Name: Chromosomika: Wykrywanie zmian numerycznych i strukturalnych we wszystkich 24 chromosomach ludzkich jednocześnie za pomocą nowatorskiego testu OctoChrome FISH (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Poznaj metodę OctoChrome FISH do jednoczesnego wykrywania zmian liczbowych i strukturalnych we wszystkich 24 chromosomach ludzkich. Technika ta usprawnia analizę aberracji chromosomowych w białaczkach i chłoniakach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować dr Clionie M. McHale za krytyczną lekturę i redakcję rękopisu. Praca ta została sfinansowana przez National Institute of Environmental Health Sciences, National Institute of Health w ramach grantu R01ES017452 przyznanego L Zhang.

1. Przygotowanie preparatów na szkiełkach
 <ul>
 <li>Zestaw OctoChrome FISH służy do badania zmian chromosomalnych w preparatach metafaz komórek ludzkich, w tym między innymi w hodowlach komórek krwi obwodowej, komórkach macierzystych/progenitorowych oraz liniach komórkowych. Próbki należy przygotować zgodnie ze standardową procedurą zbioru metafaz3,11-13: stosując kolcemid w celu zatrzymania komórek w metafazie, obróbkę hipotoniczną w celu napęcznienia komórek oraz fiksatywny Carnoya do utrwalenia komórek w zawiesinie o stężeniu około 0,5-1 x 106 komórek na ml.</li>
 <li>Oczyścić szkiełko z 8 polami (dołączone do zestawu OctoChrome, numer katalogowy: PMP 803, Cytocell Ltd, Cambridge, UK, Rysunek 2), zanurzając je w czystym etanolu na 2 min.</li>
 <li>Przed przygotowaniem szkiełka z próbką, nanieść niewielką ilość komórek na szkiełko, aby sprawdzić gęstość komórek. Jeśli gęstość komórek jest zbyt wysoka (zbyt wiele nakładających się komórek), rozcieńczyć zawiesinę świeżym fiksatywem. Jeśli gęstość komórek jest zbyt niska (zbyt mało komórek na szkiełku), odwirować komórki i zawiesić je ponownie w mniejszej objętości świeżego fiksatywu. Nanieść pipetą 5-10 μl zawiesiny komórek na każde z 8 pól szkiełka wzorcowego w sekwencji naprzemiennych kwadratów 1/7 - 2/8 - 3/5 - 4/6. Gdy pierwsze dwa kwadraty wyschną na powietrzu, nanieść próbki na pozostałe pola w ten sam sposób. Zapobiegnie to wzajemnemu zakłócaniu się rozprzestrzenionych komórek.</li>
 <li>Wysuszone szkiełko można przechowywać w temperaturze -20°C w atmosferze azotu przez ponad 5 lat przed hybrydyzacją.</li>
 </ul>
 2. Lokalizacja metafaz z wykorzystaniem systemu zautomatyzowanego
 <ul>
 <li>Nanieś 20 μl 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (0.2 μg/ml) na środek każdej połowy preparatu, a następnie przykryj szkiełkiem nakrywką.</li>
 <li>Przeprowadź automatyczne skanowanie preparatu w celu zlokalizowania komórek w metafazie, korzystając z oprogramowania Metafer (MetaSystems, Altlussheim, Niemcy). Ułatwia to odnalezienie wszystkich metafaz i późniejszą ponowną ocenę obrazów wszystkich komórek.</li>
