Name: Ocena hipermutacji somatycznej w komórkach B Ramosa po nadekspresji lub knockdownie określonych genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj metodę oceny hipermutacji somatycznej w komórkach B Ramos po modyfikacji ekspresji genów. Technika ta pozwala identyfikować nowe czynniki wpływające na różnicowanie przeciwciał.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wektory pMSCV-AID-I-Thy1.1 oraz pKat2 zostały udostępnione przez D. G. Schatz, natomiast wektory pVSV-G, pRSV-Rev oraz pMDLg/pRRE zostały udostępnione przez B. R. Cullen.

<ol><li>Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+antibody+somatic+hypermutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).</li>
<li>Peled, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemistry+of+somatic+hypermutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biochemistry of somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).</li>
<li>Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">AID in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).</li>
<li>Bardwell, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+somatic+hypermutation+and+reduced+class-switch+recombination+in+exonuclease+1-mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice.</a> Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).</li>
<li>Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Msh6+but+not+Msh3+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).</li>
<li>Phung, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+hypermutation+at+G+and+C+nucleotides+in+immunoglobulin+variable+genes+from+mice+deficient+in+the+MSH2+mismatch+repair+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein.</a> J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).</li>
<li>Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+spot+focusing+of+somatic+hypermutation+in+MSH2-deficient+mice+suggests+two+stages+of+mutational+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting.</a> Immunity. 9, 135-141 (1998).</li>
<li>Rada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+isotype+switching+is+inhibited+and+somatic+hypermutation+perturbed+in+UNG-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice.</a> Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).</li>
<li>Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+eta+is+the+sole+contributor+of+A%2FT+modifications+during+immunoglobulin+gene+hypermutation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse.</a> J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).</li>
<li>Masuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+eta+is+a+limiting+factor+for+A%3AT+mutations+in+Ig+genes+and+contributes+to+antibody+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation.</a> Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).</li>
<li>Lim, D. S., Hasty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+mouse+rad51+results+in+an+early+embryonic+lethal+that+is+suppressed+by+a+mutation+in+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53.</a> Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).</li>
<li>Xiao, Y., Weaver, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+targeted+deletion+by+Cre+recombinase+demonstrates+the+requirement+for+the+double-strand+break+repair+Mre11+protein+in+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).</li>
<li>Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+Nijmegen+breakage+syndrome+gene+NBS1+leads+to+early+embryonic+lethality+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice.</a> Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).</li>
<li>Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mRad50+causes+embryonic+stem+cell+lethality%2C+abnormal+embryonic+development%2C+and+sensitivity+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).</li>
<li>Pavri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation-induced+cytidine+deaminase+targets+DNA+at+sites+of+RNA+polymerase+II+stalling+by+interaction+with+Spt5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5.</a> Cell. 143, 122-133 (2010).</li>
<li>Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CtIP+promotes+microhomology-mediated+alternative+end+joining+during+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).</li>
<li>Basu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+exosome+targets+the+AID+cytidine+deaminase+to+both+strands+of+transcribed+duplex+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates.</a> Cell. 144, 353-363 (2011).</li>
<li>Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MRE11-RAD50-NBS1+complex+accelerates+somatic+hypermutation+and+gene+conversion+of+immunoglobulin+variable+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions.</a> Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).</li>
<li>Sale, J. E., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TdT-accessible+breaks+are+scattered+over+the+immunoglobulin+V+domain+in+a+constitutively+hypermutating+B+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line.</a> Immunity. 9, 859-869 (1998).</li>
<li>Cumbers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+iterative+affinity+maturation+of+antibodies+in+vitro+using+hypermutating+B-cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).</li>
<li>Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle-regulated+DNA+double-stranded+breaks+in+somatic+hypermutation+of+immunoglobulin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes.</a> Nature. 408, 216-221 (2000).</li>
<li>Parsa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+mutates+a+non-immunoglobulin+transgene+independent+of+chromosomal+position%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position.</a> Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).</li>
