Chromosomika: jednoczesne wykrywanie aberracji numerycznych i strukturalnych we wszystkich 24 chromosomach ludzkich z wykorzystaniem nowej metody FISH OctoChrome
6 lutego 2012
Opisano nowatorską metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), która pozwala na jednoczesne badanie zmian numerycznych i strukturalnych chromosomów, w szczególności specyficznych translokacji chromosomowych związanych z białaczką i chłoniakiem, dla wszystkich 24 ludzkich chromosomów na jednym urządzeniu w ramach jednej hybrydyzacji.
Test Octa Chrome Fish pozwala na jednoczesną analizę wszystkich 24 ludzkich chromosomów w ramach jednej hybrydyzacji na jednym szkiełku. W pierwszej kolejności należy przygotować preparaty metafaz na specjalnym szkiełku podzielonym na osiem kwadratów. Następnie wykonuje się zautomatyzowane skanowanie szkiełka z próbką, aby ułatwić lokalizację wszystkich metafaz oraz umożliwić późniejszą ponowną ocenę obrazów wszystkich komórek.
W kolejnym kroku należy umieścić szkiełko z ośmioma polami nad urządzeniem Octa chrome i przeprowadzić hybrydyzację sond. Uzyskane wyniki mogą wykazywać trzy różne pomalowane całe chromosomy w każdym polu, w zależności od układu kombinacji chromosomów w urządzeniu RO. Pomysł na tę metodę RO FISH pojawił się u mnie na początku lat 90., kiedy zacząłem stosować technikę FISH w badaniach populacji ludzkich.
Następnie, podczas corocznej konferencji A A CR w 1994 roku, przedstawiłem pomysł potrójnego malowania kolorystycznego, wykorzystującego osiem kwadratowych szkiełek do osadzania komórek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak klasyczne wyginanie chromosomów czy nowoczesne prototypowanie spektralne, jest możliwość łatwej analizy wszystkich 24 ludzkich chromosomów w większej liczbie komórek. Należy rozpocząć od przygotowania komórek w metafazie utrwalonych w zawiesinie; w ramach kontroli nanieść kroplę komórek pipetą na szkiełko i sprawdzić, czy gęstość jest odpowiednia.
Następnie zanurz w ośmiu kwadratowych polach chromu OC, a potem przesuń do czystego etanolu na dwie minuty. W sekwencji naprzemiennych kwadratów nanieś pięć µL zawiesiny komórkowej na szkiełko wzorcowe, aby zapobiec nakładaniu się rozprzestrzenionych komórek. Przesusz próbki na powietrzu przed naniesieniem kolejnych sąsiadujących par.
Nanieś 20 µL barwnika DAPI o stężeniu 0,2 µg/mL na środek każdej z połówek preparatu i nałóż szkiełko zakrywkowe. Następnie przeprowadź automatyczne skanowanie preparatu w celu zlokalizowania komórek w metafazie. Użyj oprogramowania metaverse, aby ułatwić odnalezienie wszystkich metafaz oraz przyszłą ponowną analizę obrazów wszystkich komórek.
Przejrzyj ręcznie wyniki skanowania i usuń artefakty niebędące metafazami. Najpierw usuń barwnik DPI w buforze dwa XSSC, a następnie odwodnij próbki poprzez serię przemyć etanolem. Osusz preparat na powietrzu, a następnie umieść go na płytce grzejnej o temperaturze 37 °C na pięć minut.
Następnie wyrównaj temperaturę sondy chroma, komory do hybrydyzacji wielosondowej oraz buforu do hybrydyzacji w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, kładąc je stroną z etykietą do dołu. Umieść urządzenie OC chrome na płycie grzewczej o temperaturze 37 °C. Dodaj 2 µL uprzednio ogrzanego roztworu do hybrydyzacji do każdego z ośmiu obszarów.
Ostrożnie odwróć i ustaw szablon. Nasuń go na urządzenie OC chrome. Upewnij się, że slajd szablonu jest wyrównany względem urządzenia Octa Chrome.
Następnie ostrożnie opuść szkiełko na krople roztworu hybrydyzacyjnego i przyłóż delikatny, równomierny nacisk, aby rozprowadzić roztwór hybrydyzacyjny do krawędzi każdego z wypukłych obszarów urządzenia OC chrome. Unieś matowy koniec szkiełka przedmiotowego i odwróć go tak, aby szkiełko znajdowało się pod urządzeniem OC chrome. Umieść całość na płytce grzewczej o temperaturze 37 °C na 10 minut.
Następnie przenieś próbkę na płytkę grzewczą ustawioną na 75 °C na pięć minut. Aby zdenaturować próbki przed etapem hybrydyzacji, przenieś je do wieloprzetwornikowej komory hybrydyzacyjnej Chroma Probe. Nałóż pokrywkę i pozostaw komorę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na noc.
