Powtarzalne zmiażdżenie nerwu kulszowego myszy i późniejsza ocena regeneracji za pomocą analizy całego mięśnia wierzchowca
22 lutego 2012
W tym raporcie opisujemy metodę na zmiażdżenie nerwu kulszowego myszy. Ta metoda wykorzystuje łatwo dostępne kleszcze hemostatyczne i łatwo i powtarzalnie powoduje całkowite zmiażdżenie nerwu kulszowego. Ponadto opisano metodę przygotowania całych wierzchowców mięśniowych nadających się do analizy regeneracji nerwów po zmiażdżeniu nerwu kulszowego.
Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie prostej, powtarzalnej metody zmiażdżenia nerwu kulszowego i analizy całego mocowania reinerwacji mięśni po zmiażdżeniu nerwu kulszowego. Osiąga się to poprzez uprzednie odsłonięcie nerwu kulszowego, w tym odpowiednie rozmieszczenie retraktorów chirurgicznych, aby zapewnić dobry dostęp do nerwu. Następnie zmiażdż nerw kleszczami hemostatu i zaznacz nerw węglem drzewnym.
Następnie usuń poszczególne mięśnie unerwione nerwem kulszowym z kończyny tylnej. Ostatnim krokiem jest wypreparowanie poszczególnych mięśni w celu przeprowadzenia analizy całego wierzchowca po barwieniu immunologicznym. Ostatecznie wyniki pokazują, że powtarzalne zmiażdżenie nerwu kulszowego można łatwo wykonać, a mocowania otworów mięśniowych można wykorzystać do analizy późniejszej regeneracji.
Główną zaletą tej procedury jest to, że zapewnia prostą, powtarzalną technikę zmiażdżenia nerwu kulszowego, a następnie regeneracji aksonów. Rozpocznij tę procedurę od znieczulenia myszy do operacji za pomocą koktajlu 100 miligramów na kilogram ketaminy i 10 miligramów na kilogram ksylazyny we wstrzyknięciu dootrzewnowym, aby zminimalizować ból pooperacyjny. Mysz otrzymuje również podskórne wstrzyknięcie w ilości 10 miligramów na kilogram meloksykamu.
Następnie ostrożnie ogol obie kończyny tylne za pomocą maszynki do strzyżenia chirurgicznego. Następnie nałóż krem do depilacji narośli, aby uzyskać całkowite wyczerpanie. Oczyść skórę sterylnym aplikatorem z bawełnianą końcówką i peelingiem chirurgicznym Betadine.
Następnie nałóż maść okulistyczną na oczy za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką. Umieść mysz na czystej płycie ze stali nierdzewnej na rozgrzanym kocu homeo i utrzymuj temperaturę zwierzęcia na poziomie 37 stopni Celsjusza. Następnie przyklej wszystkie kończyny taśmą.
Ostrożnie ustaw tylną kończynę symetrycznie, tak aby staw kolanowy tworzył kąt prosty z ciałem. Następnie przykryj pole operacyjne sterylną serwetą pod mikroskopem. Wykonaj półokrągłe nacięcie w poprzek linii środkowej.
Delikatnie oddziel skórę od leżącej pod nią muskulatury i od czasu do czasu zawijaj ją. Zastosuj około 0,1 mililitra sterylnej soli fizjologicznej, aby utrzymać wilgotność miejsca operowanego podczas zabiegu. Następnie otwórz płaszczyznę powięzi między pośladkiem wielkim a przednią głową mięśnia dwugłowego uda.
Aby odsłonić nerw kulszowy w celu kontroli chirurgicznej. Przeciwległy nerw kulszowy powinien być odsłonięty i zmobilizowany, ale pozostawiony nienaruszony. Następnie odpocznij i zszyj mięśnie pośladkowe.
Odsłoń eksperymentalny nerw kulszowy w ten sam sposób za pomocą retraktorów. Aby ułatwić wizualizację. Delikatnie uwolnij nerw kulszowy z otaczającej tkanki łącznej za pomocą nożyczek do irydektomii.
Następnie użyj cienkich 5-45 kleszczy, aby umieścić nerw w dolnej szczęce bardzo cienkich kleszczy hemostatycznych, ustaw trzy powięzi obok siebie, nie jedna na drugiej. Kleszcze hemostatyczne zostały wygrawerowane znakiem w odległości 1,5 milimetra od ich końcówki. Umieść najbardziej zewnętrzną część rwy kulszowej w jednej linii z tym znakiem przed zmiażdżeniem.
