Name: VisioTracker, innowacyjne, zautomatyzowane podejście do analizy okulomotorycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną analizę okulomotoryczną w larwach i dorosłych rybach Danio rerio za pomocą systemu VisioTracker. Ta metoda umożliwia badanie funkcji układu wzrokowego, farmakologii i obwodów nerwowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

KPM otrzymał wsparcie z programu EU FP7 (RETICIRC).

1. Hodowla ryb
Zarodki przechowywano i hodowano w standardowych warunkach (Brand 2002), a ich stopień rozwoju określano na podstawie liczby dni po zapłodnieniu (dpf). Do pomiarów wykorzystano osobniki dorosłe oraz larwy w 5. dniu po zapłodnieniu (5 dpf).
2. Procedura eksperymentalna
<ol>
	<li>Przygotowanie instrumentu</li>
</ol>
Larwy: Larwy ryb zatopiono w 3% uprzednio ogrzanej (28°C) metylocelulozie, aby zapobiec ruchom ciała. Embriony umieszczono w urządzeniu VisioTracker stroną grzbietową do góry, przodem do ekranu projekcyjnego. Ryby dorosłe: Ryby krótko znieczulono w roztworze MS-222 o stężeniu 300 mg/l, umieszczono w urządzeniu unieruchamiającym, a następnie w VisioTrackerze. Przed rozpoczęciem pomiarów pozostawiono je na 1-2 min w celu dojścia do siebie.
<ol start="2">
	<li>Generowanie wzorców stymulacji</li>
</ol>
Wzory bodźców składające się z pionowych czarno-białych kratownic sinusoidalnych obracających się wokół ryby zostały utworzone przy użyciu autorskiego pakietu oprogramowania. Mogły być one modulowane za pomocą tego oprogramowania pod kątem kształtu fali, kontrastu, intensywności, prędkości kątowej oraz częstotliwości przestrzennej. Wzory były rzutowane na ekran za pomocą cyfrowego projektora światła zawartego w systemie VisioTracker. Przybliżona odległość między okiem ryby a ekranem wynosiła 4,5 cm, a rozmiar projekcji na ekranie wynosił 360 deg w poziomie i 55 deg w pionie. W przypadku larw ryb kierunek stymulacji zmieniano z częstotliwością 0,33 Hz, aby zmniejszyć częstotliwość sakad. Ryby dorosłe stymulowano jednokierunkowo i brano pod uwagę tylko oko stymulowane w kierunku skroniowo-nosowym, ponieważ prędkość oka w kierunku nosowo-skroniowym jest zazwyczaj znacznie niższa i mniej stała (patrz: Mueller i Neuhauss, 2010).
<ol start="3">
	<li>Rejestracja ruchów gałek ocznych</li>
</ol>
Obraz głowy ryby w polu jasnym był przesyłany do kamery wideo w podczerwieni. Oświetlenie ryb podczerwienią realizowano od dołu. Kamera rejestrowała obrazy z częstotliwością odpowiednio 5 klatek/sekundę (larwy) lub 12,5 klatek/sekundę (dorosłe osobniki). Obrazy są automatycznie przetwarzane, korygowane i wygładzane pod kątem kształtu oka. Następnie orientacja oka w stosunku do osi poziomej była wyznaczana automatycznie, a prędkość ruchu oka obliczana przez autorski pakiet oprogramowania. Niewielkie ruchy ryb były automatycznie korygowane przez oprogramowanie. Cały proces rejestracji i analizy odbywał się w czasie rzeczywistym.
3. Przetwarzanie danych poeksperymentalnych
<ol>
	<li>Surowe pomiary prędkości ruchu oczu zostały przefiltrowane pod kątem sakad w celu wyodrębnienia prędkości fazy wolnej.</li>
	<li>Krzywe prędkości ruchu oczu po filtracji sakad zostały wygładzone za pomocą średniej kroczącej z oknem przesuwnym o szerokości 7 klatek.</li>
	<li>Prędkość ruchu oczu została uśredniona dla klatek o identycznych warunkach stymulacji.</li>
	<li>W przypadku larw ryb prędkość ruchu oczu została uśredniona dla obu oczu.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Aby ocenić możliwości systemu VisioTracker w odniesieniu do larw i dorosłych ryb, przeprowadzono doświadczenia z larwami zebrafish w 5 dpf oraz z dorosłymi osobnikami zebrafish.
W przypadku larw danio pręgowanego wybrano mutant bumper. U tego mutanta komórki nabłonka soczewki ulegają hiperproliferacji, co prowadzi do zmniejszenia rozmiaru soczewki i jej ektopowego położenia. Zmiany morfologiczne te przekładają się na znaczną redukcję czułości kontrastowej oraz ostrości wzroku (Schonthaler et al., 2010). Rycina 1 przedstawia różnicę w czułości kontrastowej mutantów bumper w porównaniu z rodzeństwem typu dzikiego. Mutanty bumper w coraz większym stopniu nie potrafią dostosować prędkości ruchu oka wraz ze spadkiem kontrastu bodźca. Analogicznie, przy zwiększeniu częstotliwości przestrzennej bodźca, tzn. zmniejszeniu szerokości pasków bodźca, mutanty bumper wykazują również obniżoną ostrość wzroku (Ryc. 2)
