Name: Diagnostyka gruźlicy płuc za pomocą testu Xpert MTB/RIF (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj szybką diagnostykę gruźlicy płuc i oporności na ryfampicynę za pomocą testu Xpert MTB/RIF. Ta metoda PCR wykrywa Mycobacterium tuberculosis w próbkach plwociny w ciągu dwóch godzin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują W. J. Looney za uważne zrecenzowanie manuskryptu.

Standard 2 Międzynarodowych Standardów Opieki nad Pacjentem z Gruźlicą (International Standards for Tuberculosis Care) stanowi, że wszyscy pacjenci z podejrzeniem gruźlicy płuc powinni dostarczyć co najmniej dwie próbki plwociny do badania bakteriologicznego. W miarę możliwości należy pobrać co najmniej jedną próbkę wczesnym rankiem, ponieważ plwocina zebrana w tym czasie charakteryzuje się najwyższą wydajnością diagnostyczną.11 Test Xpert MTB/RIF można stosować do próbek plwociny lub zagęszczonych osadów z plwociny przygotowanych z plwociny indukowanej lub odkrztuszonej, w których wynik badania plwociny metodą barwienia na prątki kwasoodporne (AFB) jest dodatni lub ujemny.6, 12, 13 Test jest przeznaczony do stosowania z próbkami pobranymi od pacjentów z klinicznym podejrzeniem gruźlicy płuc, którzy: 1) nie otrzymali leczenia przeciwgruźliczego, 2) mieli &lt; 7 dni terapii lub 3) nie otrzymywali terapii w ciągu ostatnich 60 dni. Należy zauważyć, że nie powinno być ono stosowane do monitorowania efektów farmakoterapii7 ponieważ bakteryjne DNA może utrzymywać się po zastosowaniu terapii przeciwdrobnoustrojowej.
Próbki kliniczne, w tym zużyte wkłady, należy traktować jako potencjalnie zakaźne. Należy stosować odpowiednie środki ostrożności, takie jak noszenie jednorazowych rękawic ochronnych, fartuchów laboratoryjnych i okularów ochronnych, oraz przestrzegać procedur i wytycznych bezpieczeństwa obowiązujących w danej instytucji.
1. Próbki odksztuszanej plwociny
Uwaga: Jednorazowo należy przetwarzać tylko tyle próbek, ile dostępnych jest modułów systemu GeneXpert Dx do przeprowadzenia testu!
<ol>
 <li>Każdy kartridż Xpert MTB/RIF należy opisać odpowiednim identyfikatorem próbki.</li>
 <li>Za pomocą sterylnej pipety transferowej przenieść 1,0 ml odkrztuszonej plwociny do stożkowej probówki z zakrętką. Alternatywnie całą próbkę można przetworzyć w oryginalnym, szczelnym pojemniku do zbierania plwociny.</li>
 <li>Za pomocą sterylnej pipety transferowej dodać 2,0 ml odczynnika Xpert MTB/RIF Sample Reagent (2:1; v/v) do odkrztuszonej plwociny.</li>
 <li>Zakręcić probówkę i energicznie nią wstrząsnąć 10–20 razy. Alternatywnie mieszaninę można wymieszać w wirówce typu vortex (30 s).</li>
 <li>Pozostawić probówkę w pozycji pionowej przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Energicznie wstrząsnąć probówką 10–20 razy. Alternatywnie użyć wirówki typu vortex (30 s).</li>
 <li>Pozostawić probówkę w pozycji pionowej przez kolejne 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Sprawdzić próbki: powinny być one upłynnione, bez widocznych grudek plwociny.</li>
</ol>
2. Osady zagęszczone
Uwaga: Jednocześnie należy przetwarzać tylko tyle próbek, ile dostępnych jest modułów systemu GeneXpert Dx do przeprowadzenia testów!
<ol>
 <li>Oznakuj każdy kartridż Xpert MTB/RIF odpowiadającym mu identyfikatorem próbki.</li>
 <li>Przenieś 1.5 ml odczynnika do próbek Xpert MTB/RIF (Sample Reagent) do stożkowej probówki z nakrętką, używając sterylnej pipety transferowej.</li>
 <li>Dodaj co najmniej 0.5 ml zagęszczonego osadu do probówki z odczynnikiem do próbek, używając sterylnej pipety transferowej.</li>
 <li>Zakręć probówkę i energicznie wstrząśnij nią 10-20 razy. Alternatywnie można użyć wstrząsarki typu vortex (30 s).</li>
 <li>Pozostaw probówkę w pozycji pionowej przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Energicznie wstrząśnij probówką 10-20 razy. Alternatywnie można użyć wstrząsarki typu vortex (30 s).</li>
