Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

Ogólnym celem tej procedury jest otrzymanie wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych płuc myszy. Osiąga się to poprzez najpierw pobranie tkanki płucnej bez uwzględniania drenujących węzłów chłonnych. Następnie, poprzez trawienie kolagenazą, otrzymuje się zawiesinę pojedynczych komórek.

Kolejnym krokiem jest wzbogacenie populacji komórek CD 11 C pozytywnych przy użyciu systemu magnetycznej izolacji komórek. Następnie, za pomocą sortowania komórek metodą cytometrii przepływowej, izoluje się konwencjonalną podgrupę komórek dendrytycznych. Ostatecznie konwencjonalne komórki dendrytyczne izolowane z tkanki płuc myszy mogą zostać poddane analizie z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i mikroskopii świetlnej.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii, takie jak: jaka jest rola konwencjonalnych podzbiorów komórek dendrytycznych w odporności wrodzonej i chorobach zakaźnych dróg oddechowych? Procedurę zaprezentują Issa Lancelin, pracownik naukowy z mojego laboratorium oraz ja.

Następnie należy otworzyć przeponę, przecinając klatkę piersiową, aby odsłonić serce i płuca. Po odsłonięciu serca i płuc można rozpocząć procedurę perfuzji. Napełnić strzykawkę o pojemności 5 ml roztworem E-D-T-A-H-B-S-S i przymocować do niej igłę o rozmiarze 25 G.

Następnie wprowadź igłę do prawej komory, aby zapobiec wyciekowi podczas wstrzykiwania. Użyj pęsety, aby unieruchomić tkankę mięśnia sercowego wokół igły. Następnie powoli wstrzyknij roztwór, utrzymując stałe ciśnienie.

Prawidłowa perfuzja spowoduje napompowanie płuc oraz zmianę ich koloru na różowy lub biały. Aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia, należy usunąć i zutylizować drenujące węzły chłonne. Następnie należy pobrać tkankę płucną, przenosząc wycięty organ do szalki Petriego umieszczonej na lodzie. Napełnić probówkę typu gentle max C pięcioma mililitrami roztworu do trawienia kolagenazą płuc, a następnie posiekać płuca na małe kawałki.

Za pomocą żyletki przenieś tkankę do probówki, stosując delikatną maksymalną dysocjację. Aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek, wybierz program M lung zero one. Następnie inkubuj próbkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut, wstrząsając probówką co pięć minut w celu resuspensji fragmentów tkanki, a następnie kontynuuj zgodnie z programem M lung zero two.

Przenieś teraz próbkę do 15 ml probówki stożkowej i odwiruj komórki przez 10 minut przy 335 ×g w temperaturze 4°C. Odlej nadsącz i dodaj do osadu dwa mililitry buforu lizującego CK na jedną minutę w temperaturze pokojowej, aby zlizować pozostałe erytrocyty. Następnie przemyj komórki 13 ml zimnego PBS uzupełnionego o 0,5% BSA.

Po odlaniu nadsączu, ponownie zawiesić ten osad w pięciu mililitrach zimnego PBS z dodatkiem BSA, a następnie przefiltrować zawiesinę komórkową przez nylonowy sitko o oczkach 100 µm. Na koniec oznaczyć całkowitą liczbę komórek metodą wykluczania błękitu trypanu. Zamiast stosować łagodną dysocjację maksymalną, napełnić stożkową probówkę o pojemności 15 ml pięcioma mililitrami roztworu kolagenazy na jedno płuco.

Przenieś posiekane tkankę płuc do probówki i inkubuj ją przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Co 15 minut mieszaj komórki za pomocą wortexa, aby ponownie zawiesić fragmenty tkanki. Następnie rozdrabniaj tkankę trawienną, przepuszczając próbkę od sześciu do ośmiu razy przez strzykawkę o pojemności 3 ml z podłączoną igłą o rozmiarze 20 G.

Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza podczas procesu. Najpierw zawiesinę pojedynczych komórek należy wirować przez 10 minut przy 200 ×g w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić nadsącz. Następnie komórki należy resuspender w 400 µL buforu separacyjnego.