<li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+instability+of+V+region+hypermutation+in+the+Ramos+Burkitt%27s+lymphoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line.</a> Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).</li>
<li>Ukai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a%3AT+mutations+is+dependent+on+cellular+environment+but+independent+of+mutation+frequency+and+target+gene+location%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location.</a> J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).</li>
<li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li>
<li>Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+class+switching+of+an+IgM%2B+B+lymphoma+clone+CH12F3+to+IgA%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells.</a> Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).</li>
<li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+expression+of+activation-induced+cytidine+deaminase+%28AID%29%2C+a+novel+member+of+the+RNA-editing+deaminase+family+in+germinal+center+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Jak omówiono wcześniej, modele linii komórkowych służące do badania dywersyfikacji przeciwciał stały się popularnym punktem wyjścia w celu identyfikacji nowych białek wpływających na poszczególne etapy tego procesu. Przedstawiamy tutaj metodę wykorzystującą infekcję wirusową do wyciszenia (knock-down) lub nadekspresji białek w linii komórkowej limfocytów B Ramos, a następnie analizę wpływu tych modyfikacji na proces SHM.
W badaniach tych wykorzystujemy zarówno komórki Ramos WT, jak i Ramos AID...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;Sugerowane odczynniki – większość z nich można zastąpić podobnymi produktami innych dostawców.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>przezroczyste płytki 6-dołkowe traktowane TC</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>strzykawki 10 mL BD Luer-Lok</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>przezroczyste płytki 24-dołkowe traktowane TC</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>przezroczyste 96-dołkowe mikropłytki polistyrenowe o płaskim dnie z modyfikacją TC</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>szalki hodowlane 100 mm traktowane TC</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>filtry strzykawkowe Acrodisc, 0,45 &amp;mu;m</td><td>Pall Corporation</td><td>4604</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>A7777</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>100 mg/mL w wodzie</td></tr><tr><td>cytometr przepływowy BD FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>lub podobny</td></tr><tr><td>Probówki polistyrenowe z okrągłym dnem BD Falcon</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td>do FACS</td></tr><tr><td>komórki BOSC 23</td><td>ATCC</td><td>CRL-11270</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek węgla&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; inkubator z możliwością utrzymania temperatury 37°C&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (podłoże Dulbecco)&amp;#8242;zmodyfikowane podłoże Eagle&amp;#8242;pożywka s)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>FBS (płodowa surowica bydlęca)</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>FITC &amp;alpha;przeciwciało przeciwko szczurzemu CD90/mysiemu CD90.1 </td><td>BioLegend</td><td>202503</td><td>FITC &amp;alpha;-Thy1.1 </td></tr><tr><td>Odczyn do transfekcji FuGENE 6</td><td>Grupa Roche</td><td>11814443001</td><td></td></tr><tr><td>roztwór buforu HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi DNA polimeraza</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2101</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka LB (lysogeny broth - Luria) w proszku</td><td>Difco Laboratories</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>bakteryjny stok glicerolowy shRNA MISSION TRC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>wektory shRNA</td></tr><tr><td>NCS (surowica noworodka cielęcia)</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-504</td><td></td></tr><tr><td>PBS (roztwór buforu fosforanowego)</td><td>Invitrogen</td><td>70011</td><td>rozcieńczone do stężenia 1x w wodzie</td></tr><tr><td>PE &amp;alpha;-ludzkie przeciwciało IgM</td><td>BioLegend</td><td>314508</td><td></td></tr><tr><td>PGS (roztwór penicyliny-streptomycyny-glutaminy)</td><td>Gemini Bio Products</td><td>400-110</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene (bromek heksadymetryny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689</td><td>10 mg/ml w wodzie</td></tr><tr><td>Zestaw do midipreparacji plazmidów PureYield</td><td>Promega Corp.</td><td>A2495</td><td></td></tr><tr><td>Puromycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>250 &amp;#x03BC;g/mL w wodzie</td></tr><tr><td>zestaw do oczyszczania DNA z żelu QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>komórki Ramos (RA 1)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1596</td><td></td></tr><tr><td>pożywka RPMI-1640 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II</td><td>Invitrogen</td><td>18064-022</td><td></td></tr><tr><td>zestaw SYBR FAST qPCR</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4601</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Taq</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do klonowania TOPO TA</td><td>Invitrogen</td><td>K4520-01</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>System do oczyszczania genomicznego DNA Wizard SV</td><td>Promega Corp.</td><td>A2361</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indolilo-&amp;#946;-D-galaktopyranozyd]</td><td>Hodowla komórek</td><td>C-5687</td><td>40 mg/mL w DMSO</td></tr></tbody></table>

ocena hipermutacji somatycznej w limfocytach b linii ramos po nadekspresji lub wyciszeniu specyficznych genów

