Name: Indukowanie wzrostu dendrytycznego w hodowanych neuronach współczulnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Poznaj metodę indukowania wzrostu dendrytycznego w hodowanych neuronach współczulnych szczura przy użyciu BMP-7 lub Matrigelu. Protokół ten umożliwia badanie morfogenezy neuronalnej in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez fundusze z National Institutes of Health (granty R21 NS45037 i R01 ES014901).

<ol><li>Purpura, D. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPurpura%2C+DP+%22The+Neurosciences%3A+A+Study+Program%22">The Neurosciences: A Study Program</a>. Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. , Rockefeller University Press. 372-393 (1967).</li>
<li>Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+changes+in+mammalian+sympathetic+neurons+following+interruption+of+their+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons.</a> J. Physiol. 252, 429-463 (1975).</li>
<li>Purves, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPurves%2C+D+%22A+Trophic+Theory+of+Neural+Connections%22">A Trophic Theory of Neural Connections</a>. , Harvard University Press. (1988).</li>
<li>Miller, J. P., Jacobs, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+neuronal+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Relationships between neuronal structure and function.</a> J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).</li>
<li>Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+specificity+and+long-term+information+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synapse specificity and long-term information storage.</a> Neuron. 18, 339-342 (1997).</li>
<li>Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+year+of+the+dendrite%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The year of the dendrite.</a> Science. 275, 178-179 (1997).</li>
<li>Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+consequences+of+abnormal+cortical+development%3A+insights+into+developmental+disabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities.</a> Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).</li>
<li>Connors, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+mechanisms+in+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Neurology%22%5BJournal%5D)">Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders.</a> Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).</li>
<li>Pardo, C. A., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurobiology+of+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology+%28Zurich%2C+Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">The neurobiology of autism.</a> Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).</li>
<li>Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+neurodevelopmental+disorders%3A+meeting+at+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse.</a> Science. 302, 826-830 (2003).</li>
<li>de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+and+dendritic+analysis+of+fascia+dentata+granule+cells+in+human+aging+and+senile+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia.</a> Brain Res. 402, 217-229 (1987).</li>
<li>Flood, D. G., Coleman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+plasticity+in+normal+aging+and+decreased+plasticity+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer's disease.</a> Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).</li>
<li>Jagadha, V., Becker, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+pathology%3A+an+overview+of+Golgi+studies+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man.</a> Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).</li>
<li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.+I.+Conditions+under+which+neurons+form+axons+but+not+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites.</a> Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).</li>
<li>Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+promote+dendritic+development+in+rat+sympathetic+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro.</a> Glia. 1, 380-392 (1988).</li>
<li>Lein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+extracellular+matrix+and+osteogenic+protein-1+on+the+morphological+differentiation+of+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).</li>
<li>Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+protein-1+induces+dendritic+growth+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons.</a> Neuron. 15, 597-605 (1995).</li>
<li>Lein, P. J., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+and+a+basement+membrane+extract+have+different+effects+on+axonal+and+dendritic+outgrowth+from+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro.</a> 136, 330-345 (1989).</li>
<li>Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHiggins%2C+D+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , The MIT Press. 177-295 (1991).</li>
<li>Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-5+%28BMP-5%29+promotes+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).</li>
<li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).</li>
<li>Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+induce+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons+by+modulating+the+balance+between+bone+morphogenetic+proteins+%28BMPs%29+and+BMP+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists.</a> J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).</li>
<li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHiggins%2C+D+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 177-205 (1991).</li>
<li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.+II.+Serum+promotes+dendritic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth.</a> Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zalety tego modelu obejmują: (a) hodowle składają się z jednorodnej populacji neuronów współczulnych pozbawionej innych typów komórek 17,23; (b) wymagania neuronów współczulnych w zakresie czynników wzrostu są dobrze określone, co umożliwia stosowanie zdefiniowanych pożywek, a różnorodne rodzaje zdefiniowanych pożywek i podłoży sprawdzają się w hodowli i utrzymaniu neuronów współczulnych 23; (c) neurony w tych hodowlach reagują jednolicie na aktywność promującą powstawanie dendrytów Matrigelu, BMP-7...

