonka typu drugiego z płuc płodu mysiego, a w dalszej kolejności izolowane są fibroblasty z płuc płodu mysiego.Ostatni etap opisuje system in vitro służący do stymulacji mechanicznej komórek płuc. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące zwiększenie różnicowania komórek typu drugiego za pomocą czasu rzeczywistego PCR, western blot oraz obrazowania immunochemicznego z użyciem fluorescencji. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu mechanotransdukcji, takie jak rozwój płuc płodu oraz urazy płuc.Procedurę zaprezentuje Julian gu, technik z mojego laboratorium. Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza w warunkach sterylnych, przygotowujemy 120 µg lamininy w 12 ml zimnego, sterylnego 1x PBS na płytkę. Do powlekania można użyć innych białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Szczegóły znajdują się w protokole pisemnym. Następnie należy wziąć nieobrobioną płytkę BioFlex i dodać 2 ml roztworu lamininy do każdej studni, aby uzyskać końcowe stężenie 2 µg/cm².Należy upewnić się, że dołki są całkowicie pokryte roztworem. Płytkę szczelnie owinąć folią spożywczą i pozostawić na płaskiej powierzchni w temperaturze 4 °C przez noc, aby laminat wniknął do dna dołków. Płytki powlekane można przechowywać w tych warunkach przez co najmniej tydzień, zachowując dobrą funkcję ECM w dniu przeprowadzenia eksperymentu.W warunkach sterylnych przemyj dołki trzykrotnie przy użyciu 1×PBS. Następnie dodaj do każdego dołka jeden mililitr 1% BSA w 1×PBS. Inkubuj w temperaturze 37°C przez jedną godzinę, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania na membranach.Następnie studzienki należy przemyć trzykrotnie przy użyciu XPBS. Aby usunąć niezaabsorbowane białka, do każdej studzienki płytki dodaje się jeden mililitr DMEM. Następnie płytkę przechowuje się w temperaturze 37 °C do momentu izolacji i przygotowania do wysiewu komórek nabłonka typu drugiego z płuc zarodkowych gryzoni.Dzień przed rozpoczęciem procedury izolacji komórek należy złożyć kubki do przesiewania z nylonowymi sitami o oczkach 130 i 15 µm oraz wysterylizować je w autoklawie. W dniu hodowli należy również wysterylizować autoklawem taką samą liczbę szklanych kolb o pojemności 150 ml. Płuca płodowe należy pobrać z ciężarnych myszy w 17. do 19. doby ciąży (E 17 do 19).Przenieś tkankę do probówki do wirowania o pojemności 50 ml zawierającej podłoże DMEA i umieść ją na lodzie. Przygotuj świeży bufor do trawienia w probówce do wirowania o pojemności 50 ml zgodnie z instrukcją zawartą w protokole pisemnym. Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, wysterylizuj bufor, przepuszczając go przez filtr strzykawkowy o rozmiarze oczek 0,2 µm.10 ml tego buforu wystarczy dla tkanki płucnej uzyskanej z około 20 płodów myszy. Umieść probówkę stożkową zawierającą bufor trawienny w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Wyjmij płód z probówki stożkowej zawierającej tkankę płucną płodu i przenieś tkankę do sterylnej szalki Petriego za pomocą sterylnych nożyczek lub żyletki, a następnie posiekaj tkankę na kawałki o rozmiarze mniejszym niż 1 mm.Następnie przenieś tkankę do probówki stożkowej zawierającej podgrzany bufor trawienny. Następnie wspomagaj mechanicznie trawienie tkanki, pipetując zawiesinę komórek płuc płodowych w górę i w dół sto razy każdą z pipet o coraz mniejszej średnicy otworu. Po zakończeniu procesu trawienia odwirowuj homogenat przy 1 300 RPM przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie ostrożnie usuń nadsącz za pomocą aspiratora i resuspenduj pellet zawierający komórki w 15 mililitrach DMEM z dodatkiem 20% FBS. Dalej, wyjmij sita z nylonowymi siatkami o rozmiarach 130 i 15 mikronów i umieść je na sterylnych zlewkach o pojemności 150 mililitrów. Przenieś pipetą homogenat komórkowy na siatkę 100 mikronów.Zebrać filtrat i nanieść go pipetą na siatkę o oczkach 30 µm. Przemyć siatkę 30 µm kilka razy świeżą pożywką DMEM z dodatkiem 10% FBS. Większość komórek typu drugiego tworzy skupiska i nie przechodzi przez siatkę.Płukania te usuwają komórki nieepithelialne, które mogą być przyczepione do skupisk. Przenieś filtrat z sita o oczkach 30 µm na sitko o oczkach 15 µm. Ponownie wykonaj kilka płukań w taki sam sposób jak poprzednio.Ten etap pozwala na wyodrębnienie komórek typu drugiego, które mogły przejść przez sito o oczkach 30 µm. Zbierz skupione, niefiltrowane komórki z sit o oczkach 30 i 15 µm w celu dalszego wzbogacenia frakcji komórek typu drugiego. Zachowaj filtrat z sita o oczkach 15 µm, jeśli planowana jest hodowla fibroblastów płucnych płodu gryzoni.W przeciwnym razie odrzuć ten filtrat. Następnie oczyść populację komórek nabłonkowych