Name: Izolacja komórek dendrytycznych płuc myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Naucz się izolować komórki dendrytyczne z płuc myszy metodą kolagenazy i cytometrii przepływowej. Ta technika umożliwia uzyskanie wysoko oczyszczonej frakcji komórek do badań immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Marilyn Dietrich z LSU Flow Cytometry Core Facility za pomoc w sortowaniu komórek oraz Peterowi Mottramowi za pomoc w wykonaniu mikrofotografii. Praca ta była finansowana przez Flight Attendant Medical Research Institute, w ramach LSU-Competitive Research Program Award oraz z grantów NIH/NIAID P20 RR020159 i R03AI081171.

1. Perfuzja płuc i przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek
<ol>
 <li>Uśmierć mysz poprzez doszpryknięcie dootrzewnowe mieszaniny anestetyków ketaminy i ksylazyny (dawkowanie: ketamina 1,8 mg/mysz, ksylazyna 0,19 mg/mysz) oraz upuszczenie krwi przez żyłę udową</li>
 <li>Odsłoń jamę klatki piersiowej, rozcinając i delikatnie odsuwając zewnętrzną skórę otrzewnej. Następnie otwórz przeponę, przecinając klatkę piersiową, aby odsłonić serce i płuca</li>
 <li>Delikatnie przepłucz płuca, używając strzykawki 5 ml wypełnionej EDTA-HBSS (1mM EDTA w HBSS wolnym od wapnia i magnezu). Podłącz igłę 25 G i wprowadź ją do prawej komory serca. Aby zapobiec wyciekom podczas wstrzykiwania, zabezpiecz tkankę mięśnia sercowego wokół igły za pomocą pęsety. Powoli wstrzykuj roztwór, utrzymując stałe ciśnienie. Prawidłowa perfuzja spowoduje nadmuchanie płuc i zmianę ich koloru na różowo-biały</li>
 <li>Usuń drenujące węzły chłonne, aby wyeliminować potencjalne zanieczyszczenie z tej tkanki</li>
 <li>Pobierz tkankę płucną, przenieś ją do szalki Petriego na lodzie i posiekaj na małe kawałki za pomocą żyletki</li>
 <li>Przenieś rozdrobnioną tkankę do probówki gentleMACS C zawierającej 5 ml/płuco roztworu trawiennego z kolagenazą (kolagenaza typu 1A 0,5 mg/ml oraz bydlęca DNaza trzustkowa typu IV 20 μg/ml w HBSS zawierającym 5% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny)</li>
 <li>Użyj dysocjatora gentleMACS, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Wybierz program: m_lung_01. Inkubuj próbkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Wstrząsaj probówką co 5 minut, aby resuspenderć fragmenty tkanki. Następnie uruchom program m_lung_02</li>
 <li>Przenieś próbkę do stożkowej probówki 15 ml i wiruj przez 10 minut przy 335 x g w temperaturze 4 °C. Po tym etapie wszystkie odczynniki i wirowania należy utrzymywać w temperaturze 4 °C, aby zapobiec spadkowi żywotności komórek</li>
 <li>Odlej nadsącz i poddaj pozostałe erytrocyty lizie, dodając 2 ml buforu lizującego ACK na 1 minutę w temperaturze pokojowej. Przemyj komórki 13 ml zimnego PBS/0,5% BSA i wiruj przez 10 minut przy 335 x g w temperaturze 4°C</li>
 <li>Odlej nadsącz, resuspenduj wszystkie komórki w 5 ml zimnego PBS/0,5%BSA i przefiltruj przez nylonowy siewnik 100 μm</li>
 <li>Oznacz całkowitą liczbę komórek, stosując metodę wykluczania barwnika trypan blue</li>
</ol>
2. Izolacja magnetyczna i wzbogacanie populacji komórek CD11c+
<ol>
 <li>Odwirować zawiesinę pojedynczych komórek przez 10 minut przy 200 x g w temperaturze 4 °C i usunąć nadsącz.</li>
 <li>Resuspender osad komórkowy w 400 μl buforu do separacji (PBS, 0,5% BSA i 2 mM EDTA) na każde 108 całkowitych komórek. Zablokować nieswoiste wiązanie przeciwciał zależne od receptorów Fc, stosując przeciwciało anty-CD16/CD32 (0,5 μg / 106 komórek) przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Przemyć komórki 10 ml zimnego buforu do separacji i odwirować przez 10 minut przy 200 x g w temperaturze 4 °C. Resuspender komórki w 400 μl buforu do separacji.</li>
 <li>Dodać 100 μl CD11c MicroBeads na każde 108 całkowitych komórek. Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w lodówce (2-8 °C).</li>
 <li>Przemyć komórki 10 ml zimnego buforu do separacji, odwirować przez 10 minut przy 200 x g w temperaturze 4 °C i usunąć nadsącz.</li>
 <li>Resuspender osad komórkowy w 3 ml zimnego buforu do separacji.</li>
 <li>Przeprowadzić separację magnetyczną przy użyciu separatora autoMACS ProTM, wybierając program posseld. Zebrać frakcję pozytywną (0,5 ml).</li>
</ol>
3. Izolacja konwencjonalnych komórek dendrytycznych (cDC)
<ol>
 <li>Inkubować zawiesinę wzbogaconą w komórki CD11c-dodatnie z przeciwciałami anty-CD11c PE-Cy7 oraz anty-I-A/I-E (MHC-II)-FITC przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Optymalne stężenie przeciwciał wynosi 0,5 μg/ 106 komórek.</li>