 <li>Przejrzyj wyniki skanowania ręcznie i usuń artefakty niebędące metafazami.</li>
</ul>
 3. Hybrydyzacja
 <ol>
 <li>Przygotowanie preparatu i urządzenia OctoChrome
 <ul>
 <li>Zanurzyć preparat w buforze 2x SSC w temperaturze pokojowej przez 30 min, aby wypłukać DAPI.</li>
 <li>Odwodnić preparat poprzez serię płukań etanolem (po 2 minuty w etanolu 70%, 85% i 100%), pozostawić do wyschnięcia i umieścić na płycie grzejnej o temperaturze 37°C na 5 minut.</li>
 <li>Umieścić komorę do hybrydyzacji wielosondowej Chromoprobe (dołączoną do zestawu OctoChrome) w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C i pozostawić do wyrównania temperatury do 37°C (+/- 1°C).</li>
 <li>Wymieszać roztwór do hybrydyzacji (dołączony do zestawu OctoChrome) poprzez wielokrotne pipetowanie i podgrzać alikwot o objętości 25 μl na jedno urządzenie OctoChrome do 37°C.</li>
 <li>Podgrzać każde urządzenie OctoChrome (dołączone do zestawu OctoChrome, patrz Rysunek 2) do 37°C, kładąc urządzenie stroną z etykietą do dołu na płycie grzejnej. NIE dotykać wypukłych powierzchni urządzenia OctoChrome, ponieważ znajdują się na nich sondy.</li>
 </ul></li>
 <li>Pozycjonowanie preparatu nad urządzeniem OctoChrome (Rysunek 2)
 <ul>
 <li>Nanieść 2 μl podgrzanego roztworu do hybrydyzacji na każdy z ośmiu obszarów podgrzanego urządzenia OctoChrome, utrzymując temperaturę 37°C.</li>
 <li>Ostrożnie odwrócić szkiełko z preparatem nad urządzeniem OctoChrome w taki sposób, aby liczba 1, która znajduje się teraz do góry nogami, znajdowała się nad prawym górnym obszarem urządzenia OctoChrome. Aby ułatwić zlokalizowanie pola 1, jego pozycja na urządzeniu została zaznaczona kolorem pomarańczowym.</li>
 <li>Upewnić się, że szkiełko z preparatem jest dokładnie wyrównane z odpowiadającymi mu obszarami na urządzeniu OctoChrome. Ostrożnie opuścić szkiełko na urządzenie OctoChrome tak, aby krople roztworu do hybrydyzacji zetknęły się z szkiełkiem. Przyłożyć delikatny, równomierny nacisk, aby upewnić się, że roztwór do hybrydyzacji rozprowadził się do krawędzi każdego z wypukłych obszarów urządzenia OctoChrome.</li>
 <li>Podnieść zespół szkiełko/OctoChrome, trzymając ostrożnie za matową końcówkę szkiełka przedmiotowego, i odwrócić tak, aby szkiełko znalazło się pod urządzeniem OctoChrome. Należy upewnić się, że urządzenie nie przesunęło się po szkiełku z preparatem, ponieważ mogłoby to spowodować krzyżową kontaminację sond.</li>
 <li>Umieścić na płycie grzejnej o temperaturze 37°C (+/- 1°C) na 10 minut.</li>
 </ul></li>
 <li>Denaturacja
 <ul>
 <li>Przenieść zespół szkiełko/urządzenie OctoChrome na płytę grzejną, dbając o to, aby trzymać go poziomo. Upewnić się, że szkiełko z preparatem równomiernie styka się z płytą grzejną.</li>