Zapewnia to zgniatanie o jednolitej szerokości i to, że nerw nie wystaje poza szczęki kleszczy hemostatycznych, gdy jest spłaszczony pod wpływem siły zgniatania. Jeśli nerw wystaje poza końcówki kleszczy, nerw zostanie tylko częściowo zmiażdżony. Użyj drugiej pary kleszczy hemostatycznych, które zostały wstępnie zanurzone i sproszkowane węglowe, aby oznaczyć miejsce zgniecenia.
Zmiażdż nerw w tym samym miejscu zgniatania przez 15 sekund za pomocą trzech kliknięć. Żadne oznakowanie węglowe nie powinno wykraczać poza granicę początkowego zgniecenia. Jest to szczególnie ważne, jeśli wymagane jest precyzyjne oznaczenie miejsca zgniecenia, aby wstępnie zanurzyć kleszcze w węglu i zapobiec rozprzestrzenianiu się węgla w miejscu operacji.
Otwórz kleszcze w sproszkowanym węglu. Następnie delikatnie je zamknij. Użyj sterylnej gazy, aby zetrzeć węgiel z zewnętrznej strony hemostatów.
Sprawdź kleszcze pod co najmniej trzykrotnym powiększeniem, aby upewnić się, że powierzchnie kruszenia są równomiernie pokryte sproszkowanym węglem. W razie potrzeby są ponownie zanurzane i wycierane w spoczynek i zszywa mięśnie pośladkowe w taki sam sposób, jak po stronie przeciwnej. Na koniec zamknij nacięcie skóry za pomocą dziewięciomilimetrowych klipsów refleksyjnych.
Jeśli okaże się, że dziewięciomilimetrowe klipsy refleksyjne ograniczają ruch, można użyć mniejszych klipsów refleksyjnych lub sześciu automatycznych szwów. Zamiast tego, po poświęceniu myszy, usuń cztery mięśnie. Piszczele przedni prostownik digitorum longus, mięsień strzałkowy długi i płaszczkowaty w kończynie tylnej ostrożnie, przypinając ich tkanki łączne do naczynia pokrytego czarną kardą.
Następnie opłucz je w PBS. Następnie utrwal je w 4% Aldehydzie Paraform przez 30 minut. Aby wypreparować każdy mięsień na czarnej szalce Petriego, usuń z niej ścięgna za pomocą nożyczek do irydektomii.
Następnie rozrzedź mięśnie, odrywając wewnętrzne włókna mięśniowe Ostrożnie zachowaj zewnętrzną powierzchnię mięśnia, w tym pasma płytki końcowej. Następnie zamontuj powstałe mięśnie na szkiełkach z plusem za pomocą tarczy wektorowej i szklanej pokrywy o wymiarach 22 na 40 milimetrów, uszczelnij dwie strony przezroczystym lakierem do paznokci. Po prawidłowym zamontowaniu na prowadnicy, opaski nplate powinny stykać się ze szkiełkami nakrywkowymi.
Oto przykład miejsca zmiażdżenia in situ w lewej kończynie tylnej. Miejsce zgniecenia jest oznaczone sadzą. Gwiazdka oznacza gałąź nerwu piszczelowego, która unerwia mięśnie ud i służy jako przydatny punkt orientacyjny.
Podczas operacji zmiażdżenia podział piszczelowy nerwu kulszowego jest zaznaczony na niebiesko, strzałkowy i zielony, a srel i żółty. Ta półcienka sekcja pokazuje całkowite zmiażdżenie wykonane za pomocą kleszczy hemostatycznych. Groty strzałek wskazują tutaj pokruszone włókna.
Niepełne zgniatanie wykonane za pomocą kleszczy kątowych jest wskazane w innym przekroju półpłetwy. Grot strzałki ponownie wskazuje zmiażdżone włókna, podczas gdy strzałki wskazują zachowane aksony. Są to renderowane obrazy z całych mięśni wierzchowca.
Po usunięciu tkanki łącznej, a następnie rozrzedzeniu, pasma nplate są zarysowane na każdym mięśniu. Pokazany tutaj jest mięsień sous całego wierzchowca. 14 dni po zmiażdżeniu nerwu kulszowego.
Strzałki wskazują obszary połączenia nerwowo-mięśniowego, które zostały unerwione przez akson. Oto demonstracja odnerwionego połączenia nerwowo-mięśniowego. Luka 43 dodatnich procesów komórek Schwana jest oznaczona grotami strzałek.