Ostrożnie wyjmij preparat z urządzenia i przemyj go nadmiarem 0,4 SC w temperaturze 72 °C przez dwie minuty. Przeprowadź drugie płukanie w temperaturze pokojowej przez 30 sekund. Następnie nanieś 20 µl DPI na środek każdej z połówek preparatu i nałóż szkiełko nakrywkę.
Próbki inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed analizą za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Test Octa chrome fish umożliwia jednoczesną analizę wszystkich 24 ludzkich chromosomów przy użyciu jednej hybrydyzacji na jednym szkiełku. Każdy kwadrat zawiera trzy różne sondy do malowania całych chromosomów, bezpośrednio znakowane fluorochromami o różnych kolorach.
Badanie prawidłowej komórki w metafazie w kwadracie drugim systemu Octa CHRO wykazuje, że chromosomy 8, 21 i 12 są zabarwione na czerwono, zielono i niebiesko. Można je wizualizować pojedynczo przy użyciu odpowiednich filtrów lub jednocześnie za pomocą potrójnego filtra DAPI Fitzy, Texas Red. Takie podejście do analizy chromosomów jest przydatne w wykrywaniu nieprawidłowych komórek z chromosomalnymi translokacjami i aneuplodią specyficznymi dla białaczki.
Na przykład t(8;21) jest częstą translokacją chromosomową w ostrej białaczce szpikowej. Trisomia 21 (3 kopie chromosomu 21) to powszechna aneuploidia występująca po rozwoju białaczki. Technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny cytogenetyki molekularnej i epidemiologii molekularnej do badania najczęstszych rearanżacji chromosomowych wykrywanych w białaczkach i chłoniakach, a także do analizy selektywnej ploidii wśród wszystkich chromosomów ludzkich u pacjentów klinicznych lub w populacjach narażonych na działanie substancji toksycznych.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak jednocześnie badać wszystkie 24 ludzkie chromosomy w jednej hybrydyzacji na jednym preparasie za pomocą testu Octo Chrome Fish. Definiujemy to jako chromosomy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje nowatorską metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), znaną jako test Octa Chrome Fish. Umożliwia ona jednoczesne badanie wszystkich 24 ludzkich chromosomów w ramach jednej hybrydyzacji na jednym szkiełku, ze szczególnym uwzględnieniem zmian chromosomalnych związanych z białaczką i chłoniakiem.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)
- Analiza chromosomowa
- Onkologia
Wstęp
- FISH jest techniką stosowaną do wykrywania i lokalizacji obecności lub braku specyficznych sekwencji DNA w chromosomach.
- Translokacje chromosomalne mają istotne znaczenie w badaniu białaczek i chłoniaków.
- Metoda ta umożliwia kompleksową analizę zmian chromosomalnych.
- Poprzednie metody wymagały wielokrotnych hybrydyzacji, co sprawia, że obecne podejście jest bardziej efektywne.
Cel badania
- Opracowanie metody upraszczającej wykrywanie nieprawidłowości chromosomalnych.
- Zwiększenie wydajności analizy chromosomalnej w warunkach klinicznych.
- Dostarczenie narzędzia pozwalającego na lepsze zrozumienie podłoża genetycznego nowotworów hematologicznych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie preparatów metafaz na specjalistycznym szkiełku z ośmioma polami.
- Zautomatyzowane skanowanie szkiełka w celu zlokalizowania metafaz do analizy.
- Hybrydyzacja sond przy użyciu urządzenia Octa Chrome.
- Wizualizacja wyników przedstawiająca różne pomalowane całe chromosomy w zależności od ich układu.
Główne wyniki
- Test pozwala na skuteczną wizualizację wszystkich 24 chromosomów podczas jednej hybrydyzacji.
- Wyniki mogą przedstawiać trzy różne barwione chromosomy w każdym polu szkiełka.
- Umożliwia ponowną ocenę obrazów komórek w celu przeprowadzenia kompleksowej analizy.
- Wykazuje potencjał do zastosowania w badaniach populacji ludzkiej.
Wnioski
- Analiza Octa Chrome Fish stanowi znaczący postęp w metodologii FISH.
- Metoda ta może poprawić wykrywalność nieprawidłowości chromosomowych w nowotworach hematologicznych.
- Oferuje ona bardziej wydajne podejście dla badaczy i klinicystów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Test OctoChrome-FISH umożliwia jednoczesne wykrywanie liczbowych i strukturalnych zmian chromosomalnych we wszystkich 24 ludzkich chromosomach podczas jednej hybrydyzacji, co rozwiązuje kluczowy problem w analizie cytogenetycznej nowotworów hematologicznych. Dzięki skonsolidowaniu przesiewu całego genomu w jednym procesie na preparacie, zwiększa on przepustowość i powtarzalność badań nad białaczkami i chłoniakami, wspierając wczesną walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w odkryciach przedklinicznych. Możliwość ta zwiększa pewność predykcyjną w identyfikacji onkogenów napędzanych przez translokacje oraz wzorców aneuploidii istotnych w procesie leukemogenezy indukowanej benzenem i ekspozycji na inne toksykanty.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację specyficznych dla białaczek translokacji, takich jak t(9;22), t(15;17), t(8;21) i t(14;18), w ich naturalnym kontekście chromosomalnym.