 <li>Przemyć komórki zimnym PBS/0,5% BSA i wirować przez 10 minut przy 335 x g w temperaturze 4 °C. Resuspendować komórki w 0,5 ml PBS/0,5% BSA i przefiltrować je przez nylonowe sito o oczkach 40 μm.</li>
 <li>Przeprowadzić sortowanie komórek przy użyciu sortera komórkowego FACS Aria w trybie czystości (purity mode). Do probówek odbiorczych dodać 100 μl PBS/0,5% BSA, aby zapobiec uszkodzeniu oczyszczonych komórek. Przez cały proces sortowania utrzymywać komórki w temperaturze chłodniczej.</li>
</ol>
4. Alternatywny protokół otrzymywania zawiesiny pojedynczych komórek i wzbogacania populacji komórek CD11c+
<ol>
 <li>Zamiast dysocjatora gentleMACS, rozdrobnioną tkankę płuc z kroku 1.5 można przenieść do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml roztworu kolagenazy na jedno płuco i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Co 15 minut należy wymieszać komórki na wirówce typu vortex, aby resuspenderć fragmenty tkanki. Tkankę należy rozbić, przepuszczając próbkę 6-8 razy przez strzykawkę 3 ml z igłą 20 G. Podczas tego procesu należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza, w przeciwnym razie przeżywalność komórek zostanie obniżona. Po uzyskaniu zawiesiny pojedynczych komórek należy przejść do kroku 1.8.</li>
 <li>Zamiast separatora AutoMACSProTM, izolację magnetyczną w celu wzbogacenia populacji komórek CD11c można przeprowadzić, przepuszczając zawiesinę komórek ręcznie przez dwie kolumny MACS. Wybór odpowiednich kolumn zależy od wielkości próbki.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Konwencjonalne komórki dendrytyczne (cDC) płuc są identyfikowane jako populacja komórek CD11chi/MHC-IIhi. Jak pokazano na Rys. 1, cDC stanowią niewielki odsetek wynoszący 1,4% w porównaniu z niektórymi innymi tkankami, takimi jak śledziona (4,8%). Jednak w przeciwieństwie do śledziony, komórki płuc dodatnie pod względem CD11c wykazują różny poziom ekspresji MHC-II, w tym populację komórek inną niż cDC. Po przygotowaniu zawiesiny pojedynczych komórek, całkowita liczba uzyskanych komórek płuc wynosiła około 3,0 do 3,8 x 107 komórek/płuco przy żywotności na poziomie 60-70%, z czego nieco ponad 1% stanowił podzbiór cDC. Procent ten wzrósł po magnetycznej izolacji CD11c, gdzie całkowita liczba cDC płuc zwiększyła się około 10-krotnie (&gt;16%) w stosunku do pierwotnego preparatu (Rys. 2A). Jednak komórki CD11c wykazujące niską ekspresję MHC-II (CD11chi/MHC-IIlo, makrofagi) stanowiły znaczną populację zanieczyszczeń (&gt;70%), która była zmieszana z podzbiorem cDC płuc. Jak pokazano na Rys. 2B, komórki te zostały usunięte na etapie sortowania komórek, w wyniku czego czystość cDC osiągnęła poziom &gt;96%. Typowa liczba uzyskanych cDC po całej procedurze wynosiła 5 x 104 komórek/płuco. Mikrofotografie przedstawiają cechy morfologiczne cDC jako komórki zaokrąglone z typowymi dendrytami (panel górny). Z kolei CD11chi/MHC-IIlo reprezentowały morfologicznie odmienny podzbiór wykazujący wypustki komórkowe typowe dla makrofagów (MΦ, panel dolny) 12.
<img alt="Wykresy kropkowe z cytometrii przepływowej pokazujące ekspresję CD11c vs. MHC-II w analizie cDC z płuc i śledziony." src="/files/ftp_upload/3563/3563fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Różnice w częstości występowania DC w płucach i śledzionie myszy. Tkankę płuc i śledziony myszy C57BL/6 pobrano i poddano działaniu kolagenazy. Po trawieniu kolagenazą komórki barwiono przeciwciałami anti-mouse CD11c-PE-Cy7 oraz anti-mouse I-A/I-E-FITC. Reprezentatywne wykresy z cytometrii przepływowej przedstawiają procentowy udział cDC (CD11chi/MHC-IIhi) w płucach i śledzionie.
<img alt="Schemat izolacji magnetycznej z wykresami cytometrii przepływowej CD11c/MHC-II, wynikami sortowania komórek oraz morfologią cDC." src="/files/ftp_upload/3563/3563fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Izolacja cDC z płuc myszy. Zawiesina pojedynczych komórek z płuc myszy została znakowana mikrocząsteczkami anty-CD11c i przepuszczona przez automatyczny separator komórek. A) Reprezentatywny wykres przedstawia procentowy udział populacji cDC (CD11chi/MHC-IIhi) oraz makrofagów (MΦ, CD11chi/MHC-IIlo) po wzbogaceniu w CD11c. Dalsze barwienie frakcji wzbogaconej przeprowadzono z użyciem przeciwciał anty-mysich CD11c-PE-Cy7 oraz anty-mysich I-A/I-E-FITC. Komórki podwójnie dodatnie zostały posortowane i przeanalizowane metodą cytometrii przepływowej. W celu oceny ich morfologii komórki poddano wirowaniu na szkiełku i zabarwiono zmodyfikowaną metodą Wright-Giemsa. B) Reprezentatywne wykresy pokazują procentowy udział cDC i MΦ po sortowaniu komórek. Mikrofotografie przedstawiają reprezentatywny obraz cDC i MΦ z płuc. Pasek skali = 20 μm.