 <li>Denaturować na płycie grzejnej w temperaturze 75°C (+/- 1°C) przez 5 minut.</li>
 </ul></li>
 <li>Hybrydyzacja
 <ul>
 <li>Umieścić zespół szkiełko/urządzenie OctoChrome w komorze do hybrydyzacji wielosondowej Chromoprobe.</li>
 <li>Zamknąć pokrywą i pozostawić komorę w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C (+/- 1°C) (bez mieszania) przez noc. Uwaga: NIE uszczelniać pokrywy komory do hybrydyzacji; NIE uszczelniać pokrywy kąpieli wodnej; NIE przeprowadzać hybrydyzacji w inkubatorze. Kroki te są kluczowe dla kontroli wilgotności.</li>
 </ul></li>
 <li>Płukania po hybrydyzacji
 <ul>
 <li>Przygotowanie roztworów do płukania 
 Roztwór 1: Przygotować naczynie Coplina/Hellendahla zawierające 0.4x SSC. Wyrównać temperaturę do 72°C (+/- 1°C) w kąpieli wodnej i dostosować pH do 7,0. 
 Roztwór 2: Przygotować naczynie Coplina/Hellendahla zawierające 2x SSC i 0,05% Tween 20. Pozostawić w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Ostrożnie zdjąć urządzenie OctoChrome ze szkiełka i umieścić szkiełko w Roztworze 1 na 2 minuty.</li>
 <li>Przenieść szkiełko do Roztworu 2 na 30 sekund.</li>
 </ul>
</li>
 </ol>
 4. Montowanie i wizualizacja wyników
 <ul>
 <li>Nanieś 20 μl DAPI na środek każdej połowy preparatu i przykryj szkiełkiem coverglass.</li>
 <li>Inkubuj w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed analizą pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
 </ul>
5. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 3A przedstawia prawidłową komórkę w metafazie w Polu 2. (1)-(3): chromosomy 8, 21 i 12 zostały zabarwione na czerwono, zielono i niebiesko i są odpowiednio wizualizowane za pomocą filtrów Texas Red, FITC oraz DEAC; (4): wizualizacja za pomocą potrójnego filtra DAPI/FITC/Texas Red. Zazwyczaj chromosomy zabarwione na niebiesko nie są wyraźne przy użyciu potrójnego filtra i wymagają obserwacji pod specyficznym filtrem DEAC.
Rysunek 3B przedstawia reprezentatywne nieprawidłowe komórki z translokacją chromosomową swoistą dla białaczki oraz aneuploidią. (1): t(8;21), częsta translokacja chromosomowa w ostrej białaczce szpikowej; (2): Trisomia 21, trzy kopie chromosomu 21, częsta aneuploidia w białaczkach.
<img alt="Schemat kariotypu, identyfikacja chromosomów, analiza genetyczna, chromosomy 1-22, XY, badania." src="/files/ftp_upload/3619/3619fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1">
Rysunek 1. Układ kombinacji chromosomów w urządzeniu OctoChrome i oczekiwane wyniki malowania chromosomów.
<img alt="Konfiguracja urządzenia OctoChrome do analizy próbek, przedstawiająca ponumerowaną konfigurację i pozycjonowanie preparatu." src="/files/ftp_upload/3619/3619fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2">
Rysunek 2. Pozycjonowanie preparatu na szkiełku nad urządzeniem OctoChrome.






