 <li>Pozostaw probówkę w pozycji pionowej przez kolejne 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Obejrzyj próbki: powinny być one upłynnione, bez widocznych grudek plwociny.</li>
</ol>
3. Załadunek kartridża Xpert MTB/RIF
Uwaga: Test należy rozpocząć w ciągu 30 minut od dodania próbki do kartridża!
<ol>
 <li>Sprawdzić etykiety na kartridżu Xpert MTB/RIF oraz identyfikator próbki.</li>
 <li>Otworzyć pokrywę kartridża.</li>
 <li>Za pomocą dołączonej sterylnej pipety transferowej pobrać upłynnioną próbkę tak, aby menisk znajdował się powyżej linii minimalnej, a następnie przenieść próbkę do otwortego portu kartridża Xpert MTB/RIF.</li>
</ol>
Uwaga: Należy dozować powoli, aby zminimalizować ryzyko powstania aerozolu!
<ol start="4">
 <li>Zamknij pokrywę kartridża.</li>
</ol>
4. Rozpoczęcie testu
Uwaga: Przed rozpoczęciem testu należy upewnić się, że system GeneXpert Dx jest wyposażony w oprogramowanie GX2.1, a test Xpert MTB/RIF został zaimportowany do oprogramowania! 9
<ol>
 <li>Włącz komputer, a następnie uruchom urządzenie GeneXpert Dx.</li>
 <li>Na pulpicie systemu Windows dwukrotnie kliknij ikonę skrótu GeneXpert Dx.</li>
 <li>Zaloguj się do oprogramowania systemu GeneXpert Dx, używając swojej nazwy użytkownika i hasła.</li>
 <li>W oknie systemu GeneXpert Dx kliknij Create Test. Pojawi się okno dialogowe Scan Cartridge Barcode.</li>
 <li>W polu Sample ID zeskanuj lub wpisz identyfikator próbki.</li>
 <li>Zeskanuj kod kreskowy na kartridżu Xpert MTB/RIF. Pojawi się okno Create Test.</li>
 <li>Kliknij Start Test i wprowadź hasło w wyświetlonym oknie dialogowym.</li>
 <li>Otwórz drzwiczki modułu urządzenia z migającym zielonym światłem i wkładaj kartridż.</li>
 <li>Zamknij drzwiczki. Test rozpocznie się, a światło przestanie migać i będzie świecić światłem ciągłym w kolorze zielonym. Po zakończeniu testu światło zgaśnie.</li>
 <li>Zaczekaj, aż system zwolni blokadę drzwiczek po zakończeniu cyklu, następnie otwórz drzwiczki modułu i wyjmij kartridż.</li>
 <li>Zużyte kartridże należy zutylizować w odpowiednich pojemnikach na odpady zgodnie ze standardowymi procedurami obowiązującymi w Twojej instytucji.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Każdy wkład Xpert MTB/RIF zawiera odczynniki do wykrywania kompleksu MTB i oporności na RIF, a także kontrolę przetwarzania próbki (SPC), która służy do kontroli prawidłowego przetwarzania docelowych bakterii oraz monitorowania obecności inhibitorów w reakcji PCR. Kontrola sprawdzająca sondy (PCC) weryfikuje rehydratację odczynników, napełnienie probówki PCR we wkładzie, integralność sond oraz stabilność barwnika.9 Primery w teście Xpert MTB/RIF amplifikują fragment genu rpoB zawierający 81-parowy region „rdzenia”. Pięć różnie zabarwionych fluorogennych sond hybrydyzacyjnych kwasów nukleinowych, zwanych latarniami molekularnymi (molecular beacons), analizuje cały 81-bp rdzeń.14 Każda latarnia molekularna została zaprojektowana w taki sposób, aby była na tyle specyficzna, by nie wiązać się z celem, jeśli sekwencja docelowa różni się od sekwencji rpoB typu dzikiego nawet pojedynczą substytucją nukleotydu. Ponieważ latarnie molekularne fluorescują tylko wtedy, gdy są związane ze swoimi celami, tj. sekwencją rpoB typu dzikiego, brak dowolnego z pięciu kolorów w teście pozwala odróżnić konserwatywną sekwencję typu dzikiego od mutacji w regionie rdzenia związanych z opornością na RIF.6
