Ocena hipermutacji somatycznej w limfocytach B linii Ramos po nadekspresji lub wyciszeniu specyficznych genów

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zmiana ekspresji genu, a następnie zmierzenie jej wpływu na somatyczną hipermutację. Osiąga się to poprzez transfekcję komórek Bosque 23 w celu wytworzenia cząsteczek wirusowych zawierających konstrukt prowadzący do nadekspresji lub konstrukt zawierający SHRA. W drugim kroku komórki ramo są infekowane wirusami, co prowadzi do wyciszenia lub nadekspresji badanego genu.

Następnie klony pojedynczych komórek są hodowane przez kilka tygodni, aby umożliwić komórkom akumulację mutacji. Ostatecznie wpływ zmienionej ekspresji genów można określić na podstawie analizy utraty IgM oraz poprzez sekwencjonowanie genów IG. Metoda ta może pomóc w identyfikacji nowych czynników biorących udział w dywersyfikacji przeciwciał.

Rozpocznij od odpipetowania 600 µL ocieplonego DMEM do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Następnie, uważając, aby pipetować bezpośrednio do medium, dodaj do probówki 30 µL FUgene 6, wymieszaj roztwór w wstrząsarze wirowym przez mniej niż sekundę, a następnie inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie, w przypadku infekcji lentiwirusem, takiej jak w tym przypadku, dodaj 6 µg konstruktu shRNA oraz po 1,5 µg pVSVG-pMDLgPRRE i pRSV-rev do mieszaniny DMEM i FUgene 6.

Krótko wymieszaj roztwór w wirówce typu vortex, a następnie ponownie inkubuj przez 25 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec przeprowadź transfekcję hodowli komórek Bosque 23 o konfluencji 50 do 60% za pomocą kompleksu D-N-A-D-M-E-M FU gene six. Wymieszaj i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.

Następnego dnia dodać pięć mililitrów DMEM do komórek i przenieść je z powrotem do inkubatora na kolejne 24 godziny. Trzeciego dnia po transfekcji, za pomocą strzykawki 10 ml, pobrać 10 ml pożywki z komórek transfektowanych, a następnie założyć filtr 0,45 µm na koniec strzykawki. Przefiltrowaną pożywkę zebrać do czystej polipropylenowej probówki 15 ml. Na 24 godziny przed infekcją wysiać dwie mililitry komórek RAMO w stężeniu 2 × 10⁵ komórek/ml w pełnej pożywce RPMI do płytki sześciodołkowej. Następnego dnia dodać do komórek RAMO trzy mikrolitry roztworu polybrenu o stężeniu 10 µg/ml oraz jeden mililitr wirusa, a następnie dokładnie wymieszać zawiesinę komórkową poprzez pipetowanie.

W przypadku kontroli niezinfekowanej, zamiast wirusa, dodaj do jednej z studzienek jeden mililitr kompletnego medium RPMI oraz trzy mikrolitry poly brain. Dodatkowo zainfekuj jedną studzienkę dopasowaną kontrolą negatywną, a kolejną wektorem zawierającym GFP w celu określenia wydajności infekcji za pomocą FACS. Następnie odwiruj płytkę sześciodołkową z prędkością 3000 ×g przez 90 minut w temperaturze pokojowej, a potem umieść płytkę z powrotem w inkubatorze na 48 godzin.

Na koniec odwirować zainfekowane komórki w 15 mililitrowej probówce z polipropylenu przy 400 Gs przez cztery minuty. W temperaturze pokojowej odprowadzić medium, uważając, aby nie naruszyć warstwy komórek, a następnie zawiesić komórki w świeżym medium RPMI. Po przeliczeniu komórek, rozcieńczyć alikwot zainfekowanych komórek RAMO do stężenia 10 komórek na mililitr.

W roztworze pożywki RPMI warunkowanej i FBS do końcowej objętości 10 mililitrów dla każdej wysiewanej płytki. Następnie, używając pipety wielokanałowej, należy wysiać na płytki 96-dołkowe po 100 µL rozcieńczonych komórek na dołek.

Po inkubowaniu płytek przez 24 godziny w temperaturze 37°C i w atmosferze 5% CO2, należy sprawdzić każdą poszczególną studnijkę za pomocą mikroskopu. Pozwoli to potwierdzić obecność komórek, ponieważ ustalenie odpowiedniej głębokości ostrości w celu zidentyfikowania pojedynczych komórek może być trudne. Najpierw należy spróbować ustawić ostrość na numerach studnijek wytłoczonych na dnie płytki 96-dołkowej.

