Układ eksperymentalny do badania mechanotransdukcji w komórkach płuc płodu

Celem niniejszej procedury jest opis systemu eksperymentalnego do badania transdukcji mechanicznej w komórkach płuc płodu. Jest to realizowane poprzez powlekanie płytek hodowlanych białkami macierzy zewnątrzkomórkowej. Następnie izolowane są komórki nabłonka typu drugiego z płuc płodu mysiego, a w dalszej kolejności izolowane są fibroblasty z płuc płodu mysiego.

Ostatni etap opisuje system in vitro służący do stymulacji mechanicznej komórek płuc. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące zwiększenie różnicowania komórek typu drugiego za pomocą czasu rzeczywistego PCR, western blot oraz obrazowania immunochemicznego z użyciem fluorescencji. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu mechanotransdukcji, takie jak rozwój płuc płodu oraz urazy płuc.

Procedurę zaprezentuje Julian gu, technik z mojego laboratorium. Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza w warunkach sterylnych, przygotowujemy 120 µg lamininy w 12 ml zimnego, sterylnego 1x PBS na płytkę. Do powlekania można użyć innych białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Szczegóły znajdują się w protokole pisemnym. Następnie należy wziąć nieobrobioną płytkę BioFlex i dodać 2 ml roztworu lamininy do każdej studni, aby uzyskać końcowe stężenie 2 µg/cm².

Należy upewnić się, że dołki są całkowicie pokryte roztworem. Płytkę szczelnie owinąć folią spożywczą i pozostawić na płaskiej powierzchni w temperaturze 4 °C przez noc, aby laminat wniknął do dna dołków. Płytki powlekane można przechowywać w tych warunkach przez co najmniej tydzień, zachowując dobrą funkcję ECM w dniu przeprowadzenia eksperymentu.

W warunkach sterylnych przemyj dołki trzykrotnie przy użyciu 1×PBS. Następnie dodaj do każdego dołka jeden mililitr 1% BSA w 1×PBS. Inkubuj w temperaturze 37°C przez jedną godzinę, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania na membranach.

Następnie studzienki należy przemyć trzykrotnie przy użyciu XPBS. Aby usunąć niezaabsorbowane białka, do każdej studzienki płytki dodaje się jeden mililitr DMEM. Następnie płytkę przechowuje się w temperaturze 37 °C do momentu izolacji i przygotowania do wysiewu komórek nabłonka typu drugiego z płuc zarodkowych gryzoni.

Dzień przed rozpoczęciem procedury izolacji komórek należy złożyć kubki do przesiewania z nylonowymi sitami o oczkach 130 i 15 µm oraz wysterylizować je w autoklawie. W dniu hodowli należy również wysterylizować autoklawem taką samą liczbę szklanych kolb o pojemności 150 ml. Płuca płodowe należy pobrać z ciężarnych myszy w 17. do 19. doby ciąży (E 17 do 19).

Przenieś tkankę do probówki do wirowania o pojemności 50 ml zawierającej podłoże DMEA i umieść ją na lodzie. Przygotuj świeży bufor do trawienia w probówce do wirowania o pojemności 50 ml zgodnie z instrukcją zawartą w protokole pisemnym. Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, wysterylizuj bufor, przepuszczając go przez filtr strzykawkowy o rozmiarze oczek 0,2 µm.

10 ml tego buforu wystarczy dla tkanki płucnej uzyskanej z około 20 płodów myszy. Umieść probówkę stożkową zawierającą bufor trawienny w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Wyjmij płód z probówki stożkowej zawierającej tkankę płucną płodu i przenieś tkankę do sterylnej szalki Petriego za pomocą sterylnych nożyczek lub żyletki, a następnie posiekaj tkankę na kawałki o rozmiarze mniejszym niż 1 mm.

Następnie przenieś tkankę do probówki stożkowej zawierającej podgrzany bufor trawienny. Następnie wspomagaj mechanicznie trawienie tkanki, pipetując zawiesinę komórek płuc płodowych w górę i w dół sto razy każdą z pipet o coraz mniejszej średnicy otworu. Po zakończeniu procesu trawienia odwirowuj homogenat przy 1 300 RPM przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie ostrożnie usuń nadsącz za pomocą aspiratora i resuspenduj pellet zawierający komórki w 15 mililitrach DMEM z dodatkiem 20% FBS. Dalej, wyjmij sita z nylonowymi siatkami o rozmiarach 130 i 15 mikronów i umieść je na sterylnych zlewkach o pojemności 150 mililitrów. Przenieś pipetą homogenat komórkowy na siatkę 100 mikronów.

Zebrać filtrat i nanieść go pipetą na siatkę o oczkach 30 µm. Przemyć siatkę 30 µm kilka razy świeżą pożywką DMEM z dodatkiem 10% FBS. Większość komórek typu drugiego tworzy skupiska i nie przechodzi przez siatkę.

Płukania te usuwają komórki nieepithelialne, które mogą być przyczepione do skupisk. Przenieś filtrat z sita o oczkach 30 µm na sitko o oczkach 15 µm. Ponownie wykonaj kilka płukań w taki sam sposób jak poprzednio.

Ten etap pozwala na wyodrębnienie komórek typu drugiego, które mogły przejść przez sito o oczkach 30 µm. Zbierz skupione, niefiltrowane komórki z sit o oczkach 30 i 15 µm w celu dalszego wzbogacenia frakcji komórek typu drugiego. Zachowaj filtrat z sita o oczkach 15 µm, jeśli planowana jest hodowla fibroblastów płucnych płodu gryzoni.

