Name: Analiza ekspresji podtypów histonów łącznikowych ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Poznaj metody analizy ekspresji podtypów histonów H1 ssaków przy użyciu RT-qPCR i HPLC. Techniki te umożliwiają ilościowe oznaczanie poziomów mRNA i białka w komórkach i tkankach myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta jest finansowana z grantu NIH GM085261 oraz z wyróżnienia Georgia Cancer Coalition Distinguished Scholar Award (dla Y.F.).

<ol><li>Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+linker+histones+are+essential+for+mouse+development+and+affect+nucleosome+spacing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo.</a> Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).</li>
<li>Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+linker+histone+in+chromatin+structure+and+function%3A+H1+stoichiometry+and+nucleosome+repeat+length%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length.</a> Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).</li>
<li>Shen, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+histone+H1+regulates+specific+gene+expression+but+not+global+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo.</a> Cell. 86, 475-483 (1996).</li>
<li>Alami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+linker-histone+subtypes+differentially+affect+gene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).</li>
<li>Happel, N., Doenecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+and+its+isoforms%3A+contribution+to+chromatin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function.</a> Gene. 431, 1-12 (2009).</li>
<li>Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+subtypes+differentially+modulate+chromatin+condensation+without+preventing+ATP-dependent+remodeling+by+SWI%2FSNF+or+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF.</a> PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).</li>
<li>Khadake, J. R., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+chromatin-condensing+properties+of+rat+testes+H1a+and+H1t+compared+to+those+of+rat+liver+H1bdec%3B+H1t+is+a+poor+condenser+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin.</a> Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).</li>
<li>Orrego, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinity+of+mammalian+histone+H1+somatic+subtypes+for+DNA+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin.</a> BMC Biol. 5, 22-22 (2007).</li>
<li>Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+family+histones+in+the+nucleus.+Control+of+binding+and+localization+by+the+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).</li>
<li>Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+histone+H1+genes%3A+gene+organization+and+differential+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation.</a> J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).</li>
<li>Brown, D. T., Sittman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+through+overexpression+and+tagging+of+the+variant+type+of+the+mouse+H1e+and+H1c+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes.</a> J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).</li>
<li>Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+somatic+H1+subtypes+are+dispensable+for+mouse+development+even+in+mice+lacking+the+H1%280%29+replacement+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype.</a> Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).</li>
<li>Fan, Y., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+H1+linker+histone+subtypes+and+their+functions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice.</a> Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Zestaw analiz przedstawionych w niniejszym opracowaniu umożliwia kompleksową analizę poziomów ekspresji podtypów histonów łączących ssaków. Prawidłowo zaprojektowane testy qRT-PCR zapewniają wysoką czułość i dokładność pomiarów matryc RNA dowolnych genów histonu H1 ssaków. Kluczowym elementem testów qRT-PCR dla genów podtypów histonów łączących jest przygotowanie cDNA z wykorzystaniem odwrotnej transkrypcji opartej na randomowych starterach. mRNA większości genów histonów, w tym większości genów H1, nie posiada długiego ...

<table><tbody><tr><td>RNaza Zap</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>SuperScriptIII</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolutny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>IQ SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8880</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Deoksirybonukleaza I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMP-D1</td><td></td></tr><tr><td>płytka PCR z 96 dołkami z uszczelką Microseal</td><td>Bio-Rad</td><td>MSP-9605</td><td></td></tr><tr><td>Mikrouszczelnienie &amp;rsquo;B&amp;rsquo; Uszczelnienia adhezyjne</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB-1001</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Acros Organics</td><td>AC40594</td><td></td></tr><tr><td>fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO (histochemia i patologia organizmów)&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Siedmiowodny fosforan sodu(I) dwuwodorowy (NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-330</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>Kompletna tabletka z mini koktajlem inhibitorów proteinaz</td><td>Grupa Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylowy (PMSF)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01620</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet-40 (NP-40)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01425</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>Tris [aminometanol hydroksymetylowy]</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy (H2SO4)</td><td>VWR international</td><td>VW3648-3</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH)</td><td>Acros Organics</td><td>AC42330</td><td></td></tr><tr><td>Metoda Bradforda do oznaczania stężenia białek</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0001</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>EMD Millipore</td><td>AX0145-1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>JT Baker</td><td>9470-01</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza ekspresji podtypów histonów łączących u ssaków