Rycina 3. Reprezentatywne wyniki uzyskane za pomocą metody OctoChrome FISH (Kwadrat 2).
<img alt="Schemat fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), chromosomy 8, 21, 12, analiza wielokolorowa." src="/files/ftp_upload/3619/3619fig3A.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3A">
Rysunek 3A. Prawidłowa komórka z chromosomami 8, 12, 21 zabarwionymi w Kwadracie 2.
<img alt="Analiza kariotypu; t(8;21), Trisomia 21; obrazowanie chromosomów, diagnostyka zaburzeń genetycznych, FISH." src="/files/ftp_upload/3619/3619fig3B.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3B">
Ryc. 3B. Reprezentatywne komórki abnormalne z leukemiczną translokacją chromosomową i aneuploidią w polu 2.

<ol><li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization: past, present and future.</a> J. Cell. Sci. 116, 2833-2838 (2003).</li>
<li>Zhang, L., Eastmond, D. A., Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+chromosomal+aberrations+detected+in+humans+exposed+to+benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The nature of chromosomal aberrations detected in humans exposed to benzene.</a> Crit. Rev. Toxicol. 32, 1-42 (2002).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrations+in+chromosomes+associated+with+lymphoma+and+therapy-related+leukemia+in+benzene-exposed+workers%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Aberrations in chromosomes associated with lymphoma and therapy-related leukemia in benzene-exposed workers.</a> Environ. Mol. Mutagen. 48, 467-474 (2007).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzene+increases+aneuploidy+in+the+lymphocytes+of+exposed+workers%3A+a+comparison+of+data+obtained+by+fluorescence+in+situ+hybridization+in+interphase+and+metaphase%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Benzene increases aneuploidy in the lymphocytes of exposed workers: a comparison of data obtained by fluorescence in situ hybridization in interphase and metaphase.</a> Environ. Mol. Mutagen. 34, 260-268 (1999).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+aneusomy+and+long+arm+deletion+of+chromosomes+5+and+7+in+the+lymphocytes+of+Chinese+workers+exposed+to+benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Increased aneusomy and long arm deletion of chromosomes 5 and 7 in the lymphocytes of Chinese workers exposed to benzene.</a> Carcinogenesis. 19, 1955-1961 (1998).</li>
<li>Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+translocations+and+aneusomy+in+chromosomes+8+and+21+among+workers+exposed+to+benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Increased translocations and aneusomy in chromosomes 8 and 21 among workers exposed to benzene.</a> Cancer. Res. 58, 2176-2181 (1998).</li>
<li>Bayani, J., Squire, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+detection+of+chromosomal+aberrations+using+spectral+karyotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Genet%22%5BJournal%5D)">Advances in the detection of chromosomal aberrations using spectral karyotyping.</a> Clin. Genet. 59, 65-73 (2001).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-wide+aneuploidy+study+%28CWAS%29+in+workers+exposed+to+an+established+leukemogen%2C+benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Chromosome-wide aneuploidy study (CWAS) in workers exposed to an established leukemogen, benzene.</a> Carcinogenesis. 32, 605-612 (2011).</li>
<li>Rowley, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+chromosome+translocations+in+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">The role of chromosome translocations in leukemogenesis.</a> Semin. Hematol. 36, 59-72 (1999).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+OctoChrome+fluorescence+in+situ+hybridization+to+detect+specific+aneuploidy+among+all+24+chromosomes+in+benzene-exposed+workers%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol.+Interact%22%5BJournal%5D)">Use of OctoChrome fluorescence in situ hybridization to detect specific aneuploidy among all 24 chromosomes in benzene-exposed workers.</a> Chem. Biol. Interact. , 153-154 (2005).</li>
<li>Barch, M. J., Lawce, H. J., Arsham, M. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarch%2C+MJ+%22In+The+ACT+cytogenetics+laboratory%22">In The ACT cytogenetics laboratory</a>. Barch, M. J. , Raven Press. 17-30 (1991).</li>
<li>Zhang, L., Yang, W., Hubbard, A. E., Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonrandom+aneuploidy+of+chromosomes+1%2C+5%2C+6%2C+7%2C+8%2C+9%2C+11%2C+12%2C+and+21+induced+by+the+benzene+metabolites+hydroquinone+and+benzenetriol%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Nonrandom aneuploidy of chromosomes 1, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, and 21 induced by the benzene metabolites hydroquinone and benzenetriol.</a> Environ. Mol. Mutagen. 45, 388-396 (2005).</li>
<li>Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroquinone%2C+a+benzene+metabolite%2C+increases+the+level+of+aneusomy+of+chromosomes+7+and+8+in+human+CD34-positive+blood+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Hydroquinone, a benzene metabolite, increases the level of aneusomy of chromosomes 7 and 8 in human CD34-positive blood progenitor cells.</a> Carcinogenesis. 21, 1485-1490 (2000).</li>
<li>Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+benzene+health+effects+and+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Public.+Health%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding benzene health effects and susceptibility.</a> Annu. Rev. Public. Health. 31, 133-148 (2010).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Ten nowatorski test OctoChrome-FISH umożliwia jednoczesne badanie wszystkich 24 ludzkich chromosomów w ramach jednej hybrydyzacji na jednym szkiełku. Układ kombinacji chromosomów w 8 polach został zaprojektowany tak, aby ułatwić identyfikację nierandomowych rearanżacji chromosomowych występujących w najczęstszych białaczkach i chłoniakach. W związku z tym test ten pozwala na jednoczesne wykrywanie zarówno zmian liczbowych (aneuploidii), jak i strukturalnych (translokacji) chromosomów.
Najbardz...