Zależność wydajności wizualnej dorosłych danio pręgowanych od warunków środowiskowych zbadano poprzez poddanie ryb działaniu różnych stężeń alkoholu w wodzie w zbiorniku przez 30 minut, a następnie pomiar odpowiedzi optokinetycznej w zmiennych warunkach stymulacji. Dorosłe danio pręgowane wykazują wyraźny spadek czułości kontrastowej przy utrzymywaniu ich w rosnących stężeniach alkoholu (Rys. 3). Podobny, zależny od dawki spadek całkowitej prędkości oka w szerokim zakresie częstotliwości przestrzennych można było zaobserwować, gdy ryby były poddawane działaniu rosnących stężeń alkoholu (Rys. 4). Ponadto traktowanie alkoholem w sposób zależny od dawki obniża sprawność okulomotoryczną w bardziej wymagających zadaniach, co zilustrowano zwiększonymi prędkościami stymulacji (Rys. 5).
<img alt="Wykres prędkości ruchu oka w funkcji kontrastu; wyniki eksperymentalne porównujące osobniki oznaczone jako bumper i rodzeństwo." src="/files/ftp_upload/3556/3556fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Prędkość ruchu oka larwy danio pręgowanego zależy od kontrastu bodźca. Przeanalizowano 10 mutantów bumper oraz 10 rodzeństwa typu dzikiego w 5 dpf przy różnych warunkach kontrastu pasów bodźca. Wykres przedstawia średnią prędkość ruchu oka ± 1 SEM.
<img alt="Wykres prędkości ruchu oka w funkcji częstotliwości przestrzennej; dane dla grupy bumper oraz rodzeństwa; badanie analizy behawioralnej." src="/files/ftp_upload/3556/3556fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Prędkość ruchu oka larw danio pręgowanego zależy od częstotliwości przestrzennej. 10 mutantów bumper oraz 10 rodzeństwa typu dzikiego poddano działaniu bodźców o różnej szerokości pasów w 5. dniu po zapłodnieniu (dpf) i przeanalizowano zgodnie z opisem. Wykres przedstawia średnią prędkość ruchu oka ± 1 SEM.
<img alt="Wykres czułości kontrastowej ruchów gałek ocznych, analiza wpływu etanolu na prędkość ruchu gałek ocznych, wykres danych." src="/files/ftp_upload/3556/3556fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Dorosłe danio pręgowane wykazują zależny od stężenia alkoholu spadek czułości kontrastowej. Dorosłe danio pręgowane utrzymywano przez 30 minut w różnych stężeniach alkoholu, zgodnie z oznaczeniem, a następnie analizowano w różnych warunkach kontrastu pasów bodźca. Wykres przedstawia średnią prędkość ruchu gałek ocznych w kierunku od skroni do nosa ± 1 SEM dla 9 ryb w grupie (z wyjątkiem grupy kontrolnej: n=11).
<img alt="Wykres prędkości ruchu oka w funkcji częstotliwości przestrzennej; stężenie EtOH; wyniki badania wzroku; analiza danych." src="/files/ftp_upload/3556/3556fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Dorosłe danio pręgowane wykazują zależną od stężenia alkoholu redukcję całkowitego ruchu oka w szerokim zakresie szerokości pasów bodźca. Dorosłe danio pręgowane utrzymywano przez 30 minut w różnych stężeniach alkoholu, zgodnie z oznaczeniem, a następnie analizowano w warunkach różnej szerokości pasów bodźca. Wykres przedstawia średnią prędkość ruchu oka w kierunku od skroni do nosa ± 1 SEM dla 9 ryb na grupę (z wyjątkiem grupy kontrolnej: n=11).
<img alt="Przyspieszenie kątowe a prędkość ruchu oka; wykres liniowy; wpływ etanolu na reakcję oczną." src="/files/ftp_upload/3556/3556fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Dorosłe danio pręgowane wykazują zależną od stężenia alkoholu redukcję całkowitego ruchu oka w szerokim zakresie prędkości bodźca. Dorosłe danio pręgowane utrzymywano przez 30 minut w różnych stężeniach alkoholu, zgodnie z oznaczeniem, a następnie analizowano przy różnych prędkościach bodźców. Wykres przedstawia średnią prędkość ruchu oka w kierunku od skroni do nosa ± 1 SEM dla 9 ryb na grupę (z wyjątkiem grupy kontrolnej: n=11).

