Name: Analiza ekspresji podtypów histonów łącznikowych ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Poznaj metody analizy ekspresji podtypów histonów H1 ssaków przy użyciu RT-qPCR i HPLC. Techniki te umożliwiają ilościowe oznaczanie poziomów mRNA i białka w komórkach i tkankach myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta jest finansowana z grantu NIH GM085261 oraz z wyróżnienia Georgia Cancer Coalition Distinguished Scholar Award (dla Y.F.).

<ol><li>Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+linker+histones+are+essential+for+mouse+development+and+affect+nucleosome+spacing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo.</a> Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).</li>
<li>Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+linker+histone+in+chromatin+structure+and+function%3A+H1+stoichiometry+and+nucleosome+repeat+length%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length.</a> Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).</li>
<li>Shen, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+histone+H1+regulates+specific+gene+expression+but+not+global+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo.</a> Cell. 86, 475-483 (1996).</li>
<li>Alami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+linker-histone+subtypes+differentially+affect+gene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).</li>
<li>Happel, N., Doenecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+and+its+isoforms%3A+contribution+to+chromatin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function.</a> Gene. 431, 1-12 (2009).</li>
<li>Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+subtypes+differentially+modulate+chromatin+condensation+without+preventing+ATP-dependent+remodeling+by+SWI%2FSNF+or+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF.</a> PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).</li>
<li>Khadake, J. R., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+chromatin-condensing+properties+of+rat+testes+H1a+and+H1t+compared+to+those+of+rat+liver+H1bdec%3B+H1t+is+a+poor+condenser+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin.</a> Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).</li>
<li>Orrego, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinity+of+mammalian+histone+H1+somatic+subtypes+for+DNA+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin.</a> BMC Biol. 5, 22-22 (2007).</li>
<li>Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+family+histones+in+the+nucleus.+Control+of+binding+and+localization+by+the+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).</li>
<li>Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+histone+H1+genes%3A+gene+organization+and+differential+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation.</a> J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).</li>
<li>Brown, D. T., Sittman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+through+overexpression+and+tagging+of+the+variant+type+of+the+mouse+H1e+and+H1c+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes.</a> J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).</li>
<li>Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+somatic+H1+subtypes+are+dispensable+for+mouse+development+even+in+mice+lacking+the+H1%280%29+replacement+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype.</a> Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).</li>
<li>Fan, Y., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+H1+linker+histone+subtypes+and+their+functions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice.</a> Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Zestaw analiz przedstawionych w niniejszym opracowaniu umożliwia kompleksową analizę poziomów ekspresji podtypów histonów łączących ssaków. Prawidłowo zaprojektowane testy qRT-PCR zapewniają wysoką czułość i dokładność pomiarów matryc RNA dowolnych genów histonu H1 ssaków. Kluczowym elementem testów qRT-PCR dla genów podtypów histonów łączących jest przygotowanie cDNA z wykorzystaniem odwrotnej transkrypcji opartej na randomowych starterach. mRNA większości genów histonów, w tym większości genów H1, nie posiada długiego ...

<table><tbody><tr><td>RNaza Zap</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>SuperScriptIII</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolutny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>IQ SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8880</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Deoksirybonukleaza I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMP-D1</td><td></td></tr><tr><td>płytka PCR z 96 dołkami z uszczelką Microseal</td><td>Bio-Rad</td><td>MSP-9605</td><td></td></tr><tr><td>Mikrouszczelnienie &amp;rsquo;B&amp;rsquo; Uszczelnienia adhezyjne</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB-1001</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Acros Organics</td><td>AC40594</td><td></td></tr><tr><td>fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO (histochemia i patologia organizmów)&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Siedmiowodny fosforan sodu(I) dwuwodorowy (NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-330</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>Kompletna tabletka z mini koktajlem inhibitorów proteinaz</td><td>Grupa Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylowy (PMSF)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01620</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet-40 (NP-40)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01425</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>Tris [aminometanol hydroksymetylowy]</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy (H2SO4)</td><td>VWR international</td><td>VW3648-3</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH)</td><td>Acros Organics</td><td>AC42330</td><td></td></tr><tr><td>Metoda Bradforda do oznaczania stężenia białek</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0001</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>EMD Millipore</td><td>AX0145-1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>JT Baker</td><td>9470-01</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza ekspresji podtypów histonów łączących u ssaków