SPC powinna być dodatnia w próbce negatywnej oraz może być negatywna lub dodatnia w próbce pozytywnej. Wynik testu zostanie uznany za „Nieważny” (Invalid), jeśli SPC nie zostanie wykryta w teście negatywnym. Przed rozpoczęciem reakcji PCR system GeneXpert Dx mierzy sygnał fluorescencji z sond w celu monitorowania rehydratacji kulek, napełniania probówki reakcyjnej, integralności sond oraz stabilności barwnika. PCC zostaje zaliczona, jeśli sygnał fluorescencji z sond spełnia przypisane kryteria akceptacji. Wyniki są interpretowane przez system GeneXpert Dx na podstawie zmierzonych sygnałów fluorescencji i wbudowanych algorytmów obliczeniowych, a następnie wyświetlane w oknie View Results9, zgodnie z poniższymi wskazówkami:
Wykryto MTB: wykryto docelowe DNA MTB; obie kontrole, SPC i PCC, spełniają przypisane kryteria akceptacji. Niższe wartości Ct oznaczają wyższe stężenie początkowe matrycy DNA; wyższe wartości Ct oznaczają niższe stężenie matrycy DNA. W wynikach MTB DETECTED na osobnej linii wyświetli się komunikat „RIF Resistance DETECTED” (Rysunek 1A), „RIF Resistance NOT DETECTED” (Rysunek 1B) lub „RIF Resistance INDETERMINATE”.
MTB nie wykryto: DNA docelowe MTB nie zostało wykryte; obie kontrole, SPC i PCC, spełniają przypisane kryteria akceptacji (Rysunek 2).
Wynik nieważny: Nie można określić obecności lub braku MTB: SPC nie spełnia kryteriów akceptacji, co oznacza, że próbka nie została prawidłowo przetworzona lub nastąpiło zahamowanie reakcji PCR (Rycina 3). Uwaga: powtórzyć badanie z dodatkowym materiałem!
Błąd: Jeden lub więcej wyników PCC zakończyło się niepowodzeniem (FAIL). Zarówno MTB, jak i SPC wykazują brak wyniku (NO RESULT). Uwaga: powtórz test z dodatkową próbką! Jeśli test PCC zakończył się pomyślnie (PASS), błąd jest spowodowany awarią komponentu systemu.
Rysunek 1: Wykryto docelowe DNA MTB; obie kontrole, SPC i PCC, spełniają przypisane kryteria akceptacji. Niższe wartości Ct reprezentują wyższe stężenie początkowe matrycy DNA; wyższe wartości Ct reprezentują niższe stężenie matrycy DNA. W wynikach MTB DETECTED na osobnej linii zostanie wyświetlone: „RIF Resistance NOT DETECTED” (Rysunek 1A), „RIF Resistance DETECTED” (Rysunek 1B) lub „RIF Resistance INDETERMINATE”.
<img alt="Interfejs systemu GeneXpert pokazujący wyniki diagnostyki MTB i główne krzywe fluorescencji." src="/files/ftp_upload/3547/3547fig1A.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1A"> 
Rycina 1A. WYKRYTO MTB; NIE WYKRYTO oporności na RIF, co oznacza, że obecna była jedynie sekwencja kwasu nukleinowego typu dzikiego w 81-pzp regionie determinującym oporność na RIF (RRDR) genu rpoB .6 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig1A.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną rycinę</a>.
<img alt="Interfejs oprogramowania diagnostycznego GeneXpert; wykres analizy PCR; wyniki detekcji MTB/RIF." src="/files/ftp_upload/3547/3547fig1B.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1B"> 
Rycina 1B. Wykryto MTB; wykryto oporność na RIF. Całkowity zanik sygnału sondy B (strzałka), która obejmuje pozycje od 513 do 517 regionu RRDR genu rpoB .6 W przedstawionym przykładzie częściowe sekwencjonowanie wykazało obecność mutacji D516V w genie rpoB .8 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig1Blarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycina</a>.
<img alt="Interfejs systemu GeneXpert Dx, wynik testu Xpert MTB-RIF, wykres PCR pokazujący cykl detekcji MTB." src="/files/ftp_upload/3547/3547fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Nie wykryto docelowego DNA MTB; obie kontrolki, SPC i PCC, spełniają przypisane kryteria akceptacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
<img alt="Interfejs systemu GeneXpert Dx; schemat analizy PCR z danymi fluorescencyjnymi dotyczącymi wyników testu." src="/files/ftp_upload/3547/3547fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Nieważny wynik testu, tj. nie można określić obecności lub braku MTB: SPC nie spełnia kryteriów akceptacji, ponieważ próbka nie została prawidłowo przetworzona lub proces PCR został zahamowany. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę</a>.

