Analiza ekspresji podtypów histonów łączących u ssaków

Ogólnym celem tej procedury jest analiza poziomów ekspresji podtypów histony H1 poprzez analizę poziomu mRNA H1 oraz pomiar poziomu białka H1. W celu przeprowadzenia analizy mRNA w pierwszej kolejności izoluje się całkowite RNA z hodowlanych komórek lub tkanek mysich. Drugim krokiem procedury jest przeprowadzenie odwrotnej transkrypcji całkowitego RNA przy użyciu przypadkowych starterów, a następnie wykonanie ilościowej analizy qPCR dla każdego z genów podtypów H1. Analiza białka histony H1 rozpoczyna się od przygotowania całkowitych ekstraktów histonowych z tkanek mysich lub hodowlanych komórek.

Następnie przeprowadzono frakcjonowanie i ilościowe oznaczenie każdego podtypu H1 oraz rdzeniowej histony H2B za pomocą analizy HPLC w układzie odwroconej fazy. Ostatecznie ilościowe PCR w czasie rzeczywistym oraz analiza HPLC w układzie odwroconej fazy wykazały poziomy ekspresji zarówno mRNA, jak i białek dla każdego podtypu H1.

Jesteśmy studentami studiów magisterskich i doktoranckimi w laboratorium dr Yuhan FES w School of Biology na Georgia Institute of Technology. Dzisiaj zaprezentujemy zestaw kompleksowych testów do analizy ekspresji H1 w ssaczych podtypach H1. Dzięki tym testom można uzyskać ilościowy pomiar poziomów ekspresji zarówno mRNA, jak i białka w różnych podtypach H1.

Histon H1 jest głównym białkiem strukturalnym chromatyny, które ułatwia zwijanie chromatyny w struktury wyższego rzędu. Istnieją różne warianty histonu H1, które wykazują zróżnicowaną ekspresję podczas różnicowania i rozwoju komórek. Profilowanie tych podtypów H1 jest niezbędne do lepszego zrozumienia regulacji struktury i funkcji chromatyny wyższego rzędu. Zacznijmy zatem.

Przed ekstrakcją RNA wszystkie powierzchnie robocze oraz pipety należy przetrzeć 70% ethanol i potraktować roztworem do dekontaminacji RNA. Praktyka ta zmniejsza ryzyko kontaminacji oraz degradacji RNA. Ponadto, podczas wszystkich procedur należy nosić rękawiczki, aby rozpocząć ekstrakcję RNA z przylegającej hodowli komórkowej, odessać medium hodowlane i opłukać komórki za pomocą PBS.

Następnie usuń PBS z dołków. Do uzyskania wysokiej jakości RNA niezbędna jest odpowiednia ilość odczynnika triol. Do ekstrakcji RNA z jednego dołka płytki 6-dołkowej należy użyć jednego mililitra odczynnika triol. Następnie przeprowadź ekstrakcję RNA z komórek zgodnie z instrukcją producenta odczynnika triol. Po ekstrakcji RNA zmierz stężenie RNA za pomocą NanoDrop 1000.

Typowa wydajność wynosi od 5 do 15 µg RNA na 1 × 10⁶ hodowlanych komórek. Przed przystąpieniem do syntezy cDNA należy przeanalizować jakość RNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, aby wyeliminować potencjalne zanieczyszczenie RNA śladowymi ilościami genomowego DNA; próbki RNA należy traktować DNazą wolną od RNA zgodnie z instrukcją producenta. Do odwrotnej transkrypcji całkowitego RNA do cDNA należy wykorzystać zestaw Superscript III First-Strand Synthesis System zgodnie z instrukcją producenta. Ponieważ mRNA większości genów H1 nie posiada ogonów poly A, kluczowe jest zastosowanie losowych heksamerów zamiast oligo DT w качестве starterów.

W celu syntezy cDNA, po odwrotnej transkrypcji można przeprowadzić amplifikację cDNA za pomocą metody qRT-PCR, z detekcją przy użyciu barwnika SYBR Green przed analizą qRT-PCR. Zaprojektowano specyficzne dla genu H1 oraz wewnętrznego genu referencyjnego startery PCR (forward i reverse), a wydajność starterów przetestowano metodą krzywej standardowej, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Należy przygotować każdą reakcję PCR, mieszając startery, cDNA oraz SYBR Green Super.

