Chromosomika: Wykrywanie zmian numerycznych i strukturalnych we wszystkich 24 chromosomach ludzkich jednocześnie za pomocą nowatorskiego testu OctoChrome FISH
February 6th, 2012
Opisana jest nowatorska metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), która jednocześnie bada zarówno numeryczne, jak i strukturalne zmiany chromosomów, szczególnie specyficzne translokacje chromosomowe związane z białaczką i chłoniakiem, wszystkich 24 ludzkich chromosomów na jednym urządzeniu w jednej hybrydyzacji.
Test Octa Chrome Fish jednocześnie bada wszystkie 24 ludzkie chromosomy w jednej hybrydyzacji na jednym szkiełku. Najpierw przygotuj spready metafazy na konkretnym szkiełku o powierzchni ośmiu kwadratów. Następnie wykonaj automatyczne skanowanie szkiełka z próbką, aby ułatwić lokalizację wszystkich faz meta i przyszłą ponowną ocenę wszystkich obrazów komórek.
W następnej pozycji osiem kwadratów przesuwa się po chromowanym urządzeniu Octa i hybrydyzuje sondy. Uzyskane wyniki mogą pokazać trzy różne pomalowane całe chromosomy w każdym kwadracie w oparciu o układ kombinacji chromosomów na urządzeniu RO. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody RO FISH, kiedy zacząłem stosować ryby w badaniach populacji ludzkiej na początku lat 90.
Potem przedstawiłem swój pomysł na malowanie trzema kolorami, osiem kwadratowych slajdów, aby ustawić komórkę na dorocznej konferencji AA CR w 1994 roku. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak klasyczne zginanie chromosomów i nowoczesne prototypowanie spektralne, jest to, że może ona z łatwością analizować wszystkie 24 ludzkie chromosomy w większej liczbie komórek. Rozpocząć od przygotowania komórek metafazowych utrwalonych w zawiesinie jako pipeta kontrolna, zrzucać komórki na szkiełko i sprawdzać odpowiednią gęstość.
Teraz zanurz w ośmiu kwadratowych chromach OC, wsuń w czysty etanol na dwie minuty. W sekwencji naprzemiennych kwadratów rozprowadź pięć mikrolitrów zawiesiny komórek na szkiełku matrycowym, aby zapobiec wzajemnemu zakłócaniu rozprzestrzeniania się komórek. Wysuszyć próbki na powietrzu przed zauważeniem sąsiednich par.
Nałóż 20 mikrolitrów po 0,2 mikrograma na mililitr barwnika DAPI na środek każdej połowy szkiełka i umieść szkiełko nakrywkowe. Teraz wykonaj automatyczne skanowanie szkiełka z próbką, aby zlokalizować komórki metafazy. Korzystaj z oprogramowania metaverse, aby ułatwić lokalizację wszystkich faz meta i przyszłą ponowną ocenę wszystkich obrazów komórek.
Przeglądaj wyniki skanowania ręcznie i usuwaj artefakty niebędące metafazami. Najpierw usuń plamę DPI z dwóch XSSC, a następnie odwodnij próbki przez serię płukań etanolem. Wysuszyć szkiełko na powietrzu, a następnie umieścić je na talerzu chmielowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut.
Teraz zrównoważ sondę chrominancji, komorę hybrydyzacyjną z wieloma sondami i bufor hybrydyzacyjny w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza Stroną z etykietą do dołu. Umieść urządzenie OC chrome na płycie grzejnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj dwa mikrolitry wstępnie ciepłego roztworu hybrydyzacyjnego do każdego z ośmiu obszarów.
Ostrożnie odwróć i zorientuj szablon. Przesuń palcem po urządzeniu OC chrome. Sprawdź, czy slajd szablonu jest wyrównany do urządzenia Octa Chrome.
Następnie ostrożnie opuść szkiełko na krople roztworu hybrydyzacyjnego i delikatnie równomiernie dociśnij, aby rozprowadzić roztwór hybrydyzacyjny na krawędziach każdego z podniesionych obszarów na chromowanym urządzeniu OC. Podnieś matowy koniec szklanej prowadnicy i odwróć tak, aby suwak znalazł się pod urządzeniem OC chrome. Umieść na płycie grzejnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut.