<ol><li>Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+pathogens+and+tuning+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sensing pathogens and tuning immune responses.</a> Science. 293, 253-256 (2001).</li>
<li>Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Manicassamy, S., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+control+of+tolerogenic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell control of tolerogenic responses.</a> Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).</li>
<li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology%2C+quantitation%2C+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).</li>
<li>Asselin-Paturel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+type+I+IFN-producing+cells+are+immature+APCs+with+plasmacytoid+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology.</a> Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).</li>
<li>Chan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-producing+killer+dendritic+cells+provide+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity.</a> Nat. Med. 12, 207-213 (2006).</li>
<li>Taieb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+dendritic+cell+subset+involved+in+tumor+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance.</a> Nat. Med. 12, 214-219 (2006).</li>
<li>Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+pulmonary+dendritic+cell+function+by+paramyxovirus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections.</a> Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).</li>
<li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+leukocyte+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).</li>
<li>Sung, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+lung+CD103+%28alphaE%29-beta7+integrin-positive+epithelial+dendritic+cell+population+expressing+Langerin+and+tight+junction+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins.</a> J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+CD11c%2B+MHC+class+II-+precursors+generate+lung+dendritic+cells+during+respiratory+viral+infection%2C+but+are+depleted+in+the+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process.</a> J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).</li>
<li>Bhatia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+of+alternatively+activated+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).</li>
<li>Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+regulates+migratory+pattern+and+antigen+uptake+of+lung+dendritic+cell+subsets+in+a+murine+model+of+allergic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation.</a> J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).</li>
<li>Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+response+of+respiratory+dendritic+cell+subsets+to+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection.</a> J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Izolacja komórek dendrytycznych (DC) z płuc myszy jest istotną techniką w badaniu szerokiego zakresu bodźców oddechowych. Proces pozyskiwania tych komórek obejmuje krytyczne etapy, które zapobiegają utracie komórek, a także chronią ich żywotność i czystość. Perfuzja płuc przed pobraniem pomaga usunąć komórki obwodowe oraz zmniejszyć ilość zanieczyszczających erytrocytów. Zastosowanie automatycznej dysocjacji może być korzystne przy przetwarzaniu dużej liczby płuc; w przeciwnym razie można wybrać alternatywny protokół, pa...

