Name: Pomiar translokacji peptydów do dużych pęcherzyków jednopłytkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Poznaj metodę pomiaru translokacji peptydów do dużych pęcherzyków jednopłytkowych z wykorzystaniem FRET i trypsyny. Ta technika pozwala ilościowo ocenić kinetykę przenikania peptydów przez błony lipidowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Eleanor Fleming i Jessica Chen za pomocne dyskusje. Finansowanie zapewnił National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIH-NIAID) w ramach grantu R15AI079685 oraz Research Corporation Cottrell College Science Award. Dodatkowe wsparcie dla studentów zapewnili Howard Hughes Medical Institute oraz fundusz Staley.

1. Przygotowanie dużych jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych (LUVs)
<ol>
 <li>Przygotować LUV, które będą służyć jako imitacje błon komórkowych w analizie19.</li>
 <li>Zmieszać fosfatydylocholinę (POPC, 760,10 g/mol), fosfatydyloglicerol (POPG, 770,99 g/mol) oraz 5-dimetylaminonaftalen-1-sulfonyl fosfatydyloetanolaminę (DNS-POPE, 994,350 g/mol) (Avanti Polar Lipids) rozpuszczone w chloroformie w stosunku 50:45:5. Ponieważ każda analiza wymaga oddzielnego przygotowania LUV eksperymentalnych i kontrolnych, należy przygotować dwie fiolki z osadem lipidowym. 0,376 mg całkowitej masy lipidów (0,188 mg POPC, 0,169 mg POPG i 0,019 mg DNS-POPE) jest zazwyczaj wystarczające do otrzymania liczby pęcherzyków niezbędnej do jednej próby translokacji.</li>
 <li>Odparować chloroform za pomocą strumienia gazu N2.</li>
 <li>Suszyć osad lipidowy przez 9–14 godzin w deskatorze próżniowym.</li>
 <li>Przygotować roztwór buforu HEPES 10 mM (10 mM HEPES, 238,3 g/mol, 45 mM NaCl, 58,44 g/mol, 1 mM EDTA, 372,24 g/mol, pH 7,4). Bufor HEPES przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Przygotować roztwór treściwy trypsyny wieprzowej (23,3 kg/mol) o stężeniu 0,4 mM w powyższym buforze HEPES 10 mM. Trypsynę przechowywać w temperaturze -20°C; w naszej praktyce zazwyczaj nie poddaje się ona więcej niż 2 cyklom zamrażania i rozmrażania przed użyciem.</li>
 <li>Przygotować roztwór treściwy inhibitora trypsyny Bowmana-Birka (8 kg/mol) o stężeniu 4,0 mM w buforze HEPES 10 mM i przechowywać w temperaturze -20°C. W naszej praktyce zapas ten jest uzupełniany co miesiąc i zazwyczaj nie poddaje się więcej niż 3 cyklom zamrażania i rozmrażania przed ponownym przygotowaniem.</li>
 <li>Rekonstytuować eksperymentalne pęcherzyki wielowarstwowe (MLV) w roztworze trypsyny 0,2 mM, dodając do wysuszonego osadu lipidowego równą objętość roztworu treściwego trypsyny 0,4 mM oraz buforu HEPES 10 mM. Dla pojedynczej próbki o zawartości 0,376 mg całkowitego lipidu wystarczająca jest mieszanina 150 μL roztworu trypsyny i 150 μL buforu HEPES.</li>
 <li>Rekonstytuować kontrolne MLV w roztworze zawierającym 0,2 mM trypsyny i 2,0 mM inhibitora trypsyny Bowmana-Birka, dodając do wysuszonych osadów lipidowych równą objętość roztworu treściwego trypsyny 0,4 mM i inhibitora trypsyny 4,0 mM. Dla pojedynczej próbki o zawartości 0,376 mg całkowitego lipidu wystarczająca jest mieszanina 150 μL roztworu trypsyny i 150 μL inhibitora trypsyny.</li>
 <li>Przenieść roztwory MLV z fiolek szklanych do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml.</li>
 <li>Poddać roztwory MLV 5 cyklom zamrażania i rozmrażania w ciekłym azocie.</li>