<ol><li>Bahadori, R., Rinner, O., Schonthaler, H. B., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. V., Paris, R., Jagadeeswaran, P., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fade+out+mutant+is+a+novel+genetic+model+for+Hermansky-Pudlak+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Optical+and+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">The fade out mutant is a novel genetic model for Hermansky-Pudlak syndrome.</a> Investigative Optical and Visual Sciences. 47, 4523-4531 (2006).</li>
<li>Beck, J. C., Gilland, E., Baker, R., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instrumentation+for+measuring+oculomotor+performance+and+plasticity+in+larval+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Instrumentation for measuring oculomotor performance and plasticity in larval organisms.</a> Methods in Cell Biol. 76, 383-411 (2004).</li>
<li>Brand, M. G. M., Nüsslein-Vollhard, C. Keeping and raising Zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+MGM+%22Zebrafish%2C+Practical+Approach+Series%22">Zebrafish, Practical Approach Series</a>. Nüsslein-Vollhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).</li>
<li>Easter, S. S., Nicola, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+vision+in+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The development of vision in the zebrafish (Danio rerio).</a> Dev. Biol. 180, 646-663 (1996).</li>
<li>Easter, S. S., Nicola, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+eye+movements+in+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Psychobiol%22%5BJournal%5D)">The development of eye movements in the zebrafish (Danio rerio).</a> Dev. Psychobiol. 31, 267-276 (1997).</li>
<li>Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+acuity+in+zebrafish%3A+behavior+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Zoology%22%5BJournal%5D)">Visual acuity in zebrafish: behavior and histology.</a> Frontiers in Zoology. 7, 8-8 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+optokinetic+response+in+zebrafish+and+its+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">The optokinetic response in zebrafish and its applications.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 1899-1916 (2008).</li>
<li>Major, G., Baker, R., Aksaya, E., Mensh, B., Seung, H. S., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+and+tuning+by+visual+feedback+of+the+stability+of+a+neural+integrator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Plasticity and tuning by visual feedback of the stability of a neural integrator.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 101, 7739-7744 (2004).</li>
<li>Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Measurements+of+the+optokinetic+response+in+adult+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Quantitative Measurements of the optokinetic response in adult fish.</a> J. Neurosci. Meth. 186, 29-34 (2010).</li>
<li>Neuhauss, S. C. F., Biehlmaier, O., Seeliger, M. W., Das, T., Kohler, K., Harris, W. A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+disorders+of+vision+revealed+by+a+behavioral+screen+of+400+essential+loci+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish.</a> J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).</li>
<li>Qian, H., Zhu, Y., Ramsey, D. J., Chappell, R. L., Dowling, J. E., Ripps, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+asymmetries+in+the+optokinetic+response+of+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Directional asymmetries in the optokinetic response of larval zebrafish.</a> Zebrafish. 2, 189-196 (2005).</li>
<li>Renninger, S. L., Gesemann, M., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+arrestin+confers+cone+vision+of+high+temporal+resolution+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cone arrestin confers cone vision of high temporal resolution in zebrafish larvae.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 658-667 (2011).</li>
<li>Rick, J. M., Horschke, I., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optokinetic+behavior+is+reversed+in+achiasmatic+mutant+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Optokinetic behavior is reversed in achiasmatic mutant zebrafish larvae.</a> Curr. Biol. 10, 595-598 (2000).</li>
<li>Rinner, O., Rick, J. M., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrast+sensitivity%2C+spatial+and+temporal+tuning+of+the+larval+zebrafish+optokinetic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Contrast sensitivity, spatial and temporal tuning of the larval zebrafish optokinetic response.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 137-142 Forthcoming.</li>
<li>Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O. S., Neuhauss, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cone+specific+kinase+GRK7+in+larval+zebrafish+leads+to+impaired+cone-response+recovery+and+delayed+dark+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cone specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone-response recovery and delayed dark adaptation.</a> Neuron. 47, 231-242 (2005).</li>
<li>Roeser, T., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visuomotor+behaviors+in+larval+zebrafish+after+GFP-guided+laser+ablation+of+the+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visuomotor behaviors in larval zebrafish after GFP-guided laser ablation of the optic tectum.</a> J. Neurosci. 23, 3726-3734 (2003).</li>
<li>Schonthaler, H., Fleisch, V. C., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. M., Rinner, O., Bahadori, R., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+mutant+leberkn+del%2Fvam6+resembles+human+multi-systemic+disorders+caused+by+aberrant+trafficking+of+endosomal+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish mutant leberkn del/vam6 resembles human multi-systemic disorders caused by aberrant trafficking of endosomal vesicles.</a> Development. 135, 387-399 (2008).</li>
<li>Schonthaler, H. B., Franz-Odendaal, T. A., Hodel, C., Gehring, I., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+mutant+bumper+shows+a+hyperproliferation+of+lens+epithelial+cells+and+fibre+cell+degeneration+leading+to+functional+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">The zebrafish mutant bumper shows a hyperproliferation of lens epithelial cells and fibre cell degeneration leading to functional blindness.</a> Mech. Dev. 127, 203-219 (2010).</li>
<li>Schonthaler, H. B., Lampert, J. M., Lintig, J. von, Schwarz, H., Geisler, R., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+the+pmel17+gene+leads+to+defects+in+melanosome+biogenesis+and+alterations+the+visual+system+in+the+zebrafish+mutant+fading+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A mutation in the pmel17 gene leads to defects in melanosome biogenesis and alterations the visual system in the zebrafish mutant fading vision.</a> Developmental Biology. 284, 231-242 (2005).</li>
</ol>