Dokładnie wymieszaj reakcje w mikropłytce PCR 96-dołkowej marki EAL, używając uszczelek adhezyjnych EAL B, aby zapewnić szczelne zamknięcie pokrywy płyty. Następnie poddaj zamkniętą płytkę wirowaniu w wstrząsarzu typu vortex i krótko odwiruj mieszaniny reakcyjne. Umieść płytkę w systemie detekcji qPCR My IQ do jedno-kolorowej analizy PCR w czasie rzeczywistym.

Ustaw warunki QPCR i przeprowadź analizę zgodnie z instrukcjami zawartymi w tekście następującym po amplifikacji. Przeanalizuj krzywe amplifikacji pod kątem wydajności PCR oraz wartości progu cyklu lub CT. Linia progu może zostać automatycznie ustawiona przez oprogramowanie systemu optycznego IQ five w wersji 2.0.

Ponieważ barwnik cyber green wykrywa każdą dwuniciową cząsteczkę DNA, kluczowe jest przeprowadzenie analizy krzywej topnienia po reakcji QPCR, aby upewnić się, że amplifikowano i wykryto pożądany amplikon, a nie dimery starterów lub zanieczyszczenia. W programie analizy krzywej topnienia instrument QPCR ogrzewa próbki od 55 °C do 95 °C w przyrostach 0,5 °C z jednoczesnym zbieraniem danych. Ponieważ temperatura lub TM dwuniciowego DNA zależy od długości amplikonu oraz zawartości GC, różne amplikony będą miały różne Tm.

Przeanalizuj pochodne krzywe topnienia produktów QPCR, aby potwierdzić specyficzną temperaturę topnienia pożądanych amplikonów oraz brak pików amplikonów szumowych, takich jak pokazane tutaj krzywe topnienia amplikonów PCR H1A z TM wynoszącą 86 °C. Następnie przeanalizuj dane QPCR za pomocą oprogramowania systemu optycznego IQ5. Znormalizuj wartości ekspresji genów izoform H1 względem ekspresji genów referencyjnych (housekeeping genes), aby uzyskać względne poziomy ekspresji genów H1.

Po wypreparowaniu interesującego organu z uśpionej myszy, należy opłukać go lodowatym PBS. W tej demonstracji preparatyka całkowitego homogenatu jest przeprowadzana na wątrobie; po opłukaniu tkankę należy posiekać na kawałki za pomocą żyletki. Posiekaną tkankę przenieś do homogenizatora, a następnie dodaj do niego bufor sacharozowy w objętości 10 mililitrów na gram tkanki.

Następnie należy zhomogenizować tkankę, wykonując od 10 do 15 pociągnięć. Po przeniesieniu homogenatów do probówki o pojemności 15 ml, należy odwirować próbki przy 500 RPM przez 30 sekund. Po wirowaniu należy ostrożnie przenieść nadfiltr do nowej probówki i wirować przy 2000 RPM przez pięć minut.

Aby uzyskać osad komórkowy, zawiesić osad komórek w 10 mililitrach buforu sacharozowego z dodatkiem 0,5% NP 40. Przenieść próbkę do homogenizatora i wykonać 10 pociągnięć w ciągu 20-minutowej inkubacji. Na tym etapie uzyskuje się jądra komórkowe.

Oceń jakość jąder pod mikroskopem. Po osadzeniu jąder poprzez wirowanie przy 2000 RPM przez pięć minut, supernatant można odrzucić. Następnie ponownie zawiesić osad z jąder w trzech mililitrach buforu wysokosolnego na jeden gram tkanki.

Przenieś próbkę do małego homogenizatora i homogenizuj, wykonując od pięciu do 10 pociągnięć. Przelej zawiesinę do trzech probówek typu Eppendorf. Inkubuj probówki w lodzie przez 20 minut.

Po inkubacji odwiruj próbki przy 14 000 RPM przez 10 minut w celu wytrącenia chromatyny. Po odlaniu supernatantu wyekstrahuj całkowitą pulę histonów, dodając do każdego osadu chromatyny 0,8 mililitra 0,2 normalnego kwasu siarkowego. Użyj tłuczka do probówek typu Eppendorf, aby dokładnie rozetrzeć osad, aż zostanie on całkowicie rozpuszczony.

Próbki należy inkubować na platformie rotacyjnej w temperaturze 4°C przez noc. Po odwirowaniu nadsącz przenieś do dwóch probówek EOR. Do każdej probówki dodaj 2,5 objętości lodowatego etanolu.