 <li>Przygotować ekstruder lipidowy (Avanti Polar Lipids), umieszczając dwa zwilżone buforem HEPES wsporniki filtrów na każdym teflonowym elemencie ekstrudera. Pomiędzy dwoma teflonowymi elementami ekstrudera umieścić membranę Nuclepore z trawionymi kanałami o średnicy porów 0,1 μm (Whatman, Wielka Brytania), a następnie umieścić elementy ekstrudera w metalowym kanistrze ekstrudera. Przed dokręceniem metalnej górnej części kanistra ekstrudera i umieszczeniem go w uchwycie, nałożyć pierścieniową przekładkę na oba elementy ekstrudera.</li>
 <li>Wypełnić wolną przestrzeń w ekstruderze 500 μL buforu HEPES 10 mM za pomocą szklanej strzykawki 250 μL, aby zapobiec utracie próbki pęcherzyków.</li>
 <li>Wprowadzić każdą próbkę MLV do ekstrudera i przepchnąć próbkę przez membranę co najmniej 21 razy, aby zapewnić jednolity rozmiar pęcherzyków jednowarstwowych. LUV otrzymuje się z roztworu MLV po ekstruzji.</li>
 <li>Przechowywać LUV w temperaturze 4°C i zużyć w ciągu 48 godzin.</li>
</ol>
2. Oznaczanie stężenia LUV
<ol>
 <li>Stężenie LUV określono poprzez wyznaczenie całkowitej zawartości fosforu w próbce20.</li>
 <li>Przygotować 8,9 N H2SO4 w wodzie nanopure i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przygotować 2,5% w/v roztwór molibdanu amonu(VI) (588,04 g/mol) w wodzie nanopure. Przygotować 10% w/v roztwór kwasu askorbinowego (176,1 g/mol) w wodzie nanopure. Chronić roztwór kwasu askorbinowego przed światłem, owijając probówkę folią. Oba roztwory przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 2 miesiące.</li>
 <li>Przygotować roztwór buforu fosforanowego 0,65 mM (bezwodny fosforan sodu jednopodstawowy, 120 g/mol).</li>
 <li>Przygotować sześć probówek ze wzorcami. Standardy powinny zawierać odpowiednio 0,0 μL, 50 μL (0,0325 μmoli), 100 μL (0,065 μmoli), 175 μL (0,114 μmoli), 250 μL (0,163 μmoli) lub 350 μL (0,228 μmoli) roztworu fosforu.</li>
 <li>Przygotować próbki LUV w trzech powtórzeniach. Każda probka z próbką powinna zawierać około 0,1 μmoli LUV. Stężenia LUV dla próbek doświadczalnych i kontrolnych należy mierzyć oddzielnie.</li>
 <li>Aby skorygować wpływ ewentualnych wysuszonych soli fosforanowych w proszku inhibitora Bowmana-Birka, należy przygotować próbę ślepą LUV. Próba ślepa powinna zawierać taką samą objętość roztworu trypsyny 0,2 mM/inhibitora Bowmana-Birka 2,0 mM, jaka została dodana do kontrolnej probki LUV.</li>
 <li>Do każdej z probówek z próbkami, wzorcami i próbami ślepymi wlać 450 μL 8,9 N H2SO4.</li>
 <li>Nagrzewać próbki, wzorce i próby ślepe przez 25 minut w temperaturze 175-210 °C w piecu.</li>
 <li>Wyjąć wszystkie probówki i pozwolić im ostygnąć. Do każdej z probówek dodać 150 μL 30% H2O2.</li>
 <li>Nagrzewać próbki, wzorce i próby ślepe przez 30 minut w temperaturze 175-210 °C.</li>
 <li>Zdjąć próbki, wzorce i próby ślepe z ogrzewania. Jeśli którykolwiek z roztworów nie jest jeszcze bezbarwny, dodać 50 μL H2O2 do wszystkich probówek i nagrzewać przez dodatkowe 15 minut w temperaturze 175-210 °C.</li>
 <li>Do każdej probówki dodać 3,9 mL nanopure H2O, 0,5 mL roztworu molibdanu amonu i 0,5 mL roztworu kwasu askorbinowego.</li>
 <li>Nagrzewać wszystkie probówki przez 5-7 minut w kąpieli wodnej o temperaturze wrzenia.</li>
 <li>Zmierzyć absorbancję każdego wzorca i próbki przy 820 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis Agilent 8453. Probówkę zawierającą 0,0 mmoli fosforu należy wykorzystać jako próbę ślepą dla wszystkich wzorców i doświadczalnych próbek LUV. Probówkę zawierającą roztwór trypsyny 0,2 mM/inhibitora Bowmana-Birka 2,0 mM należy wykorzystać jako próbę ślepą dla kontrolnej próbki LUV.</li>
 <li>Na podstawie wyników można sporządzić liniową krzywą wzorcową zależności absorbancji od zawartości fosforu, a następnie obliczyć całkowitą zawartość fosforu oraz stężenie LUV w próbkach.</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworów peptydów