<table><tbody><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Bellco Glass</td><td>1943-10012</td><td>Szkiełko nakrywkowe okrągłe 12 mm, grubość nr 1, szkło niemieckie</td></tr><tr><td>Pipety z zakrzywioną końcówką</td><td>Bellco Glass</td><td>1273-50003</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899-100MG</td><td>Roztwór stokowy 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjne pęsety Dumont nr 4 i 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30 11241-30</td><td></td></tr><tr><td>igły 20 G</td><td>BD Biosciences</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;pożywka L-15</td><td>Invitrogen</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Worthington Biochemical</td><td>4176</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Dyspaza</td><td>Grupa Roche</td><td>04942078001</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;zrównoważony roztwór soli (bez Ca, Mg)</td><td>Invitrogen</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>DMEM o niskiej zawartości glukozy</td><td>Invitrogen</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td>20 mM</td></tr><tr><td>Insulina/Transferyna/Selen</td><td>Invitrogen</td><td>51500-056</td><td>100X</td></tr><tr><td>BSA wolne od kwasów tłuszczowych</td><td>Calbiochem</td><td>126609</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>Harlan Laboratories</td><td>5017</td><td></td></tr><tr><td>pożywka Ham F-12 (F-12)</td><td>Invitrogen</td><td>11765</td><td></td></tr><tr><td>Cytarabina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>Należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>BMP-7</td><td>R&amp;R&D Systems</td><td>345-BP BMP7-07H</td><td>Białka BMP 4, 5 i 6 działają równie skutecznie jak BMP-7 i czasami są łatwiejsze do nabycia w handlu.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie przeciwko szczurzemu białku MAP2</td><td>Sternberger Monoclonals Inc.</td><td>SMI52</td><td>1/5000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 przeciwciało kozie antymysie</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td>1/10000</td></tr><tr><td>Media montażowe</td><td>Sondy molekularne, Life Technologies</td><td>P7481</td><td></td></tr></tbody></table>

indukowanie wzrostu dendrytów w hodowlanych neuronach współczulnych

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Kształt drzewka dendrytycznego determinuje całkowitą sumę sygnałów synaptycznych, jakie może odebrać neuron 1-3, oraz wpływa na rodzaje i rozkład tych sygnałów 4-6. Zmienione wzorce wzrostu i plastyczności dendrytów są powiązane z zaburzeniami funkcji neurobehawioralnych w modelach eksperymentalnych 7 i uważa się, że przyczyniają się do objawów klinicznych obserwowanych zarówno w zaburzeniach neurorozwojowych 8-10, jak i w chorobach neurodegeneracyjnych 11-13. Takie obserwacje podkreślają funkcjonalne znaczenie precyzyjnej regulacji morfologii dendrytów i sugerują, że zidentyfikowanie mechanizmów kontrolujących wzrost dendrytów nie tylko poszerzy wiedzę o tym, jak regulowana jest łączność neuronalna podczas prawidłowego rozwoju, ale może również dostarczyć informacji na temat nowych strategii terapeutycznych w różnych chorobach neurologicznych.
Badania mechanistyczne nad wzrostem dendrytów zostałyby znacznie ułatwione dzięki dostępności systemu modelowego, który pozwala na eksperymentalne przełączenie neuronów ze stanu, w którym nie rozwijają one dendrytów, do stanu, w którym tworzą one drzewo dendrytyczne porównywalne z tym u ich odpowiedników in vivo. Takim modelem są kultury pierwotne neuronów współczulnych wyizolowanych z zwojów szyjnych górnych (SCG) gryzoni perinatalnych. Hodowane w zdefiniowanym medium, w obecności serum i gliozy zwojowej, neurony współczulne rozwijają pojedynczy wypustek o charakterze aksonalnym, a ten stan unipolarny utrzymuje się w kulturze od kilku tygodni do kilku miesięcy 14,15. Jednak dodanie do medium hodowlanego białka morfogenetycznego kości-7 (BMP-7) 16,17 lub Matrigelu 18 pobudza te neurony do wytworzenia wielu wypustek spełniających morfologiczne, biochemiczne i funkcjonalne kryteria dendrytów. Neurony współczulne wyizolowane z SCG gryzoni perinatalnych i hodowane w zdefiniowanych warunkach stanowią jednorodną populację neuronów 19, które reagują jednolicie na aktywność pro-dendrytyczną Matrigelu, BMP-7 oraz innych BMP z podrodzin decapentaplegic (dpp) i 60A 17,18,20,21. Co istotne, indukowany przez Matrigel i BMP proces tworzenia dendrytów zachodzi bez zmian w przeżywalności komórek lub wzroście aksonów 17,18.
W niniejszej pracy opisujemy sposób przygotowania dysocjowanych kultur neuronów współczulnych pochodzących z zwojów szyjnych gwiazdowatych (SCG) szczurów perinatalnych, tak aby były one podatne na selektywną aktywność promującą wzrost dendrytów Matrigelu lub BMP.

