Zmodyfikowany system dwuhybrydowy drożdżowy do identyfikacji białek oddziałujących z czynnikiem wzrostu progranuliną

Ten system MY two H stanowi ulepszenie konwencjonalnego protokołu dwuhybrydowego z użyciem drożdży, co pozwala na znaczne zmniejszenie liczby wyników fałszywie dodatnich. Najpierw należy przeprowadzić transformację plazmidu przynęty do drożdży w małej skali. Po zwalidowaniu konstruktu przynęty za pomocą przesiewu z zastosowaniem inhibitora konkurencyjnego, należy przesiać bibliotekę cDNA na płytkach z czterema brakami (minus four).

Następnie należy zweryfikować klony dodatnie za pomocą testów XGL i testów reakcji. Następnie należy zidentyfikować potencjalne białka oddziałujące poprzez sekwencjonowanie DNA i analizę bioinformatyczną. W rezultacie ten zmodyfikowany system drożdżowego dwuetapowego hybrydowego zwiększa znacząco skuteczność i powodzenie procesu przesiewowego.

Konwencjonalny system dwuhybrydowy drożdżowy jest znany z generowania wyników fałszywie dodatnich. W niniejszym materiale przedstawiono zmodyfikowaną procedurę przesiewową, która znacząco poprawia wykrywalność interakcji dwupunktowych. Zapraszamy do rozpoczęcia.

Zaszczep 50 ml pożywki YPD pięcioma ml hodowli nocnej szczepu MAV 2 0 3. Inkubuj przez dwie do czterech godzin w temperaturze 30 °C. Następnie zbierz drożdże poprzez wirowanie, po jednym przemyciu resuspenduj osad w 2 ml roztworu jeden i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Przygotuj mieszaninę DNA do transformacji. Dodaj 100 µl komórek drożdży i dokładnie wymieszaj. Następnie dodaj 700 µl roztworu dwa i dokładnie wymieszaj.

Najpierw inkubuj w temperaturze 30°C przez 30 minut, a następnie przeprowadź szok termiczny. Teraz należy zebrać komórki za pomocą wirowania i resuspender osad w 200 µL sterylnej wody destylowanej. Rozniesć rozcieńczenia seryjne zawiesiny na płytki SD LU i inkubować w temperaturze 30°C przez dwa do trzech dni. Ten etap potwierdza, że plazmid przynęty aktywuje transkrypcję oraz że ta samoaktywacja może zostać zneutralizowana przez inhibitory, takie jak 3-AT, będący inhibitorem konkurencyjnym produktu genu hiss3.

Najpierw przeprowadź transformację plazmidu przynęty do drożdży MAV 2 0 3. Wyjałowiony materiał z reakcji wysiej na płytki SD LU i inkubuj w temperaturze 30°C. W celu przesiewania kolonii pod kątem indukowanej samoaktywacji 3-AT, użyj autoklawowanych wykałaczek do przeniesienia kolonii z każdej transformacji na płytki SD LU Hiss zawierające zwiększające się stężenia 3-AT; płytki inkubuj w temperaturze 30°C.

Odrzuć szczepy przynęty, które rosną na płytkach zawierających 100 millimolar trzy at, jako nieprzydatne do zastosowania w badaniu dwuhybrydowym dla re. Dla pozostałych przynęt wybierz najniższe stężenie trzy at hamujące wzrost komórek do zastosowania w przesiewaniu biblioteki CD NA; zawieś kilka wyizolowanych kolonii drożdży zawierających plazmid przynęty w 100 microliters wody destylowanej w autoklawie. Rozsiej je na dwie 10 centimeter płytkach SD LU.

Inkubuj obie płytki w temperaturze 30 °C. Zeskrob i całkowicie zawieś komórki w 10 ml. Autoklawuj wodę destylowaną i zaszczep 500 ml ciekłego medium YPD.

Zweryfikuj gęstość komórek za pomocą spektroskopii, fotometrii oraz hodowli w temperaturze 30 °C. Następnie przystąp do zbierania komórek poprzez wirowanie. Przepłucz raz w 100 ml autoklawowanej wody destylowanej, a następnie raz w 50 ml roztworu jeden.