<ol>
 <li>Rozpuścić peptyd w wodzie nanopure H2O. Peptydy stosowane w tym teście, zgodnie z opisem, muszą zawierać jedną resztę tryptofanu.</li>
 <li>Zmierzyć absorbancję roztworu peptydu przy 282 nm w trzech powtórzeniach. Obliczyć stężenie peptydu, korzystając ze współczynnika ekstynkcji molowej dla tryptofanu wynoszącego 5700 M-1cm-1.</li>
 <li>Rozcieńczyć peptyd w wodzie nanopure do stężenia końcowego 30 μM. Przechowywać w temperaturze -20°C.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja translokacji
<ol>
 <li>Przygotować próbki badawcze i kontrolne w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL. Do każdego roztworu dodać odpowiednią ilość LUV, aby uzyskać stężenie końcowe 250 μM. Dodać odpowiednią ilość roztworu inhibitora Bowmana-Birka, tak aby stężenie końcowe inhibitora było 10X wyższe niż stężenie trypsyny. Dodać odpowiednią ilość buforu HEPES 10 mM, aby doprowadzić końcową objętość roztworu do 450 μL.</li>
 <li>Przenieść 50 μL roztworu peptydów do mikrokuwety kwarcowej fluorometru Starna. Stosunek LUV do peptydów jest na tyle wysoki, aby zapewnić, że niemal wszystkie nienaruszone peptydy znajdują się w wystarczającej bliskości grupy dansylowej, by generować sygnał FRET, nawet jeśli żaden z nich nie przeszedł do wnętrza pęcherzyka. Jest to zgodne z podobnym efektem FRET obserwowanym w warunkach kontrolnych dla peptydów, które translokują oraz tych, które nie translokują do pęcherzyków.</li>
 <li>Dodać próbkę badawczą lub kontrolną do roztworu peptydów w kuwecie. Powinno to doprowadzić do uzyskania końcowego stężenia peptydów wynoszącego 3 μM.</li>
 <li>Rozpocząć 25-minutowy eksperyment z kinetyki fluorescencji natychmiast po dodaniu badawczego lub kontrolnego roztworu LUV, wykonując pomiar fluorescencji co najmniej raz na sekundę. Ustawić długość fali wzbudzenia na 280 nm, długość fali emisji na 525 nm oraz temperaturę na 25 °C. Korzystając ze spektrofluorometru Cary Eclipse, ustawiono wysoką czułość PMT.</li>
</ol>
5. Obliczanie ilościowego współczynnika translokacji
<ol>
 <li>Zdefiniuj początkową fluorescencję (Fo) jako odczyt fluorescencji po piętnastu sekundach zbierania danych. W naszej konfiguracji urządzenia ustalono, że pierwsze piętnaście sekund zgromadzonych danych fluorescencji jest niewiarygodnych ze względu na mieszanie, zamykanie komory z próbką oraz inne zakłócenia systemu podczas dodawania próbki. Podziel każdy kolejny odczyt przez Fo, aby uzyskać względną fluorescencję (F/F0) dla każdego punktu czasowego.</li>
 <li>Oblicz średnią ze wszystkich odczytów względnej fluorescencji z ostatniej minuty eksperymentu, aby uzyskać końcową średnią względną fluorescencję <img alt="Wzór na stosunek fluorescencji [F/F0]avg, stosowany w badaniach optycznych do analizy emisji." src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="[F/Fo]avg">.</li>
 <li>Podziel <img alt="Wzór na stosunek fluorescencji [F/F0]avg, stosowany w badaniach optycznych do analizy emisji." src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="[F/Fo]avg"> dla próbek kontrolnych przez <img alt="Wzór na stosunek fluorescencji [F/F0]avg, stosowany w badaniach optycznych do analizy emisji." src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="[F/Fo]avg"> dla próbek eksperymentalnych, aby uzyskać skorygowaną końcową wartość fluorescencji.