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw OctoChrome</td><td>Cytocell Ltd.</td><td>PMP 803</td><td></td></tr><tr><td>fitohemaglutynina (PHA)</td><td>Invitrogen</td><td>10576-015</td><td></td></tr><tr><td>Kolcemid</td><td>Invitrogen</td><td>15212-012</td><td></td></tr><tr><td>Fiksatyw Carnoy&amp;rsquo;a</td><td></td><td></td><td>Methanol : glacial acetic acid = 3: 1</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td></td><td></td><td>Wyposażony w filtry do osobnej obserwacji widm DAPI, Texas Red, FITC i kumaryny oraz potrójny filtr DAPI/FITC/Texas Red do jednoczesnej obserwacji różnych kolorów</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Metafer</td><td>MetaSystems, Altlussheim, Germany</td><td></td><td>Ułatwia lokalizację wszystkich metafaz oraz ponowną ocenę nieprawidłowości</td></tr></tbody></table>

chromosomika: jednoczesne wykrywanie aberracji numerycznych i strukturalnych we wszystkich 24 chromosomach ludzkich z wykorzystaniem nowej metody fish octochrome

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH) jest techniką umożliwiającą wykrywanie specyficznych sekwencji DNA na chromosomach w metafazie lub interfazie w jądrach komórkowych1. Technika ta wykorzystuje sondy DNA o unikalnych sekwencjach, które hybrydyzują z całymi chromosomami lub specyficznymi regionami chromosomalnymi, i stanowi potężne uzupełnienie klasycznej cytogenetyki. Na przykład w wielu wcześniejszych badaniach z wykorzystaniem klasycznej analizy cytogenetycznej zgłaszano częste wykrywanie zwiększonej liczby aberracji chromosomalnych u pacjentów z białaczką związaną z ekspozycją na benzen, u pacjentów z zatruciem benzenem oraz u zdrowych pracowników narażonych na benzen2. Z zastosowaniem metody FISH zaobserwowano podwyższony poziom specyficznych dla białaczki zmian chromosomalnych u pozornie zdrowych pracowników narażonych na benzen3-6, co wskazuje na kluczową rolę zmian cytogenetycznych w indukowanej benzenem leukemogenezie.
Zazwyczaj pojedynczy test FISH analizuje tylko jeden lub kilka całych chromosomów lub specyficznych loci na jednym szkiełku, dlatego w celu objęcia wszystkich ludzkich chromosomów konieczne jest przeprowadzenie wielu hybrydyzacji na wielu szkiełkach. Kariotypowanie spektralne (SKY) umożliwia jednoczesną wizualizację całego genomu, jednak wymóg zastosowania specjalistycznego oprogramowania i sprzętu ogranicza jego zastosowanie7. W niniejszej pracy opisujemy nową metodę FISH, OctoChrome-FISH, którą można zastosować w Chromosomics, co definiujemy tutaj jako jednoczesną analizę wszystkich 24 ludzkich chromosomów na jednym szkiełku w badaniach ludzi, takich jak badanie aneuploidii w obrębie całego zestawu chromosomów (CWAS)8. Podstawą tej metody, oferowanej przez firmę Cytocell jako Chromoprobe Multiprobe System, jest urządzenie OctoChrome podzielone na 8 kwadratów, z których każdy zawiera trzy różne sondy do malowania całych chromosomów (Rycina 1). Każda z trzech sond jest bezpośrednio znakowana fluorophorem o innym kolorze: zielonym (FITC), czerwonym (Texas Red) i niebieskim (Coumarin). Układ kombinacji chromosomów w urządzeniu OctoChrome został zaprojektowany tak, aby ułatwić identyfikację nierandomowych strukturalnych zmian chromosomowych (translokacji) występujących w najczęstszych białaczkach i chłoniakach, np. t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Ponadto można jednocześnie wykrywać zmiany liczby chromosomów (aneuploidie). Odpowiadający im szkiełko matryca jest również podzielone na 8 kwadratów, do których przytwierdzone są preparaty metafaz (Rycina 2), i jest ono umieszczane nad urządzeniem OctoChrome. Sondy oraz docelowe DNA są denaturowane w wysokiej temperaturze i hybrydyzowane w komorze wilgotnej, a następnie wszystkie 24 ludzkie chromosomy mogą zostać zwizualizowane jednocześnie.
OctoChrome FISH to obiecująca technika w diagnostyce klinicznej białaczek i chłoniaków oraz w wykrywaniu aneuploidii we wszystkich chromosomach. Zastosowaliśmy to nowe podejście chromosomalne w badaniu CWAS wśród chińskich pracowników narażonych na działanie benzenu8,10.