W przeciwnym razie odrzuć ten filtrat. Następnie oczyść populację komórek nabłonkowych typu drugiego, dodając pożywkę i inkubując niefiltrowane komórki z koszyczków z siatką 30 i 15 μm w kolbie do hodowli tkanek o powierzchni 75 cm² przez 30 minut; po tej inkubacji odwiruj nadsącz jak wcześniej, odseparuj komórki z osadu, a następnie resuspenduj osad w 2 mL serum-free DMEM. Pipetą przenieś 1 mL zawiesiny komórkowej do każdego dołka lamininowych płytek BioFlex z sześcioma dołkami; na tym etapie komórki obserwowane pod mikroskopem występują w skupiskach. Inkubuj płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek ustawionym na 37 °C i 5% CO2. Optymalny czas inkubacji wynosi 24 h, natomiast wymagana jest inkubacja przez minimum 6 h.

Przed rozpoczęciem eksperymentów nad odkształceniem mechanicznym należy pobrać filtrat z siatki 15 µm i przenieść go do kolby hodowlanej o powierzchni 75 cm² w temperaturze 37 °C na 30 do 60 minut, aby umożliwić adhezję fibroblastów, a następnie odessać i usunąć supernatant. Następnie objętość w kolbie należy zastąpić bezserwatkowym DMEM i inkubować przez noc. Następnego dnia komórki należy zebrać przy użyciu 0,25% trypsyny w 0,4 mM EDTA i wysiać na powlekane fibronektyną płytki BioFlex, a następnie inkubować w inkubatorze do kultur tkankowych ustawionym na 37 °C i 5% CO₂, idealnie przez 24 godziny przed rozpoczęciem eksperymentów nad odkształceniem mechanicznym.

Wymagana jest inkubacja przez minimum sześć godzin, jeśli do eksperymentów potrzebna jest określona liczba komórek. Komórki typu drugiego są utrzymywane w kolbach o powierzchni 75 cm² z DMEM bez surowicy po izolacji, a następnego dnia komórki są trypsynizowane, liczone i wysiewane. Monowarstwa nie powinna przekraczać 80% konfluencji przed rozpoczęciem eksperymentów. W dniu eksperymentu zywczenia mechanicznego pożywka hodowlana jest zastępowana dwoma mililitrami świeżego DMEM bez surowicy na każdą studzienkę, a następnie płytka jest montowana w urządzeniu do rozciągania Flexcell FX-5000.

Następnie poddaj membrany równomiernemu rozciąganiu dwuosiowemu (EQU). Program rozciągania różni się w zależności od symulacji sił mechanicznych in vivo. Jak omówiono w protokole pisemnym, komórki hodowano na membranach rozciąganych w trybie non-ST.

Próbki hodowane równolegle służą jako kontrole w eksperymencie. Po zakończeniu doświadczenia monowarstwy można poddać obróbce w celu analizy zmian w ekspresji genów za pomocą real-time PCR lub zmian w zawartości białek za pomocą western blot. Ponadto monowarstwy można utrwalić do przeprowadzenia eksperymentów immunochemicznych przy użyciu tej techniki.

Po utrwaleniu membrany astyczne są wycinane z płytek i montowane na szkiełkach przedmiotowych przy użyciu 10 do 20 µL wody jako środka montującego przed permeabilizacją i inkubacją z przeciwciałami. Nadfiltr z eksperymentu może być również wykorzystany do badania obecności wydzielanych substancji, takich jak czynniki wzrostu lub cytokiny. Na obrazie przedstawiono utrwalone formaldehydem komórki nabłonkowe typu drugiego płodu E 18, które zostały wyizolowane zgodnie z niniejszym protokołem i wysiane na płytki BioFlex pokryte lamininą.

Komórki utrwalono i wykonano fotografię. Następnego dnia po rozciąganiu typu non-ST wysiano komórki. Czystość komórek określono na 90 ± 5% na podstawie analizy mikroskopowej morfologii komórek nabłonkowych oraz immunobarwienia na białko surfaktantu C. Poniższe rysunki przedstawiają dane z płodowych komórek nabłonkowych typu drugiego, które poddano 5% odkształceniu cyklicznemu z częstotliwością 40 cykli na minutę przez 16 godzin.

Ten northern blot ekspresji mRNA białka surfaktantu C obrazuje, że rozciąganie indukuje różnicowanie komórek typu drugiego przy użyciu różnych substratów ECM. Znaki plus i minus oznaczają odpowiednio ekspozycję na rozciąganie lub brak ekspozycji na rozciąganie. Dane dotyczące ekspresji przedstawiono na histogramie jako średnia plus lub minus SEM, N równa się trzy, a gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0,05.

Te obrazy immunochemii fluorescencyjnej przedstawiają poziomy białka surfactant protein C w kolorze zielonym. W komórkach typu drugiego płodu niepoddanym naprężeniom mechanicznym (po lewej) oraz poddanym naprężeniom mechanicznym (po prawej) jądra komórkowe wybarwiono dapi, który widoczny jest w kolorze niebieskim. Ten histogram ilościowo przedstawia wyniki western blot z trzech eksperymentów, wykazując, że rozciąganie mechaniczne zwiększa poziomy białka surfactant protein C.

W tym doświadczeniu wartość N wynosi trzy, a gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0,05. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, w jaki sposób przyspieszyć wzrost komórek płuc płodu i poddać je rozciąganiu mechanicznemu.