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Limfocyty B rozpoczynają swój rozwój z przeciwciałami o niskim powinowactwie, generowanymi poprzez rekombinację V(D)J. Jednak po wykryciu patogenu region zmienny (V) genu immunoglobuliny (Ig) ulega mutacjom około 100 000 razy częściej niż reszta genomu w procesie hipermutacji somatycznej (SHM), co prowadzi do powstania przeciwciał o wysokim powinowactwie1,2. Ponadto rekombinacja zmiany klasy (CSR) wytwarza przeciwciała o różnych funkcjach efektorowych, w zależności od rodzaju odpowiedzi immunologicznej wymaganej dla danego patogenu. Zarówno CSR, jak i SHM są inicjowane przez cytydynodeaminazę indukowaną aktywacją (AID), która deaminuje reszty cytozyny w DNA, tworząc uracyle. Uracyle te są przetwarzane przez podatne na błędy szlaki naprawcze, co ostatecznie prowadzi do mutacji i rekombinacji1-3.
Nasza obecna wiedza na temat szczegółów molekularnych SHM oraz CSR opiera się na połączeniu badań prowadzonych na myszach, komórkach pierwotnych, liniach komórkowych oraz w eksperymentach bezkomórkowych. Modele mysie pozostają złotym standardem, a genetyczne nokauty wykazały kluczową rolę wielu czynników naprawczych (np. Ung, Msh2, Msh6, Exo1 oraz polimerazy η)4-10. Jednak nie wszystkie geny nadają się do badań z wykorzystaniem nokautów. Przykładowo, nokauty kilku białek odpowiedzialnych za naprawę pęknięć dwuniciowych są letalne w okresie embrionalnym lub upośledzają rozwój limfocytów B11-14. Co więcej, specyficzna funkcja białka w procesie SHM lub CSR może być czasami maskowana przez bardziej globalne defekty wywołane nokautem. Ponadto, ponieważ eksperymenty na myszach mogą być czasochłonne, modyfikacja ekspresji poszczególnych genów w liniach komórkowych stała się coraz popularniejszym pierwszym krokiem w identyfikacji i charakteryzacji genów kandydackich15-18.
Ramos – linia komórkowa chłoniaka Burkitta, w której konstytutywnie zachodzi SHM – jest popularnym modelem komórkowym do badania SHM18-24. Jedną z zalet komórek Ramos jest to, że posiadają one wbudowaną, wygodną, półilościową miarę SHM. Komórki typu dzikiego wykazują ekspresję IgM, a w miarę powstawania mutacji, niektóre z nich prowadzą do zniesienia ekspresji IgM. Zatem analiza utraty IgM za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS) zapewnia szybki odczyt poziomu SHM. Bardziej ilościowy pomiar SHM można uzyskać poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie genów przeciwciał.
Ponieważ komórki Ramos są trudne do transfekcji, wytwarzamy stabilne pochodne o zwiększonej lub zmniejszonej ekspresji pojedynczego genu poprzez zakażanie komórek konstruktami retrowirusowymi lub lentiwirusowymi, które zawierają odpowiednio kasetę nadekspresyjną lub krótką zapinkę RNA (shRNA). W niniejszej pracy opisujemy sposób zakażania komórek Ramos, a następnie wykorzystanie tych komórek do badania roli specyficznych genów w procesie SHM (Rycina 1).

Opisujemy sposób przeprowadzania infekcji retrowirusowych lub lentiwirusowych konstruktami do nadekspresji lub zawierającymi shRNA w ludzkiej linii komórek B Ramos oraz metodę pomiaru hipermutacji somatycznej w tych komórkach.

Ocena hipermutacji somatycznej w limfocytach B linii Ramos po nadekspresji lub wyciszeniu specyficznych genów

