Eksperymentalny system do badania mechanotransdukcji w komórkach płuc płodu

Siły mechaniczne odgrywają kluczową rolę w rozwoju i uszkodzeniu płuc. W tym artykule opisano metodę izolacji komórek nabłonkowych i fibroblastów płuc typu II u płodu gryzoni oraz poddania ich stymulacji mechanicznej za pomocą systemu in vitro.

Celem tej procedury jest opisanie eksperymentalnego systemu do badania transdukcji mechanicznej w komórkach płuc płodu. Osiąga się to poprzez kodowanie płytek hodowlanych białkami macierzy zewnątrzkomórkowej. Następnie izoluje się płodowe komórki nabłonkowe płuc myszy typu dwa, a następnie izoluje się płodowe fibroblasty myszy.

Ostatni etap opisuje system in vitro, który zapewnia mechaniczną stymulację komórek płuc. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na wzrost różnicowania komórek typu drugiego poprzez PCR w czasie rzeczywistym, western blot i obrazy immunochemiczne fluorescencji. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transdukcji mechano, takie jak rozwój płuc płodu i uszkodzenie płuc.

Procedurę zademonstruje Julian gu, technik z mojego laboratorium Podczas gdy pracujemy w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach, wytwarza 120 mikrogramów lamininy z 12 mililitrami zimnej sterylnej jednej płytki XPBS. Do powlekania można wykorzystać inne białka macierzy zewnątrzkomórkowej. Szczegółowe informacje można znaleźć w pisemnym protokole, a następnie wziąć niepoddaną działaniu BioFlex płytkę i dodać dwa mililitry roztworu laminatu do każdej studzienki do końcowego stężenia dwóch mikrogramów na centymetr kwadratowy.

Upewnij się, że studzienki są całkowicie pokryte roztworem. Całkowicie przykryj płytkę folią spożywczą i umieść na nocy na płaskiej powierzchni w środowisku o temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby laminat mógł wchłonąć się na dno studzienek. Powlekane płytki mogą być przechowywane w tych warunkach przez co najmniej tydzień, zachowując dobrą funkcję ECM następnego dnia.

W sterylnych warunkach umyj studzienki trzy razy jednym XPBS. Następnie dodaj jeden mililitr 1% BSA w jednym XPBS do każdego. Dobrze inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania na błonach.

Następnie ponownie umyj studzienki trzy razy jednym XPBS. Aby usunąć niewchłonięte białka, dodaj jeden mililitr DMEM do każdego dołka płytki. Następnie przechowuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż płód gryzonia typu dwa komórki nabłonkowe zostaną wyizolowane i gotowe do posiewu.

Dzień przed rozpoczęciem procedury izolacji komórek zmontuj kubki sitowe z nylonowymi siatkami o grubości 130 i 15 mikronów i wysterylizuj je w autoklawie. Również autoklaw tej samej liczby 150-mililitrowych szklanych pików w dniu hodowli. Pobrać płuca płodu od ciężarnej myszy w okresie od E 17 do 19 ciąży.

Przenieś tkankę do 50-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej pożywkę DMEA i umieść ją na lodzie. Przygotuj świeży bufor wytrawiający w 50-mililitrowej probówce wirówkowej zgodnie z przepisem w pisemnym protokole. A podczas pracy w filtrze okapowym z przepływem laminarnym sterylizuj przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,2 mikrona.

10 mililitrów tego buforu wystarcza na tkankę płucną uzyskaną z około 20 płodów myszy. Umieścić stożkową rurkę zawierającą bufor wytrawiający w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zespalaj dium ze stożkowej rurki zawierającej tkankę płucną płodu i przenieś tkankę na sterylną szalkę Petriego za pomocą sterylnych nożyczek lub żyletki, zmiel tkankę na kawałki o wielkości mniejszej niż jeden milimetr.

Następnie przenieś tkankę do stożkowej rurki zawierającej bufor do wstępnego rozgrzewania. Następnie mechanicznie wspomagać trawienie tkanki, pipetując zawiesinę komórek płuc płodu sto razy w górę i w dół za pomocą pipet o zmniejszającym się rozmiarze apertury. Po zakończeniu procesu trawienia odwirować homogenat z prędkością 1 300 obr./min przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie ostrożnie usunąć leżącą na wznak przez aspirację i ponownie zawiesić osad zawierający komórki w 15 mililitrach DMEM plus 20% FBS. Następnie wyjmij kubki sitowe z nylonowymi siatkami o grubości 130 i 15 mikronów i umieść je na sterylnych zlewkach o pojemności 150 mililitrów. Odpipetować homogenat komórki na siatkę o grubości 100 mikronów.

Zebrać filtrat i pipetować go na siatkę o średnicy 30 mikronów. Umyj siatkę o grubości 30 mikronów kilkakrotnie świeżym DMEM plus 10% FBS. Większość komórek typu drugiego zlepia się ze sobą i nie przechodzi przez siatkę.

Płukanie to usuwa komórki nienabłonkowe, które mogą być przyczepione do grudek. Nanieść filtrat z siatki 30 mikronów na kubek sitowy o oczkach 15 mikronów. Ponownie umyj kilka razy, tak jak poprzednio.