Opisujemy protokół wykorzystania białka morfogenetycznego kości-7 (BMP-7) lub Matrigelu do selektywnego indukowania wzrostu dendrytów w pierwotnych neuronach współczulnych rozdzielonych z zwojów szyjnych górnych (SCG) szczurów perinatalnych.

Indukowanie wzrostu dendrytów w hodowlanych neuronach współczulnych

Kształt drzewa dendrytycznego determinuje całkowitą liczbę wejść synaptycznych, jakie może otrzymać neuron 1-3, oraz wpływa na rodzaje i rozmieszczenie tych wejść ...

Celem niniejszej procedury jest hodowla neuronów współczulnych w celu umożliwienia manipulowania wzrostem ich dendrytów. Jest to realizowane poprzez wstępne wyizolowanie zwojów szyjnych górnych od noworodków gryzoni w warunkach sterylnych. Drugim krokiem jest dysocjacja zwojów w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, która następnie jest wysiewana na przygotowane podłoża.Medium zdefiniowane Inde. Następnie, po potraktowaniu kultur środkiem antymitotycznym w celu wyeliminowania komórek nieneuronalnych, należy poddać kultury działaniu BMP lub matrigelu, aby zaindukować wzrost dendrytów. Ostatecznie wykorzystuje się mapowanie immunoreaktywności map2, aby wykazać wydłużone dendryty hodowanych neuronów współczulnych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak hodowla pierwotna neuronów hipokampa, jest możliwość manipulowania stanem morfologicznym neuronów DYS w taki sposób, aby mniej niż 5% neuronów w hodowli posiadało dendryty lub aby ponad 95% neuronów w hodowli wykazywało intensywny wzrost neurytowy. Aby przygotować powiązane hodowle SCG z płodów szczurzych w 19. do 21. dnia embrionalnego, najpierw należy ogolić brzuch uśpionego eutanazją ciężarnego szczura, oczyścić skórę 70% ethanol, a następnie w warunkach sterylnych usunąć rogi macicy, unikając uszkodzenia jelit lub innych organów wewnętrznych. Rogi macicy należy umieścić w sterylnej 150 milimetrowej czaszce Petriego. Następnie czaszkę Petriego należy przenieść na tacę z lodem.Aby znieczulić zarodki w celu ich uśmiercenia, należy przeciąć rdzeń kręgowy wzdłuż linii środkowej poniżej łopatki. Powoduje to również przerwanie żyły głównej, co zmniejsza krwawienie z tętnicy szyjnej. Podczas sekcji zwojów szyjnych (SCG) zarodki należy umieścić w sterylnym medium Leibovitz's L 15 uzupełnionym o penicylinę i streptomycynę. Następnie należy przenieść zarodki do szalki Petriego o średnicy 150 mm, wypełnionej w połowie substancją sil guard, i ułożyć je na plecach.Użyj sterylnych igieł o rozmiarze 20 G, aby przypiąć klatkę piersiową i głowę, delikatnie przeprostowując szyję, co ułatwi wypreparowanie SCG pod mikroskopem. Wykonaj nacięcie w linii środkowej wzdłuż szyi na poziomie obojczyków, aby odsłonić ślinianki podżuchwiowe. Usuń ślinianki za pomocą precyzyjnych pęset, aby odsłonić warstwę mięśniową.Następnie przetnij mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy w pobliżu obojczyka, delikatnie odsuwając mięsień łopatkowo-gnykowy znajdujący się obok tchawicy. Mięsień ten jest bardzo cienki, dlatego należy unikać zbyt głębokiego cięcia, które mogłoby doprowadzić do przerwania leżącej głębiej tętnicy szyjnej oraz SCG. Po usunięciu tych warstw mięśniowych tętnica szyjna i nerw błędny powinny być wyraźnie widoczne.Zwoj SCG znajduje się tuż poniżej rozwidlenia tętnicy szyjnej. Za pomocą precyzyjnej pęsety odsunąć tkankę z obu stron tętnicy szyjnej, aby odsłonić zwoj. Następnie za pomocą dwóch precyzyjnych pęset chwycić tętnicę szyjną odpowiednio tuż nad i pod soczewką rostralną i kordalną zwoju SCG.Aby usunąć odcinek tętnicy szyjnej znajdujący się powyżej SCG, a także sam SCG, prawdopodobne jest, że na tym etapie rozwoju zostanie również usunięty zwoj pętlowaty, który znajduje się obok SCG. Umieść wypreparowaną tkankę w sterylnym 35 milimetrowym naczyniu hodowlanym zawierającym podłoże L 15 i antybiotyki. Następnie usuń SCG ze wszystkich szczeniąt przed przejściem do kolejnych kroków.Następnie delikatnie oddziel zwoje szyjne górne (SCG) od tętnicy szyjnej oraz innych tkanek. Usuń je podczas