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 2 przedstawia wyniki tego testu dla reprezentatywnego peptydu, który wykazał silną translokację. Sygnał w tym doświadczeniu (czarna linia) wykazuje wyraźny spadek sygnału FRET w czasie. Należy jednak kontrolować potencjalną utratę sygnału FRET wynikającą z niepełnego hamowania trypsyny lub innych czynników niezwiązanych ze zdolnością do translokacji. W tym celu zawsze mierzymy również sygnał FRET pomiędzy peptydem a LUV zawierającymi zarówno trypsynę, jak i inhibitor trypsyny Bowmana-Birka (szara linia, Rysunek 2). W naszej praktyce kluczowe okazało się przeprowadzanie tej kontroli dla każdego peptydu przy każdym wykonaniu eksperymentu. Pozwala nam to precyzyjnie skorygować wszelkie zmiany sygnału wynikające z różnic między preparatami pęcherzyków lipidowych lub szumem aparatury, który może być znaczący w przypadku stosunkowo słabych sygnałów fluorescencyjnych typowo obserwowanych przy tych stężeniach.
Znaczenie eksperymentu kontrolnego z użyciem LUV zawierających inhibitor trypsyny zostało podkreślone przez dane przedstawione na Rysunku 3. W tym przypadku sygnał peptydowy zmalał w stopniu podobnym do tego z Rysunku 2 w próbce badawczej (czarna linia). Jednak w próbce kontrolnej obserwuje się szybszy spadek dla tego peptydu, w związku z czym jego netto translokacja jest niższa.
W sekcji 5 naszego protokołu opisano prostą metodę ilościowego oznaczania translokacji w tym eksperymencie. Wyższe współczynniki translokacji wskazują na peptydy, które translokują efektywnie; współczynnik translokacji dla peptydu przenikającego przez błony komórkowe pokazanego na rysunku 2 wynosi 1,16, podczas gdy peptydy słabo translokujące mają współczynniki translokacji bliższe 1. Z naszego doświadczenia wynika, że błąd standardowy dla trzech niezależnych eksperymentów przeprowadzonych z użyciem różnych preparatów pęcherzyków mieści się w zakresie od 0,01 do 0,06.
<img alt="Schemat edycji genomu wirusowego, CRISPR-Cas9, analiza procesu oddziaływań molekularnych." src="/files/ftp_upload/3571/3571fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat testu translokacji. Eksperymentalne próbki LUV (A) są domieszkowane fluorescencyjnym dansylowym POPE (czarne paski) i zawierają enkapsulowaną trypsynę (nożyczki). Inhibitor trypsyny (czerwone koło) jest stosowany do hamowania trypsyny poza LUV. LUV są poddane działaniu peptydu (fioletowy). Asocjacja peptydu z błonami LUV generuje sygnał FRET (zielony), który maleje w miarę jak translokujące peptydy napotykają niehamowaną trypsynę wewnętrzną. Zarówno trypsyna, jak i inhibitor trypsyny są enkapsulowane w kontrolnych próbkach LUV (B) w celu zmierzenia spadków sygnału FRET niezwiązanych z translokacją.
<img alt="Wykres intensywności fluorescencji (F/F₀) w czasie; analiza danych kontrolnych i eksperymentalnych." src="/files/ftp_upload/3571/3571fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywne dane dla peptydu przenikającego przez błony komórkowe. Reprezentatywny translokujący peptyd przeciwdrobnoustrojowy wykazuje znaczący spadek sygnału FRET w porównaniu z próbką kontrolną.
<img alt="Wykres zaniku fluorescencji; grupa kontrolna vs. eksperymentalna; czas vs. F/F₀; porównanie analizy danych." src="/files/ftp_upload/3571/3571fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Reprezentatywne dane podkreślające znaczenie kontroli. Niepełne hamowanie trawienia trypsynowego peptydu nietranslokującego prowadzi do spadku sygnału FRET w czasie zarówno w eksperymentalnych, jak i kontrolnych roztworach LUV. Ponieważ różnica między śladami kontrolnymi a eksperymentalnymi jest stosunkowo niewielka, mutant ten został określony jako peptyd słabo translokujący.