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Histona łącząca H1 wiąże się z rdzeniem nukleosomu i DNA łącznikowym, ułatwiając zwijanie chromatyny w struktury wyższego rzędu. H1 jest niezbędna dla rozwoju ssaków1 i reguluje ekspresję specyficznych genów in vivo2-4. Wśród silnie konserwowanych białek histonowych rodzina histonów łączących H1 stanowi grupę najbardziej heterogenną. U ssaków występuje 11 podtypów H1, które są różnicowo regulowane podczas rozwoju oraz w różnych typach komórek. Podtypy te obejmują 5 somatycznych histonów H1 (H1a-e), histonę zastępczą H10, 4 podtypy H1 specyficzne dla komórek linii zarodkowej oraz H1x5. Obecność wielu podtypów H1, różniących się powinowactwem do wiązania DNA i zdolnością do kondensacji chromatyny6-9, zapewnia dodatkowy poziom modulacji funkcji chromatyny. Z tego względu ilościowa analiza ekspresji poszczególnych podtypów H1, zarówno na poziomie mRNA, jak i białek, jest niezbędna dla lepszego zrozumienia regulacji funkcji i struktury chromatyny wyższego rzędu.
W niniejszej pracy opisujemy zestaw testów zaprojektowanych do analizy poziomów ekspresji poszczególnych podtypów H1 (Rycina 1). Ekspresję mRNA różnych genów wariantów H1 mierzy się za pomocą zestawu wysoce czułych i ilościowych testów polimerazy w łańcuchu za pomocą odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR), które są szybsze, dokładniejsze i wymagają znacznie mniejszej ilości próbek w porównaniu z alternatywnym podejściem, jakim jest analiza Northern blot. W przeciwieństwie do większości innych komórkowych cząsteczek mRNA, mRNA większości genów histonów, w tym większości genów H1, nie posiada długiego ogona polyA, lecz zawiera strukturę spinki do włosów w niekodującej sekwencji 3' (UTR)10. W związku z tym cDNA przygotowuje się z całkowitego RNA poprzez odwrotną transkrypcję z użyciem starterów losowych zamiast starterów oligo-dT. Testy Realtime PCR ze starterami specyficznymi dla każdego podtypu H1 (Tabela 1) są przeprowadzane w celu uzyskania wysoce ilościowego pomiaru poziomów mRNA poszczególnych podtypów H1. Ekspresja genów pomocniczych (housekeeping genes) jest analizowana jako kontrola do normalizacji. 
Względną zawartość białek każdego podtypu H1 oraz histonów rdzeniowych wyznacza się za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej w fazie odwróconej (RP-HPLC) wszystkich histonów wyekstrahowanych z komórek ssaków11-13. Opisana tutaj metoda HPLC oraz warunki elucji zapewniają optymalny rozdział podtypów H1 myszy. Poprzez ilościowe określenie profilu HPLC obliczamy względną proporcję poszczególnych podtypów H1 w obrębie rodziny H1, a także wyznaczamy stosunek H1 do nukleosomów w komórkach.

Opisujemy zestaw analiz służących do badania poziomów ekspresji histonów łączących H1. Ilościowy pomiar mRNA poszczególnych genów H1 przeprowadzono za pomocą odwrotnej transkrypcji z zastosowaniem randomowych starterów, a następnie w czasie rzeczywistym za pomocą techniki PCR, natomiast do ilościowego oznaczenia białek histonów H1 wykorzystano analizę HPLC.

Analiza ekspresji podtypów histonów łączących u ssaków

Histon łącznikowy H1 wiąże się z cząsteczką rdzenia nukleosomu oraz DNA łącznikowym, ułatwiając zwijanie chromatyny w strukturę wyższego rzędu. H1 jest niezbędny...