sekcji. Usuń torebkę ze zwojów.Następnie przenieś zwoje do innego sterylnego naczynia o średnicy 35 milimetrów zawierającego podłoże L 15. Aby rozdysocjować SCG, usuń podłoże L 15. Zastąp je kolagenazą rozpuszczoną w roztworze Hanks Balance Salt Solution pozbawionym wapnia i magnezu.Następnie inkubuj próbkę w temperaturze 37°C przez 40 minut. Po tym czasie przenieś SCG do sterylnej stożkowej probówki do wirowania o pojemności 15 ml. Doprowadź objętość do 10 ml za pomocą medium L 15 uzupełnionego o BSA do końcowego stężenia od 1 do 2 mg/ml.Wiruj z prędkością 200 ×g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po upływie pięciu minut odlej nadsącz i wypłucz próbkę jeszcze raz medium L 15 uzupełnionym o BSA. Po drugim płukaniu usuń medium L 15 i zawieś zwoje w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej.Przenieś komórki średnio trzy do czterech razy, używając pipety z wygiętą końcówką wypolerowaną ogniem. Upewnij się, że pipeta jest pokryta BSAL 15 przed przenoszeniem, aby zminimalizować przywieranie komórek do szkła. Pozostaw duże skupiska na około jedną minutę, a następnie przelej zawiesinę komórkową do probówki stożkowej o pojemności 15 ml.Następnie dodaj więcej pożywki do pozostałych SCG i przeprowadź kolejną triturację. Po opadnięciu grudek przenieś zawiesinę komórkową z drugiej trituracji do tej zebranej po pierwszej trituracji. Powtarzaj ten proces kilka razy, aż zwoje zostaną w większości rozdzielone.Po czwartej triizacji odrzuć wszelkie pozostałe grudki. W przypadku komórek wydzielonych z jednego litra szczeniąt szczura, całkowitą objętość medium w zawiesinie komórkowej należy doprowadzić do 8–10 ml. Dodając dodatkowe medium hodowlane, delikatnie resuspenduj komórki za pomocą pipety. Następnie pobierz niewielką alikwot do oznaczenia gęstości komórek.Dostosuj objętość zawiesiny komórkowej, aby uzyskać gęstość komórek dwukrotnie większą niż pożądana w kulturze. Następnie odmień 250 µL zawiesiny komórkowej na każdą studzienkę. W badaniach morfometrycznych wzrostu dendrytów komórki wysiewamy zazwyczaj na płytki 24-dołkowe przy niskiej gęstości, wynoszącej około 5 × 10⁴ komórek na studzienkę.Następnie umieść kultury SCG na porcelanowej płytce w szklonym eksykatorze zawierającym sterylną wodę. Przed szczelnym zamknięciem eksykatora wstrzyknij do niego około 120 mililitrów dwutlenku węgla. Następnie umieść cały eksykator w inkubatorze i ustaw temperaturę na 35,5 °C.W tej procedurze należy dokarmić kulturę poprzez wymianę połowy pożywki 24 godziny po wysianiu, powtarzając tę czynność trzy razy w tygodniu, aby wyeliminować z kultury komórki nieneuronalne. W tym czasie do pożywki hodowlanej zazwyczaj dodaje się środek antymitotyczny RRC w stężeniu od 1 do 2 µM.Następnie do każdej studni dodaj świeżą pożywkę hodowlaną z RSC i inkubuj przez 48 godzin, aby zaindukować wzrost dendrytyczny po wyeliminowaniu komórek nieneuronalnych i znacznym obniżeniu poziomu RSC. W piątym dniu dodaj do pożywki hodowlanej matrigel lub BMP seven. Następnie w warunkach in vitro zasilaj hodowlę zgodnie z wcześniejszym opisem; przedstawiony tutaj neuron hodowany w warunkach kontrolnych wykazuje brak dendrytów, co potwierdza brak procesów immunopozytywnych dla MAP two.W przeciwieństwie do niego, ten neuron, który został poddany działaniu BMP7, posiada kilka zwężających się dendrytów immunopozytywnych pod kątem MAP2, pokazanych tutaj. Hodowane neurony współczulne przebywały w kulturze od 5 do 7 dni przed traktowaniem BMP7 oraz po traktowaniu BMP7 w stężeniu od 30 do 50 ng/ml przez dwa dni. Zwróć uwagę na początek wzrostu dendrytów.Kultury hodowano od 7 do 14 dni w nieobecności bmp.Seven. Wykazywały one wyłącznie wzrost aksonalny, podczas gdy kultury traktowane BMP.Seven. w stężeniu od 30 do 50 ng/mL przez 7 do 14 dni.Wykazują intensywny wzrost dendrytów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób izolacji SCG. Przygotuj rozproszoną kulturę neuronów współczulnych do badań nad morfogenezą neuronalną i eksperymentalnie manipuluj wzrostem dendrytów.