<ol><li>Sudre, P., Dam, ten, Chan, G., C,, Kochi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis+in+the+present+time%3A+a+global+overview+of+the+tuberculosis+situation%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organisation+Document+WHO%2FTUB%2F91%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis in the present time: a global overview of the tuberculosis situation.</a> World Health Organisation Document WHO/TUB/91. 158, 1-47 (1991).</li>
<li>World Health Organisation. Global tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+report+2010%22">WHO report 2010</a>. , (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+global+plan+to+stop+TB%2C+2006-2015%22">The global plan to stop TB, 2006-2015</a>. , World Health Organization. Geneva. (2006).</li>
<li>Morris, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+multiple+drug+resistance+in+clinical+isolates+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of multiple drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Infect. Dis. 171, 954-960 (1995).</li>
<li>Traore, H., Fissette, K., Bastian, I., Devleeschouwer, M., Portaels, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+rifampicin+resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis+isolates+from+diverse+countries+by+a+commercial+line+probe+assay+as+aninitial+indicator+of+multidrug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Tuberc.+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">Detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from diverse countries by a commercial line probe assay as aninitial indicator of multidrug resistance.</a> Int. J. Tuberc. Lung Dis. 4, 481-484 (2000).</li>
<li>Helb, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+Rifampin+Resistance+by+Use+of+On-Demand+Near-Patient+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and Rifampin Resistance by Use of On-Demand Near-Patient Technology.</a> J. Clin. Microbiol. 48, 229-237 (2010).</li>
<li>Blakemore, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Analytical+Performance+of+the+Xpert+MTB%2FRIF%5BTitle%5D)+AND+%22Assay.+J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Analytical Performance of the Xpert MTB/RIF.</a> Assay. J. Clin. Microbiol. 48, 2495-2501 (2010).</li>
<li>Telenti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+rifampicin-resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Detection of rifampicin-resistance in Mycobacterium tuberculosis.</a> Lancet. 341, 647-650 (1993).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22GeneXpert+Dx+System+Operator+Manual%22">GeneXpert Dx System Operator Manual</a>. , Cepheid Inc. Sunnyvale, CA, USA. (2011).</li>
<li>Foundation for new innovative diagnostics [Internet]. , Geneva, Switzerland. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.finddiagnostics.org/about/what_we_do/successes/find-negotiated-prices/xpert_mtb_rif.html">http://www.finddiagnostics.org/about/what_we_do/successes/find-negotiated-prices/xpert_mtb_rif.html</a> (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22International+Standards+for+Tuberculosis+Care+%28ISTC%29%22">International Standards for Tuberculosis Care (ISTC)</a>. , Tuberculosis Coalition for Technical Assistance. The Hague. (2009).</li>
<li>Boehme, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Molecular+Detection+of+Tuberculosis+and+Rifampin+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid Molecular Detection of Tuberculosis and Rifampin Resistance.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).</li>
<li>Marlowe, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Cepheid+Xpert+MTB%2FRIF+assay+for+the+Direct+Detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+Complex+from+Respiratory+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Cepheid Xpert MTB/RIF assay for the Direct Detection of Mycobacterium tuberculosis Complex from Respiratory Specimens.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 1621-1623 (2011).</li>
<li>El-Hajj, H. H., Marras, S. A. M., Tyagi, S., Kramer, F. R., Alland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+rifampin+resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis+in+a+single+tube+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis in a single tube with molecular beacons.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 4131-4137 (2001).</li>