Limfocyty B rozpoczynają swój rozwój z przeciwciałami o niskim powinowactwie, generowanymi w procesie rekombinacji V(D)J. Jednakże po wykryciu patogenu region zmienny (V) ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zmiana ekspresji genu, a następnie zmierzenie jej wpływu na somatyczną hipermutację. Osiąga się to poprzez transfekcję komórek Bosque 23 w celu wytworzenia cząsteczek wirusowych zawierających konstrukt prowadzący do nadekspresji lub konstrukt zawierający SHRA. W drugim kroku komórki ramo są infekowane wirusami, co prowadzi do wyciszenia lub nadekspresji badanego genu.Następnie klony pojedynczych komórek są hodowane przez kilka tygodni, aby umożliwić komórkom akumulację mutacji. Ostatecznie wpływ zmienionej ekspresji genów można określić na podstawie analizy utraty IgM oraz poprzez sekwencjonowanie genów IG. Metoda ta może pomóc w identyfikacji nowych czynników biorących udział w dywersyfikacji przeciwciał.Rozpocznij od odpipetowania 600 µL ocieplonego DMEM do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Następnie, uważając, aby pipetować bezpośrednio do medium, dodaj do probówki 30 µL FUgene 6, wymieszaj roztwór w wstrząsarze wirowym przez mniej niż sekundę, a następnie inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie, w przypadku infekcji lentiwirusem, takiej jak w tym przypadku, dodaj 6 µg konstruktu shRNA oraz po 1,5 µg pVSVG-pMDLgPRRE i pRSV-rev do mieszaniny DMEM i FUgene 6.Krótko wymieszaj roztwór w wirówce typu vortex, a następnie ponownie inkubuj przez 25 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec przeprowadź transfekcję hodowli komórek Bosque 23 o konfluencji 50 do 60% za pomocą kompleksu D-N-A-D-M-E-M FU gene six. Wymieszaj i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.Następnego dnia dodać pięć mililitrów DMEM do komórek i przenieść je z powrotem do inkubatora na kolejne 24 godziny. Trzeciego dnia po transfekcji, za pomocą strzykawki 10 ml, pobrać 10 ml pożywki z komórek transfektowanych, a następnie założyć filtr 0,45 µm na koniec strzykawki. Przefiltrowaną pożywkę zebrać do czystej polipropylenowej probówki 15 ml. Na 24 godziny przed infekcją wysiać dwie mililitry komórek RAMO w stężeniu 2 × 10⁵ komórek/ml w pełnej pożywce RPMI do płytki sześciodołkowej. Następnego dnia dodać do komórek RAMO trzy mikrolitry roztworu polybrenu o stężeniu 10 µg/ml oraz jeden mililitr wirusa, a następnie dokładnie wymieszać zawiesinę komórkową poprzez pipetowanie.W przypadku kontroli niezinfekowanej, zamiast wirusa, dodaj do jednej z studzienek jeden mililitr kompletnego medium RPMI oraz trzy mikrolitry poly brain. Dodatkowo zainfekuj jedną studzienkę dopasowaną kontrolą negatywną, a kolejną wektorem zawierającym GFP w celu określenia wydajności infekcji za pomocą FACS. Następnie odwiruj płytkę sześciodołkową z prędkością 3000 ×g przez 90 minut w temperaturze pokojowej, a potem umieść płytkę z powrotem w inkubatorze na 48 godzin.Na koniec odwirować zainfekowane komórki w 15 mililitrowej probówce z polipropylenu przy 400 Gs przez cztery minuty. W temperaturze pokojowej odprowadzić medium, uważając, aby nie naruszyć warstwy komórek, a następnie zawiesić komórki w świeżym medium RPMI. Po przeliczeniu komórek, rozcieńczyć alikwot zainfekowanych komórek RAMO do stężenia 10 komórek na mililitr.W roztworze pożywki RPMI warunkowanej i FBS do końcowej objętości 10 mililitrów dla każdej wysiewanej płytki. Następnie, używając pipety wielokanałowej, należy wysiać na płytki 96-dołkowe po 100 µL rozcieńczonych komórek na dołek.Po inkubowaniu płytek przez 24 godziny w temperaturze 37°C i w atmosferze 5% CO2, należy sprawdzić każdą poszczególną studnijkę za pomocą mikroskopu. Pozwoli