Oliver D.R. Schnaedelbach i Holger D. Russig są pracownikami firmy TSE Systems GmbH, która produkuje system śledzenia wydajności wizualnej wykorzystany w niniejszym artykule. Produkcja tego artykułu została sponsorowana przez TSE Systems GmbH. Stephan C.F. Neuhuass jest pracownikiem Uniwersytetu w Zurychu, który otrzymuje wynagrodzenie od TSE Systems za każdy sprzedany system.

Znaczenie OKR w badaniach nad funkcją wzrokową jest od dawna uznawane w społeczności naukowej (Easter &amp; Nicola 1996, 1997), a próby rzeczywistej kwantyfikacji tego paradygmatu rozpoczęły się ponad dekadę temu. Easter i Nicola (1996) opracowali system z zmotoryzowanymi, obracającymi się bębnami w paski, w którym zapis wideo ruchów gałki ocznej analizowano ręcznie. System ten był obarczony wadą w postaci braku unieruchomienia zarodka ryby, co wymagało częstego ręcznego repozycjonowania, a wykrywanie ruchów śledzących oczu było możliwe jedynie z dużym trudem. Krokiem naprzód było zastosowanie wideo-projektowanego bębna w paski, co umożliwiło prezentację bardziej zróżnicowanych bodźców generowanych komputerowo (Roeser &amp; Baier, 2003; Rinner et al., 2005a). 
Większościowo ręczna analiza nagrań wideo klatka po klatce okazała się niezwykle pracochłonna i w pewnym stopniu obciążona błędem obserwatora (Beck et al., 2004). Zaproponowano zautomatyzowaną analizę w czasie rzeczywistym, aby umożliwić wykorzystanie mechanizmów uczenia opartego na sprzężeniu zwrotnym z zachowaniem (Major et al., 2004). Zastosowanie oświetlenia podczerwonego oraz stymulacji rotacyjnej z kontrolowaną częstotliwością zostało zapoczątkowane przez Beck et al. (2004). Jednak system tam opisany był stosowany wyłącznie w przypadku larw, a analiza była przeprowadzana w trybie off-line. Co więcej, VisioTracker zapewnia pełną kontrolę nad bodźcami, w tym możliwość ich zmiany w trakcie eksperymentu, co pozwala na większą elastyczność i spontaniczny wpływ na przebieg doświadczenia. Ponadto cyfrowe tworzenie bodźców wykorzystywane przez VisioTracker rozwiązało wspomniane wcześniej problemy z przyspieszeniem masy bezwładnej prążkowanego bębna stymulującego (Beck et al., 2004).
Unieruchomienie larw za pomocą metylocelulozy nie zakłóca w znacznym stopniu ruchów gałek ocznych i nie wywiera żadnego długofalowego wpływu na dobrostan danio pręgowanych. Larwy ryb były z powodzeniem utrzymywane w zatopieniu w metylocelulozie przez kilka dni, aż do momentu, gdy podaż tlenu przez skórę stawała się niewystarczająca w stosunku do zapotrzebowania rosnącego wraz z wiekiem (Qian et al., 2005).
Metoda unieruchamiania dorosłych ryb jest równie łagodna dla zwierzęcia. Krótki czas trwania eksperymentu, w połączeniu z możliwością szybkiej wymiany zwierzęcia testowego na inne, dodatkowo wpływa na pozytywne aspekty dobrostanu zwierząt w tym systemie. Ponieważ skrzela są stale przepłukiwane wodą, wygodne jest dodawanie do wody dowolnej wybranej substancji chemicznej w celu zbadania jej wpływu na ruchy gałek ocznych i sprawność wzrokową. Podobnie można przeprowadzić eksperyment z wymywaniem (wash-out) bez konieczności manipulowania zwierzęciem pomiędzy badaniami.
Szum pikseli w obrazie wideo został zminimalizowany za pomocą algorytmów wygładzania w autorskim oprogramowaniu VisioTracker, co umożliwiło bardzo precyzyjne pomiary pozycji oka i prędkości kątowej. Ponadto, w celu ułatwienia analizy statystycznej, oprogramowanie odfiltrowało ruchy sakadowe, które występują ze stałą prędkością i nie wnoszą wkładu do tezy eksperymentalnej. Uśrednienie krzywych prędkości z 7 klatek wideo ułatwiło późniejszą analizę.