<table><tbody><tr><td>bufor lizujący ACK</td><td>Invitrogen</td><td>D6-0005DG</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko mysiemu CD11c (HL3)</td><td>BD Biosciences</td><td>5580979</td><td>sprzężony z PE-Cy7</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw mysiej I-A/I-E (269)</td><td>BD Biosciences</td><td>553623</td><td>sprzężony z FITC </td></tr><tr><td>Kolagenaza typu 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9891-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Sita do oddzielania komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>352340, 352360</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokule CD11c (N418)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;zrównoważony roztwór soli</td><td>Invitrogen</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforu Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petri 60 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351016</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS&amp;#8482; probówki C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Gentle MACS dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS-Pro&amp;#8482;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>FASCS Aria</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Komórki dendrytyczne (DC) płuc odgrywają fundamentalną rolę w wykrywaniu naciekających patogenów 1,2, a także w kontrolowaniu odpowiedzi tolerogennych 3 w drogach oddechowych. U myszy opisano co najmniej trzy główne podgrupy komórek dendrytycznych płuc: konwencjonalne DC (cDC) 4, plazmacytoidalne DC (pDC) 5 oraz produkujące IFN killer DC (IKDC) 6,7. Podgrupa cDC jest najliczniejszą podgrupą DC w płucach 8.
Powszechnie stosowanym markerem służącym do identyfikacji subpopulacji komórek DC jest CD11c, integryna transbłonowa typu I (β2), która jest również ekspresjonowana przez monocyty, makrofagi, neutrofile i niektóre limfocyty B 9. W niektórych tkankach wykorzystanie CD11c jako markera do identyfikacji mysich komórek DC jest zasadne, jak na przykład w śledzionie, gdzie większość komórek CD11c+ reprezentuje subpopulację cDC wykazującą wysoką ekspresję głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy II (MHC-II). Jednak płuca są tkanką bardziej heterogenną, w której obok subpopulacji DC występuje wysoki odsetek odrębnej populacji komórek wykazujących wysoką ekspresję CD11c, lecz niską ekspresję MHC-II. Na podstawie charakterystyki, a przede wszystkim ekspresji F4/80, markera makrofagów śledzionowych, populacja komórek płuc CD11chiMHC-IIlo została zidentyfikowana jako makrofagi płucne 10, a w nowszych badaniach jako potencjalny prekursor DC 11.
W przeciwieństwie do mysich pDC, badanie specyficznej roli cDC w płucnej odpowiedzi odpornościowej było ograniczone ze względu na brak specyficznego markera, który pomógłby w izolacji tych komórek. Dlatego w niniejszej pracy opisujemy procedurę izolacji wysoko oczyszczonych cDC z płuc myszy. Izolacja subpopulacji DC z płuc stanowi bardzo użyteczne narzędzie do poznania funkcji tych komórek w odpowiedzi na patogeny układu oddechowego, a także czynniki środowiskowe, które mogą wywołać odpowiedź odpornościową gospodarza w płucach.