Ogólnym celem tej procedury jest analiza poziomów ekspresji podtypów histony H1 poprzez analizę poziomu mRNA H1 oraz pomiar poziomu białka H1. W celu przeprowadzenia analizy mRNA w pierwszej kolejności izoluje się całkowite RNA z hodowlanych komórek lub tkanek mysich. Drugim krokiem procedury jest przeprowadzenie odwrotnej transkrypcji całkowitego RNA przy użyciu przypadkowych starterów, a następnie wykonanie ilościowej analizy qPCR dla każdego z genów podtypów H1. Analiza białka histony H1 rozpoczyna się od przygotowania całkowitych ekstraktów histonowych z tkanek mysich lub hodowlanych komórek.Następnie przeprowadzono frakcjonowanie i ilościowe oznaczenie każdego podtypu H1 oraz rdzeniowej histony H2B za pomocą analizy HPLC w układzie odwroconej fazy. Ostatecznie ilościowe PCR w czasie rzeczywistym oraz analiza HPLC w układzie odwroconej fazy wykazały poziomy ekspresji zarówno mRNA, jak i białek dla każdego podtypu H1.Jesteśmy studentami studiów magisterskich i doktoranckimi w laboratorium dr Yuhan FES w School of Biology na Georgia Institute of Technology. Dzisiaj zaprezentujemy zestaw kompleksowych testów do analizy ekspresji H1 w ssaczych podtypach H1. Dzięki tym testom można uzyskać ilościowy pomiar poziomów ekspresji zarówno mRNA, jak i białka w różnych podtypach H1.Histon H1 jest głównym białkiem strukturalnym chromatyny, które ułatwia zwijanie chromatyny w struktury wyższego rzędu. Istnieją różne warianty histonu H1, które wykazują zróżnicowaną ekspresję podczas różnicowania i rozwoju komórek. Profilowanie tych podtypów H1 jest niezbędne do lepszego zrozumienia regulacji struktury i funkcji chromatyny wyższego rzędu. Zacznijmy zatem.Przed ekstrakcją RNA wszystkie powierzchnie robocze oraz pipety należy przetrzeć 70% ethanol i potraktować roztworem do dekontaminacji RNA. Praktyka ta zmniejsza ryzyko kontaminacji oraz degradacji RNA. Ponadto, podczas wszystkich procedur należy nosić rękawiczki, aby rozpocząć ekstrakcję RNA z przylegającej hodowli komórkowej, odessać medium hodowlane i opłukać komórki za pomocą PBS.Następnie usuń PBS z dołków. Do uzyskania wysokiej jakości RNA niezbędna jest odpowiednia ilość odczynnika triol. Do ekstrakcji RNA z jednego dołka płytki 6-dołkowej należy użyć jednego mililitra odczynnika triol. Następnie przeprowadź ekstrakcję RNA z komórek zgodnie z instrukcją producenta odczynnika triol. Po ekstrakcji RNA zmierz stężenie RNA za pomocą NanoDrop 1000.Typowa wydajność wynosi od 5 do 15 µg RNA na 1 × 10⁶ hodowlanych komórek. Przed przystąpieniem do syntezy cDNA należy przeanalizować jakość RNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, aby wyeliminować potencjalne zanieczyszczenie RNA śladowymi ilościami genomowego DNA; próbki RNA należy traktować DNazą wolną od RNA zgodnie z instrukcją producenta. Do odwrotnej transkrypcji całkowitego RNA do cDNA należy wykorzystać zestaw Superscript III First-Strand Synthesis System zgodnie z instrukcją producenta. Ponieważ mRNA większości genów H1 nie posiada ogonów poly A, kluczowe jest zastosowanie losowych heksamerów zamiast oligo DT w качестве starterów.W celu syntezy cDNA, po odwrotnej transkrypcji można przeprowadzić amplifikację cDNA za pomocą metody qRT-PCR, z detekcją przy użyciu barwnika SYBR Green przed analizą qRT-PCR. Zaprojektowano specyficzne dla genu H1 oraz wewnętrznego genu referencyjnego startery PCR (forward i reverse), a wydajność starterów przetestowano metodą krzywej standardowej, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Należy przygotować każdą reakcję PCR, mieszając startery, cDNA oraz SYBR Green Super.Dokładnie wymieszaj reakcje w mikropłytce PCR 96-dołkowej marki EAL, używając uszczelek adhezyjnych EAL B, aby zapewnić szczelne