typu drugiego, dodając pożywkę i inkubując niefiltrowane komórki z koszyczków z siatką 30 i 15 μm w kolbie do hodowli tkanek o powierzchni 75 cm² przez 30 minut; po tej inkubacji odwiruj nadsącz jak wcześniej, odseparuj komórki z osadu, a następnie resuspenduj osad w 2 mL serum-free DMEM. Pipetą przenieś 1 mL zawiesiny komórkowej do każdego dołka lamininowych płytek BioFlex z sześcioma dołkami; na tym etapie komórki obserwowane pod mikroskopem występują w skupiskach. Inkubuj płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek ustawionym na 37 °C i 5% CO2. Optymalny czas inkubacji wynosi 24 h, natomiast wymagana jest inkubacja przez minimum 6 h.Przed rozpoczęciem eksperymentów nad odkształceniem mechanicznym należy pobrać filtrat z siatki 15 µm i przenieść go do kolby hodowlanej o powierzchni 75 cm² w temperaturze 37 °C na 30 do 60 minut, aby umożliwić adhezję fibroblastów, a następnie odessać i usunąć supernatant. Następnie objętość w kolbie należy zastąpić bezserwatkowym DMEM i inkubować przez noc. Następnego dnia komórki należy zebrać przy użyciu 0,25% trypsyny w 0,4 mM EDTA i wysiać na powlekane fibronektyną płytki BioFlex, a następnie inkubować w inkubatorze do kultur tkankowych ustawionym na 37 °C i 5% CO₂, idealnie przez 24 godziny przed rozpoczęciem eksperymentów nad odkształceniem mechanicznym.Wymagana jest inkubacja przez minimum sześć godzin, jeśli do eksperymentów potrzebna jest określona liczba komórek. Komórki typu drugiego są utrzymywane w kolbach o powierzchni 75 cm² z DMEM bez surowicy po izolacji, a następnego dnia komórki są trypsynizowane, liczone i wysiewane. Monowarstwa nie powinna przekraczać 80% konfluencji przed rozpoczęciem eksperymentów. W dniu eksperymentu zywczenia mechanicznego pożywka hodowlana jest zastępowana dwoma mililitrami świeżego DMEM bez surowicy na każdą studzienkę, a następnie płytka jest montowana w urządzeniu do rozciągania Flexcell FX-5000.Następnie poddaj membrany równomiernemu rozciąganiu dwuosiowemu (EQU). Program rozciągania różni się w zależności od symulacji sił mechanicznych in vivo. Jak omówiono w protokole pisemnym, komórki hodowano na membranach rozciąganych w trybie non-ST.Próbki hodowane równolegle służą jako kontrole w eksperymencie. Po zakończeniu doświadczenia monowarstwy można poddać obróbce w celu analizy zmian w ekspresji genów za pomocą real-time PCR lub zmian w zawartości białek za pomocą western blot. Ponadto monowarstwy można utrwalić do przeprowadzenia eksperymentów immunochemicznych przy użyciu tej techniki.Po utrwaleniu membrany astyczne są wycinane z płytek i montowane na szkiełkach przedmiotowych przy użyciu 10 do 20 µL wody jako środka montującego przed permeabilizacją i inkubacją z przeciwciałami. Nadfiltr z eksperymentu może być również wykorzystany do badania obecności wydzielanych substancji, takich jak czynniki wzrostu lub cytokiny. Na obrazie przedstawiono utrwalone formaldehydem komórki nabłonkowe typu drugiego płodu E 18, które zostały wyizolowane zgodnie z niniejszym protokołem i wysiane na płytki BioFlex pokryte lamininą.Komórki utrwalono i wykonano fotografię. Następnego dnia po rozciąganiu typu non-ST wysiano komórki. Czystość komórek określono na 90 ± 5% na podstawie analizy mikroskopowej morfologii komórek nabłonkowych oraz immunobarwienia na białko surfaktantu C. Poniższe rysunki przedstawiają dane z płodowych komórek nabłonkowych typu drugiego, które poddano 5% odkształceniu cyklicznemu z częstotliwością 40 cykli na minutę przez 16 godzin.Ten northern blot ekspresji mRNA białka surfaktantu C obrazuje, że rozciąganie indukuje różnicowanie komórek typu drugiego przy użyciu różnych substratów ECM. Znaki plus i minus oznaczają odpowiednio ekspozycję na rozciąganie lub brak ekspozycji na rozciąganie. Dane dotyczące ekspresji przedstawiono na histogramie jako średnia plus lub minus SEM, N równa się trzy, a gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0,05.Te obrazy immunochemii fluorescencyjnej przedstawiają poziomy białka surfactant protein C w kolorze zielonym. W komórkach typu drugiego płodu niepoddanym naprężeniom mechanicznym (po lewej) oraz poddanym naprężeniom mechanicznym (po prawej) jądra komórkowe wybarwiono dapi, który widoczny jest w kolorze niebieskim. Ten histogram ilościowo przedstawia wyniki western blot z trzech eksperymentów, wykazując, że rozciąganie mechaniczne zwiększa poziomy białka surfactant protein C.W tym doświadczeniu wartość N wynosi trzy, a gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0,05. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, w jaki sposób przyspieszyć wzrost komórek płuc płodu i poddać je rozciąganiu mechanicznemu.