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Histona łącząca H1 wiąże się z rdzeniem nukleosomu i DNA łącznikowym, ułatwiając zwijanie chromatyny w struktury wyższego rzędu. H1 jest niezbędna dla rozwoju ssaków1 i reguluje ekspresję specyficznych genów in vivo2-4. Wśród silnie konserwowanych białek histonowych rodzina histonów łączących H1 stanowi grupę najbardziej heterogenną. U ssaków występuje 11 podtypów H1, które są różnicowo regulowane podczas rozwoju oraz w różnych typach komórek. Podtypy te obejmują 5 somatycznych histonów H1 (H1a-e), histonę zastępczą H10, 4 podtypy H1 specyficzne dla komórek linii zarodkowej oraz H1x5. Obecność wielu podtypów H1, różniących się powinowactwem do wiązania DNA i zdolnością do kondensacji chromatyny6-9, zapewnia dodatkowy poziom modulacji funkcji chromatyny. Z tego względu ilościowa analiza ekspresji poszczególnych podtypów H1, zarówno na poziomie mRNA, jak i białek, jest niezbędna dla lepszego zrozumienia regulacji funkcji i struktury chromatyny wyższego rzędu.
W niniejszej pracy opisujemy zestaw testów zaprojektowanych do analizy poziomów ekspresji poszczególnych podtypów H1 (Rycina 1). Ekspresję mRNA różnych genów wariantów H1 mierzy się za pomocą zestawu wysoce czułych i ilościowych testów polimerazy w łańcuchu za pomocą odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR), które są szybsze, dokładniejsze i wymagają znacznie mniejszej ilości próbek w porównaniu z alternatywnym podejściem, jakim jest analiza Northern blot. W przeciwieństwie do większości innych komórkowych cząsteczek mRNA, mRNA większości genów histonów, w tym większości genów H1, nie posiada długiego ogona polyA, lecz zawiera strukturę spinki do włosów w niekodującej sekwencji 3' (UTR)10. W związku z tym cDNA przygotowuje się z całkowitego RNA poprzez odwrotną transkrypcję z użyciem starterów losowych zamiast starterów oligo-dT. Testy Realtime PCR ze starterami specyficznymi dla każdego podtypu H1 (Tabela 1) są przeprowadzane w celu uzyskania wysoce ilościowego pomiaru poziomów mRNA poszczególnych podtypów H1. Ekspresja genów pomocniczych (housekeeping genes) jest analizowana jako kontrola do normalizacji. 
Względną zawartość białek każdego podtypu H1 oraz histonów rdzeniowych wyznacza się za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej w fazie odwróconej (RP-HPLC) wszystkich histonów wyekstrahowanych z komórek ssaków11-13. Opisana tutaj metoda HPLC oraz warunki elucji zapewniają optymalny rozdział podtypów H1 myszy. Poprzez ilościowe określenie profilu HPLC obliczamy względną proporcję poszczególnych podtypów H1 w obrębie rodziny H1, a także wyznaczamy stosunek H1 do nukleosomów w komórkach.

Opisujemy zestaw analiz służących do badania poziomów ekspresji histonów łączących H1. Ilościowy pomiar mRNA poszczególnych genów H1 przeprowadzono za pomocą odwrotnej transkrypcji z zastosowaniem randomowych starterów, a następnie w czasie rzeczywistym za pomocą techniki PCR, natomiast do ilościowego oznaczenia białek histonów H1 wykorzystano analizę HPLC.

Analiza ekspresji podtypów histonów łączących u ssaków

Histon łącznikowy H1 wiąże się z cząsteczką rdzenia nukleosomu oraz DNA łącznikowym, ułatwiając zwijanie chromatyny w strukturę wyższego rzędu. H1 jest niezbędny...

Ogólnym celem tej procedury jest analiza poziomów ekspresji podtypów histony H1 poprzez analizę poziomu mRNA H1 oraz pomiar poziomu białka H1. W celu przeprowadzenia analizy mRNA w pierwszej kolejności izoluje się całkowite RNA z hodowlanych komórek lub tkanek mysich. Drugim krokiem procedury jest przeprowadzenie odwrotnej transkrypcji całkowitego RNA przy użyciu przypadkowych starterów, a następnie wykonanie ilościowej analizy qPCR dla każdego z genów podtypów H1. Analiza białka histony H1 rozpoczyna się od przygotowania całkowitych ekstraktów histonowych z tkanek mysich lub hodowlanych komórek.Następnie przeprowadzono frakcjonowanie i ilościowe oznaczenie każdego podtypu H1 oraz rdzeniowej histony H2B za pomocą analizy HPLC w układzie odwroconej fazy. Ostatecznie ilościowe PCR w czasie rzeczywistym oraz analiza HPLC w układzie odwroconej fazy wykazały poziomy ekspresji zarówno mRNA, jak i białek dla każdego podtypu H1.Jesteśmy studentami studiów magisterskich i doktoranckimi w laboratorium dr Yuhan FES w School of Biology na Georgia Institute of Technology. Dzisiaj zaprezentujemy zestaw kompleksowych testów do analizy ekspresji H1 w ssaczych podtypach H1. Dzięki tym testom można

expression-analysis-of-mammalian-linker-histone-subtypes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza ekspresji podtypów histonów łącznikowych ssaków