VisioTracker otwiera nowy wymiar dla wielu zróżnicowanych obszarów badawczych. System ten oraz jego poprzednicy zostały już z sukcesem wykorzystane do kwantyfikacji sprawności wzrokowej u larw danio pręgowanego, z wykorzystaniem parametrów takich jak ostrość wzroku, czułość kontrastowa i adaptacja do światła (Rinner et al., 2005a, Schonthaler et al., 2010), do analizy funkcjonalnej fotoreceptorów czopkowych po manipulacji elementami kaskady transdukcji wzrokowej (np. Rinner et al., 2005b, Renninger et al., 2011) oraz do analizy wad wzroku u mutantowych larw danio pręgowanego (np. Schonthaler et al., 2005, 2008; Bahadori et al., 2006). Współzależność między dojrzewaniem morfologicznym a funkcjonalnym systemu wzrokowego była badana za pomocą pomiarów OKR, co wykazało, że ostrość wzroku na etapach larwalnych jest ograniczona głównie, choć nie całkowicie, przez rozmieszczenie fotoreceptorów (Haug et al., 2010).
Urządzenie VisioTracker jest równie odpowiednie do analizy funkcji wzrokowych u dorosłych danio pręgowanych oraz innych gatunków ryb o podobnych rozmiarach (Mueller i Neuhauss (2010), niniejszy raport).
Możliwe jest również wykorzystanie tego systemu w obszarach badawczych takich jak toksykologia czy farmakologia, w których badane substancje mogą być dodawane do przepływu wody otaczającego skrzela dorosłych ryb. Ponadto wszechstronność systemu VisioTracker umożliwia przeprowadzenie bardziej szczegółowych analiz, na przykład ontogenezy funkcji wzrokowej, funkcjonowania i rozwoju obwodów neuronalnych lub kontroli sensorimotorycznej (patrz przegląd w Huang &amp; Neuhauss, 2008).

<table><tbody><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonian etylu 3-aminobenzojanu (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko do hodowli komórkowej 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta surowiczka</td><td>Greiner Bio-One</td><td>612 361</td><td></td></tr><tr><td>VisioTracker</td><td>TSE Systems</td><td>302060</td><td></td></tr></tbody></table>

visiotracker, innowacyjne zautomatyzowane podejście do analizy okulomotorycznej

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Badania nad rozwojem i funkcją układu wzrokowego wymagają mierzalnych modeli behawioralnych sprawności wzrokowej, które są łatwe do wywołania, stabilne i proste w manipulacji. Odpowiedni model znaleziono w odpowiedzi optokinetycznej (OKR), która jest zachowaniem refleksowym występującym u wszystkich kręgowców ze względu na wysoką wartość selekcyjną. OKR obejmuje powolne ruchy śledzące bodziec, przeplatane szybkimi sakkadami resetującymi. Pomiar tego zachowania jest łatwo przeprowadzalny u larw danio pręgowanego dzięki jego wczesnemu i stabilnemu pojawieniu się (pełny rozwój po 96 godzinach od zapłodnienia (hpf)) oraz dzięki gruntownej wiedzy na temat genetyki danio pręgowanego, który od dziesięcioleci jest jednym z preferowanych organizmów modelowych w tej dziedzinie. Jednocześnie analiza podobnych mechanizmów u dorosłych ryb zyskała na znaczeniu, szczególnie w zastosowaniach farmakologicznych i toksykologicznych.
W niniejszym opracowaniu opisujemy VisioTracker, w pełni zautomatyzowany system wysokoprzepustowy do ilościowej analizy wydajności wizualnej. System opiera się na badaniach przeprowadzonych w grupie prof. Stephana Neuhaussa i został przeprojektowany przez firmę TSE Systems. Składa się on z urządzenia immobilizującego małe ryby, monitorowane przez wysokiej jakości kamerę wideo wyposażoną w obiektyw zoom o wysokiej rozdzielczości. Pojemnik z rybą jest otoczony bębnowym ekranem, na który można projektować generowane komputerowo wzory stymulujące. Ruchy gałek ocznych są rejestrowane i automatycznie analizowane w czasie rzeczywistym przez pakiet oprogramowania VisioTracker.
Analiza danych umożliwia natychmiastowe określenie takich parametrów jak czas trwania fazy wolnej i szybkiej, częstotliwość cyklu ruchowego, wzmocnienie fazy wolnej, ostrość wzroku oraz czułość kontrastowa.
Typowe wyniki pozwalają na przykład na szybką identyfikację mutantów układu wzrokowego, które nie wykazują wyraźnych zmian w morfologii typu dzikiego, lub na określenie ilościowych efektów działania środków farmakologicznych, toksycznych i mutagennych na sprawność układu wzrokowego.