Zablokuj nieswoiste wiązanie przeciwciał za pośrednictwem receptorów FC w 10⁸ całkowitych komórek, stosując 0,5 µg przeciwciała anty-CD163, inkubując komórki przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Po przemyciu komórek 10 mL zimnego buforu separacyjnego, resuspenduj komórki w 400 µL buforu separacyjnego. Następnie dodaj 100 µL mikrokuleczek CD11c do 10⁸ całkowitych komórek, wymieszaj dokładnie i inkubuj zawiesinę komórek i kuleczek przez 15 minut w lodówce.

Po usunięciu niezwiązanych kulek za pomocą 10 mililitrów zimnego buforu separacyjnego, odrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w jednym mililitrze zimnego buforu separacyjnego. Na koniec wprowadź próbki do separatora AutoMax pro i uruchom program P-O-S-S-E-L-D, aby zebrać frakcję komórek wykazujących ekspresję CD 11 C.

Inkubuj wzbogaconą zawiesinę komórek CD 11 C dodatnich z przeciwciałami anty-CD 11 C PEI siedem oraz przeciwciałami skierowanymi przeciwko cząsteczkom MHC klasy II obecnym na tych komórkach przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po przemyciu komórek zimnym PBS plus BSA, resuspenduj komórki w 0,5 mililitra PBS plus BSA i przepuść je przez nylonowy filtr siatkowy o oczkach 40 mikrometrów. Na koniec przenieś oczyszczone komórki CD 11 C dodatnie do probówki FACS w celu późniejszego oznaczania ilościowego w oddzielnych pustych probówkach.

Do probówek do zbierania o pojemności pięciu mililitrów należy dodać 100 µL PBS z dodatkiem BSA, aby zapobiec uszkodzeniu oczyszczonych komórek, a następnie posortować przefiltrowaną zawiesinę komórkową; zebrane komórki powinny być utrzymywane w temperaturze chłodniczej przez cały proces sortowania. Na tych wykresach gęstości w śledzionie stwierdzono ponad trzykrotnie więcej konwencjonalnych komórek dendrytycznych niż w płucach. Ponadto w płucach komórki CD11c-dodatnie obejmują populację komórek, które nie są konwencjonalnymi komórkami dendrytycznymi, co reprezentuje grupa zdarzeń MHC klasy II-low poza bramką konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Po lewej stronie rysunku, jak widać na tym wykresie gęstości, separacja magnetyczna wszystkich komórek płuc CD11c zwiększa liczbę konwencjonalnych komórek dendrytycznych z około 1,5% wszystkich komórek do około 16,5%. Jednakże makrofagi CD11c-dodatnie z niską ekspresją MHC klasy II wciąż stanowią ponad 70% całkowitej populacji komórek, znacząco zanieczyszczając czystość wzbogaconego podzbioru konwencjonalnych komórek dendrytycznych płuc na tym etapie procesu izolacji. Sortowanie metodą FACS zwiększa jednak czystość konwencjonalnych komórek dendrytycznych do ponad 96%, co widać na mikrofotografii w prawym górnym rogu. Konwencjonalne komórki dendrytyczne CD11c-wysokie MHC klasy II-wysokie są komórkami zaokrąglonymi z typowymi dendrytami, podczas gdy komórki CD11c-wysokie MHC klasy II-niskie widoczne na mikrofotografii w prawym dolnym rogu wykazują wypustki komórkowe bardziej typowe dla morfologii makrofagów.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o manipulowaniu tkanką płucną oraz preparatem pojedynczych komórek w wskazanych temperaturach. Jest to kluczowe dla zachowania żywotności komórek i uzyskania konwencjonalnej wydajności komórek dendrytycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować podgrupy komórek dendrytycznych z płuc myszy.

Izolacja subpopulacji komórek dendrytycznych z płuc stanowi bardzo przydatne narzędzie do poznania funkcji tych komórek w odpowiedzi na patogeny układu oddechowego oraz czynniki środowiskowe, które mogą wywołać odpowiedź immunologiczną gospodarza w płucach.