<ol><li>Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides+and+antimicrobial+peptides%3A+how+different+are+they%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they?</a> Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).</li>
<li>Trehin, R., Merkle, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chances+and+pitfalls+of+cell+penetrating+peptides+for+cellular+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 209-209 (2004).</li>
<li>Temsamani, J., Vidal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cell-penetrating+peptides+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">The use of cell-penetrating peptides for drug delivery.</a> Drug Discov. Today. 9 (23), 1012-1012 (2004).</li>
<li>Hale, J. D., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+mechanisms+of+action+of+cationic+antimicrobial+peptides+on+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anti-Infective+Therapy%22%5BJournal%5D)">Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria.</a> Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5 (6), 951-951 (2007).</li>
<li>Nicolas, P., Rosenstein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+host+defense+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Multifunctional host defense peptides.</a> FEBS J. 276 (22), 6464-6464 (2009).</li>
<li>Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Action+on+Escherichia-Coli+of+Cecropin-P1+and+Pr-39%2C+2+Antibacterial+Peptides+from+Pig+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine.</a> Infection and Immunity. 61 (7), 2978-2978 (1993).</li>
<li>Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+action+of+the+antimicrobial+peptide+buforin+II%3A+Buforin+II+kills+microorganisms+by+penetrating+the+cell+membrane+and+inhibiting+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 244 (1), 253-253 (1998).</li>
<li>Bobone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thin+line+between+cell-penetrating+and+antimicrobial+peptides%3A+the+case+of+Pep-1+and+Pep-1-K%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pept.+Sci%22%5BJournal%5D)">The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K.</a> J. Pept. Sci. 17 (5), 335-335 (2011).</li>
<li>Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Membrane-Translocating+Peptides+by+Orthogonal+High-throughput+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc.%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening.</a> J. Am. Chem. Soc.. , (2011).</li>
<li>Rosenbluh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+histone+proteins+across+lipid+bilayers+and+Mycoplasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes.</a> J. Mol. Biol. 345 (2), 387-387 (2005).</li>
<li>Bárány-Wallje, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+reassessment+of+penetratin+translocation+across+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes.</a> Biophys. J. 89 (4), 2513-2513 (2005).</li>
<li>Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+beta-galactosidase+mediated+by+the+cell-penetrating+peptide+pep-1+into+lipid+vesicles+and+human+HeLa+cells+is+driven+by+membrane+electrostatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential.</a> Biochemistry. 44 (30), 10189-10189 (2005).</li>
<li>Orioni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+perturbation+by+the+antimicrobial+peptide+PMAP-23%3A+a+fluorescence+and+molecular+dynamics+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1788 (7), 1523-1523 (2009).</li>
<li>Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+and+analyze+tryptophan+fluorescence+in+membranes+properly%2C+and+why+bother%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother?</a> Anal. Biochem. 285 (2), 235-235 (2000).</li>
<li>Epand, R. M., Epand, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+as+models+for+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Liposomes as models for antimicrobial peptides.</a> Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).</li>
<li>Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+the+novel+antimicrobial+peptide+buforin+2+with+lipid+bilayers%3A+Proline+as+a+translocation+promoting+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor.</a> Biochemistry. 39 (29), 8648-8648 (2000).</li>
<li>Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+a+channel-forming+antimicrobial+peptide%2C+magainin+2%2C+across+lipid+bilayers+by+forming+a+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore.</a> Biochemistry. 34 (19), 6521-6521 (1995).</li>
<li>Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluating+the+role+of+strongly+charged+sequences+in+amphipathic+cell-penetrating+peptides%3A+a+fluorescence+study+using+Pep-1%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1.</a> FEBS Lett. 579 (20), 4498-4498 (2005).</li>
<li>Torchilin, V. P., Weissig, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTorchilin%2C+VP+%22Liposomes%22">Liposomes</a>. , Oxford University Press. New York. (2003).</li>
<li>Almeida, P. F., Pokorny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avanti+Polar+Lipids%2C+Determination+of+Total+Phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus.</a> Biochemistry. 1686 (34), 8083-8083 (2009).</li>
<li>Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+translocation+mechanism+of+the+antimicrobial+peptide+buforin+2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2.</a> Biochemistry. 43 (49), 15610-15610 (2004).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Przedstawiony tutaj protokół może być wykorzystany do oceny względnej zmiany stężenia peptydów wewnątrz i na zewnątrz pęcherzyków lipidowych. Zmiany te są związane ze zdolnością do translokacji. Protokół ten może służyć do identyfikacji peptydów przenikających przez błony komórkowe o potencjale jako wektory dostarczania leków. Wraz ze wzrostem zainteresowania peptydami przenikającymi przez błony, interesujące będzie obserwowanie, w jaki sposób metody bezpośrednio mierzące zdarzenie translokacji będą rozwijane i stosowane...

