Name: Powtarzalne zmiażdżenie nerwu kulszowego myszy i późniejsza ocena regeneracji za pomocą analizy całego mięśnia wierzchowca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj powtarzalną metodę zmiażdżenia nerwu kulszowego u myszy i analizę całego mięśnia wierzchowca do oceny reinnerwacji. Technika wykorzystuje kleszczyki hemostatyczne i immunobarwienie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez granty NIH K08NS065157 (dla T.A.F.). Ponadto, badania te były wspierane przez Penn Center for Musculoskeletal Disorders, numer przyznania P30AR050950 z National Institute of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases (T.A.F. oraz Steven S. Scherer). Wreszcie, praca ta otrzymała wsparcie z funduszy zalążkowych Shriners Pediatric Research Center Seed funding (T.A.F). Pragniemy podziękować dr. Young-Jin Son za początkowe zaprezentowanie procedury całego preparatu (whole mount) oraz Amy A. Kim za pomoc w przygotowaniu szkiców do Ryciny 1.

<ol><li>Pan, Y. A., Misgeld, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neurotoxic+and+neuroprotective+agents+on+peripheral+nerve+regeneration+assayed+by+time-lapse+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effects of neurotoxic and neuroprotective agents on peripheral nerve regeneration assayed by time-lapse imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 23, 11479-11488 (2003).</li>
<li>Magill, C., Tong, A., Kawamura, D., Hayashi, A., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinnervation+of+the+tibialis+anterior+following+sciatic+nerve+crush+injury%3A+A+confocal+microscopic+study+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice.</a> Exp. Neurol. 207, 64-74 (2007).</li>
<li>Amado, S., Simñes, M. J., Armada-da-Silva, P. A. S., Luís, A. L., Shirosaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+hybrid+chitosan+membranes+and+N1E-115+cells+for+promoting+nerve+regeneration+in+an+axonotmesis+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Use of hybrid chitosan membranes and N1E-115 cells for promoting nerve regeneration in an axonotmesis rat model.</a> Biomaterials. 29, 4409-4419 (2008).</li>
<li>Luís, A. L., Rodrigues, J. M., Geuna, S., Amado, S., Simðes, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+cell+transplantation+effects+on+sciatic+nerve+regeneration+after+a+standardized+crush+injury+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat.</a> Microsurgery. 28, 458-470 (2008).</li>
<li>Luís, A. L., Amado, S., Geuna, S., Rodrigues, J. M., Simðes, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+functional+and+morphological+assessment+of+a+standardized+rat+sciatic+nerve+crush+injury+with+a+non-serrated+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp.</a> J. Neurosci. Methods. 163, 92-104 (2007).</li>
<li>Baptista, A. F., de Souza Gomes, J. R., Oliveira, J. T., Santos, S. M. G., Vannier-Santos, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+assess+function+after+sciatic+nerve+lesion+in+the+mouse+-+adaptation+of+the+sciatic+static+index%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to assess function after sciatic nerve lesion in the mouse - adaptation of the sciatic static index.</a> J. Neurosci. Methods. 161, 259-264 (2007).</li>
<li>Ronchi, G., Raimondo, S., Varejão, A. S. P., Tos, P., Perroteau, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+crush+injury+of+the+mouse+median+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Standardized crush injury of the mouse median nerve.</a> J. Neurosci. Methods. 188, 71-75 (2010).</li>
<li>Berg, A., Zelano, J., Cullheim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrin+G-2+ligand+mRNA+is+downregulated+in+spinal+motoneurons+after+sciatic+nerve+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Netrin G-2 ligand mRNA is downregulated in spinal motoneurons after sciatic nerve lesion.</a> Neuroreport. 21, 782-785 (2010).</li>
<li>Girolami, E. I., Bouhy, D., Haber, M., Johnson, H., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+and+potential+role+of+SOCS1+and+SOCS3+in+Wallerian+degeneration+in+injured+peripheral+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differential expression and potential role of SOCS1 and SOCS3 in Wallerian degeneration in injured peripheral nerve.</a> Exp. Neurol. 223, 173-182 (2010).</li>
<li>Hossain-Ibrahim, M. K., Rezajooi, K., Stallcup, W. B., Lieberman, A. R., Anderson, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+axonal+regeneration+in+the+central+and+peripheral+nervous+systems+of+the+NG2-deficient+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Analysis of axonal regeneration in the central and peripheral nervous systems of the NG2-deficient mouse.</a> BMC Neurosci. 8, 80-80 (2007).</li>
<li>Thornton, M. R., Mantovani, C., Birchall, M. A., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+N-CAM+and+N-cadherin+expression+in+axotomized+and+crushed+rat+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Quantification of N-CAM and N-cadherin expression in axotomized and crushed rat sciatic nerve.</a> J. Anat. 206, 69-78 (2005).</li>
<li>Beer, G. M., Steurer, J., Meyer, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+nerve+crushes+with+a+non-serrated+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reconstr.+Microsurg%22%5BJournal%5D)">Standardizing nerve crushes with a non-serrated clamp.</a> J. Reconstr. Microsurg. 17, 531-534 (2001).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Przedstawiliśmy metodę uzyskania wiarygodnie całkowitego zmiażdżenia nerwu kulszowego z precyzyjnym oznaczeniem miejsca urazu. Jak wspomniano wcześniej, zmiażdżenie nerwu kulszowego jest powszechnym modelem uszkodzenia nerwów obwodowych u myszy i szczurów. Chociaż każda metoda zmiażdżenia ma swoje zalety i wady, stwierdziliśmy, że ta metoda pozwala na uzyskanie całkowitego zmiażdżenia, które można łatwo oznaczyć przy użyciu minimalnej ilości specjalistycznego sprzętu (np. specjalnych zacisków itp.).
<p class="jove_s...