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Ten protokół przedstawia w pełni zintegrowany przepływ pracy do charakteryzowania modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą spektrometrii mas (MS). Przepływ pracy obejmuje oczyszczanie histonów z kultur komórkowych lub tkanek, derywatyzację i trawienie histonów, analizę MS za pomocą nanoprzepływowej chromatografii cieczowej oraz instrukcje analizy danych. Protokół jest przeznaczony do wypełnienia w ciągu 2 - 3 dni.

Kompletny przepływ pracy do analizy modyfikacji potranslacyjnych histonów przy użyciu spektrometrii mas od dołu do góry: od ekstrakcji histonów do analizy danych

Ten protokół opisuje rekonstytucję nukleosomów zawierających różnie znakowane izotopowo histony siostrzane. Jednocześnie asymetrycznie zmodyfikowane potranslacyjnie nukleosomy mogą być generowane po użyciu wstępnie zmodyfikowanej kopii histonu. Preparaty te mogą być z łatwością wykorzystywane do badania mechanizmów przesłuchów modyfikacji, jednocześnie na obu siostrzanych histonach, przy użyciu spektroskopii NMR o wysokiej rozdzielczości.

Rekonstytucja nukleosomów z histonami siostrzanymi znakowanymi różnicowo izotopami

Ten manuskrypt opisuje metody zastosowania technologii mikromacierzy peptydowych do profilowania specyficzności przeciwciał rozpoznających histony i ich potranslacyjne modyfikacje.

Analiza swoistości przeciwciał histonowych z mikromacierzami peptydowymi

Prezentujemy skuteczną i powtarzalną metodę izolacji i hodowli nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnej i postnatalnej tkanki mózgowej do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) histonu 3 lizyny 79 dimetylacji (H3K79me2) - znacznika histonowego znajdującego się w domenie globularnej histonu 3.

Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79

Inhibitory acetylotransferaz histonowych (HAT, znane również jako acetylotransferazy lizyny), takie jak CBP/p300, są potencjalnymi terapiami w leczeniu raka. Potrzebne są jednak rygorystyczne metody walidacji tych inhibitorów. Trzy metody walidacji in vitro obejmują testy HAT z rekombinowanymi acetylotransferazami, immunoblotting acetylacji histonów w hodowli komórkowej oraz ChIP-qPCR.

Testy do walidacji inhibitorów acetylotransferazy histonowej

Kurtyna DNA, wysokoprzepustowa technika obrazowania pojedynczych cząsteczek, stanowi platformę do wizualizacji w czasie rzeczywistym różnych interakcji białko-DNA. Niniejszy protokół wykorzystuje technikę kurtyny DNA do zbadania biologicznej roli i mechanizmu molekularnego Abo1, ATPazy AAA + zawierającej bromodomenę Schizosaccharomyces pombe.

Rozszyfrowanie molekularnego mechanizmu składania histonów za pomocą techniki kurtyny DNA

Ten protokół opisuje, jak trójwymiarowy system hodowli komórkowej może być używany do modelowania, leczenia i analizowania modyfikacji chromatyny w stanie zbliżonym do fizjologicznego.

Kwantyfikacja na poziomie globalnym modyfikacji potranslacyjnych histonów w modelu 3D hodowli komórkowej tkanki wątrobowej

Analityczny przepływ pracy oparty na chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) dla wysokiej pewności i wysoce powtarzalnej "oddolnej" analizy modyfikacji histonów i identyfikacji na podstawie głównych parametrów (czas retencji [RT], przekrój zderzenia [CCS] i dokładny stosunek masy do ładunku [m/z]).

Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

Ta metoda opisuje prostą i szybką strategię charakterystyki i badania proteoform histonów.

Odsłonięcie proteoform histonów przy użyciu elektroforezy żelowej 2D-TAU

Poznaj metody analizy ekspresji podtypów histonów H1 ssaków przy użyciu RT-qPCR i HPLC. Techniki te umożliwiają ilościowe oznaczanie poziomów mRNA i białka w komórkach i tkankach myszy.

Analiza ekspresji podtypów histonów łączących u ssaków

Przeglądaj więcej filmów