VisioTracker to zautomatyzowany system do ilościowej analizy sprawności wzrokowej larw i niewielkich osobników dorosłych ryb, oparty na rejestracji ruchów gałek ocznych. Charakteryzuje się on pełną kontrolą nad właściwościami bodźców wzrokowych oraz analizą w czasie rzeczywistym, co umożliwia prowadzenie wysokoprzepustowych badań w takich dziedzinach jak rozwój i funkcje układu wzrokowego, farmakologia, badania obwodów neuronalnych oraz integracja sensoromotoryczna.

VisioTracker, innowacyjne zautomatyzowane podejście do analizy okulomotorycznej

Badania nad rozwojem i funkcjonowaniem układu wzrokowego wymagają mierzalnych modeli behawioralnych sprawności wzrokowej, które są łatwe do wywołania, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest behawioralna ocena funkcji układu wzrokowego u larw i dorosłych danio pręgowanych, aby szybko zidentyfikować larwy mutantów z wadami układu wzrokowego lub porównać właściwości układu wzrokowego zwierząt typu dzikiego oraz mutantów lub zwierząt poddanych traktowaniu morfolino. Osiąga się to poprzez wstępne ograniczenie ruchów ciała zwierzęcia doświadczalnego. Larwy są osadzane w metylocelulozie, a dorosłe ryby są znieczulane i umieszczane w urządzeniu do unieruchomienia.Następnie unieruchomione zwierzę umieszcza się w urządzeniu Vizio tracker w centrum ekranu w kształcie bębna. Za pomocą cyfrowego projektora światła na wewnętrzną stronę ekranu projektowane są pionowe czarno-białe pasy. Pozycje oczu są następnie rejestrowane i analizowane automatycznie przez pakiet oprogramowania Vizio Tracker, który oblicza również prędkość ruchu oczu w czasie rzeczywistym.Ostatnim krokiem jest przetworzenie uzyskanych danych, powiązanie prędkości ruchu oczu z właściwościami bodźca wzrokowego oraz obliczenie średniej prędkości ruchu oczu i błędu standardowego dla każdego warunku eksperymentalnego. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat właściwości systemu wzrokowego larw i dorosłych osobników danio pręgowanego, można ją również zastosować do innych organizmów modelowych, takich jak medica, kpi oraz praktycznie każdy inny mały gatunek T. Pomysł na tę metodę pojawił się u mnie po raz pierwszy, gdy wykorzystaliśmy odpowiedź optokinetyczną do przesiewania larw roślin i szybko zainteresowaliśmy się danymi z larw, które nie były całkowicie ślepe, lecz raczej niedowidzące.Takie larwy Newtona potencjalnie wpływają na aspekty przetwarzania bodźców wzrokowych. System obejmuje urządzenie unieruchamiające małe ryby, umieszczone pod wysokiej jakości kamerą wideo wyposażoną w obiektyw z zoomem. Pojemnik z rybami otoczony jest ekranem bębnowym, na który projektowane są generowane komputerowo wzory stymulujące.Ruchy oczu są rejestrowane za pomocą kamery i automatycznie analizowane w czasie rzeczywistym przez pakiet oprogramowania Vizio Tracker. Aby zapobiec ruchom ciała podczas rejestracji, należy unieruchomić larwy ryb w piątym dniu po zapłodnieniu w 3% metylocelulozie podgrzanej do 28 °C. Ciepłą metylocelulozę wlewa się do 35 mm szalki hodowlanej, a następnie przenosi larwy za pomocą pipety seryjnej z dużym haczykiem.Wymieszaj larwy z metylocelulozą, a następnie za pomocą małej igły usuń pęcherzyki powietrza i odpowiednio ustaw larwę; w ten sposób do eksperymentów można jednocześnie przygotować do ośmiu larw. Po unieruchomieniu larw umieść szalkę hodowlaną w stojaku na osiem szalek. Następnie rozpocznij wyświetlanie pasów bodźca na otaczającym bębnie, aby unieruchomić