Następnie przenieś go na płytę grzejną o temperaturze 75 stopni Celsjusza na pięć minut. Aby zdenaturować próbki do etapu hybrydyzacji, przenieś je do sondy chrominancji, komory hybrydyzacji z wieloma sondami. Załóż pokrywę i zanurz komorę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc.
Ostrożnie wyjmij szkiełko z urządzenia i myj w 0,4 nadmiarze SC w temperaturze 72 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Drugie pranie w temperaturze pokojowej wykonuj przez 30 sekund. Kontynuuj dodawanie 20 mikrolitrów DPI do środka każdej połowy szkiełka i umieść szkiełko nakrywkowe.
Próbki należy inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed obejrzeniem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Test ryb Octa chrome ułatwia jednoczesne badanie wszystkich 24 ludzkich chromosomów przy użyciu pojedynczej hybrydyzacji na jednym szkiełku. Każdy kwadrat zawiera trzy różne sondy do malowania całych chromosomów bezpośrednio oznaczone fluorem o różnych kolorach.
Badanie czwórek normalnej komórki metafazy w drugim kwadracie systemu Octa CHRO pokazuje, że chromosomy 8, 21 i 12 są pomalowane na czerwono, zielono i niebiesko. Mogą być wizualizowane indywidualnie za pomocą odpowiednich filtrów lub wizualizowane jednocześnie przez potrójny filtr DAPI Fitzy, Texas Red. To podejście chromosomowe ma zastosowanie w wykrywaniu nieprawidłowych komórek z chromosomami, translokacjami i aneuploidią specyficznymi dla białaczki.
Na przykład T 8 21 jest powszechną translokacją chromosomową w ostrej białaczce szpikowej. Trisomia 21 3 kopie chromosomu 21 jest powszechną aneuploidią w białaczce Po rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się cytogenetyką molekularną i epidemiologią molekularną do zbadania najczęstszych rearanżacji chromosomów wykrywanych w białaczce i chłoniaku oraz do zbadania selektywnej ploidalności wszystkich ludzkich chromosomów u pacjentów klinicznych lub populacji narażonych na toksyczne chemikalia.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak jednocześnie badać wszystkie 24 ludzkie chromosomy w jednej hybrydyzacji na jednym szkiełku za pomocą testu Octo Chrome Fish. Definiujemy to jako chromosomy.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje nową metodę hybrydyzacji in situ z fluorescencyjnym markerem (FISH) znaną jako Octa Chrome Fish assay. Pozwala ona na jednoczesne badanie wszystkich 24 ludzkich chromosomów w jednym hybrydyzacji na jednej szkle, koncentrując się na aberracjach chromosomowych związanych z białaczką i chłoniakiem.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Hybrydyzacja in situ z fluorescencyjnym markerem (FISH)
- Analiza chromosomowa
- Onkologia
Tło
- FISH to technika stosowana do wykrywania i lokalizowania obecności lub braku określonych sekwencyj DNA na chromosomach.
- Translokacje chromosomowe mają znaczenie w badaniach nad białaczką i chłoniakiem.
- Metoda pozwala na kompleksową analizę aberracji chromosomowych.
- Poprzednie metody wymagały wielokrotnego hybrydyzacji, co sprawia, że podejście to jest bardziej efektywne.
Cel badania
- Opracowanie metody, która upraszcza wykrywanie aberracji chromosomowych.
- Poprawa efektywności analizy chromosomowej w warunkach klinicznych.
- Dostarczenie narzędzia do lepszego zrozumienia genetycznych podstaw nowotworów krwi.
Stosowane metody
- Przygotowanie rozmazu metafazowego na specjalistycznej osiemkwadratowej szkle.
- Automatyczne skanowanie szkla w celu zlokalizowania metafaz do analizy.
- Hybrydyzacja sond za pomocą urządzenia Octa Chrome.
- Wizualizacja wyników pokazujących różne pomalowane chromosomy w całości na podstawie układów.