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

Komórki dendrytyczne (DC) płuc odgrywają fundamentalną rolę w wykrywaniu wnikających patogenów 1,2, a także w kontrolowaniu odpowiedzi tolerogennych 3 w...

Ogólnym celem tej procedury jest otrzymanie wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych płuc myszy. Osiąga się to poprzez najpierw pobranie tkanki płucnej bez uwzględniania drenujących węzłów chłonnych. Następnie, poprzez trawienie kolagenazą, otrzymuje się zawiesinę pojedynczych komórek.Kolejnym krokiem jest wzbogacenie populacji komórek CD 11 C pozytywnych przy użyciu systemu magnetycznej izolacji komórek. Następnie, za pomocą sortowania komórek metodą cytometrii przepływowej, izoluje się konwencjonalną podgrupę komórek dendrytycznych. Ostatecznie konwencjonalne komórki dendrytyczne izolowane z tkanki płuc myszy mogą zostać poddane analizie z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i mikroskopii świetlnej.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii, takie jak: jaka jest rola konwencjonalnych podzbiorów komórek dendrytycznych w odporności wrodzonej i chorobach zakaźnych dróg oddechowych? Procedurę zaprezentują Issa Lancelin, pracownik naukowy z mojego laboratorium oraz ja.Następnie należy otworzyć przeponę, przecinając klatkę piersiową, aby odsłonić serce i płuca. Po odsłonięciu serca i płuc można rozpocząć procedurę perfuzji. Napełnić strzykawkę o pojemności 5 ml roztworem E-D-T-A-H-B-S-S i przymocować do niej igłę o rozmiarze 25 G.Następnie wprowadź igłę do prawej komory, aby zapobiec wyciekowi podczas wstrzykiwania. Użyj pęsety, aby unieruchomić tkankę mięśnia sercowego wokół igły. Następnie powoli wstrzyknij roztwór, utrzymując stałe ciśnienie.Prawidłowa perfuzja spowoduje napompowanie płuc oraz zmianę ich koloru na różowy lub biały. Aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia, należy usunąć i zutylizować drenujące węzły chłonne. Następnie należy pobrać tkankę płucną, przenosząc wycięty organ do szalki Petriego umieszczonej na lodzie. Napełnić probówkę typu gentle max C pięcioma mililitrami roztworu do trawienia kolagenazą płuc, a następnie posiekać płuca na małe kawałki.Za pomocą żyletki przenieś tkankę do probówki, stosując delikatną maksymalną dysocjację. Aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek, wybierz program M lung zero one. Następnie inkubuj próbkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut, wstrząsając probówką co pięć minut w celu resuspensji fragmentów tkanki, a następnie kontynuuj zgodnie z programem M lung zero two.Przenieś teraz próbkę do 15 ml probówki stożkowej i odwiruj komórki przez 10 minut przy 335 ×g w temperaturze 4°C. Odlej nadsącz i dodaj do osadu dwa mililitry buforu lizującego CK na jedną minutę w temperaturze pokojowej, aby zlizować pozostałe erytrocyty. Następnie przemyj komórki 13 ml zimnego PBS uzupełnionego o 0,5% BSA.Po odlaniu nadsączu, ponownie zawiesić ten osad w pięciu mililitrach zimnego PBS z dodatkiem BSA, a następnie przefiltrować zawiesinę komórkową przez nylonowy sitko o oczkach 100 µm. Na koniec oznaczyć całkowitą liczbę komórek metodą wykluczania błękitu trypanu. Zamiast stosować łagodną dysocjację maksymalną, napełnić stożkową probówkę o pojemności 15 ml pięcioma mililitrami roztworu kolagenazy na jedno płuco.Przenieś posiekane tkankę płuc do probówki i inkubuj ją przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Co 15 minut mieszaj komórki za pomocą wortexa, aby ponownie zawiesić fragmenty tkanki. Następnie rozdrabniaj tkankę trawienną, przepuszczając próbkę od sześciu do ośmiu razy przez strzykawkę o pojemności 3 ml z podłączoną igłą o rozmiarze 20 G.Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza podczas procesu. Najpierw zawiesinę pojedynczych komórek należy wirować przez 10 minut przy 200 ×g w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić nadsącz. Następnie komórki należy resuspender w 400 µL buforu separacyjnego.Zablokuj nieswoiste wiązanie przeciwciał za pośrednictwem receptorów FC w 10⁸ całkowitych komórek, stosując 0,5 µg przeciwciała anty-CD163, inkubując komórki przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Po przemyciu komórek 10 mL zimnego buforu separacyjnego, resuspenduj komórki w 400 µL buforu separacyjnego. Następnie dodaj 100 µL mikrokuleczek CD11c do 10⁸ całkowitych komórek, wymieszaj dokładnie i inkubuj zawiesinę komórek i kuleczek przez 15 minut w lodówce.Po usunięciu niezwiązanych kulek za pomocą 10 mililitrów zimnego buforu separacyjnego, odrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w jednym mililitrze zimnego buforu separacyjnego. Na koniec wprowadź próbki do separatora AutoMax pro i uruchom program P-O-S-S-E-L-D, aby zebrać frakcję komórek wykazujących ekspresję CD 11 C.Inkubuj wzbogaconą zawiesinę komórek CD 11 C dodatnich z przeciwciałami anty-CD 11 C PEI siedem oraz przeciwciałami skierowanymi przeciwko cząsteczkom MHC klasy II obecnym na tych komórkach przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po przemyciu komórek zimnym PBS plus BSA, resuspenduj komórki w 0,5 mililitra PBS plus BSA i przepuść je przez nylonowy filtr siatkowy o oczkach 40 mikrometrów. Na koniec przenieś oczyszczone komórki CD 11 C dodatnie do probówki FACS w celu późniejszego oznaczania ilościowego w oddzielnych pustych probówkach.Do probówek do zbierania o pojemności pięciu mililitrów należy dodać 100 µL PBS z dodatkiem BSA, aby zapobiec uszkodzeniu oczyszczonych komórek, a następnie posortować przefiltrowaną zawiesinę komórkową; zebrane komórki powinny być utrzymywane w temperaturze chłodniczej przez cały proces sortowania. Na tych wykresach gęstości w śledzionie stwierdzono ponad trzykrotnie więcej konwencjonalnych komórek dendrytycznych niż w płucach. Ponadto w płucach komórki CD11c-dodatnie obejmują populację komórek, które nie są konwencjonalnymi komórkami dendrytycznymi, co reprezentuje grupa zdarzeń MHC klasy II-low poza bramką konwencjonalnych komórek dendrytycznych.Po lewej stronie rysunku, jak widać na tym wykresie gęstości, separacja magnetyczna wszystkich komórek płuc CD11c zwiększa liczbę konwencjonalnych komórek dendrytycznych z około 1,5% wszystkich komórek do około 16,5%. Jednakże makrofagi CD11c-dodatnie z niską ekspresją MHC klasy II wciąż stanowią ponad 70% całkowitej populacji komórek, znacząco zanieczyszczając czystość wzbogaconego podzbioru konwencjonalnych komórek dendrytycznych płuc na tym etapie procesu izolacji. Sortowanie metodą FACS zwiększa jednak czystość konwencjonalnych komórek dendrytycznych do ponad 96%, co widać na mikrofotografii w prawym górnym rogu. Konwencjonalne komórki dendrytyczne CD11c-wysokie MHC klasy II-wysokie są komórkami zaokrąglonymi z typowymi dendrytami, podczas gdy komórki CD11c-wysokie MHC klasy II-niskie widoczne na mikrofotografii w prawym dolnym rogu wykazują wypustki komórkowe bardziej typowe dla morfologii makrofagów.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o manipulowaniu tkanką płucną oraz preparatem pojedynczych komórek w wskazanych temperaturach. Jest to kluczowe dla zachowania żywotności komórek i uzyskania konwencjonalnej wydajności komórek dendrytycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować podgrupy komórek dendrytycznych z płuc myszy.Izolacja subpopulacji komórek dendrytycznych z płuc stanowi bardzo przydatne narzędzie do poznania funkcji tych komórek w odpowiedzi na patogeny układu oddechowego oraz czynniki środowiskowe, które mogą wywołać odpowiedź immunologiczną gospodarza w płucach.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja komórek dendrytycznych płuc myszy