- Wartość operacyjna: Ogranicza konieczność przeprowadzania wielu sekwencyjnych hybrydyzacji FISH, co pozwala na oszczędność materiału biologicznego i przyspiesza potwierdzenie celu w badaniach nad odkrywaniem nowych leków.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów badawczych poprzez jednoczesną ocenę rearanżacji strukturalnych i aneuploidii w całym genomie, co zwiększa pewność co do powiązań między celem molekularnym a chorobą.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy chromosomowe do dalszego przesiewu poprzez ustalenie kariotypów bazowych oraz wykrywanie wskaźników zmian tła w populacjach eksponowanych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje odczyty cytogenetyczne dzięki spójnemu znakowaniu sond i architekturze preparatów, co zwiększa odtwarzalność pomiędzy laboratoriami i kampaniami przesiewowymi.
- Wartość skalowalności: Umożliwia wysokotreściową analizę rozprzestrzenionych metafaz za pomocą automatycznego skanowania, co ułatwia ponowną ocenę i długoterminowe śledzenie stabilności chromosomowej w podłużnych badaniach toksykologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Łączy fazę odkryć z walidacją przedkliniczną, umożliwiając bezpośrednie porównanie zmian chromosomalnych w modelach komórkowych, próbkach pacjentów oraz kohortach populacyjnych narażonych na leukemogeny, takie jak benzen.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Pozwala wyjaśnić, czy obserwowane aneuploidie lub translokacje są zdarzeniami losowymi, czy wzorcami powiązanymi z ekspozycją, co dostarcza danych do oceny ryzyka w rozwoju translacyjnych biomarkerów.
- Wartość ciągłości: Wspiera płynne przejście od wyników in vitro do istotności in vivo poprzez zachowanie rozdzielczości chromosomalnej w różnych systemach modelowych i preparatach ludzkich.
Integracja potoków i przepływów pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając analizę chromosomową we wczesnych fazach testowania hipotez oraz wspierając identyfikację wiodących związków poprzez mechanistyczną redukcję ryzyka związanego z niestabilnością genomiczną.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez dotyczących mechanizmów chromosomalnych w leukemogenezie, umożliwiając jednoczesne przesiewowe badanie wielu znanych i nowych zmian w całym genomie.
- Badania przesiewowe: Dostarcza ilościowych, multipleksowych wyników (np. częstość translokacji, wskaźniki aneuploidii), które pozwalają na porównanie efektów działania związków lub ekspozycji w różnych warunkach.
- Analityka: Generuje multipleksowe odczyty fluorescencyjne kompatybilne z automatycznym obrazowaniem i wspomaganym programowo kariotypowaniem, co umożliwia obiektywne porównanie stanów chromosomalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki uzyskane in vitro z istotnością kliniczną dla ludzi poprzez wykrywanie identycznych wzorców chromosomalnych w badaniach populacyjnych, co wspiera dopasowanie biomarkerów.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma cytogenetyczna, możliwa do zastosowania w programach onkologicznych, toksykologicznych i farmakogenomicznych wymagających oceny integralności chromosomów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez redukcję wyników fałszywie ujemnych dzięki kompleksowemu pokryciu chromosomów.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki ustandaryzowanym zestawom sond oraz formatowi szkiełek, minimalizując zmienność między laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Zwiększa efektywność kapitałową poprzez zmniejszenie zużycia odczynników i czasu pracy manualnej w porównaniu do sekwencyjnych metod FISH lub SKY.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju skorygowanych o ryzyko, dostarczając wczesnych dowodów na stabilność lub niestabilność genomową w głównych kandydatach.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu mikroskopii fluorescencyjnej i preparatyki cytogenetycznej w celu dokładnego przygotowania rozprzestrzenionych metafaz oraz interpretacji sygnałów.
- Metoda zależy od dostępu do urządzenia OctoChrome oraz kompatybilnych komór hybrydyzacyjnych umożliwiających jednoczesne dostarczenie wielu sond.
- Konieczna jest standaryzacja procedur obchodzenia się z szkiełkami, denaturacji i przemywania, aby zapewnić spójną penetrację sond oraz odpowiedni stosunek sygnału do szumu.
- Adaptacja do modelowych systemów niehumanoidalnych może wymagać ponownej walidacji specyficzności sond oraz wydajności malowania chromosomów.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zależność od próbek wysokiej jakości w fazie metafazy oraz potencalne nakładanie się sygnałów w genomach z licznymi rearanżacjami, co wymaga starannego rozdzielania widmowego (spectral unmixing).
