Pomiar translokacji peptydów do dużych pęcherzyków jednowarstwowych

W celu ilościowego oznaczenia translokacji peptydów przez błony pęcherzyków generowane są fluorescencyjnie znakowane pęcherzyki lipidowe z enkapsulowaną trypsyną. Dodaje się inhibitor trypsyny, aby zahamować aktywność trypsyny egzogennej, pozostawiając aktywną trypsynę w świetle pęcherzyka.

Dopiero po dodaniu fluorescencyjnie znakowanych peptydów do pęcherzyków ich znaczniki fluorescencyjne pełnią rolę donorów FRET i wzbudzają cząsteczki fluorescencyjne na pęcherzyku. Jednak gdy białka przechodzą przez błonę, są trawione przez trypsynę, co prowadzi do utraty sygnału FRET. Analiza spektrometryczna pozwala określić zakres translokacji peptydów, co objawia się jako spadek sygnału FRET między pęcherzykami a peptydem w czasie.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, w tym innymi technikami z wykorzystaniem pęcherzyków lipidowych oraz metodami pomiaru wnikania peptydów do komórek, jest to, że dostarcza ona informacji o kinetyce wnikania przez błonę i nie wymaga dodawania znacznika fluorescencyjnego do peptydów, jeśli zawierają one tryptofan. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące projektowania i inżynierii peptydów aktywnych błonowo, takie jak określenie, jakie cechy są niezbędne do efektywnej translokacji przez błonę. Pierwszym krokiem tej procedury jest przygotowanie dużych jednoplamowych pęcherzyków lipidowych (UUVs), które posłużą jako mimetyki błon komórkowych w analizie.

Należy rozpocząć od połączenia fosfatydylocholiny, fosfatydyloglicerolu i pięciu dimetyloaminonaftaleno-1-sulfonylo-fosfatydyloetanolaminy w chloroformie. W stosunku 50:45:5 zazwyczaj wystarcza 0,376 mg całkowitej zawartości lipidów, aby przygotować odpowiednią liczbę pęcherzyków do pojedynczej próby eksperymentalnej lub kontrolnej.

Przygotuj jedną fiolkę jako próbkę badawczą i jedną jako kontrolną, a następnie odparuj chloroform za pomocą strumienia azotu. Wysuszone lipidy pozostałe po tym etapie określa się mianem osadów lipidowych. Susz osady lipidowe od 9 do 14 godzin w eksykatore próżniowym.

Następnie należy przygotować 10 mM roztwór zapasowy HEI, 0,4 mM roztwór zapasowy trypsyny wieprzowej oraz 4,0 mM roztwór zapasowy inhibitora trypsyny Bowmana-Burke; szczegóły przygotowania znajdują się w dołączonym dokumencie. Do wysuszonych placków lipidowych należy dodać równą objętość 0,4 mM roztworu zapasowego trypsyny i 10 mM roztworu buforowego HEI. Następnie należy wymieszać fiolkę w wstrząsarze typu vortex, aby zrekonstytuować pęcherzyki wielolamellarne (MLV). W celu rekonstytucji kontrolnych MLV do wysuszonego placka lipidowego należy dodać równą objętość 0,4 mM roztworu zapasowego trypsyny i 4,0 mM inhibitora trypsyny, a następnie wymieszać w wstrząsarze typu vortex jak wcześniej.

Po rekonstytucji mvs, przenieść roztwory MLV ze szklanych fiolek do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mililitra. Następnie poddać roztwory MLV pięciu cyklom zamrażania i rozmrażania, naprzemiennie stosując ciekły azot oraz kąpiel wodną o temperaturze 30 stopni Celsjusza. W kolejnym kroku przygotować ekstruder lipidowy, zwilżając dwa podłoża filtracyjne w buforze Heiss.

Następnie należy umieścić każdy z nich na zwilżonym elemencie wytłaczarki teflonowej, a pomiędzy dwoma elementami wytłaczarki teflonowej umieścić membranę nukleoporową z trawionymi śladami o porach 0,1 µm. Teraz należy umieścić elementy wytłaczarki w metalowym kanistrze wytłaczarki i nałożyć przekładkę w kształcie pierścienia na oba elementy wytłaczarki. Należy dokręcić metalną górną część kanistra wytłaczarki, a następnie umieścić go w uchwycie, używając szklanej strzykawki o pojemności 250 µL.