dorosłe ryby.Najpierw krótko znieczul ryby w osobnym zbiorniku, stosując MS 222 w stężeniu 300 mg/L. Po znieczuleniu umieść rybę w urządzeniu do immobilizacji, delikatnie i odpowiednio zakleszczając jej ciało między dwiema gąbkami. Ograniczenie ruchów ciała dorosłych ryb jest najtrudniejszym etapem tej procedury.Aby ułatwić wprowadzenie do urządzenia immobilizującego, ustabilizuj gąbkę za pomocą dwóch plastikowych rurek kalibrowych. Po unieruchomieniu ryby umieść urządzenie w trackerze Vizio i pozwól rybie dojść do siebie przez jedną lub dwie minuty przed rozpoczęciem rejestracji. Aby dostarczyć bodziec wywołujący ruchy gałek ocznych, wyświetl na ekranie bębna wygenerowany programowo wzór bodźca składający się z pionowych czarno-białych gradientów fal sinusoidalnych.Używając cyfrowego projektora światła wbudowanego w tracker Vizio, oświetl rybę od dołu światłem podczerwonym, a następnie wykorzystaj pakiet oprogramowania do zapisu ruchów oczu w odpowiedzi na wzór bodźca. Larwalne mutanty bumper charakteryzują się zmniejszoną wielkością soczewki oraz jej ektopowym położeniem, a te zmiany morfologiczne przekładają się na znaczną redukcję czułości kontrastowej w porównaniu z typem dzikim. Jak pokazano tutaj, mutanty bumper w coraz większym stopniu nie są w stanie dostosować prędkości ruchu oka wraz ze spadkiem kontrastu bodźca.Dodatkowo, gdy częstotliwość przestrzenna bodźca zostaje zwiększona poprzez zmniejszenie jego szerokości, mutanty stripe bumper wykazują również obniżoną ostrość widzenia w porównaniu z rodzeństwem typu dzikiego. Dorosłe danio pręgowane typu dzikiego wykazują wyraźny spadek czułości kontrastowej po utrzymywaniu w rosnących stężeniach alkoholu przez 30 minut przed rejestracją. Podobny, zależny od dawki spadek całkowitej prędkości ruchu oka obserwuje się w szerokim zakresie częstotliwości przestrzennych, gdy ryby były poddawane działaniu rosnących stężeń alkoholu.Podanie alkoholu niezależnie od dawki obniża również sprawność okulomotoryczną podczas bardziej wymagających zadań, co pokazano tutaj w odpowiedzi na zwiększenie prędkości bodźców. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie badań nad wzrokiem do zgłębiania rozwoju i funkcji systemu wzrokowego u ryb danio-pręgowanych, złotych rybek i innych organizmów modelowych, z wykorzystaniem modeli genetycznych i farmakologicznych.

visiotracker-an-innovative-automated-approach-to-oculomotor-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

VisioTracker, innowacyjne zautomatyzowane podejście do analizy ruchów oczu

Kontrolę neuronalną oraz procesy poznawcze można badać poprzez ruchy gałek ocznych. Oprogramowanie VisualEyes umożliwia operatorowi niezależne programowanie bodźców na dwóch ekranach komputera przy użyciu prostego, niestandardowego języka skryptowego. System może stymulować tandemowe ruchy oczu (sakady i pościg płynny), ruchy przeciwstawne (wergencję) lub dowolną ich kombinację.

VisualEyes: modularny system oprogramowania do eksperymentów okulomotorycznych

Okulografia (eye tracking) od dawna jest wykorzystywana do badania wzorców spojrzenia u osób rozwijających się typowo, jednak ostatnie postępy technologiczne zwiększyły możliwość jej zastosowania w populacjach klinicznych, w tym u osób z autyzmem. Chociaż okulografia u małych dzieci z autyzmem może dostarczyć informacji o wczesnych manifestacjach objawów, wiąże się ona z wyzwaniami metodologicznymi. Przedstawiono sugestie dotyczące najlepszych praktyk.