to potwierdzić obecność komórek, ponieważ ustalenie odpowiedniej głębokości ostrości w celu zidentyfikowania pojedynczych komórek może być trudne. Najpierw należy spróbować ustawić ostrość na numerach studnijek wytłoczonych na dnie płytki 96-dołkowej.Następnie spróbuj wyszukać komórki po dwóch tygodniach. Sprawdź, czy wzdłuż krawędzi studzienek znajdują się kolonie komórek, używając trwałego pisaka. Zaznacz studzienki z intensywnym wzrostem komórek, a następnie przenieś kolonie do płytek 24-dołkowych w 1 ml RPMI w celu dalszej inkubacji.Po kilku dniach wzrostu przenieść komórki na płytkę sześciodołkową i kontynuować inkubację kultur. Trzy tygodnie po wysianiu kolonii komórkowych na płytkę sześciodołkową, przenieść 5×10⁵ komórek z każdego dołka do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. W tym samym czasie zebrać komórki z każdego z dołków kontrolnych i dołków z knockdownem HRNA, a także jedną próbkę do kontroli niebarwionej.Następnie odwiruj wszystkie komórki z siłą 400 G przez cztery minuty w temperaturze pokojowej, dwukrotnie przemywając komórki 1 ml PBS podczas drugiego wirowania. Po drugim przemyciu zawieszamy osad kontrolny bez barwienia w 50 µl PBS, a pozostałe osady w PBS z dodatkiem przeciwciała anty-ludzkie IGM znakowanego PE w rozcieńczeniu 1:20. Następnie inkubuj wszystkie próbki komórek na lodzie przez jedną godzinę, po czym przemyj komórki jeszcze dwa razy PBS w ten sam sposób co wcześniej, odlej nadsącz i ponownie zawieś wszystkie osady w 100 µl PBS.Następnie przenieś resuspenderowane komórki barwione oraz kontrolne niebarwione do probówek typu fax, a następnie poddaj komórki analizie za pomocą cytometrii przepływowej. Porównaj odsetek komórek ujemnych pod względem IgM w grupach kontrolnych oraz w komórkach z wyciszeniem S-H-R-N-A. Do komórek bosque 23 dokonano transfekcji retrowirusowego wektora nadekspresyjnego dla ID.Następnie zebrano wirusy i wykorzystano je do zakażenia komórek Ramos, zarówno typu dzikiego (wt), jak i komórek z nadekspresją AID (AID.High). Komórki wysiano pojedynczo i hodowano przez trzy tygodnie, po czym przeanalizowano ekspresję genów metodą qRT-PCR. Zgodnie z oczekiwaniami, wyniki qRT-PCR wykazały wyraźny wzrost ekspresji AID po zakażeniu komórek wektorem nadekspresyjnym AID. Za pomocą metody FACS oceniono również utratę IgM w zakażonych komórkach. Poziom powierzchniowego IgM zmierzono metodą FACS w punkcie czasowym trzech tygodni (zgodnie z poprzednią rycina), a następnie obliczono procent utraty IgM dla komórek typu dzikiego oraz komórek AID.High i przedstawiono wyniki graficznie. Jak oczekiwano, komórki z nadekspresją AID wykazały większą utratę powierzchniowego IgM.W oddzielnym eksperymencie w komórkach bosque 23 wytworzono lentiwirusy zawierające albo nieistotne S-H-R-N-A jako kontrolę, albo S-H-R-N-A przeciwko czynnikowi naprawy DNA o wysokiej wierności, który według przewidywań chroni przed SHM. Następnie lentiwirusy zainfekowano w klonie o wysokim poziomie ID komórek Ramos. Ponownie przeanalizowano ekspresję genów i, zgodnie z oczekiwaniami, zaobserwowano spadek poziomów czynnika naprawy DNA w obecności ukierunkowanego S-H-R-N-A przeciwko temu czynnikowi; po trzech tygodniach przeanalizowano również utratę IGM w klonach pojedynczych komórek. Ponieważ uważa się, że czynnik naprawczy zapewnia ochronę przed mutacjami podczas SHM, w jego nieobecności dochodzi do zwiększenia utraty IGM oraz SHM, co można zaobserwować na tej rycinie.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić infekcje wirusowe linii surowych komórek B konstruktami zawierającymi OVEREXPRESSION lub S-H-R-N-A, a następnie jak pomierzyć poziom somatycznej hipermutacji w tych komórkach.