Wypełnij wolną przestrzeń ekstrudera 500 µL buforu HEPES o stężeniu 10 mM, aby zapobiec stracie próbki pęcherzyków. Przenieś próbkę do zlewki o pojemności 10 mL.

Następnie należy wprowadzić każdą próbkę MLV do ekstrudera i przepchnąć ją przez membranę co najmniej 21 razy. Aby zapewnić jednolity rozmiar pęcherzyków Ella po ekstruzji, należy przenieść duże pęcherzyki lipidowe ELLA lub L UUVs do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml. Przechowywać UUVs w temperaturze 4 °C i wykorzystać w ciągu 48 godzin.

Aby ocenić stężenie LUV, wyznacza się całkowitą zawartość fosforu w próbce. Należy przygotować następujące odczynniki zgodnie ze specyfikacjami zawartymi w towarzyszącym protokole pisemnym: 8,9 N H₂SO₄, 2,5% (m/v) molibdanu amonu, 6% (m/v) kwasu askorbinowego oraz 0,65 mM roztwór buforu fosforanowego.

Przygotuj sześć wzorców fosforu zgodnie z instrukcją przedstawioną tutaj. Następnie przygotuj próbę ślepą LUV z taką samą objętością 0,2 milimolowej trypsyny oraz 2,0 milimolowego roztworu inhibitora Bowman BIR, jakiej użyto w przypadku kontroli. Jest to konieczne w celu skorygowania wpływu wszelkich wysuszonych soli fosforu obecnych w proszku inhibitora Bowman B.

Następnie pipetujemy około 0,1 mikromola (zazwyczaj około 25 µL) UUV do jednorazowych szklanych probówek hodowlanych w trzech powtórzeniach. Następnie do każdej z probówek z próbką, wzorcem i próbą ślepą dodajemy 450 µL 8,9 N H₂SO₄. Następnie próbki, wzorce i próby ślepe umieszczamy w piecu w temperaturze od 175 do 210 °C na 25 minut.

Po upływie 25 minut należy wyjąć wszystkie probówki z pieca i pozwolić im ostygnąć. Do każdej z probówek należy dodać 150 µL 30%H2O. Następnie próbki, wzorce i próbki ślepe należy ogrzewać przez kolejne 30 minut w temperaturze od 175 do 210 °C.

Po 30 minutach wyjmij standardy próbek oraz próbki ślepe z urządzenia grzewczego. Jeśli któraś z prób nie jest jeszcze bezbarwna, dodaj 50 µL H2O do wszystkich probówek i ogrzewaj przez dodatkowe 15 minut w temperaturze od 175 do 210 °C. Gdy roztwory staną się bezbarwne, dodaj do każdej probówki 3,9 mL nanopure H2O, 0,5 mL roztworu molibdanu amonu oraz 0,5 mL roztworu kwasu askorbinowego.

Następnie ogrzewaj wszystkie probówki przez pięć do siedmiu minut. W łaźni wodnej w temperaturze wrzenia zmierz absorbancję każdego wzorca i próbki przy 820 nanometrach, używając spektrofotometru UV-vis Agilent 8 4 5 3. Stężenia LUV w próbkach eksperymentalnych i kontrolnych należy zmierzyć oddzielnie.

Probetkę zawierającą 0,0 millimoli fosforu należy wykorzystać jako próbę ślepą dla wszystkich wzorców oraz eksperymentalnych próbek LUV. Probetkę zawierającą 0,2 millimolarny trypsynę i 2,0 millimolarny roztwór inhibitora kości i bir należy wykorzystać jako próbę ślepą dla kontrolnej próbki LUV. Uzyskaną liniową krzywą wzorcową absorbancji w funkcji zawartości fosforu należy wykorzystać do obliczenia całkowitej zawartości fosforu oraz stężenia LUV w próbkach.