W tym odnerwionym połączeniu nerwowo-mięśniowym nie widać aksonów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak powtarzalnie zmiażdżyć nerw statyczny i przygotować mocowania hormonów mięśniowych do analizy regeneracji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy raport opisuje prostą i odtwarzalną metodę miażdżenia nerwu kulszowego u myszy oraz analizy ponownej inercji mięśni. Technika wykorzystuje łatwo dostępne kleszcze hemostatyczne do uzyskania całkowitego miażdżenia nerwu i obejmuje przygotowanie całych blaszek mięśniowych do analizy regeneracji.
Kluczowe elementy badania
Dział obszaru nauki
- Neuroscience
- Regenerative Medicine
- Muscle Physiology
Tło
- Uszkodzenia nerwu kulszowego mogą prowadzić do znacznych deficytów motorycznych.
- Zrozumienie regeneracji nerwów jest kluczowe dla opracowywania strategii terapeutycznych.
- Analiza całych blaszek zapewnia wgląd w ponowną inercję mięśni.
- Istniejące metody mogą brakować odtwarzalności i dostępności.
Cel badania
- Zaprojektowanie odtwarzalnej metody miażdżenia nerwu kulszowego.
- Przygotowanie całych blaszek mięśniowych do dalszej analizy regeneracji nerwów.
- Dostarczenie prostego protokołu, który może być łatwo zaadaptowany przez badaczy.
Wykorzystane metody
- Uwidocznić nerw kulszowy za pomocą narzędzi chirurgicznych.
- Miażdżyć nerw za pomocą kleszczy hemostatycznych i oznaczyć go węglem.
- Usunąć poszczególne mięśnie unerwione przez nerw kulszowy z kończyny tylnej.
- Wypreparować mięśnie do analizy całych blaszek po znakowaniu przeciwciałami.
Główne wyniki
- Metoda umożliwia konsekwentne i całkowite miażdżenie nerwu kulszowego.
- Całe blaszki mięśniowe można skutecznie analizować pod kątem regeneracji.
- Wyniki demonstrują wykonalność tego podejścia do badania naprawy nerwów.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia procesów ponownej inercji mięśni.
Wnioski
- Ta metoda zapewnia niezawodne narzędzie dla badaczy zajmujących się badaniem uszkodzeń nerwów.
- Analiza całych blaszek jest cenną techniką oceny ponownej inercji mięśni.
- Protokół można łatwo wdrożyć w różnych środowiskach badawczych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method provides a reproducible model for studying peripheral nerve regeneration, enabling mechanistic de-risking of therapeutic targets in preclinical neuroscience programs. By standardizing sciatic nerve crush and quantifying reinnervation via whole mount muscle analysis, it supports target validation and assay development for neuroprotective or neuroregenerative candidates. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking axonal growth to functional reinnervation readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses on axonal regeneration and Schwann cell interactions in a genetically tractable model.
- Operational Value: Uses widely available transgenic mouse lines to dissect molecular mechanisms of nerve repair with high reproducibility.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, imaging-ready outputs (e.g., neuromuscular junction reinnervation) for high-content screening of compound libraries.
- Operational Value: Standardizes crush site marking and muscle preparation to ensure assay consistency across laboratories and timepoints.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery to preclinical validation by modeling axonotmesis, a clinically relevant peripheral nerve injury.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through longitudinal, structure-function correlation of regeneration.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing a disease-relevant system for evaluating biologics or small molecules aimed at enhancing nerve repair.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation by enabling precise measurement of axonal regeneration kinetics.
- Screening: Delivers assay-ready tissue preparations with quantifiable dependent variables (e.g., reinnervated endplate bands) for compound effect assessment.
- Analytics: Generates statistical outputs from whole mount imaging that allow comparison of regeneration efficacy across experimental conditions.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by using a rodent model predictive of human peripheral nerve lesion responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable platform for repeated use in target de-risking and lead optimization campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation through direct visualization of axonal-Schwann cell-basal lamina interactions.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized crush force, site marking, and muscle whole mount protocol.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective, histology-based regeneration metrics early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroregenerative candidates based on functional reinnervation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, tissue dissection, and immunofluorescence staining.
- Depends on access to stereomicroscopes, hemostatic forceps, and imaging systems for whole mount analysis.
- Necessitates cross-team standardization of crush duration, marking technique, and muscle fixation timing.
- Involves adaptation considerations when applying the model to different mouse strains or genetic backgrounds.
- Limited by the need for terminal procedures and skilled handling to maintain crush consistency and marking fidelity.