Główne wyniki
- Test z powodzeniem wizualizuje wszystkie 24 chromosomy w jednym hybrydyzacji.
- Wyniki mogą wyświetlać trzy różne pomalowane chromosomy w każdym kwadracie szkla.
- Ułatwia ponowną ocenę obrazów komórek dla kompleksowej analizy.
- Wykazuje potencjał zastosowania w badaniach populacji ludzkich.
Wnioski
- Octa Chrome Fish assay reprezentuje znaczący postęp w metodologii FISH.
- Ta metoda może poprawić wykrywanie aberracji chromosomowych w rakach hematologicznych.
- Oferuje bardziej efektywne podejście dla badaczy i lekarzy.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The OctoChrome-FISH assay enables simultaneous detection of numerical and structural chromosomal alterations across all 24 human chromosomes in a single hybridization, addressing a key bottleneck in cytogenetic analysis for hematological malignancies. By consolidating whole-genome screening into one slide-based workflow, it enhances throughput and reproducibility in leukemia and lymphoma research, supporting early target validation and mechanistic de-risking in preclinical discovery. This capability improves predictive confidence in identifying translocation-driven oncogenes and aneuploidy patterns relevant to benzene-induced leukemogenesis and other toxicant exposures.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing leukemia-specific translocations such as t(9;22), t(15;17), t(8;21), and t(14;18) in their native chromosomal context.
- Operational Value: Reduces need for multiple sequential FISH hybridizations, conserving samples and accelerating target confirmation in discovery biology.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing concurrent assessment of structural rearrangements and genome-wide aneuploidy, improving confidence in target-disease associations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated chromosomal systems for downstream screening by establishing baseline karyotypes and detecting background alteration rates in exposed populations.
- Operational Value: Standardizes cytogenetic readouts through consistent probe labeling and slide architecture, enhancing reproducibility across laboratories and screening campaigns.
- Scalability Value: Enables high-content analysis of metaphase spreads via automated scanning, facilitating reevaluation and longitudinal tracking of chromosomal stability in longitudinal toxicology studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Bridges discovery and preclinical validation by allowing direct comparison of chromosomal alterations in cell models, patient samples, and population cohorts exposed to leukemogens like benzene.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed aneuploidies or translocations are random events or exposure-linked patterns, informing risk assessment in translational biomarker development.
- Continuity Value: Supports seamless transition from in vitro findings to in vivo relevance by maintaining chromosomal resolution across model systems and human specimens.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling chromosomal analysis at early hypothesis testing stages and supporting lead identification through mechanistic de-risking of genomic instability.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of chromosomal mechanisms in leukemogenesis by allowing simultaneous screening for multiple known and novel alterations across the genome.
- Screening: Delivers quantitative, multiplexed outputs (e.g., translocation frequency, aneuploidy rates) that allow comparison of compound or exposure effects across conditions.
- Analytics: Generates multiplexed fluorescence readouts compatible with automated imaging and software-assisted karyotyping, enabling objective comparison of chromosomal states.
- Translational Research: Connects in vitro findings to human relevance by detecting identical chromosomal patterns in population studies, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable cytogenetic platform applicable across oncology, toxicology, and pharmacogenomics programs requiring chromosomal integrity assessment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false negatives through comprehensive chromosomal coverage.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility via standardized probe sets and slide format, minimizing inter-laboratory variability.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by reducing reagent consumption and hands-on time compared to sequential FISH or SKY approaches.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions by providing early evidence of genomic stability or instability in lead candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and cytogenetic preparation for accurate metaphase spread generation and signal interpretation.
- Dependent on access to the OctoChrome device and compatible hybridization chambers for multi-probe simultaneous delivery.
- Necessitates standardization of slide handling, denaturation, and washing protocols to ensure consistent probe penetration and signal-to-noise ratios.
- Adaptation to non-human model systems may require revalidation of probe specificity and chromosomal painting efficiency.
- Practical limitations include reliance on metaphase-quality samples and potential signal overlap in highly rearranged genomes, requiring careful spectral unmixing.