Aby przygotować roztwory peptydów, należy rozpuścić peptyd w Oppu H2O; peptydy użyte w tym teście muszą zawierać jeden resztę tryptofanu. Pomiar absorbancji roztworu peptydowego należy przeprowadzić przy 282 nanometrach w trzech powtórzeniach. Stężenie peptydów należy obliczyć, korzystając ze współczynnika ekstynkcji molowej dla tryptofanu wynoszącego 5 700.

Rozcieńczyć peptyd w wodzie nanopure do stężenia końcowego 30 µM i przechowywać w temperaturze -20 °C. Aby ilościowo określić translokację, przygotować próbki eksperymentalne i kontrolne w probówkach do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml. Do każdego roztworu dodać odpowiednią ilość UUV, aby uzyskać stężenie końcowe 250 µM.

Dodać odpowiednią ilość roztworu inhibitora Bowman BIR, aby jego stężenie końcowe było 10 razy większe niż stężenie trypsyny. Dodać odpowiednią ilość buforu HEIS o stężeniu 10 mM, aby końcowa objętość roztworu wyniosła 450 µL. Przenieść 50 µL roztworu peptydowego do kuwety fluorymetrycznej Stana micro chords i umieścić ją w spektrofotometrze zgodnie z programem.

Spektrofotometr fluorescencyjny do przeprowadzenia 25-minutowego eksperymentu kinetyki fluorescencji, w którym odczyt fluorescencji jest rejestrowany co najmniej raz na sekundę przy długości fali wzbudzenia 280 nanometrów i długości fali emisji 525 nanometrów w temperaturze 25 °C. Przy ustawionej wysokiej czułości PMT, dodaj próbkę badawczą lub kontrolną do roztworu peptydów w kuwecie. Powinno to doprowadzić do uzyskania końcowego stężenia peptydów 3 µM; niezwłocznie rozpocznij eksperyment kinetyki fluorescencji.

Po przeanalizowaniu próbek eksperymentalnych i kontrolnych należy obliczyć współczynniki translokacji zgodnie z opisem w dołączonym dokumencie. Stosunek między s a peptydem jest wystarczająco wysoki, aby zapewnić, że niemal wszystkie nienaruszone peptydy znajdują się w wystarczająco bliskiej odległości od grupy danselu, by wywołać sygnał fret, nawet jeśli żaden z nich nie uległ translokacji do pęcherzyka. Jest to zgodne z podobnym sygnałem fret zaobserwowanym w warunkach kontrolnych dla peptydów, które ulegają i nie ulegają translokacji do pęcherzyków.

Testy translokacji przeprowadzono zgodnie z opisem w tym filmie. Rysunek przedstawia wyniki dla reprezentatywnego peptydu, który wykazał silną translokację. Sygnał w tym eksperymencie, reprezentowany przez czarną linię, wykazuje wyraźny spadek sygnału FRET.

Z biegiem czasu wyższe współczynniki translokacji wskazują na peptydy, które translokują efektywnie. Współczynnik translokacji dla przedstawionych tutaj peptydów penetrujących komórki wynosi 1,19; słabo translokujące peptydy mają współczynniki translokacji bliższe jedności, co pozwala skorygować potencjalną utratę sygnału FRET wynikającą z niepełnego trawienia trypsyną, inhibicji lub innych czynników niezwiązanych ze zdolnością do translokacji. Pomiarowi podlega sygnał FRET między peptydem a UUV zawierającymi zarówno trypsynę, jak i inhibitor trypsyny Bowman-Birk.

Jest to przedstawione jako szary ślad. Znaczenie eksperymentu kontrolnego z użyciem UUV zawierających inhibitor trypsyny zostało podkreślone przez dane pokazane tutaj. W tym przypadku sygnał peptydowy zmniejszył się o podobną wartość co w poprzedniej figurze w próbce eksperymentalnej reprezentowanej przez czarny ślad.

Jednakże w próbce kontrolnej obserwuje się szybszy spadek dla tego peptydu, zatem jego wypadkowa translokacja jest niższa. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre pojęcie o tym, jak przygotować pęcherzyki lipidowe i jak mierzyć translokację peptydów zawierających tryptofan. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o rozpoczęciu zbierania danych natychmiast po wymieszaniu peptydu z pęcherzykami.