zamknięcie pokrywy płyty. Następnie poddaj zamkniętą płytkę wirowaniu w wstrząsarzu typu vortex i krótko odwiruj mieszaniny reakcyjne. Umieść płytkę w systemie detekcji qPCR My IQ do jedno-kolorowej analizy PCR w czasie rzeczywistym.Ustaw warunki QPCR i przeprowadź analizę zgodnie z instrukcjami zawartymi w tekście następującym po amplifikacji. Przeanalizuj krzywe amplifikacji pod kątem wydajności PCR oraz wartości progu cyklu lub CT. Linia progu może zostać automatycznie ustawiona przez oprogramowanie systemu optycznego IQ five w wersji 2.0.Ponieważ barwnik cyber green wykrywa każdą dwuniciową cząsteczkę DNA, kluczowe jest przeprowadzenie analizy krzywej topnienia po reakcji QPCR, aby upewnić się, że amplifikowano i wykryto pożądany amplikon, a nie dimery starterów lub zanieczyszczenia. W programie analizy krzywej topnienia instrument QPCR ogrzewa próbki od 55 °C do 95 °C w przyrostach 0,5 °C z jednoczesnym zbieraniem danych. Ponieważ temperatura lub TM dwuniciowego DNA zależy od długości amplikonu oraz zawartości GC, różne amplikony będą miały różne Tm.Przeanalizuj pochodne krzywe topnienia produktów QPCR, aby potwierdzić specyficzną temperaturę topnienia pożądanych amplikonów oraz brak pików amplikonów szumowych, takich jak pokazane tutaj krzywe topnienia amplikonów PCR H1A z TM wynoszącą 86 °C. Następnie przeanalizuj dane QPCR za pomocą oprogramowania systemu optycznego IQ5. Znormalizuj wartości ekspresji genów izoform H1 względem ekspresji genów referencyjnych (housekeeping genes), aby uzyskać względne poziomy ekspresji genów H1.Po wypreparowaniu interesującego organu z uśpionej myszy, należy opłukać go lodowatym PBS. W tej demonstracji preparatyka całkowitego homogenatu jest przeprowadzana na wątrobie; po opłukaniu tkankę należy posiekać na kawałki za pomocą żyletki. Posiekaną tkankę przenieś do homogenizatora, a następnie dodaj do niego bufor sacharozowy w objętości 10 mililitrów na gram tkanki.Następnie należy zhomogenizować tkankę, wykonując od 10 do 15 pociągnięć. Po przeniesieniu homogenatów do probówki o pojemności 15 ml, należy odwirować próbki przy 500 RPM przez 30 sekund. Po wirowaniu należy ostrożnie przenieść nadfiltr do nowej probówki i wirować przy 2000 RPM przez pięć minut.Aby uzyskać osad komórkowy, zawiesić osad komórek w 10 mililitrach buforu sacharozowego z dodatkiem 0,5% NP 40. Przenieść próbkę do homogenizatora i wykonać 10 pociągnięć w ciągu 20-minutowej inkubacji. Na tym etapie uzyskuje się jądra komórkowe.Oceń jakość jąder pod mikroskopem. Po osadzeniu jąder poprzez wirowanie przy 2000 RPM przez pięć minut, supernatant można odrzucić. Następnie ponownie zawiesić osad z jąder w trzech mililitrach buforu wysokosolnego na jeden gram tkanki.Przenieś próbkę do małego homogenizatora i homogenizuj, wykonując od pięciu do 10 pociągnięć. Przelej zawiesinę do trzech probówek typu Eppendorf. Inkubuj probówki w lodzie przez 20 minut.Po inkubacji odwiruj próbki przy 14 000 RPM przez 10 minut w celu wytrącenia chromatyny. Po odlaniu supernatantu wyekstrahuj całkowitą pulę histonów, dodając do każdego osadu chromatyny 0,8 mililitra 0,2 normalnego kwasu siarkowego. Użyj tłuczka do probówek typu Eppendorf, aby dokładnie rozetrzeć osad, aż zostanie on całkowicie rozpuszczony.Próbki należy inkubować na platformie rotacyjnej w temperaturze 4°C przez noc. Po odwirowaniu nadsącz przenieś do dwóch probówek EOR. Do każdej probówki dodaj 2,5 objętości lodowatego etanolu.Próbki należy przechowywać w temperaturze -20°C przez noc. Następnego dnia wiruj próbki przy 14 000 RPM przez 10 minut, aby wytrącić całkowite histony, a następnie odlej nadsącz. Po trzykrotnym przemyciu osadu 70% etanolem, pozostaw otwarte probówki na blacie na 20 do 30 minut