Próbki należy przechowywać w temperaturze -20°C przez noc. Następnego dnia wiruj próbki przy 14 000 RPM przez 10 minut, aby wytrącić całkowite histony, a następnie odlej nadsącz. Po trzykrotnym przemyciu osadu 70% etanolem, pozostaw otwarte probówki na blacie na 20 do 30 minut do wyschnięcia na powietrzu i przystąp do analizy HPLC. Natychmiast zawieś osad histonowy w zalecanej objętości wody dwukrotnie destylowanej, zależnie od wydajności kolumny w fazie odwróconej oraz urządzenia HPLC, a następnie wiruj przy 14 000 RPM przez pięć minut.

Aby usunąć nierozpuszczalne pozostałości, nanieś od 50 do 100 µg całkowitego białka histonowego na kolumnę do chromatografii w fazie odwróconej systemu HPLC, takiego jak GE ACTA purifier UPC 900. Należy unikać nadmiaru białka, aby zapobiec zapchaniu kolumny. Frakcję ósmą, łączniki, histony i histony rdzeniowe eluouje się przy zastosowaniu rosnącego gradientu acetonitrylu, zgodnie z opisem w protokole pisemnym; effluent jest monitorowany przy 214 nm, a profilem HPLC są rejestrowane i analizowane. Frakcje białek można również zbierać za pomocą automatycznego kolektora frakcji GE FRAC nine 20 w celu dalszej analizy.

Przedstawione tutaj są typowe krzywe amplifikacji reakcji qPCR dla genów H1, z wykorzystaniem cDNA przygotowanego z komórek wątroby myszy oraz embrionalnych komórek macierzystych myszy. Analiza wykresu amplifikacji wykazuje, że reakcje qPCR wykonane w trzech powtórzeniach dla każdej próbki dały spójne sygnały z niemal identycznymi wartościami CT, co sugeruje wysoką powtarzalność. Brak narastania amplikonów w reakcjach qPCR bez odwrotnej transkrypcji (RT minus) wskazuje, że zanieczyszczenie DNA genomicznym nie występowało lub było minimalne. Wykorzystując wartości CT genów H1 oraz genów housekeepingowych, obliczono względne poziomy ekspresji RNA dla każdego genu H1.

Przedstawione tutaj wykresy są przykładami obliczonych wyników dla genów H1A i H1.0. Poziomy względnej ekspresji mRNA H1A są wyższe w embrionalnych komórkach macierzystych myszy w porównaniu z wątrobą myszy, podczas gdy ekspresja H1.0 jest znacznie wyższa w wątrobie niż w embrionalnych komórkach macierzystych. Różnica w ekspresji H1A lub H1.0 w embrionalnych komórkach macierzystych myszy w stosunku do wątroby dorosłej myszy jest widoczna również na profilach HPLC białek histonowych.

H10. Zróżnicowane specyficznie H1 gromadzi się w dużych ilościach w wątrobie dorosłej myszy. W przeciwieństwie do tego, białko H10 jest niemal nieobecne w niezróżnicowanych embrionalnych komórkach macierzystych myszy.

Z drugiej strony, H1A wykazuje wysoką ekspresję w embrionalnych komórkach macierzystych, natomiast w wątrobie dorosłej myszy występuje na niskim poziomie, co stwierdzono poprzez kwantyfikację pików H1. W profilu HPLC określono względną proporcję każdego poszczególnego podtypu H1 w obrębie rodziny H1 w wątrobie dorosłej myszy. Ponadto wartości poszczególnych podtypów H1 na nukleosom można obliczyć z powodu stosunku znormalizowanej wartości piku dla absorbancji przy 214 nanometrach odpowiednich podtypów H1 do połowy znormalizowanej wartości dla H2B. W analogiczny sposób można obliczyć wartość całkowitego H1 na nukleosom.

Po opanowaniu metody, analiza Q-R-T-P-C-R podtypu H1 może zostać przeprowadzona w jeden dzień, a ekstrakcja histonów i analiza HPRC w trzy dni, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas przeprowadzania analizy Q-R-T-P-C-R genów histonowych H1 kluczowe jest zapobieganie degradacji RNA i wyeliminowanie kontaminacji genomowym DNA, a przede wszystkim dodanie randomowych starterów do reakcji odwrotnej transkrypcji. Podczas ekstrakcji histonów i analizy HPOC ważne jest świeże dodanie inhibitorów białek do buforu ekstrakcyjnego, aby uniknąć degradacji białek; należy również zadbać o całkowitą dysaggregację chromatyny, aby ułatwić pełną ekstrakcję histonów.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat kompleksowej analizy ekspresji podtypów histonu H1 ssaków, zarówno na poziomie mRNA, jak i białek.