Diagnostyka gruźlicy płuc za pomocą testu Xpert MTB/RIF

Ogólnym celem niniejszej procedury jest jednoczesne wykrycie w ciągu dwóch godzin prątków gruźlicy oraz oporności na ryfampicynę w wykrztuszanej plwocinie lub w zagęszczonych osadach z plwociny. Pracę należy rozpocząć od prostego, wysoce skutecznego protokołu dekontaminacji próbki. Następnie każdą przetworzoną próbkę przenosi się do jednorazowego wkładu expert M-T-B-R-I-F, który zawiera odczynniki do PCR i służy jako miejsce przeprowadzania procesu PCR.

Wprowadź wkłady do systemu GeneXpert DX i uruchom ultra-czułą metodę HEMI nested PCR do jednoczesnego wykrywania mycobacterium tuberculosis oraz oporności na ryfampicynę. Na koniec odczytaj wyniki testu i przekaż je lekarzowi. Test Expert MTPR jest przeznaczony do stosowania z próbkami pobranymi od pacjentów, u których istnieje kliniczne podejrzenie gruźlicy płuc i którzy spełniają kryteria opisane w tekście towarzyszącym.

Należy pamiętać, że metoda ta nie powinna być stosowana do monitorowania efektów terapii lekowej.Kryształ. Technik z mojego laboratorium zaprezentuje teraz protokół zgodnie ze standardem numer dwa międzynarodowych standardów opieki nad pacjentami z gruźlicą. Należy pobrać dwie próbki do badania bakteriologicznego od każdego pacjenta z podejrzeniem gruźlicy płuc.

Przeznacz jeden moduł systemu GeneXpert DX dla każdej próbki testowej, etykietując każdy kartridż identyfikatorem próbki. Następnie, dla każdego badania próbki, przenieś 1 mL plwociny do 15 ml stożkowej probówki z nakrętką za pomocą kolejnej sterylnej pipety transferowej. Dodaj 2 ml odczynnika do próbek M-T-B-R-I-F.

Mocno zakręć nakrętkę. Wstrząśnij probówką od 10 do 20 razy. Następnie pozostaw probówkę w pozycji pionowej przez pięć minut w temperaturze pokojowej po intensywnym wstrząśnięciu.

Ponownie doprowadzić do stanu równowagi w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Sprawdzić, czy wszystkie próbki są rozrzedzone i nie zawierają widocznych grudek plwociny. Najpierw opisać wkłady identyfikatorem każdej próbki osadu z plwociny; do każdej próbki osadu dodać 1,5 ml odczynnika do próbek M-T-B-R-I-F, a następnie przenieść 0,5 ml do 15 ml konicznej probówki z nakrętką. Zamknąć pokrywkę, mieszać w wortexie przez 30 sekund i pozostawić probówkę w pozycji pionowej na pięć minut po drugiej sekundzie.

Pomieszać za pomocą wibratora vortex i pozostawić probówki w pozycji pionowej na 10 minut. Sprawdzić upłynnione próbki, aby upewnić się, że nie zawierają one grudek plwociny. Dopasować etykiety na probówkach do odpowiednich kaset.

Nie otwierać wkładziny do momentu rozpoczęcia testowania; należy zużyć wkładzinę w ciągu 30 minut od otwarcia jej pokrywy. Za pomocą sterylnej pipety transferowej należy pobrać upłynnioną próbkę, aż menisk znajdzie się powyżej linii minimum. Powoli wprowadzić próbkę do wkładziny.

Zamknij pokrywę kartridża. Rozpocznij test w ciągu 30 minut od dodania próbki do kartridża. W pierwszej kolejności włącz komputer, a następnie urządzenie znajdujące się na blacie.

Kliknij dwukrotnie ikonę gene expert DX. Zaloguj się do oprogramowania systemowego. Wybierz opcję create test, aby otworzyć okno dialogowe skanowania kodu kreskowego kartridża.

Następnie wpisz identyfikator próbki i zeskanuj kod kreskowy na kartridżu. Po pojawieniu się okna tworzenia testu kliknij start test i wprowadź hasło w polu dialogowym. Teraz otwórz drzwiczki modułu instrumentu i umieść w nim kartridż.

Zamknij drzwi, aby rozpocząć test. Gdy zielone światło zgaśnie, test zostanie zakończony. Po zwolnieniu blokady drzwi przez system otwórz drzwi modułu i wyjmij kasetę.

Na koniec zutylizuj zużyte wkłady w odpowiednich pojemnikach na odpady. Każdy wkład testowy zawiera odczynniki do qPCR w kierunku oporności kompleksu Mycobacterium tuberculosis na ryfampicynę oraz odpowiednie kontrole eksperymentalne. Kontrola sprawdzenia sondy weryfikuje rehydratację odczynników, napełnienie probówki PCR we wkładzie, integralność sondy oraz stabilność barwnika.

Krzywa przetwarzania próbek służy jako kontrola pozytywna prawidłowego przetworzenia docelowych bakterii, a także wskazuje na obecność ewentualnych inhibitorów PCR. Primery zostały zaprojektowane tak, aby odróżnić konserwowaną sekwencję typu dzikiego od mutacji w regionie rdzeniowym genu RPOB związanych z opornością na RIF. Wartości CT są odwrotnie proporcjonalne do stężenia docelowego matrycowego M-T-B-D-N-A w badanej próbce.

Okno dialogowe z wynikiem testu stwierdza, że w próbce pacjenta wykryto docelowe DNA MTB, a oporność na RIF nie została wykryta. Docelowe DNA MTB jest wykrywane na niskim poziomie z przesłankami o oporności na ryfampicynę. Obie kontrole, SPC i PCC, spełniają przypisane kryteria akceptacji.

Wynik tego testu uznaje się za nieważny, ponieważ SPC jest ujemny, a produkty PCR nie wystąpiły. Oznacza to, że próbka nie została prawidłowo przetworzona lub nastąpiło zahamowanie reakcji PCR. Należy powtórzyć badanie.

Jak pokazano w materiale wideo, test ten jest zestandaryzowany i wymaga jedynie umiarkowanej infrastruktury laboratoryjnej oraz szkolenia. W związku z tym uważam, że ekspercki test M-T-B-R-F ma potencjał, aby zapewnić zestandaryzowaną, czułą i bardzo specyficzną diagnostykę zarówno gruźlicy, jak i oporności na ryfampicynę w powszechnych punktach opieki zdrowotnej (point of care).