powtarzalny model zmiażdżenia nerwu kulszowego myszy i późniejsza ocena regeneracji poprzez analizę całego preparatu mięśnia

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneracja w obwodowym układzie nerwowym (OUN) jest szeroko badana zarówno ze względu na jej znaczenie dla chorób ludzkich, jak i w celu zrozumienia silnej odpowiedzi regeneracyjnej wywoływanej przez neurony OUN, co może rzucić światło na przyczyny niepowodzeń regeneracji w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)1. Zmiażdżenie nerwu kulszowego (aksonotmeza) jest jednym z najczęstszych modeli uszkodzenia nerwu obwodowego u gryzoni2. Zmiażdżenie przerywa wszystkie aksony, ale błony podstawne komórek Schwanna zostają zachowane, dzięki czemu regeneracja przebiega optymalnie3,4. Pozwala to badaczowi na precyzyjne badanie zdolności rosnącego aksonu do oddziaływania zarówno z komórką Schwanna, jak i z błoną podstawną4. Szczury były zazwyczaj preferowanymi modelami zwierzęcymi w eksperymentalnym zmiażdżeniu nerwu. Są one powszechnie dostępne, a ich uszkodzony nerw kulszowy stanowi rozsądne przybliżenie ludzkich uszkodzeń nerwów5,4. Choć nerw myszy jest mniejszy niż nerw szczura, posiada wiele podobnych właściwości. Co najważniejsze, modele mysie są coraz bardziej wartościowe ze względu na szeroką dostępność linii transgenicznych, co pozwala obecnie na szczegółową analizę poszczególnych cząsteczek kluczowych dla regeneracji nerwów6, 7. Poprzedni badacze stosowali wiele metod wywoływania zmiażdżenia lub uszkodzenia nerwu, w tym zwykłe pęsety kątowe, pęsety chłodzone, pęsety hemostatyczne, zaciski naczyniowe oraz zaciski zaprojektowane przez badaczy8,9,10,11,12. Badacze stosowali również różne metody znakowania miejsca uszkodzenia, w tym szwy, cząsteczki węgla i koraliki fluorescencyjne13,14,1. Opisujemy naszą metodę uzyskania powtarzalnego, całkowitego zmiażdżenia nerwu kulszowego z dokładnym i trwałym znakowaniem miejsca zmiażdżenia przy użyciu precyzyjnej pęsety hemostatycznej i późniejszym znakowaniem miejsca zmiażdżenia węglem. Jako część opisu procedury zmiażdżenia nerwu kulszowego, uwzględniliśmy również stosunkowo prostą metodę preparatyki całego mięśnia (whole mount), której używamy do późniejszej kwantyfikacji regeneracji.