an-experimental-system-to-study-mechanotransduction-fetal-lung

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Eksperymentalny system do badania mechanotransdukcji w komórkach płuc płodów

Hodowla organów płuc wczesnego embrionu jest bardzo użytecznym systemem do badania oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych. Zarówno morfogeneza nabłonka, jak i mezenchymy przebiegają w specyficznych warunkach, które można łatwo manipulować w tym systemie.

Kultura zarodkowych płuc myszy – system do oceny molekularnych mechanizmów rozgałęziania

Ulepszona technologia obrazowania pozwala na trójwymiarowe obrazowanie organów podczas rozwoju. W tym miejscu opisujemy cały system hodowli narządów, który umożliwia obrazowanie na żywo rozwijających się kosmków w jelicie płodu myszy.

System hodowli całego jelita moczowego u myszy płodu do manipulacji ex vivo szlakami sygnałowymi i trójwymiarowego obrazowania na żywo rozwoju kosmków

Nowatorski protokół obrazowania został opracowany przy użyciu niestandardowego mechanicznego siłownika napędzanego silnikiem, aby umożliwić pomiar reakcji w czasie rzeczywistym na mechaniczne naprężenia w żywych komórkach. Istotny z punktu widzenia mechanobiologii system może nanosić szczepy do 20%, umożliwiając jednocześnie obrazowanie w czasie zbliżonym do rzeczywistego za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii sił atomowych.

Obrazowanie żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego

Wiele komórek ssaków preferencyjnie migruje w kierunku bardziej sztywnej matrycy lub substratu poprzez durotaksję. Celem tego protokołu jest dostarczenie prostego systemu in vitro, który może być używany do badania i manipulowania zachowaniami durotaksji komórek poprzez włączenie substratów polidimetylosiloksanu (PDMS) o określonej sztywności, łączących się ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi.

Uproszczony system do oceny mechanodetekcji komórek i durotaksji in vitro

Artykuł opisuje stopniowe różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do trójwymiarowych organoidów całego płuca zawierających zarówno proksymalne, jak i dystalne komórki nabłonkowe płuc wraz z mezenchymą.

Generowanie 3D organoidów całych płuc z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania biologii i chorób rozwojowych płuc

Obecny protokół opisuje projekt, produkcję i charakterystykę systemu mikroprzepływowego zdolnego do wyrównania, unieruchomienia i precyzyjnego ucisku setek zarodków Drosophila melanogaster przy minimalnym zaangażowaniu użytkownika. System ten umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i odzyskiwanie próbek do analizy po stymulacji i może być skalowany w celu uwzględnienia innych wielokomórkowych systemów biologicznych.

Mechanostymulacja organizmów wielokomórkowych za pomocą wysokoprzepustowego systemu kompresji mikroprzepływowej

Ta praca przedstawia zwierzęcy model zwłóknienia wywołanego przejściem śródbłonka do mezenchymalnego, obserwowanego w wrodzonych wadach serca, takich jak krytyczne zwężenie zastawki aortalnej lub zespół niedorozwoju lewego serca, co pozwala na szczegółową ocenę tkanki histologicznej, identyfikację regulacyjnych szlaków sygnałowych i testowanie opcji leczenia.

Noworodkowy heterotopowy model przeszczepu serca szczura do badania przejścia ze śródbłonka do mezenchymów

Opisano tutaj prosty proces różnicowania komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, a następnie szczegółowy protokół ich mechanicznej stymulacji. Pozwala to na badanie mechanobiologii rozwojowej komórek śródbłonka. Podejście to jest kompatybilne z dalszymi testami żywych komórek pobranych z chipa hodowlanego po stymulacji mechanicznej.

In vitro Model płodu ludzkiego naczynia na chipie do badania mechanobiologii rozwojowej

Tutaj prezentujemy protokół do dożylnego obrazowania przeszczepionego lewego płuca myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Stanowi to cenne narzędzie do badania dynamiki i interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym po przeszczepie płuc u myszy.

Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

Opracowano unikalną metodę inżynierii tkankowej w celu wydłużenia licznych włókien nerwowych w hodowli poprzez odtworzenie wzrostu aksonów indukowanego rozciąganiem; jest to forma wzrostu układu nerwowego, w której nerwy wydłużają się równocześnie ze wzrostem powiększającego się organizmu.

Wzrost aksonów indukowany rozciąganiem: mechanotransdukcja wzrostu neuronalnego

Poznaj metodę izolacji komórek nabłonkowych typu II i fibroblastów z płuc płodowych myszy oraz system in vitro do badania mechanotransdukcji. Technika ta pozwala analizować różnicowanie komórek pod wpływem bodźców mechanicznych.

Układ eksperymentalny do badania mechanotransdukcji w komórkach płuc płodu

Przeglądaj więcej filmów