inducing-dendritic-growth-in-cultured-sympathetic-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wywoływanie wzrostu dendrytów w hodowli sympatychcznych neuronów

Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji i hodowli pierwotnych neuronów współczulnych z zwojów szyjnych górnych (SCG) nowo narodzonych szczurów.

Protokół hodowli neuronów współczulnych z zwojów szyjnych górnych (SCG) szczura

Liczne niedawne badania zidentyfikowały mutacje w białkach synaptycznych powiązanych z patologiami mózgu. Pierwotne hodowle neuronów korowych zapewniają dużą elastyczność w badaniu wpływu tych białek związanych z chorobami na morfologię i ruchliwość kolców dendrytycznych.

Analiza morfologii kolców dendrytycznych w hodowlanych neuronach OUN

Opisano model in vitro do badań genetycznych nad regeneracją aksonów z wykorzystaniem hodowli neuronów z zwojów korzeni grzbietowych dorosłych myszy. Metoda obejmuje etap resuspensji i ponownego wysiewu, aby umożliwić ponowny wzrost aksonów z neuronów poddanych manipulacjom genetycznym. Podejście to jest szczególnie przydatne w badaniach nad utratą funkcji w procesie regeneracji aksonów z wykorzystaniem wyciszania ekspresji białek opartego na RNAi.