<table><tbody><tr><td>16:0-18:1 PG</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td>1:18 Dansyl PE</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>810330C</td><td></td></tr><tr><td>16:0-18:1 PC</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna wieprzowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-0303</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny/chymotrypsyny Bowmana-Birka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9777</td><td></td></tr><tr><td>Mini-ekstruder</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Molibdan amonu (para)</td><td>Alfa Aesar</td><td>10811</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1417</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru, roztwór 30%</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>5240-05</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9625</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-0751</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar translokacji peptydów do dużych pęcherzyków jednowarstwowych

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Istnieje duże zainteresowanie peptydami, które łatwo przenikają przez błony komórkowe bez udziału receptorów błonowych1. Wiele z nich określa się mianem peptydów penetrujących komórki, które często wskazuje się jako potencjalne wektory dostarczania leków1-3. Ponadto rośnie zainteresowanie peptydami przeciwdrobnoustrojowymi, które działają poprzez niemembranowe mechanizmy lityczne4,5, w szczególności tymi, które przenikają przez błony bakteryjne bez wywoływania lizy komórkowej i zabijają komórki poprzez zakłócanie procesów wewnątrzkomórkowych6,7. W rzeczywistości autorzy coraz częściej wskazują na związek między peptydami penetrującymi komórki a peptydami przeciwdrobnoustrojowymi1,8. Dogłębne zrozumienie procesu translokacji przez błony oraz związku między strukturą peptydu a jego zdolnością do translokacji wymaga skutecznych i powtarzalnych testów translokacji. Kilka grup zaproponowało metody pomiaru translokacji do dużych jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych (LUVs)9-13. LUVs stanowią użyteczne modele błon komórkowych bakterii i eukariontów i są często wykorzystywane w badaniach fluorescencyjnych peptydów14,15. W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie metody opracowanej pierwotnie przez Matsuzakiego i współpracowników do badania peptydów przeciwdrobnoustrojowych, takich jak magainina i buforyna II16,17. Oprócz przedstawienia protokołu tej metody, prezentujemy również proste podejście do analizy danych, które pozwala ilościowo określić zdolność do translokacji przy użyciu tego testu. Zaletą tego testu translokacji w porównaniu z innymi jest potencjalna możliwość uzyskania informacji o szybkości translokacji przez błonę oraz brak konieczności dodawania znacznika fluorescencyjnego, który może zmieniać właściwości peptydów18, w przypadku peptydów zawierających tryptofan. W skrócie, zdolność do translokacji do pęcherzyków lipidowych jest mierzona jako funkcja transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) między natywnymi resztami tryptofanu a dansylowaną fosfatydyloetanolaminą, gdy białka są związane z zewnętrzną błoną LUV (Rycina 1). Peptydy penetrujące komórki są rozszczepiane w momencie zetknięcia z nieinhibowaną trypsyną zamkniętą w LUVs, co prowadzi do dysocjacji z błony LUV i spadku sygnału FRET. Spadek sygnału FRET obserwowany dla peptydu translokującego jest znacznie większy niż ten obserwowany dla tego samego peptydu, gdy LUVs zawierają zarówno trypsynę, jak i inhibitor trypsyny, lub gdy peptyd, który nie przenika samoistnie przez błony lipidowe, jest wystawiony na działanie LUVs zawierających trypsynę. Ta zmiana fluorescencji zapewnia bezpośrednią kwantyfikację translokacji peptydu w czasie.