Śledzenie ruchu gałek ocznych u małych dzieci z autyzmem

Opisano metodę ilościowego określania jakości przetwarzania informacji wizualnych na podstawie odruchowych ruchów gałek ocznych w odpowiedzi na określone modalności wizualne. Czasy reakcji i wyjściowe parametry fiksacji służą do charakteryzowania sprawności wzrokowej u dzieci z wadami wzroku i bez wad wzroku od 6 miesiąca życia.

Metoda ilościowego określania przetwarzania informacji wzrokowych u dzieci za pomocą śledzenia ruchu gałek ocznych

Niniejszy artykuł omawia metodologię śledzenia wzroku w badaniach nad rozumieniem języka. Aby uzyskać wiarygodne dane, należy postępować zgodnie z kluczowymi krokami protokołu. Należą do nich m.in. prawidłowa konfiguracja eye trackera (np. zapewniająca dobrą jakość obrazów oka i głowy) oraz dokładna kalibracja.

Śledzenie ruchu gałek ocznych podczas wizualnego rozumienia języka: elastyczność i ograniczenia w odkrywaniu wizualnych efektów kontekstowych

Metoda została zaprojektowana w celu zbadania roli hamowania powrotu (IOR) w regresyjnych ruchach gałek ocznych podczas czytania. Nacisk kładziony jest na rozróżnienie między regresjami wywołanymi w wyniku trudności ze zrozumieniem a tymi wywołanymi błędem okoruchowym, w tym na roli IOR w tych dwóch typach regresji.

Śledzenie ruchu gałek ocznych w celu rozróżnienia regresywnych ruchów gałek ocznych opartych na rozumieniu i okoruchowych podczas czytania

Korzystanie z czujników multimodalnych jest obiecującym sposobem na zrozumienie roli interakcji społecznych w środowisku edukacyjnym. W artykule opisano metodologię przechwytywania wspólnej uwagi wzrokowej z kolokowanych diad za pomocą mobilnych urządzeń śledzących ruch gałek ocznych.

Metodologia przechwytywania wspólnej uwagi wzrokowej za pomocą mobilnych urządzeń śledzących ruch gałek ocznych

VisualEyes2020 (VE2020) to niestandardowy język skryptowy, który prezentuje, rejestruje i synchronizuje bodźce wzrokowe ruchu gałek ocznych. VE2020 dostarcza bodźców do sprzężonych ruchów gałek ocznych (sakkady i płynny pościg), sprzężonych ruchów gałek ocznych (wergencja), akomodacji i kombinacji każdego z nich. Dwa programy analityczne ujednolicają przetwarzanie danych z systemów śledzenia ruchu gałek ocznych i rejestracji zakwaterowania.

Kwantyfikacja reakcji okoruchowych i akomodacji za pomocą oprzyrządowania i zestawów narzędzi do analizy

W tym artykule prezentujemy nowatorską, zautomatyzowaną metodę oceny ostrości wzroku u niemowląt i małych dzieci za pomocą systemu śledzenia wzroku.

Zautomatyzowana metoda oceny ostrości wzroku u niemowląt i małych dzieci za pomocą systemu śledzenia ruchu gałek ocznych

Opisujemy tutaj PyOKR, półautomatyczną metodę analizy ilościowej, która bezpośrednio mierzy ruchy gałek ocznych wynikające z wizualnych reakcji na dwuwymiarowy ruch obrazu. Interfejs użytkownika i algorytm analizy oparty na języku Python pozwalają na większą przepustowość i dokładniejsze pomiary ilościowe parametrów śledzenia ruchu gałek ocznych niż poprzednie metody.

PyOKR: Półautomatyczna metoda ilościowego określania zdolności śledzenia odruchów optokinetycznych

Metodologia badała wkład wzrokowy i przedsionkowy w stabilizację spojrzenia podczas rotacji optokinetycznej i całego ciała. Stymulacje przeprowadzono poprzez badania wzrokowe, przedsionkowe i wizuo-przedwostykowe. Wzmocnienie ruchu oczu skrętne i częstotliwości oczopląsów służyły jako wskaźniki podkorowego przekazywania informacji o ruchu specyficznym dla sensorycznych do odruchowej odpowiedzi pnia mózgu w każdym badaniu.

Wykorzystanie śledzenia oczu do oceny względnego znaczenia bodźców wzrokowych i przedsionkowych dla przetwarzania ruchu podkorowego w płaszczyźnie przechylania

Poznaj zautomatyzowaną analizę okulomotoryczną w larwach i dorosłych rybach Danio rerio za pomocą systemu VisioTracker. Ta metoda umożliwia badanie funkcji układu wzrokowego, farmakologii i obwodów nerwowych w czasie rzeczywistym.

VisioTracker, innowacyjne zautomatyzowane podejście do analizy okulomotorycznej

Przeglądaj więcej filmów