Opisano nowatorską metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), która pozwala na jednoczesne badanie zmian numerycznych i strukturalnych chromosomów, w szczególności specyficznych translokacji chromosomowych związanych z białaczką i chłoniakiem, dla wszystkich 24 ludzkich chromosomów na jednym urządzeniu w ramach jednej hybrydyzacji.

Chromosomika: jednoczesne wykrywanie aberracji numerycznych i strukturalnych we wszystkich 24 chromosomach ludzkich z wykorzystaniem nowej metody FISH OctoChrome

Hybrydyzacja in situ fluorescencyjna (FISH) to technika umożliwiająca detekcję specyficznych sekwencji DNA w chromosomach w metafazie lub interfazie w komórkach...

Test Octa Chrome Fish pozwala na jednoczesną analizę wszystkich 24 ludzkich chromosomów w ramach jednej hybrydyzacji na jednym szkiełku. W pierwszej kolejności należy przygotować preparaty metafaz na specjalnym szkiełku podzielonym na osiem kwadratów. Następnie wykonuje się zautomatyzowane skanowanie szkiełka z próbką, aby ułatwić lokalizację wszystkich metafaz oraz umożliwić późniejszą ponowną ocenę obrazów wszystkich komórek.W kolejnym kroku należy umieścić szkiełko z ośmioma polami nad urządzeniem Octa chrome i przeprowadzić hybrydyzację sond. Uzyskane wyniki mogą wykazywać trzy różne pomalowane całe chromosomy w każdym polu, w zależności od układu kombinacji chromosomów w urządzeniu RO. Pomysł na tę metodę RO FISH pojawił się u mnie na początku lat 90., kiedy zacząłem stosować technikę FISH w badaniach populacji ludzkich.Następnie, podczas corocznej konferencji A A CR w 1994 roku, przedstawiłem pomysł potrójnego malowania kolorystycznego, wykorzystującego osiem kwadratowych szkiełek do osadzania komórek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak klasyczne wyginanie chromosomów czy nowoczesne prototypowanie spektralne, jest możliwość łatwej analizy wszystkich 24 ludzkich chromosomów w większej liczbie komórek. Należy rozpocząć od przygotowania komórek w metafazie utrwalonych w zawiesinie; w ramach kontroli nanieść kroplę komórek pipetą na szkiełko i sprawdzić, czy gęstość jest odpowiednia.Następnie zanurz w ośmiu kwadratowych polach chromu OC, a potem przesuń do czystego etanolu na dwie minuty. W sekwencji naprzemiennych kwadratów nanieś pięć µL zawiesiny komórkowej na szkiełko wzorcowe, aby zapobiec nakładaniu się rozprzestrzenionych komórek. Przesusz próbki na powietrzu przed naniesieniem kolejnych sąsiadujących par.Nanieś 20 µL barwnika DAPI o stężeniu 0,2 µg/mL na środek każdej z połówek preparatu i nałóż szkiełko zakrywkowe. Następnie przeprowadź automatyczne skanowanie preparatu w celu zlokalizowania komórek w metafazie. Użyj oprogramowania metaverse, aby ułatwić odnalezienie wszystkich metafaz oraz przyszłą ponowną analizę obrazów wszystkich komórek.Przejrzyj ręcznie wyniki skanowania i usuń artefakty niebędące metafazami. Najpierw usuń barwnik DPI w buforze dwa XSSC, a następnie odwodnij próbki poprzez serię przemyć etanolem. Osusz preparat na powietrzu, a następnie umieść go na płytce grzejnej o temperaturze 37 °C na pięć minut.Następnie wyrównaj temperaturę sondy chroma, komory do hybrydyzacji wielosondowej oraz buforu do hybrydyzacji w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, kładąc je stroną z etykietą do dołu. Umieść urządzenie OC chrome na płycie grzewczej o temperaturze 37 °C. Dodaj 