Dysocjacja komórek z określonych typów tkanek wymaga zastosowania specyficznych parametrów agitacji tkanki, aby uzyskać dużą liczbę żywotnych komórek zdolnych do hodowli. Dysocjator Miltenyi gentleMACS optymalizuje to zadanie dzięki prostemu i praktycznemu protokołowi. W niniejszej publikacji wyjaśniono sposób wykorzystania tego urządzenia w odniesieniu do tkanki płucnej.

Standaryzowane przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki płuc myszy przy użyciu dysocjatora gentleMACS

W niniejszym artykule prezentujemy izolację mysich rezydentnych mezenchymalnych komórek macierzystych płuc (lung MSC), ich ekspansję, charakterystykę oraz analizę właściwości immunomodulacyjnych.

Izolacja &amp;#38; Charakterystyka barwnika Hoechstniski CD45ujemny Mezenchymalne komórki macierzyste płuc myszy

W niniejszym opracowaniu szczegółowo opisano metodologię szybkiej izolacji komórek dendrytycznych (DCs) oraz makrofagów z jelit myszy. Charakterystyka fenotypowa jelitowych komórek dendrytycznych i makrofagów jest przeprowadzana za pomocą wielokolorowej analizy cytometrycznej, natomiast wzbogacanie za pomocą kulek magnetycznych z następującym po nim sortowaniem komórek jest stosowane w celu uzyskania populacji o wysokiej czystości do badań funkcjonalnych.

Izolacja i charakterystyka komórek dendrytycznych oraz makrofagów z jelit myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania komórek prezentujących antygen z ludzkiej grasicy poprzez różne etapy enzymatycznego trawienia tkanki, następnie gęstości odwirowania zawiesiny pojedynczej komórki i na końcu magnetycznego i/lub FACS sortowania interesujących populacji komórek.

Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Opisujemy metodę generowania precyzyjnie wycinanych plastrów płuc (PCLS) i ich barwienia immunologicznego, aby zobrazować lokalizację różnych typów komórek odpornościowych w płucach. Nasz protokół można rozszerzyć w celu wizualizacji lokalizacji i funkcji wielu różnych typów komórek w różnych warunkach.

Precyzyjnie wycięte plastry płuc myszy do wizualizacji żywych komórek dendrytycznych płuc

DC (MoDC) pochodzące z monocytów może wykrywać niewielkie ilości cząsteczek związanych z niebezpieczeństwem i dlatego jest łatwo zapoczątkowane. Przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji MoDC z krwi i nowotworów oraz ich aktywacji za pomocą kompleksów immunologicznych, podkreślając jednocześnie kluczowe środki ostrożności, które należy wziąć pod uwagę, aby uniknąć ich przedwczesnej aktywacji.

Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych

Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

W tym artykule, pierwotne komórki śródbłonka płuc zostały wyizolowane i wyhodowane od nowonarodzonych myszy.

Izolacja pierwotnych komórek śródbłonka płuc myszy

Dostarczamy szczegółowy protokół do izolowania i identyfikacji rzadkich populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu w płucach myszy poprzez magnetyczne wzbogacanie limfocytów T na bazie kulek magnetycznych i tetramery peptydu:głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC).

Identyfikacja rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu z płuc myszy za pomocą peptydów: głównych tetramerów kompleksu zgodności tkankowej

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację żywych populacji immunologicznych i nieimmunologicznych z płuc myszy w stanie ustalonym i po zakażeniu grypą. Zapewnia również strategie bramkowania do identyfikacji podzbiorów komórek nabłonkowych i szpikowych.

Izolacja żywych populacji komórek szpikowych i nabłonkowych z płuc myszy

Naucz się izolować komórki dendrytyczne z płuc myszy metodą kolagenazy i cytometrii przepływowej. Ta technika umożliwia uzyskanie wysoko oczyszczonej frakcji komórek do badań immunologicznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

Przeglądaj więcej filmów