<li>Hillemann, D., Ruesch-Gerdes, S., Boehme, C., Richter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+molecular+detection+of+extrapulmonary+tuberculosis+by+automated+GeneXpert+MTB%2FRIF+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid molecular detection of extrapulmonary tuberculosis by automated GeneXpert MTB/RIF system.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 1202-1205 (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Test Xpert MTB/RIF integruje dekontaminację próbki, bezobsługową pracę, wbudowane przetwarzanie próbek oraz ultrasensytywną hemi-zagnieżdżoną PCR do jednoczesnego wykrywania MTB i oporności na RIF, zarówno w odkrztuszonej plwocinie, jak i w zagęszczonych osadach, w jednym, łatwym w obsłudze systemie. Wykazano, że analityczna granica wykrywalności testu wynosi 131 CFU/ml plwociny.6 Log-liniowa zależność między wartościami Ct a liczbą obecnych komórek MTB utrzymuje się w zakresie od 102 do 107 CFU/ml plwociny. Ponieważ wszystkie klinicznie istotne stężenia MTB mieszczą się w zakresie liniowym testu, umożliwia on półilościową ocenę obciążenia bakteryjnego.7 Test wymaga jedynie umiarkowanej infrastruktury laboratoryjnej i przeszkolenia. Granica wykrywalności jest co najmniej o dwa rzędy wielkości niższa niż w przypadku konwencjonalnej mikroskopii.6 Specyficzność jest doskonała. Co więcej, jednoczesne wykrywanie MTB opornego na RIF stanowi istotną korzyść w ramach testów w punkcie opieki nad pacjentem w erze gruźlic lekoopornych.3
Do tej pory dostępne są jedynie ograniczone opublikowane dane dotyczące wydajności tego testu w diagnostyce gruźlicy płuc w warunkach klinicznych.12; 13 Ogólna czułość kliniczna testu Xpert MTB/RIF w wykrywaniu MTB w plwocinie pacjentów z podejrzeniem gruźlicy płuc wyniosła 97,6% w porównaniu do metody hodowli jako referencyjnej. Były to wyniki prospektywnego badania wieloośrodkowego, w którym uczestniczyło pięć ośrodków (Lima, Peru; Baku, Azerbejdżan; Kapsztad i Durban, RPA; Bombaj, Indie) i łącznie 1462 pacjentów. Ogólne prawdopodobieństwo przedtestowe wystąpienia gruźlicy potwierdzonej hodowlą w badanej populacji wyniosło 50,7%. Czułość wyniosła 99,8% dla przypadków dodatnich w badaniu mikroskopowym i hodowli oraz 90,2% dla przypadków ujemnych w badaniu mikroskopowym, a dodatnich w hodowli. Wśród pacjentów z HIV z gruźlicą płuc czułość testu MTB/RIF wyniosła 93,9%, w porównaniu do 98,4% u pacjentów HIV-ujemnych.12 W warunkach niskiej zapadalności na gruźlicę ogólna zgodność w wykrywaniu MTB wyniosła 89% w porównaniu do hodowli; czułość wyniosła odpowiednio 98% dla próbek dodatnich w badaniu mikroskopowym i 72% dla próbek ujemnych w badaniu mikroskopowym, natomiast swoistość była doskonała.13 Nie stwierdzono istotnej różnicy w czułości pomiędzy testami przeprowadzonymi na nieobrobionej plwocinie a tymi na osadach zagęszczonych.12 W tym samym badaniu test MTB/RIF prawidłowo wykrył oporność na RIF u 209 z 211 pacjentów (czułość 99,1%) oraz u wszystkich 506 pacjentów z wrażliwością na RIF (swoistość 100%), przy uwzględnieniu wyników sekwencjonowania.12 Autorzy stwierdzili, że wydajność zarówno w wykrywaniu przypadków, jak i w rozróżnianiu oporności na RIF była podobna we wszystkich ośrodkach, co sugeruje, że wyniki te są prawdopodobnie szeroko stosowalne.12 Ponadto, zagęszczone osady z innych próbek z dróg oddechowych niż plwocina, takich jak płukanie pęcherzykowo-oskrzelowe i wydzielina oskrzelowa, zostały przetestowane z porównywalną czułością i swoistością.13 Pojawiają się dane dotyczące wydajności testu przy diagnozowaniu gruźlicy pozapłucnej.15
Globalna kontrola gruźlicy pilnie wymaga skutecznych narzędzi umożliwiających szybką diagnostykę nowych przypadków TB oraz wykrywanie szczepów MTB opornych na RIF w powszechnie dostępnych punktach opieki nad pacjentem (point-of-care).3 Obecne metody amplifikacji kwasów nukleinowych stosowane do wykrywania MTB są złożone, pracochłonne i wymagające pod względem technicznym. Test Xpert MTB/RIF ma potencjał, aby wprowadzić do tych placówek zestandaryzowane, czułe i bardzo specyficzne testy diagnostyczne zarówno w kierunku TB, jak i lekooporności, pod warunkiem, że będzie je stać na ich zakup. Aby ułatwić dostęp, fundacja Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND) wynegocjowała znaczne obniżki cen testu Xpert MTB/RIF. Aktualne ceny wynegocjowane przez FIND, wraz z listą krajów uprawnionych do zniżek, są dostępne w sieci.10