2 µL uprzednio ogrzanego roztworu do hybrydyzacji do każdego z ośmiu obszarów.Ostrożnie odwróć i ustaw szablon. Nasuń go na urządzenie OC chrome. Upewnij się, że slajd szablonu jest wyrównany względem urządzenia Octa Chrome.Następnie ostrożnie opuść szkiełko na krople roztworu hybrydyzacyjnego i przyłóż delikatny, równomierny nacisk, aby rozprowadzić roztwór hybrydyzacyjny do krawędzi każdego z wypukłych obszarów urządzenia OC chrome. Unieś matowy koniec szkiełka przedmiotowego i odwróć go tak, aby szkiełko znajdowało się pod urządzeniem OC chrome. Umieść całość na płytce grzewczej o temperaturze 37 °C na 10 minut.Następnie przenieś próbkę na płytkę grzewczą ustawioną na 75 °C na pięć minut. Aby zdenaturować próbki przed etapem hybrydyzacji, przenieś je do wieloprzetwornikowej komory hybrydyzacyjnej Chroma Probe. Nałóż pokrywkę i pozostaw komorę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na noc.Ostrożnie wyjmij preparat z urządzenia i przemyj go nadmiarem 0,4 SC w temperaturze 72 °C przez dwie minuty. Przeprowadź drugie płukanie w temperaturze pokojowej przez 30 sekund. Następnie nanieś 20 µl DPI na środek każdej z połówek preparatu i nałóż szkiełko nakrywkę.Próbki inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed analizą za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Test Octa chrome fish umożliwia jednoczesną analizę wszystkich 24 ludzkich chromosomów przy użyciu jednej hybrydyzacji na jednym szkiełku. Każdy kwadrat zawiera trzy różne sondy do malowania całych chromosomów, bezpośrednio znakowane fluorochromami o różnych kolorach.Badanie prawidłowej komórki w metafazie w kwadracie drugim systemu Octa CHRO wykazuje, że chromosomy 8, 21 i 12 są zabarwione na czerwono, zielono i niebiesko. Można je wizualizować pojedynczo przy użyciu odpowiednich filtrów lub jednocześnie za pomocą potrójnego filtra DAPI Fitzy, Texas Red. Takie podejście do analizy chromosomów jest przydatne w wykrywaniu nieprawidłowych komórek z chromosomalnymi translokacjami i aneuplodią specyficznymi dla białaczki.Na przykład t(8;21) jest częstą translokacją chromosomową w ostrej białaczce szpikowej. Trisomia 21 (3 kopie chromosomu 21) to powszechna aneuploidia występująca po rozwoju białaczki. Technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny cytogenetyki molekularnej i epidemiologii molekularnej do badania najczęstszych rearanżacji chromosomowych wykrywanych w białaczkach i chłoniakach, a także do analizy selektywnej ploidii wśród wszystkich chromosomów ludzkich u pacjentów klinicznych lub w populacjach narażonych na działanie substancji toksycznych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak jednocześnie badać wszystkie 24 ludzkie chromosomy w jednej hybrydyzacji na jednym preparasie za pomocą testu Octo Chrome Fish. Definiujemy to jako chromosomy.

chromosomics-detection-numerical-structural-alterations-all-24-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Chromosomiki: Wykrywanie numerycznych i strukturalnych zmian we wszystkich 24 chromosomach ludzkich jednocześnie za pomocą nowatorskiej metody OctoChrome FISH

Niniejszy artykuł opisuje dobór odpowiednich sond do techniki single-cell FISH, metody preparowania jąder blastomerów, a także hybrydyzację in situ i ocenę sygnałów w kontekście diagnostyki przedimplantacyjnej (PGD) stosowanej w warunkach klinicznych.