W niniejszym raporcie opisujemy metodę zmiażdżenia nerwu kulszowego u myszy. Metoda ta wykorzystuje powszechnie dostępne kleszczyki hemostatyczne i pozwala w prosty oraz powtarzalny sposób uzyskać całkowite zmiażdżenie nerwu kulszowego. Ponadto opisujemy metodę przygotowania preparatów całych mięśni, odpowiednich do analizy regeneracji nerwów po zmiażdżeniu nerwu kulszowego.

Powtarzalny model zmiażdżenia nerwu kulszowego myszy i późniejsza ocena regeneracji poprzez analizę całego preparatu mięśnia

Regeneracja w obwodowym układzie nerwowym (OUN) jest szeroko badana zarówno ze względu na jej znaczenie dla ludzkich schorzeń, jak i w celu zrozumienia wysokiej zdolności regeneracyjnej...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie prostej, powtarzalnej metody zmiażdżenia nerwu kulszowego oraz analiza całego preparatu w celu oceny reinnerwacji mięśni po zmiażdżeniu nerwu kulszowego. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez uprzednie odsłonięcie nerwu kulszowego, z uwzględnieniem właściwego rozmieszczenia retraktorów chirurgicznych w celu zapewnienia dobrego dostępu do nerwu. Następnie nerw zostaje zmiażdżony za pomocą kleszczyków hemostatycznych i oznakowany węglem aktywnym.Następnie należy usunąć poszczególne mięśnie unerwione przez nerw kulszowy z kończyny tylnej. Ostatnim krokiem jest wypreparowanie poszczególnych mięśni do analizy w preparatach całych (whole mount) po barwieniu immunologicznym. Ostatecznie wyniki wykazują, że powtarzalne zmiażdżenie nerwu kulszowego można przeprowadzić w prosty sposób, a preparaty całych mięśni mogą być wykorzystane do analizy późniejszej regeneracji.Główną zaletą tej procedury jest to, że zapewnia ona prostą i powtarzalną technikę zmiażdżenia nerwu kulszowego, a następnie oceny regeneracji aksonów. Rozpocznij procedurę od znieczulenia myszy do operacji, stosując koktajl złożony z 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny pop

reproducible-mouse-sciatic-nerve-crush-subsequent-assessment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Odtwarzalne Zgniecenie Nerwu Stycznego Myszy i Kolejna Ocena Regeneracji przez Analizę Całoskórnego Mięśnia

Źródło: Li, Q., et al. Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje proces regeneracji aksonów w nerwie kulszowym myszy po urazie zmiażdżenia. Izolowany nerw jest utrwalony i przygotowany do obrazowania, a białka fluorescencyjne ulegają ekspresji w neuronach w celu wizualizacji wzrostu aksonów. Za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego śledzi się regenerację aksonów od miejsca urazu, aby ocenić zakres...

Regeneracja aksonów w nerwie kulszowym myszy po urazie zmiażdżenia

Źródło: Li, Q. et al. Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje transfekcję neuronów DRG myszy za pośrednictwem elektroporacji w celu zbadania regeneracji aksonów. Przedstawiono w nim etapy dostarczania konstruktów kwasu nukleinowego do neuronów DRG, indukowania uszkodzenia nerwu kulszowego i oceny regeneracji aksonów.

Transfekcja zwojów korzenia grzbietowego myszy za pośrednictwem elektroporacji w celu wspomagania regeneracji aksonów czuciowych

Źródło: Dalkin, W., et al. Metoda uszkodzenia nerwu strzałkowego: wiarygodny test do identyfikacji i testowania czynników naprawiających połączenia nerwowo-mięśniowe. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia zabieg chirurgiczny mający na celu wywołanie uszkodzenia nerwu strzałkowego u myszy w celu zbadania regeneracji połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ). Procedura polega na odsłonięciu nerwu strzałkowego, zastosowaniu kontrolowanego nacisku w celu wywołania urazu i upewnieniu się, że epineurium...