<table><tbody><tr><td>Test Xpert MTB/RIF</td><td>Cepheid</td><td>GXMTB/RIF-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>86.1172.001</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe, 15 ml, 120 x 17 mm, PS</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>62.553.542</td><td></td></tr></tbody></table>

diagnostyka gruźlicy płuc za pomocą testu xpert mtb/rif

Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test

Gruźlica (TB) wywoływana przez Mycobacterium tuberculosis (MTB) pozostaje poważnym problemem zdrowia publicznego: zakażenie dotyczy do jednej trzeciej populacji świata1, a każdego roku na gruźlicę umiera prawie dwa miliony osób.2 Powszechny dostęp do wysokiej jakości, zorientowanego na pacjenta leczenia dla wszystkich chorych na gruźlicę jest podkreślony w strategii Stop TB opracowanej przez WHO.3 Szybka detekcja MTB w próbkach z dróg oddechowych oraz terapia lekowa oparta na wiarygodnych wynikach testów oporności na leki są warunkiem wstępnym skutecznej realizacji tej strategii. Jednak w wielu regionach świata diagnostyka gruźlicy wciąż opiera się na mało czułych, słabo zestandaryzowanych metodach mikroskopii plwociny. Nieskuteczna detekcja TB oraz pojawianie się i transmisja szczepów MTB opornych na leki coraz bardziej zagrażają globalnym działaniom w zakresie kontroli gruźlicy.2
Skuteczna diagnostyka gruźlicy płuc wymaga dostępności — w skali globalnej — zestandaryzowanych, łatwych w użyciu i odpornych narzędzi diagnostycznych, które umożliwiałyby bezpośrednie wykrywanie zarówno kompleksu MTB, jak i oporności na kluczowe antybiotyki, takie jak ryfampicyna (RIF). Ten drugi wynik może służyć jako marker dla wielolekoopornych szczepów MTB (MDR TB) i odnotowano go w &gt; 95% izolatów MDR-TB.4, 5 Szybka dostępność wiarygodnych wyników testów prawdopodobnie przełoży się bezpośrednio na trafne decyzje dotyczące leczenia pacjentów, co w ostateczności pozwoli wyleczyć konkretnego pacjenta i przerwać łańcuch transmisji gruźlicy w populacji.2
Test Xpert MTB/RIF firmy Cepheid (Sunnyvale, CA, USA)6, 7 w wyjątkowy sposób spełnia opisane powyżej wymagania. Jest to test amplifikacji kwasów nukleinowych służący do 1) wykrywania DNA kompleksu MTB w plwocinach lub zagęszczonych osadach z plwocin oraz 2) wykrywania mutacji genu rpoB związanych z opornością na RIF.8 Został on zaprojektowany do użytku z systemem GeneXpert Dx firmy Cepheid, który integruje i automatyzuje przygotowanie próbki, amplifikację kwasów nukleinowych oraz detekcję sekwencji docelowych z wykorzystaniem real-time PCR i PCR z odwrotną transkrypcją. System składa się z urządzenia, komputera osobistego, skanera kodów kreskowych oraz wstępnie zainstalowanego oprogramowania do przeprowadzania testów i przeglądania wyników.9 Wykorzystuje on jednorazowe wkłady Xpert MTB/RIF, które zawierają odczynniki do PCR i w których zachodzi proces PCR. Ponieważ wkłady są zamknięte, eliminuje to ryzyko zanieczyszczeń krzyżowych między próbkami.6 Obecnie stosowane metody amplifikacji kwasów nukleinowych do wykrywania MTB są złożone, pracochłonne i wymagające technicznie. Test Xpert MTB/RIF ma potencjał, aby wprowadzić standaryzowane, czułe i bardzo specyficzne testy diagnostyczne zarówno w kierunku TB, jak i lekooporności, do powszechnie dostępnych punktów opieki pacjenta (point-of-care)3, pod warunkiem, że będzie ich stać na ich zakup. W celu ułatwienia dostępu, Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND) wynegocjowała znaczne obniżki cen. Aktualne ceny wynegocjowane przez FIND, wraz z listą krajów uprawnionych do zniżek, są dostępne w Internecie.10

Test Xpert MTB/RIF integruje dekontaminację próbki, obsługę bezdotykową, pokładowe przetwarzanie próbki oraz ultrasensytywną hemi-zagnieżdżoną reakcję PCR w celu jednoczesnego wykrywania Mycobacterium tuberculosis oraz oporności na ryfampicynę, zarówno w odkrztuszonej plwocinie, jak i w zagęszczonych osadach z plwociny, w czasie około dwóch godzin. Badanie jest zestandaryzowane i wymaga jedynie umiarkowanej infrastruktury laboratoryjnej oraz przeszkolenia.