FISH w diagnostyce preimplantacyjnej

Spektralne kariotypowanie (SKY) jest zaawansowaną techniką cytogenetyczną służącą do identyfikacji aberracji genomicznych i chromosomalnych. Technika ta wykorzystuje sondy do malowania chromosomów, które umożliwiają klasyfikację wszystkich chromosomów. SKY pozwala również na identyfikację złożonych aberracji chromosomalnych oraz wad segregacji u myszy i ludzi z różnymi schorzeniami, w tym z wielotorbielkową chorobą nerek.

Kariotypowanie spektralne w badaniu nieprawidłowości chromosomowych u ludzi i myszy z wielotorbielkowatą chorobą nerek

Opisujemy solidny i wszechstronny protokół do analizy architektury jądrowej za pomocą 3D DNA FISH przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond fluorescencyjnych.

Solidna ryba DNA 3D przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond

Malowanie chromosomów jest użyteczną metodą do badania organizacji jądra komórkowego i ewolucji kariotypu. W tym miejscu demonstrujemy podejście do izolowania i amplifikacji określonych regionów zainteresowania z pojedynczych chromosomów politenowych, które są następnie wykorzystywane do dwu- i trójwymiarowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Malowanie chromosomów 2D i 3D u komarów malarii

Opisano protokół przygotowania wysokiej jakości rozsiewów mitotycznych chromosomów roślinnych metodą szybkiego upuszczania na sucho, odpowiednią do wykrywania FISH pojedynczych i wysokokopijnych sond DNA.

Szybka metoda przygotowania chromosomów do opadania na powietrzu odpowiednia dla RYB w roślinach

Niniejszy protokół opisuje przydatność wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) w identyfikacji stabilnych międzychromosomowych aberracji w komórkach szpiku kostnego myszy po ekspozycji na promieniowanie całego ciała.

Wykrywanie stabilnych aberracji międzychromosomowych za pomocą wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) u napromieniowanych myszy

Ten manuskrypt przedstawia szczegółową metodę generowania sond ramienia chromosomu X i przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu zbadania stanu kohezji chromatydy siostrzanej w oocytach Drosophila zatrzymanych w prometafazie i metafazie I. Protokół ten jest odpowiedni do określenia, czy spójność ramienia mejotycznego jest nienaruszona, czy zakłócona w różnych genotypach.

Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do monitorowania stanu kohezji ramienia w oocytach prometafazy i metafazy I drosophila

3D wielokolorowe DNA FISH reprezentuje narzędzie do wizualizacji wielu loci genomowych w zachowanych jądrach 3D, jednoznacznie definiując ich wzajemne oddziaływania i lokalizację w przestrzeni jądrowej na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu opisano protokół krok po kroku dla szerokiego spektrum ludzkich komórek pierwotnych.

Wielokolorowe narzędzie 3D DNA FISH do badania architektury jądrowej w ludzkich komórkach pierwotnych

Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

Niniejszy artykuł wideo przedstawia krok po kroku sposób przetwarzania próbki nasienia w celu uzyskania wysokiej jakości hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ na ludzkich plemnikach. Otrzymane preparaty mogą być wykorzystywane do przesiewowego badania aneuploidii w ramach diagnostyki klinicznej.<br...

Protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w ludzkich plemnikach

Poznaj metodę OctoChrome FISH do jednoczesnego wykrywania zmian liczbowych i strukturalnych we wszystkich 24 chromosomach ludzkich. Technika ta usprawnia analizę aberracji chromosomowych w białaczkach i chłoniakach.

Chromosomika: Wykrywanie zmian numerycznych i strukturalnych we wszystkich 24 chromosomach ludzkich jednocześnie za pomocą nowatorskiego testu OctoChrome FISH (Wideo) | JoVE Journal

Chromosomika: jednoczesne wykrywanie aberracji numerycznych i strukturalnych we wszystkich 24 chromosomach ludzkich z wykorzystaniem nowej metody FISH OctoChrome

Przeglądaj więcej filmów