VisioTracker, innowacyjne, zautomatyzowane podejście do analizy okulomotorycznej

VisioTracker to zautomatyzowany system do ilościowej analizy wizualnej larw i małych dorosłych ryb na podstawie rejestracji ruchów gałek ocznych. Oferuje pełną kontrolę nad właściwościami bodźców wzrokowych i analizę w czasie rzeczywistym, umożliwiając wysokoprzepustowe badania w takich dziedzinach, jak rozwój i funkcjonowanie układu wzrokowego, farmakologia, badania obwodów nerwowych i integracja sensomotoryczna.

Ogólnym celem tej procedury jest behawioralna ocena funkcji układu wzrokowego u larw i dorosłych danio pręgowanych w celu szybkiej identyfikacji zmutowanych larw z wadami układu wzrokowego lub porównania właściwości układu wzrokowego zwierząt dzikich i zmutowanych lub morfologicznych. Osiąga się to poprzez pierwsze ograniczenie ruchów ciała zwierzęcia doświadczalnego. Larwy są zanurzane w metylocelulozie, a dorosłe ryby są znieczulane i umieszczane w urządzeniu unieruchamiającym.

Następne miejsce, ciało skrępowane zwierzę w trackerze Vizio pośrodku ekranu w kształcie bębna. Pionowe czarno-białe paski są wyświetlane na wewnętrznej stronie tego ekranu za pomocą cyfrowego projektora świetlnego. Pozycje oczu są następnie rejestrowane i analizowane automatycznie przez pakiet oprogramowania Vizio Tracker, który również oblicza prędkości oczu w czasie rzeczywistym.

Ostatnim krokiem jest przetworzenie uzyskanych danych, odniesienie prędkości gałek ocznych do właściwości bodźca wzrokowego oraz obliczenie średniej prędkości gałki ocznej i błędu standardowego dla każdego warunku eksperymentalnego. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w właściwości systemu wzrokowego larw i dorosłych ryb danio pręgowanego, może być również stosowana do innych organizmów modelowych, takich jak medica, kpi i praktycznie każdy inny mały gatunek T. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, kiedy wykorzystaliśmy reakcję kinetyczną optyki do badania przesiewowego larw roślin i szybko zainteresowałem się danymi dotyczącymi larw, nie całkowicie ślepych, ale raczej niedowidzących.

Takie larwy Newtona potencjalnie wpływają na aspekty przetwarzania wzrokowego. System zawiera urządzenie unieruchamiające dla małych ryb umieszczone pod wysokiej jakości kamerą wideo, wyposażoną w obiektyw zmiennoogniskowy. Pojemnik na ryby jest otoczony ekranem bębna, na który rzutowane są generowane komputerowo wzorce bodźców.

Ruchy gałek ocznych są rejestrowane za pomocą kamery i automatycznie analizowane przez pakiet oprogramowania Vizio Tracker w czasie rzeczywistym. Aby zapobiec ruchom ciała podczas nagrywania, larwy ryb należy umieścić pięć dni po zapłodnieniu w 3% metylocelulozie, która została podgrzana do 28 stopni Celsjusza. Wlej ciepłą metylocelulozę do 35-milimetrowego naczynia do hodowli komórek, a następnie przenieś larwy za pomocą pipety do surowicy z dużym hakiem.

Wymieszaj larwy z metylocelulozą, a następnie użyj małej igły, aby usunąć pęcherzyki powietrza i ustawić larwę, do których można przygotować do eksperymentów jednocześnie do ośmiu larw. Po unieruchomieniu larw umieść naczynie do hodowli komórkowych w stojaku na osiem szalek. Następnie zacznij rzutować paski bodźca na otaczający bęben, aby unieruchomić dorosłe ryby.

Najpierw krótko znieczul je 300 miligramami na litr MS 2 22 w osobnym zbiorniku. Po znieczuleniu dopasuj rybę do urządzenia mobilizacyjnego, delikatnie zaciskając ciało ryby między dwoma kawałkami gąbki. Ograniczanie ruchów ciała dorosłych ryb jest najtrudniejszym etapem tej procedury.

Aby ułatwić włożenie do urządzenia unieruchamiającego, należy ustabilizować gąbkę za pomocą dwóch plastikowych rurek łydowych. Gdy ryba zostanie unieruchomiona, umieść urządzenie w trackerze Vizio i pozwól rybie dojść do siebie przez jedną do dwóch minut przed nagraniem. Aby zapewnić bodziec do projektu ruchu gałek ocznych, wygenerowano programowo wzorzec bodźca składający się z pionowych czarno-białych gradacji fal sinusoidalnych na ekranie bębna.

Korzystając z cyfrowego projektora światła zawartego w trackerze Vizio, oświetl rybę od dołu światłem podczerwonym, a następnie użyj pakietu oprogramowania do rejestrowania ruchów gałek ocznych w odpowiedzi na wzorzec bodźca. Mutanty zderzaków larwalnych mają zmniejszony rozmiar soczewki i ektopowe umiejscowienie soczewki, a te zmiany morfologiczne znajdują odzwierciedlenie w znacznym zmniejszeniu wrażliwości na kontrast w porównaniu z typem dzikim. Jak pokazano tutaj, mutanty zderzakowe coraz częściej nie dostosowują prędkości gałek ocznych wraz ze spadkiem kontrastu bodźca.

Dodatkowo, gdy częstotliwość przestrzenna bodźca jest zwiększana poprzez zmniejszanie szerokości bodźca, mutanty zderzaków pasiastych wykazują również obniżoną ostrość wzroku w porównaniu z rodzeństwem typu dzikiego. Dorosłe rybki pręgowane typu dzikiego wykazują wyraźne zmniejszenie wrażliwości na kontrast, gdy są utrzymywane w rosnącym stężeniu alkoholu przez 30 minut przed nagraniem. Podobne, zależne od dawki zmniejszenie ogólnej prędkości gałki ocznej obserwuje się w ogólnym szerokim zakresie częstotliwości przestrzennych, gdy ryby były traktowane zwiększonym stężeniem alkoholu.

Leczenie alkoholem również niezależnie od dawki zmniejsza sprawność oczną motoryczną przy bardziej wymagających zadaniach, jak pokazano tutaj w odpowiedzi na zwiększoną prędkość bodźca Po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad wzrokiem do zbadania rozwoju i funkcji układu wzrokowego u ryb Sbra, medycznych złotych rybek i innych organizmów modelowych przy użyciu zarówno modeli genetycznych, jak i farmakologicznych.