Diagnostyka gruźlicy płuc za pomocą testu Xpert MTB/RIF

Gruźlica (TB) wywoływana przez Mycobacterium tuberculosis (MTB) pozostaje poważnym problemem zdrowia publicznego: zakażenie dotyczy do jednej trzeciej ludności świata ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest jednoczesne wykrycie w ciągu dwóch godzin prątków gruźlicy oraz oporności na ryfampicynę w wykrztuszanej plwocinie lub w zagęszczonych osadach z plwociny. Pracę należy rozpocząć od prostego, wysoce skutecznego protokołu dekontaminacji próbki. Następnie każdą przetworzoną próbkę przenosi się do jednorazowego wkładu expert M-T-B-R-I-F, który zawiera odczynniki do PCR i służy jako miejsce przeprowadzania procesu PCR.Wprowadź wkłady do systemu GeneXpert DX i uruchom ultra-czułą metodę HEMI nested PCR do jednoczesnego wykrywania mycobacterium tuberculosis oraz oporności na ryfampicynę. Na koniec odczytaj wyniki testu i przekaż je lekarzowi. Test Expert MTPR jest przeznaczony do stosowania z próbkami pobranymi od pacjentów, u których istnieje kliniczne podejrzenie gruźlicy płuc i którzy spełniają kryteria opisane w tekście towarzyszącym.Należy pamiętać, że metoda ta nie powinna być stosowana do monitorowania efektów terapii lekowej.Kryształ. Technik z mojego laboratorium zaprezentuje teraz protokół zgodnie ze standardem numer dwa międzynarodowych standardów opieki nad pacjentami z gruźlicą. Należy pobrać dwie próbki do badania bakteriologicznego od każdego pacjenta z podejrzeniem gruźlicy płuc.Przeznacz jeden moduł systemu GeneXpert DX dla każdej próbki testowej, etykietując każdy kartridż identyfikatorem próbki. Następnie, dla każdego badania próbki, przenieś 1 mL plwociny do 15 ml stożkowej probówki z nakrętką za pomocą kolejnej sterylnej pipety transferowej. Dodaj 2 ml odczynnika do próbek M-T-B-R-I-F.Mocno zakręć nakrętkę. Wstrząśnij probówką od 10 do 20 razy. Następnie pozostaw probówkę w pozycji pionowej przez pięć minut w temperaturze pokojowej po intensywnym wstrząśnięciu.Ponownie doprowadzić do stanu równowagi w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Sprawdzić, czy wszystkie próbki są rozrzedzone i nie zawierają widocznych grudek plwociny. Najpierw opisać wkłady identyfikatorem każdej próbki osadu z plwociny; do każdej próbki osadu dodać 1,5 ml odczynnika do próbek M-T-B-R-I-F, a następnie przenieść 0,5 ml do 15 ml konicznej probówki z nakrętką. Zamknąć pokrywkę, mieszać w wortexie przez 30 sekund i pozostawić probówkę w pozycji pionowej na pięć minut po drugiej sekundzie.Pomieszać za pomocą wibratora vortex i pozostawić probówki w pozycji pionowej na 10 minut. Sprawdzić upłynnione próbki, aby upewnić się, że nie zawierają one grudek plwociny. Dopasować etykiety na probówkach do odpowiednich kaset.Nie otwierać wkładziny do momentu rozpoczęcia testowania; należy zużyć wkładzinę w ciągu 30 minut od otwarcia jej pokrywy. Za pomocą sterylnej pipety transferowej należy pobrać upłynnioną próbkę, aż menisk znajdzie się powyżej linii minimum. Powoli wprowadzić próbkę do wkładziny.Zamknij pokrywę kartridża. Rozpocznij test w ciągu 30 minut od dodania próbki do kartridża. W pierwszej kolejności włącz komputer, a następnie urządzenie znajdujące się na blacie.Kliknij dwukrotnie ikonę gene expert DX. Zaloguj się do oprogramowania systemowego. Wybierz opcję create test, aby otworzyć okno dialogowe skanowania kodu kreskowego kartridża.Następnie wpisz identyfikator próbki i zeskanuj kod kreskowy na kartridżu. Po pojawieniu się okna tworzenia testu kliknij start test i wprowadź hasło w polu dialogowym. Teraz otwórz drzwiczki modułu instrumentu i umieść w nim kartridż.Zamknij drzwi, aby rozpocząć test. Gdy zielone światło zgaśnie, test zostanie zakończony. Po zwolnieniu blokady drzwi przez system otwórz drzwi modułu i wyjmij kasetę.Na koniec zutylizuj zużyte wkłady w odpowiednich pojemnikach na odpady. Każdy wkład testowy zawiera odczynniki do qPCR w kierunku oporności kompleksu Mycobacterium tuberculosis na ryfampicynę oraz odpowiednie kontrole eksperymentalne. Kontrola sprawdzenia sondy weryfikuje rehydratację odczynników, napełnienie probówki PCR we wkładzie, integralność sondy oraz stabilność barwnika.Krzywa przetwarzania próbek służy jako kontrola pozytywna prawidłowego przetworzenia docelowych bakterii, a także wskazuje na obecność ewentualnych inhibitorów PCR. Primery zostały zaprojektowane tak, aby odróżnić konserwowaną sekwencję typu dzikiego od mutacji w regionie rdzeniowym genu RPOB związanych z opornością na RIF. Wartości CT są odwrotnie proporcjonalne do stężenia docelowego matrycowego M-T-B-D-N-A w badanej próbce.Okno dialogowe z wynikiem testu stwierdza, że w próbce pacjenta wykryto docelowe DNA MTB, a oporność na RIF nie została wykryta. Docelowe DNA MTB jest wykrywane na niskim poziomie z przesłankami o oporności na ryfampicynę. Obie kontrole, SPC i PCC, spełniają przypisane kryteria akceptacji.Wynik tego testu uznaje się za nieważny, ponieważ SPC jest ujemny, a produkty PCR nie wystąpiły. Oznacza to, że próbka nie została prawidłowo przetworzona lub nastąpiło zahamowanie reakcji PCR. Należy powtórzyć badanie.Jak pokazano w materiale wideo, test ten jest zestandaryzowany i wymaga jedynie umiarkowanej infrastruktury laboratoryjnej oraz szkolenia. W związku z tym uważam, że ekspercki test M-T-B-R-F ma potencjał, aby zapewnić zestandaryzowaną, czułą i bardzo specyficzną diagnostykę zarówno gruźlicy, jak i oporności na ryfampicynę w powszechnych punktach opieki zdrowotnej (point of care).

diagnosing-pulmonary-tuberculosis-with-the-xpert-mtbrif-test

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Diagnozowanie gruźlicy płuc za pomocą testu Xpert MTB/RIF

Test wrażliwości na leki metodą obserwacji mikroskopowej (MODS) jest tanim i niedostępnym technologicznie narzędziem do wysokowydajnego wykrywania gruźlicy (TB) oraz gruźlicy wielkoopornej (MDRTB). Niniejszy film opisuje metodę hodowli MODS w pożywkach płynnych.