Następnie zawiesinę w osadzie resuspender w 2,5 ml roztworu jeden. Teraz dodać zdenaturowane, ścinane DNA plemni łososia oraz bibliotekę cDNA, mieszając delikatnie za pomocą pipety. Następnie dodać 15 ml roztworu dwa zawierającego 40% glikolu polietylenowego.

Delikatnie wymieszać i rozdzielić aliquoty o objętości 700 µL do 25 autoklawowanych probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Inkubować przez 30 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 30 °C, a następnie przeprowadzić szok termiczny przez 15 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C.

Zbiór komórek należy przeprowadzić poprzez wirowanie, a następnie ostrożnie zawiesić każdy osad w 400 µL wody destylowanej autoklawowanej. Każdą mieszaninę transformacyjną należy wysiać na dwie płytki selekcyjne i inkubować od 5 do 10 dni w temperaturze 30 °C w celu kontrolnej oceny wydajności transformacji z płytki reakcyjnej. Wykonano rozcieńczenia seryjne jednej reakcji.

Po inkubacji przez trzy dni w temperaturze 30 °C należy określić całkowitą liczbę kolonii. Przenieś kolonie na płytkę YPD i inkubuj w temperaturze 30 °C przez noc. Następnie umieść okrągłą membranę nitrocelulozową bezpośrednio na płytce YPD, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza.

Po minucie należy sprawdzić, czy wszystkie kolonie zostały przeniesione na membrany. Umieść membranę stroną z koloniami do góry w łódce z folii aluminiowej i połóż ją na powierzchni ciekłego azotu na 20 sekund. Następnie zanurz ją w ciekłym azocie na kilka minut.

Teraz należy wyjąć membranę w celu rozmrożenia. W międzyczasie przygotuj szalkę Petriego z warstwą świeżego roztworu XCA na papierze Whatmana. Następnie ostrożnie zanurz rozmrożoną membranę i inkubuj w temperaturze 37 °C.

Do czasu pojawienia się niebieskich kolonii. Reakcja z konstruktami ofiary, klonów i przynęty w drożdżach może dodatkowo wyeliminować wyniki fałszywie dodatnie. Najpierw wyizoluj DNA plazmidowe ze szczepów drożdży potencjalnie zawierających oddziałujące białka.

Przeprowadź transformację DNA do szczepu e coli DH5α i dokonaj selekcji poprzez hodowlę na płytkach LB z ampicyliną. Przesiew transformantów wykonaj za pomocą analizy enzymów restrykcyjnych. Następnie przeprowadź kotransformację plazmidów prey i bait do drożdży MAV 2.03 na płytkach SC LU trip i inkubuj przez dwa do trzech dni w temperaturze 30 °C.

Wybierz trzy różne kolonie do przeprowadzenia sekwencji analizy xal, DNA plazmidowego z pozytywnych klonów i zidentyfikuj geny za pomocą bioinformatyki. W tym doświadczeniu czynnik wzrostu Rine pro Granulin został użyty jako przynęta do przesiewania biblioteki CD NA mózgu w poszukiwaniu 54 pozytywnych klonów.

Kandydaty wyizolowano spośród 2,5 miliona transformantów przesianych z użyciem przynęci progranuliny. Dalsze analizy z wykorzystaniem testu ex skull wykazały 23 pozytywne klony kandydackie dla przynęci progranuliny.

Co ciekawe, analizy bioinformatyczne danych z sekwencjonowania zidentyfikowały TNF R dwa. Rzeczywiście, dalsze eksperymenty funkcjonalne potwierdziły, że progranulina jest nowym ligandem receptorów TNF. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić ten zmodyfikowany dwuhybrydowy skrining z wykorzystaniem interesującej Państwa bazy.

Pamiętaj o pracy w rękawiczkach, ponieważ niektóre z używanych odczynników stwarzają zagrożenie. Powodzenia w eksperymentach.