Ten krok rekrutuje komórki typu drugiego, które mogły przejść przez siatkę o grubości 30 mikronów. Zebrać zbite nieprzefiltrowane komórki z siatek o wielkości 30 i 15 mikronów w celu dalszego wzbogacenia komórek typu drugiego. Zachować filtrat z siatki o grubości 15 mikronów, jeśli ma być hodowany fibroblasty płuc płodów gryzoni.

W przeciwnym razie należy wyrzucić ten filtrat. Dalej. Oczyść populację komórek nabłonkowych typu drugiego, dodając pożywkę i inkubując niefiltrowane komórki z kubków o siatkach 30 i 15 mikronów w kolbie do hodowli tkankowej o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych przez 30 minut po tej inkubacji odwirować super nazwę jak poprzednio, zdegranulować komórki, a następnie ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach pipety DMEM pro fetus bez surowicy jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdej studzienki pokrytej laminatem BioFlex sześciodołkowe płytki w tym momencie, komórki pojawiają się w grudkach, gdy są obserwowane pod mikroskopem, inkubuj płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Optymalna jest 24-godzinna inkubacja i wymagana jest co najmniej sześciogodzinna inkubacja.

Przed rozpoczęciem eksperymentów z odkształceniem mechanicznym należy pobrać filtrat z siatki o grubości 15 mikronów i przenieść do kolby do hodowli tkankowej o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 do 60 minut, aby umożliwić fibroblastom przyleganie, oddychanie i odrzucenie satu. Następnie zastąpić objętość w kolbie wolnym od surowicy DMEM i inkubować przez noc. Następnego dnia zbierz komórki z 0,25% trypsyny w 0,4 milimolowym EDTA i umieść je na płytkach BioFlex pokrytych fibronektyną inkubuj w inkubatorze do hodowli tkankowej ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, najlepiej przez 24 godziny przed rozpoczęciem eksperymentów ze szczepami mechanicznymi.

Wymagana jest co najmniej sześciogodzinna inkubacja, jeśli do eksperymentów wymagana jest określona liczba komórek. Komórki typu drugiego są utrzymywane w kolbach DMEM o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych bez surowicy po izolacji, a następnego dnia komórki są zliczane trypsami, a następnie osadzone Monowarstwa nie powinna być większa niż 80% zlewania się przed rozpoczęciem eksperymentów. W dniu eksperymentu ze stymulacją mechaniczną pożywkę do hodowli komórkowej zastępuje się dwoma mililitrami świeżego DMEM wolnego od surowicy na dołek, a następnie płytkę montuje się w jednostce szczepu FX 5 000 z elastyczną komórką.

Następnie zastosuj dwuosiowe odkształcenie EQU do membran. Schemat odkształceń różni się w zależności od symulacji sił mechanicznych in vivo. Jak omówiono w pisemnym protokole, komórki hodowane na błonach innych niż ST rozciągnięte.

Hodowane równolegle są używane jako kontrole w eksperymencie. Pod koniec eksperymentu monowarstwy mogą być przetwarzane w celu analizy zmian w ekspresji genów za pomocą PCR w czasie rzeczywistym lub zmian w obfitości białek za pomocą western blot. Ponadto monowarstwy można utrwalić do eksperymentów immunochemicznych dla tej techniki.

Po utrwaleniu membrany astyczne są wycinane z płytek i montowane na szkiełkach przy użyciu od 10 do 20 mikrolitrów wody jako środka mocującego przed przenikaniem i inkubacją z przeciwciałami. Super datyna z eksperymentu może być również wykorzystana do zbadania obecności uwolnionych substancji, takich jak czynniki wzrostu czy cytokiny. To zdjęcie przedstawia parmalnie utrwalone komórki nabłonkowe typu płodowego E 18, które zostały wyizolowane zgodnie z tym protokołem i posiane na płytkach BioFlex kodowanych lamininą.

Komórki zostały naprawione i zrobiono zdjęcie. Dzień po tym, jak komórki rozciągliwe bez ST zostały posiane. Czystość komórek określono na 90 plus minus 5% za pomocą mikroskopowej analizy morfologii komórek nabłonka i barwienia immunologicznego dla białka C środka powierzchniowo czynnego. Poniższe rysunki przedstawiają dane z komórek nabłonka płodu typu drugiego, które były wystawione na 5% cykliczny szczep w 40 cyklach na minutę przez 16 godzin.

Ten północny blot ekspresji mRNA białka powierzchniowo czynnego C ilustruje, że szczep indukuje różnicowanie komórek typu drugiego przy użyciu różnych substratów ECM. Znaki plus minus oznaczają odpowiednio narażenie na obciążenie lub brak narażenia na obciążenie. Dane wyrażenia są przedstawione na histogramie jako średnia plus lub minus SEM, gdzie N jest równe trzy, a gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0,05.

Te obrazy immunochemiczne fluorescencji pokazują poziomy białka C surfaktantu na zielono. W typie płodowym dwie komórki nienarażone na obciążenie mechaniczne po lewej stronie i poddane obciążeniu mechanicznemu po prawej stronie zostały poddane barwieniu za pomocą dapi, które wydaje się niebieskie. Ten histogram określa ilościowo wyniki western blot z trzech eksperymentów pokazujących, że rozciąganie mechaniczne zwiększa poziom białka C surfaktantu.

W tym eksperymencie N jest równe trzy, a gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0,05. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przyspieszyć komórki płuc płodu i wystawić je na mechaniczne rozciąganie.