Metoda MODS w diagnostyce gruźlicy oraz gruźlicy wielolekoopornej

Badanie wrażliwości Mycobacterium tuberculosis na środki przeciwdrobnoustrojowe jest trudne, lecz kluczowe dla opieki nad pacjentem. Ten format z użyciem płytek mikrotytrujących umożliwia przetestowanie 12 leków przeciwprątkowych i pozwala wyznaczyć wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC), co pomoże w doborze odpowiedniego leczenia.

Badanie wrażliwości kompleksu Mycobacterium tuberculosis na leki pierwszego i drugiego rzutu metodą rozcieńczeń w bulionie z wykorzystaniem płytek mikrotitracyjnych

Ten film demonstruje technikę wykrywania gruźlicy pozapłucnej. Superparamagnetyczne nanosondy tlenku żelaza (SPIO), sprzężone z przeciwciałami specyficznymi dla Mycobacterium, są wstrzykiwane myszy wcześniej zakażonej Mycobacterium bovis BCG, znakując ziarniniaka i zapewniając lepszy kontrast obrazowania w celu jego wykrycia.

Technika wykrywania gruźlicy pozapłucnej za pomocą nanosond superparamagnetycznych

Mikromacierz amplifikacyjna łączy asymetryczną amplifikację PCR i hybrydyzację mikromacierzy w jednej komorze, co znacznie usprawnia pracę z mikromacierzą dla użytkownika końcowego. Uproszczenie przepływu pracy z mikromacierzami jest niezbędnym pierwszym krokiem do stworzenia diagnostyki opartej na mikromacierzach, która może być rutynowo używana w środowiskach o niższych zasobach.

Demonstracja wielolekoopornej mikromacierzy amplifikacyjnej Mycobacterium tuberculosis

Aby ulepszyć serologiczne testy diagnostyczne dla antygenów Mycobacterium tuberculosis, opracowaliśmy superparamagnetyczne nanosondy tlenku żelaza do wykrywania gruźlicy pozapłucnej.

Synteza, charakterystyka i zastosowanie superparamagnetycznych nanosond tlenku żelaza do wykrywania gruźlicy pozapłucnej

Opisujemy test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy przeprowadzony po inaktywacji termicznej plwociny. Inaktywacja termiczna sprawia, że próbki plwociny stają się niezakaźne i eliminuje potrzebę stosowania laboratoriów o poziomie 3 hermetyczności do testów molekularnych na gruźlicę.

Test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy (TB-MBLA)

Przedstawiamy zoptymalizowaną metodę ekstrakcji DNA z odkażonej plwociny przy użyciu metody ekstrakcji opartej na matrycy w połączeniu z oczyszczaniem kulek magnetycznych w celu dalszego ukierunkowanego sekwencjonowania Mycobacterium tuberculosis.

Ekstrakcja DNA oparta na matrycy do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji na odkażonych próbkach plwociny

Mycobacterium tuberculosis tworzy lekooporne biofilmy podczas hodowli w określonych warunkach. W niniejszej pracy opisujemy metody hodowli biofilmów M. tuberculosis oraz określania częstotliwości występowania lekoopornych form przetrwalnikowych (persisterów). Protokoły te będą przydatne w dalszych badaniach nad mechanizmami tolerancji leków u M. tuberculosis.

Wzrost biofilmu Mycobacterium tuberculosis

Specyficzny i szybki protokół do jednoczesnego badania funkcji prawego serca, zapalenia płuc i odpowiedzi immunologicznej jest opisany jako narzędzie do nauki.  Filmy i rysunki opisują fizjologię i techniki mikrodysekcji w zorganizowanym podejściu zespołowym, które można dostosować do stosowania w małych i dużych badaniach.

Pomiary ciśnienia skurczowego prawej komory w połączeniu z pobieraniem próbek płuc i tkanek immunologicznych u myszy

Gruźlica i malaria to dwie z najbardziej rozpowszechnionych infekcji u ludzi oraz główne przyczyny zachorowalności i śmiertelności w zubożałych populacjach w tropikach. Stworzyliśmy eksperymentalny system modelowy do badania wyników koinfekcji malarią i gruźlicą u myszy po prowokacji obydwoma patogenami za pośrednictwem ich naturalnej drogi zakażenia.

Model eksperymentalny do badania koinfekcji gruźlicą i malarią po naturalnym przenoszeniu Mycobacterium tuberculosis i Plasmodium berghei

Poznaj szybką diagnostykę gruźlicy płuc i oporności na ryfampicynę za pomocą testu Xpert MTB/RIF. Ta metoda PCR wykrywa Mycobacterium tuberculosis w próbkach plwociny w ciągu dwóch godzin.

Diagnostyka gruźlicy płuc za pomocą testu Xpert MTB/RIF

Przeglądaj więcej filmów