assessing-somatic-hypermutation-ramos-b-cells-after-overexpression-or

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ocena hipermutacji somatycznej w komórkach B Ramosa po nadekspresji lub knockdownie określonych genów

Przedstawiamy metodę testowania wariantów BRCA1 w teście opartym na hodowli tkankowej dla homologicznej naprawy pęknięć DNA, polegającą na usunięciu endogennego białka BRCA1 z komórki za pomocą RNAi i zastąpieniu go mutantem punktowym BRCA1 zawierającym zmianę kodującą.

Identyfikacja wpływu mutacji BRCA1 na rekombinację homologiczną z wykorzystaniem komórek wykazujących endogenną ekspresję BRCA1 typu dzikiego

Tutaj opisujemy test mutagenezy in vivo dla małej liczby oczyszczonych komórek krwiotwórczych przy użyciu transgenicznego modelu myszy LacI. Gen LacI może być wyizolowany w celu określenia częstotliwości, lokalizacji i rodzaju mutantów DNA spontanicznie powstałych lub po ekspozycji na genotoksyny.

Identyfikacja mutacji DNA w oczyszczonych hematopoetycznych komórkach macierzystych/progenitorowych

Czynniki epigenetyczne mogą wchodzić w interakcje z programami genetycznymi, aby modulować ekspresję genów i regulować funkcję komórek B. Łącząc stymulację komórek B in vitro, qRT-PCR oraz wysokoprzepustowe sekwencje mikroRNA i sekwencje mRNA, możemy analizować epigenetyczną modulację miRNA i ekspresję genów w komórkach B.

Analiza całego genomu modulacji mikroRNA i mRNA za pośrednictwem inhibitora HDAC w komórkach B indukowanych do rekombinacji DNA ze zmianą klasy i różnicowania komórek plazmatycznych

Wykrywanie krążącego kwasu rybonukleinowego (cRNA) we krwi jest niezaspokojoną potrzebą w diagnostyce klinicznej. W tym miejscu opisujemy metody charakteryzujące cRNA od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca przy użyciu czułej i specyficznej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy. Testy spełniają wymagania projektowe, aby wykryć warianty fuzji w ciągu 72 godzin.

Test krwi do wykrywania transkryptów fuzji ROS1 i RET z krążącego kwasu rybonukleinowego przy użyciu cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy

Tutaj opisujemy test hybrydyzacji in situ, który umożliwia czułe i specyficzne wykrywanie sekwencji tak krótkich jak 50 nukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu na poziomie pojedynczej komórki. Test, który może być wykonywany ręcznie lub automatycznie, może umożliwić wizualizację wariantów splicingu, krótkich sekwencji i mutacji w kontekście tkanki.

Wizualizacja wariantów genetycznych, krótkich celów i mutacji punktowych w kontekście morfologicznym tkanki za pomocą testu hybrydyzacji RNA in situ

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół identyfikacji zdarzeń rekombinacji homologicznej, które wystąpiły w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą Southern blotting i/lub PCR. Przykładem tej metody jest generowanie modeli myszy zastępujących genetyczną miozynę II bez mięśni przy użyciu tradycyjnej technologii celowania opartej na embrionalnych komórkach macierzystych opartej na rekombinacji homologicznej.

Identyfikacja zdarzeń rekombinacji homologicznej w embrionalnych komórkach macierzystych myszy przy użyciu Southern blotting i reakcji łańcuchowej polimerazy

Ten manuskrypt opisuje metodę opartą na CRISPR-Cas9 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) do prostego i szybkiego badania roli wielu genów kandydujących w równoległej proliferacji komórek ostrej białaczki szpikowej (AML). Technika ta jest skalowalna i może być stosowana również w innych liniach komórek nowotworowych.

Badanie zależności genetycznych za pomocą testów konkurencji opartych na CRISPR-Cas9

Prezentowany tutaj jest test do ilościowego określenia hipermutacji somatycznej w locus genu ciężkiego łańcucha immunoglobuliny przy użyciu komórek B centrum zarodkowego z mysich plastrów Peyera.

Analiza hipermutacji somatycznej w intronie JH4 komórek B centrum rozrodczego z mysich plastrów Peyera

Ten artykuł przedstawia zastosowanie metody wykrywania niskiej częstotliwości opartej na sekwencjonowaniu Sangera w chłoniaku angioimmunoblastycznym. Zapewnij podstawę do zastosowania tej metody do innych chorób.

PCR blokujący typu dzikiego w połączeniu z sekwencjonowaniem Sangera w celu wykrycia mutacji somatycznej o niskiej częstotliwości

Ten protokół opisuje skalowalne podejście do wewnątrzkanalikowego przesiewania CRISPR, umożliwiające równoległe in vivo badania nad wyłączeniem genów i aktywacją w gruczołach piersiowych myszy.

Równoległe in vivo badanie wyłączania i aktywacji genów w gruczołach piersiowych myszy

Poznaj metodę oceny hipermutacji somatycznej w komórkach B Ramos po modyfikacji ekspresji genów. Technika ta pozwala identyfikować nowe czynniki wpływające na różnicowanie przeciwciał.

Ocena hipermutacji somatycznej w limfocytach B linii Ramos po nadekspresji lub wyciszeniu specyficznych genów

Przeglądaj więcej filmów