do wyschnięcia na powietrzu i przystąp do analizy HPLC. Natychmiast zawieś osad histonowy w zalecanej objętości wody dwukrotnie destylowanej, zależnie od wydajności kolumny w fazie odwróconej oraz urządzenia HPLC, a następnie wiruj przy 14 000 RPM przez pięć minut.Aby usunąć nierozpuszczalne pozostałości, nanieś od 50 do 100 µg całkowitego białka histonowego na kolumnę do chromatografii w fazie odwróconej systemu HPLC, takiego jak GE ACTA purifier UPC 900. Należy unikać nadmiaru białka, aby zapobiec zapchaniu kolumny. Frakcję ósmą, łączniki, histony i histony rdzeniowe eluouje się przy zastosowaniu rosnącego gradientu acetonitrylu, zgodnie z opisem w protokole pisemnym; effluent jest monitorowany przy 214 nm, a profilem HPLC są rejestrowane i analizowane. Frakcje białek można również zbierać za pomocą automatycznego kolektora frakcji GE FRAC nine 20 w celu dalszej analizy.Przedstawione tutaj są typowe krzywe amplifikacji reakcji qPCR dla genów H1, z wykorzystaniem cDNA przygotowanego z komórek wątroby myszy oraz embrionalnych komórek macierzystych myszy. Analiza wykresu amplifikacji wykazuje, że reakcje qPCR wykonane w trzech powtórzeniach dla każdej próbki dały spójne sygnały z niemal identycznymi wartościami CT, co sugeruje wysoką powtarzalność. Brak narastania amplikonów w reakcjach qPCR bez odwrotnej transkrypcji (RT minus) wskazuje, że zanieczyszczenie DNA genomicznym nie występowało lub było minimalne. Wykorzystując wartości CT genów H1 oraz genów housekeepingowych, obliczono względne poziomy ekspresji RNA dla każdego genu H1.Przedstawione tutaj wykresy są przykładami obliczonych wyników dla genów H1A i H1.0. Poziomy względnej ekspresji mRNA H1A są wyższe w embrionalnych komórkach macierzystych myszy w porównaniu z wątrobą myszy, podczas gdy ekspresja H1.0 jest znacznie wyższa w wątrobie niż w embrionalnych komórkach macierzystych. Różnica w ekspresji H1A lub H1.0 w embrionalnych komórkach macierzystych myszy w stosunku do wątroby dorosłej myszy jest widoczna również na profilach HPLC białek histonowych.H10. Zróżnicowane specyficznie H1 gromadzi się w dużych ilościach w wątrobie dorosłej myszy. W przeciwieństwie do tego, białko H10 jest niemal nieobecne w niezróżnicowanych embrionalnych komórkach macierzystych myszy.Z drugiej strony, H1A wykazuje wysoką ekspresję w embrionalnych komórkach macierzystych, natomiast w wątrobie dorosłej myszy występuje na niskim poziomie, co stwierdzono poprzez kwantyfikację pików H1. W profilu HPLC określono względną proporcję każdego poszczególnego podtypu H1 w obrębie rodziny H1 w wątrobie dorosłej myszy. Ponadto wartości poszczególnych podtypów H1 na nukleosom można obliczyć z powodu stosunku znormalizowanej wartości piku dla absorbancji przy 214 nanometrach odpowiednich podtypów H1 do połowy znormalizowanej wartości dla H2B. W analogiczny sposób można obliczyć wartość całkowitego H1 na nukleosom.Po opanowaniu metody, analiza Q-R-T-P-C-R podtypu H1 może zostać przeprowadzona w jeden dzień, a ekstrakcja histonów i analiza HPRC w trzy dni, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas przeprowadzania analizy Q-R-T-P-C-R genów histonowych H1 kluczowe jest zapobieganie degradacji RNA i wyeliminowanie kontaminacji genomowym DNA, a przede wszystkim dodanie randomowych starterów do reakcji odwrotnej transkrypcji. Podczas ekstrakcji histonów i analizy HPOC ważne jest świeże dodanie inhibitorów białek do buforu ekstrakcyjnego, aby uniknąć degradacji białek; należy również zadbać o całkowitą dysaggregację chromatyny, aby ułatwić pełną ekstrakcję histonów.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat kompleksowej analizy ekspresji podtypów histonu H1 ssaków, zarówno na poziomie mRNA, jak i białek.