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metodę ilościowego pomiaru translokacji peptydów do dużych jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych. Metoda ta dostarcza również informacji o szybkości translokacji przez błonę i może być wykorzystana do identyfikacji peptydów, które w sposób wydajny i spontaniczny przenikają przez dwuwarstwy lipidowe.

Pomiar translokacji peptydów do dużych pęcherzyków jednowarstwowych

Istnieje duże zainteresowanie peptydami, które łatwo przenikają przez błony komórkowe bez udziału receptorów błonowych1. Wiele z nich określa się mianem...

W celu ilościowego oznaczenia translokacji peptydów przez błony pęcherzyków generowane są fluorescencyjnie znakowane pęcherzyki lipidowe z enkapsulowaną trypsyną. Dodaje się inhibitor trypsyny, aby zahamować aktywność trypsyny egzogennej, pozostawiając aktywną trypsynę w świetle pęcherzyka.Dopiero po dodaniu fluorescencyjnie znakowanych peptydów do pęcherzyków ich znaczniki fluorescencyjne pełnią rolę donorów FRET i wzbudzają cząsteczki fluorescencyjne na pęcherzyku. Jednak gdy białka przechodzą przez błonę, są trawione przez trypsynę, co prowadzi do utraty sygnału FRET. Analiza spektrometryczna pozwala określić zakres translokacji peptydów, co objawia się jako spadek sygnału FRET między pęcherzykami a peptydem w czasie.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, w tym innymi technikami z wykorzystaniem pęcherzyków lipidowych oraz metodami pomiaru wnikania peptydów do komórek, jest to, że dostarcza ona informacji o kinetyce wnikania przez błonę i nie wymaga dodawania znacznika fluorescencyjnego do peptydów, jeśli zawierają one tryptofan. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące projektowania i inżynierii peptydów aktywnych błonowo, takie jak ok

measuring-peptide-translocation-into-large-unilamellar-vesicles

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pomiar translokacji peptydów do dużych unilamellarnych wezykułek

Ten film omawia test wycieku fluorescencji w celu zbadania interakcji peptydów penetrujących komórki z błonami komórkowymi za pomocą mimiki błony komórkowej - dużych pęcherzyków jednopłytkowych lub LUV, otoczonych barwnikiem fluorescencyjnym i gaszącym.