Genetyczne badanie regeneracji aksonów w hodowlach neuronów z dorosłych zwojów korzeni grzbietowych

Ten film demonstruje metodę in vitro do generowania postganglionowych neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). hPSC są różnicowane w komórki grzebienia nerwowego (NCC) na podporze macierzy błony podstawnej za pomocą pożywki różnicującej. NCC są następnie dysocjowane i formowane w sferoidy za pomocą innego ośrodka różnicującego. Wreszcie sferoidy są przekształcane w pozazwojowe neurony współczulne za pomocą współczulnego ośrodka neuronowego.

Generowanie zazwojowych neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Wideo pokazuje współtworzenie neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) z komórkami Schwanna. Neurony DRG są najpierw hodowane na wstępnie rozciągniętej błonie w celu wyrównania wzrostu aksonów. Następnie wprowadzane są komórki Schwanna, które przyczepiają się do aksonów, izolując je i promując przeżycie i funkcję komórek nerwowych.

Wspólna hodowla komórek Schwanna z neuronami DRG na wstępnie rozciągniętej błonie

Ten film demonstruje wykorzystanie transfekowanych komórek zwojowych korzenia grzbietowego do badania uwalniania neuroprzekaźników poprzez stymulację ich agonistą receptora neuropeptydowego.

Stymulacja neuronów czuciowych zwoju korzenia grzbietowego za pomocą agonisty receptora neuropeptydowego

Obecny protokół przedstawia eksperymentalne procedury stymulujące hodowlane makrofagi do wyposażenia w zdolność do uwalniania czynników molekularnych, które sprzyjają wzrostowi neurytów. Traktowanie cAMP kokulturami neuronów i makrofagów indukuje makrofagi do wytwarzania kondycjonowanej pożywki, która ma silną aktywność wzrostu neurytów.

Kokultury neuronów i makrofagów w celu aktywacji makrofagów wydzielających czynniki molekularne z aktywnością wzrostu neurytów

Opisujemy izolację, dyspersję i powlekanie komórek pierwotnych miazgi zębowej (DP) z neuronami trójdzielnymi (TG) hodowanymi na nałożonych na nich filtrach transwell. Odpowiedzi komórkowe komórek DP można analizować za pomocą immunofluorescencji lub analizy RNA/białka. Immunofluorescencja markerów neuronalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej pozwala na analizę odpowiedzi na przerost neurytów.

Metoda kohodowli do badania przerostu neurytów w odpowiedzi na sygnały parakrynne miazgi zębowej

W tym protokole opisujemy stabilną, wysoce efektywną strategię różnicowania do generowania postganglionowych neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Model ten sprawi, że neurony będą dostępne do wykorzystania w badaniach nad wieloma zaburzeniami autonomicznymi.

Skuteczne różnicowanie zazwojowych neuronów współczulnych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli bez karmienia i zdefiniowanych chemicznie

Ten artykuł opisuje izolację i hodowlę embrionalnych neuronów współczulnych szczurów z górnych zwojów szyjnych. Zawiera również szczegółowe protokoły barwienia immunocytochemicznego i przygotowywania ekstraktów neuronalnych do analizy spektrometrii mas.

Hodowla neuronów współczulnych szczurów z embrionalnych górnych zwojów szyjnych do analizy morfologicznej i proteomicznej

Poznaj metodę indukowania wzrostu dendrytycznego w hodowanych neuronach współczulnych szczura przy użyciu BMP-7 lub Matrigelu. Protokół ten umożliwia badanie morfogenezy neuronalnej in vitro.

Indukowanie wzrostu dendrytów w hodowlanych neuronach współczulnych

Przeglądaj więcej filmów