expression-analysis-of-mammalian-linker-histone-subtypes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza ekspresji podtypów histonów łącznikowych ssaków

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Ten protokół przedstawia w pełni zintegrowany przepływ pracy do charakteryzowania modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą spektrometrii mas (MS). Przepływ pracy obejmuje oczyszczanie histonów z kultur komórkowych lub tkanek, derywatyzację i trawienie histonów, analizę MS za pomocą nanoprzepływowej chromatografii cieczowej oraz instrukcje analizy danych. Protokół jest przeznaczony do wypełnienia w ciągu 2 - 3 dni.

Kompletny przepływ pracy do analizy modyfikacji potranslacyjnych histonów przy użyciu spektrometrii mas od dołu do góry: od ekstrakcji histonów do analizy danych

Ten protokół opisuje rekonstytucję nukleosomów zawierających różnie znakowane izotopowo histony siostrzane. Jednocześnie asymetrycznie zmodyfikowane potranslacyjnie nukleosomy mogą być generowane po użyciu wstępnie zmodyfikowanej kopii histonu. Preparaty te mogą być z łatwością wykorzystywane do badania mechanizmów przesłuchów modyfikacji, jednocześnie na obu siostrzanych histonach, przy użyciu spektroskopii NMR o wysokiej rozdzielczości.

Rekonstytucja nukleosomów z histonami siostrzanymi znakowanymi różnicowo izotopami

Ten manuskrypt opisuje metody zastosowania technologii mikromacierzy peptydowych do profilowania specyficzności przeciwciał rozpoznających histony i ich potranslacyjne modyfikacje.

Analiza swoistości przeciwciał histonowych z mikromacierzami peptydowymi

Prezentujemy skuteczną i powtarzalną metodę izolacji i hodowli nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnej i postnatalnej tkanki mózgowej do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) histonu 3 lizyny 79 dimetylacji (H3K79me2) - znacznika histonowego znajdującego się w domenie globularnej histonu 3.

Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79

Inhibitory acetylotransferaz histonowych (HAT, znane również jako acetylotransferazy lizyny), takie jak CBP/p300, są potencjalnymi terapiami w leczeniu raka. Potrzebne są jednak rygorystyczne metody walidacji tych inhibitorów. Trzy metody walidacji in vitro obejmują testy HAT z rekombinowanymi acetylotransferazami, immunoblotting acetylacji histonów w hodowli komórkowej oraz ChIP-qPCR.

Testy do walidacji inhibitorów acetylotransferazy histonowej

Kurtyna DNA, wysokoprzepustowa technika obrazowania pojedynczych cząsteczek, stanowi platformę do wizualizacji w czasie rzeczywistym różnych interakcji białko-DNA. Niniejszy protokół wykorzystuje technikę kurtyny DNA do zbadania biologicznej roli i mechanizmu molekularnego Abo1, ATPazy AAA + zawierającej bromodomenę Schizosaccharomyces pombe.

Rozszyfrowanie molekularnego mechanizmu składania histonów za pomocą techniki kurtyny DNA

Ten protokół opisuje, jak trójwymiarowy system hodowli komórkowej może być używany do modelowania, leczenia i analizowania modyfikacji chromatyny w stanie zbliżonym do fizjologicznego.

Kwantyfikacja na poziomie globalnym modyfikacji potranslacyjnych histonów w modelu 3D hodowli komórkowej tkanki wątrobowej

Analityczny przepływ pracy oparty na chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) dla wysokiej pewności i wysoce powtarzalnej "oddolnej" analizy modyfikacji histonów i identyfikacji na podstawie głównych parametrów (czas retencji [RT], przekrój zderzenia [CCS] i dokładny stosunek masy do ładunku [m/z]).

Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

Ta metoda opisuje prostą i szybką strategię charakterystyki i badania proteoform histonów.

Odsłonięcie proteoform histonów przy użyciu elektroforezy żelowej 2D-TAU

Poznaj metody analizy ekspresji podtypów histonów H1 ssaków przy użyciu RT-qPCR i HPLC. Techniki te umożliwiają ilościowe oznaczanie poziomów mRNA i białka w komórkach i tkankach myszy.

Analiza ekspresji podtypów histonów łączących u ssaków

Przeglądaj więcej filmów