Wywoływanie uszkodzenia nerwu strzałkowego u myszy w celu zbadania regeneracji połączeń nerwowo-mięśniowych

Opracowaliśmy metodę uszkodzenia nerwów, aby wiarygodnie badać reinerwację mięśni, a tym samym regenerację połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy. Technika ta polega na uszkodzeniu wspólnego nerwu strzałkowego za pomocą prostej i wysoce powtarzalnej operacji.  Renerwacja mięśni jest następnie oceniana poprzez całkowite zamontowanie mięśnia prostownika długiego palca.

Metoda uszkodzenia nerwu strzałkowego: wiarygodny test do identyfikacji i testowania czynników naprawiających połączenia nerwowo-mięśniowe

Elektroporacja to skuteczne podejście do dostarczania interesujących genów do komórek. Stosując to podejście in vivo na neuronach zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy (DRG), opisujemy model do badania regeneracji aksonów in vivo.

Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy

Prezentowany jest protokół do wytwarzania różnych typów uszkodzeń nerwu pośrodkowego (MN) i naprawy u szczura. Dodatkowo protokół pokazuje, jak ocenić funkcjonalną regenerację nerwu za pomocą kilku nieinwazyjnych testów behawioralnych i pomiarów fizjologicznych.

Funkcjonalne i fizjologiczne metody oceny regeneracji nerwu pośrodkowego u szczura

Zautomatyzowana analiza chodu jest możliwym narzędziem do oceny funkcjonalnego powrotu do zdrowia w modelach gryzoni z uszkodzeniem nerwów obwodowych i uszkodzeniem rdzenia kręgowego. Chociaż wymaga to tylko jednego zestawu do oceny funkcji lokomotorycznych w różnych modelach eksperymentalnych, bardzo ważne jest skrupulatne dostosowanie i szkolenie zwierząt w sprzęcie i sprzęcie.

Zautomatyzowana analiza chodu w celu oceny powrotu do sprawności funkcjonalnej u gryzoni z uszkodzeniem nerwów obwodowych lub stłuczenia rdzenia kręgowego

Ocena regeneracji motorycznej pozostaje punktem odniesienia w eksperymentalnych badaniach nerwów obwodowych. Izometryczny pomiar siły tężcowej mięśnia piszczelowego przedniego u szczura jest nieocenionym narzędziem do oceny wyników funkcjonalnych po rekonstrukcji wad nerwu kulszowego. Metody i niuanse są szczegółowo opisane w tym artykule.

Maksymalny izometryczny pomiar siły tężcowej mięśnia piszczelowego przedniego u szczura

Udostępniamy protokół oceny zachowań motorycznych za pomocą baterii testów behawioralnych u szczurów po urazie zmiażdżenia nerwu kulszowego.

Wieloczynnikowa ocena zachowań motorycznych u szczurów po jednostronnym urazie zmiażdżenia nerwu kulszowego

Prezentujemy protokół izolacji aksoplazmy z nerwu kulszowego dorosłego szczura, oparty na wycięciu pęczków nerwowych i inkubacji w medium hipotonicznym w celu uwolnienia mieliny oraz lizy struktur nieaksonalnych, a następnie ekstrakcji pozostałego materiału wzbogaconego w aksony.

Izolacja aksoplazmy z nerwu kulszowego szczura

Poznaj powtarzalną metodę zmiażdżenia nerwu kulszowego u myszy i analizę całego mięśnia wierzchowca do oceny reinnerwacji. Technika wykorzystuje kleszczyki hemostatyczne i immunobarwienie.

Powtarzalny model zmiażdżenia nerwu kulszowego myszy i późniejsza ocena regeneracji poprzez analizę całego preparatu mięśnia

Przeglądaj więcej filmów