Następnie spróbuj wyszukać komórki po dwóch tygodniach. Sprawdź, czy wzdłuż krawędzi studzienek znajdują się kolonie komórek, używając trwałego pisaka. Zaznacz studzienki z intensywnym wzrostem komórek, a następnie przenieś kolonie do płytek 24-dołkowych w 1 ml RPMI w celu dalszej inkubacji.

Po kilku dniach wzrostu przenieść komórki na płytkę sześciodołkową i kontynuować inkubację kultur. Trzy tygodnie po wysianiu kolonii komórkowych na płytkę sześciodołkową, przenieść 5×10⁵ komórek z każdego dołka do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. W tym samym czasie zebrać komórki z każdego z dołków kontrolnych i dołków z knockdownem HRNA, a także jedną próbkę do kontroli niebarwionej.

Następnie odwiruj wszystkie komórki z siłą 400 G przez cztery minuty w temperaturze pokojowej, dwukrotnie przemywając komórki 1 ml PBS podczas drugiego wirowania. Po drugim przemyciu zawieszamy osad kontrolny bez barwienia w 50 µl PBS, a pozostałe osady w PBS z dodatkiem przeciwciała anty-ludzkie IGM znakowanego PE w rozcieńczeniu 1:20. Następnie inkubuj wszystkie próbki komórek na lodzie przez jedną godzinę, po czym przemyj komórki jeszcze dwa razy PBS w ten sam sposób co wcześniej, odlej nadsącz i ponownie zawieś wszystkie osady w 100 µl PBS.

Następnie przenieś resuspenderowane komórki barwione oraz kontrolne niebarwione do probówek typu fax, a następnie poddaj komórki analizie za pomocą cytometrii przepływowej. Porównaj odsetek komórek ujemnych pod względem IgM w grupach kontrolnych oraz w komórkach z wyciszeniem S-H-R-N-A. Do komórek bosque 23 dokonano transfekcji retrowirusowego wektora nadekspresyjnego dla ID.

Następnie zebrano wirusy i wykorzystano je do zakażenia komórek Ramos, zarówno typu dzikiego (wt), jak i komórek z nadekspresją AID (AID.High). Komórki wysiano pojedynczo i hodowano przez trzy tygodnie, po czym przeanalizowano ekspresję genów metodą qRT-PCR. Zgodnie z oczekiwaniami, wyniki qRT-PCR wykazały wyraźny wzrost ekspresji AID po zakażeniu komórek wektorem nadekspresyjnym AID. Za pomocą metody FACS oceniono również utratę IgM w zakażonych komórkach. Poziom powierzchniowego IgM zmierzono metodą FACS w punkcie czasowym trzech tygodni (zgodnie z poprzednią rycina), a następnie obliczono procent utraty IgM dla komórek typu dzikiego oraz komórek AID.High i przedstawiono wyniki graficznie. Jak oczekiwano, komórki z nadekspresją AID wykazały większą utratę powierzchniowego IgM.

W oddzielnym eksperymencie w komórkach bosque 23 wytworzono lentiwirusy zawierające albo nieistotne S-H-R-N-A jako kontrolę, albo S-H-R-N-A przeciwko czynnikowi naprawy DNA o wysokiej wierności, który według przewidywań chroni przed SHM. Następnie lentiwirusy zainfekowano w klonie o wysokim poziomie ID komórek Ramos. Ponownie przeanalizowano ekspresję genów i, zgodnie z oczekiwaniami, zaobserwowano spadek poziomów czynnika naprawy DNA w obecności ukierunkowanego S-H-R-N-A przeciwko temu czynnikowi; po trzech tygodniach przeanalizowano również utratę IGM w klonach pojedynczych komórek. Ponieważ uważa się, że czynnik naprawczy zapewnia ochronę przed mutacjami podczas SHM, w jego nieobecności dochodzi do zwiększenia utraty IGM oraz SHM, co można zaobserwować na tej rycinie.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić infekcje wirusowe linii surowych komórek B konstruktami zawierającymi OVEREXPRESSION lub S-H-R-N-A, a następnie jak pomierzyć poziom somatycznej hipermutacji w tych komórkach.