Test nieszczelności fluorescencji w celu zbadania interakcji peptydu przenikającego przez komórkę z błoną

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Prezentujemy technikę bezdotykowej mikromanipulacji pęcherzykami, wykorzystując zlokalizowane gradienty jonów wapnia. Mikroiniekcja roztworu jonów wapnia w pobliżu gigantycznego pęcherzyka lipidowego jest wykorzystywana do przebudowy błony lipidowej, w wyniku czego powstają wypukłości rurki błonowe.

Przebudowa błony gigantycznych pęcherzyków w odpowiedzi na zlokalizowane gradienty jonów wapnia

Przedstawione tutaj są protokoły tworzenia małych jednopłytkowych pęcherzyków opartych na peptydach, zdolnych do wzrostu. Aby ułatwić produkcję pęcherzyków peptydu błonowego, pęcherzyki te są wyposażone w system transkrypcyjno-translacyjny i plazmid kodujący peptydy.

In Vesiculo Synteza prekursorów błony peptydowej do autonomicznego wzrostu pęcherzyków

Celem protokołu jest wiarygodny pomiar właściwości mechanicznych membrany gigantycznych pęcherzyków za pomocą aspiracji mikropipet.

Wykrywanie gigantycznych jednopłytkowych pęcherzyków hybrydowych przez elektroformację i pomiar ich właściwości mechanicznych za pomocą aspiracji mikropipetami

Test wycieku fluorescencji to prosta metoda, która umożliwia badanie interakcji peptyd/błona, aby zrozumieć ich udział w kilku procesach biologicznych, a zwłaszcza zdolność peptydów penetrujących komórki do zakłócania dwuwarstwowych fosfolipidów podczas bezpośredniego procesu translokacji komórkowej.

Test przecieku fluorescencyjnego w celu zbadania destabilizacji błony przez peptyd penetrujący komórkę

Ten protokół opisuje oparte na iSCAT przetwarzanie obrazów i śledzenie pojedynczych cząstek, które umożliwia jednoczesne badanie masy cząsteczkowej i dyfuzyjnego zachowania makrocząsteczek oddziałujących z błonami lipidowymi. Instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbki, konwersji masy na kontrast, akwizycji filmu i obróbki końcowej są dostępne wraz ze wskazówkami, aby zapobiec potencjalnym pułapkom.

Śledzenie cząstek czułych na masę w celu scharakteryzowania dynamiki makrocząsteczek związanych z błoną

Ten artykuł przedstawia metodę przygotowywania złożonych wielowarstwowo-jednowarstwowych pęcherzyków (cGUVs) o strukturze pęcherzyka w pęcherzyku, z dostosowaną przewodnością elektryczną w regionach wewnętrznym, pierścieniowym i zewnętrznym. Elektroformacja syntetyzuje proste GUV, które są przekształcane w stomatocyty i cGUV za pomocą wstrząsu osmotycznego, zapewniając wartościowy model do badania biofizyki komórek z jądrami.

Synteza złożonych gigantycznych jednowarstwowych pęcherzyków: Biomimetyczny model komórek z jądrem

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Przedstawiono protokół eksperymentalny do składania, stymulacji elektrycznej i analizy kropli dwuwarstwy lipidowych zmodyfikowanych gramicydyną A. Relacje struktura-funkcja lipidów i białek są ilościowo określane poprzez pomiar zmian w obszarze błony, przepływie jonowym i przewodnictwie pojedynczego kanału oraz odniesienie tych reakcji do zmian przypominających plasticzne zmiany w przewodnictwie jonowym w modelu błony inspirowanym synapsami elektrycznymi.

Charakterystyka struktury i funkcji błony lipidowo-białkowej z wykorzystaniem warstw dwubiegunowych interfejsu kropelkowego

Poznaj metodę pomiaru translokacji peptydów do dużych pęcherzyków jednopłytkowych z wykorzystaniem FRET i trypsyny. Ta technika pozwala ilościowo ocenić kinetykę przenikania peptydów przez błony lipidowe.

Pomiar translokacji peptydów do dużych pęcherzyków jednowarstwowych

Przeglądaj więcej filmów