Name: Produkcja mikromacierzy tkankowych, barwienie immunohistochemiczne i digitalizacja w atlasie białek ludzkich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Poznaj produkcję mikromacierzy tkankowych i barwienie immunohistochemiczne do analizy ekspresji białek w ludzkich tkankach. Ta metoda umożliwia wysokoprzepustowe badania zachowując cenny materiał biologiczny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana z grantów fundacji Knut and Alice Wallenberg. Autorzy wyrażają wdzięczność całemu personelowi centrów Human Protein Atlas w Uppsali, Sztokholmie i Indiach za ich wysiłki włożone w stworzenie Human Protein Atlas. Autorzy pragną szczególnie podziękować Frankowi Hammarowi i Sofie Gustafsson za pomoc przy zdjęciach oraz Elené Karlberg za pomoc przy produkcji TMA podczas filmowania.

1. Jak przygotować tkanki do produkcji macierzy tkankowej (Animacja 1)
<ol>
 <li>Wybierz odpowiedni materiał utrwalony w formalinie i zatopiony w parafinie (próbki tkanek lub komórek), w tym odpowiadający im skrawek tkanki barwiony hematoksyliną.</li>
 <li>Zaznacz odpowiedni obszar na skrawku tkanki. Zaleca się użycie świeżo wyciętego skrawka barwionego hematoksyliną, odpowiadającego blokowi parafinowemu.</li>
 <li>Opracuj szablon wykorzystywany do produkcji TMA. Randomizuj próbki w obrębie szablonu, aby uniknąć artefaktów spowodowanych problemami technicznymi, takimi jak nierównomierne pokrycie całego skrawka TMA przeciwciałem oraz problemy z cięciem. Dodaj do szablonu dodatkowe znaczniki orientacyjne.</li>
 <li>Zorganizuj tkanki zgodnie z szablonem.</li>
</ol>
2. Ręczne przygotowanie macierzy tkanek (Niezbędne do celów filmowania)
<ol>
<li>Aby uzyskać ustandaryzowaną długość rdzeni tkankowych, należy zaznaczyć stylet, np. 4,5 mm (Rysunek 2). Wytyczne dotyczące odstępów między centrami próbek: 
rozmiar rdzenia 0,6 mm – 0,8-1,0 mm 
rozmiar rdzenia 1,0 mm – 1,8-2,0 mm 
rozmiar rdzenia 1,5 mm – 2,0-3,0 mm 
rozmiar rdzenia 2,0 mm – 2,5-4,0 mm 
Zaleca się pozostawienie marginesów 2,5-3,0 mm z każdej strony bloku parafiniowego, aby uniknąć pękania parafiny. 
</li>
<li>
 <ol class="lalpha">
 <li>Zamontuj wybrane wycinaki do użycia. Zacznij od poluzowania śrub z gniazdem sześciokątnym, które utrzymują wycinak na miejscu. Wycinak jest prawidłowo ustawiony, gdy rowek w piaście wycinaka jest ściśle przylegać do metalowego pręta w plastikowym wsporniku V. Dokręć śruby i upewnij się, że krawędź metalowego klipsa jest pozioma.</li>
 <li>Wycinak odbiorczy (oznaczony na zielono i czerwono, specyficzny dla dystrybutora) powinien zostać umieszczony po lewej stronie. Wycinak dawczy (oznaczony na zielono i niebiesko, specyficzny dla dystrybutora), który ma nieco większą średnicę, powinien zostać umieszczony po prawej stronie (Rysunek 3).</li>
 </ol>
</li>
<li>
 <ol class="lalpha">
 <li> Przesuwaj wycinaki wzdłuż osi x i y za pomocą pokręteł regulacyjnych XY. Prawe pokrętło regulacyjne przesuwa wycinaki wzdłuż osi x, a lewe pokrętło regulacyjne przesuwa wycinaki wzdłuż osi y. 
 Na obu pokrętłach regulacyjnych znajduje się cyfrowy odczyt mikrometryczny. Są one aktywowane podczas obracania pokręteł. </li>
 <li> Resetowanie → naciśnij przycisk ZERO/ABS.
 
 Przełączanie między calami a mm → naciśnij przycisk IN/mm.
 
 Odległość między otworami powinna wynosić 2,0 mm (mierzona między centrami otworów) przy użyciu wycinaka 1 mm dla szablonu 9x8.</li>
 </ol>
</li>
<li>
 <ol class="lalpha">
 <li> Aby upewnić się, że wycinak nie zostanie wciśnięty zbyt głęboko w blok, uderzając w kasetkę i niszcząc wycinak, włóż do uchwytu kasetkę bez parafiny i ustaw dolną pozycję wycinaka odbiorczego na 1 mm powyżej dna kasetki za pomocą śruby ogranicznika głębokości w lewym górnym rogu prowadnicy Z (Rysunek 3). </li>
 <li> Włóż blok odbiorczy do uchwytu i użyj najmniejszego śrubokręta, aby dokręcić śruby. Nie dokręcaj śrub zbyt mocno, ponieważ parafina może oddzielić się od kasetki. </li>
 <li> Wciśnij wycinak odbiorczy w dół na około 5 mm do bloku odbiorczego i użyj uchwytu w wycinaku, aby obrócić go raz w przód i w tył (Rysunek 3). Otwór będzie miał 5 mm głębokości przy maksymalnym wciśnięciu wycinaka w blok. </li>
 <li> Powoli zmniejsz nacisk w dół, aby sprężyny mogły przesunąć wycinak w górę. Użyj styletu, aby opróżnić wycinak i usunąć rdzeń parafiny. </li>
 </ol>
</li>
<li>Przesuń wieżyczkę, aby przełączyć na wycinak dawczy (Rysunek 3). </li>
<li>Umieść mostek bloku dawczego z blokiem dawczym nad uchwytem bloku odbiorczego (Rysunek 3). </li>
<li>
 <ol class="lalpha">
 <li> Wciśnij wycinak dawczy w wybrany obszar bloku dawczego. Użyj odpowiadającego mu preparatu barwionego hematoksyliną i eozyną, na którym zaznaczono obszar zainteresowania, aby zlokalizować tkankę do pobrania. Przytrzymaj ręcznie blok dawczy w pozycji lewą ręką i wciśnij wycinak prawą ręką. Pamiętaj, aby nie naciskać na stylet. Ogranicznik głębokości nie blokuje ruchu wycinaka w odpowiedniej pozycji dla bloku dawczego, dlatego ważne jest, aby przestać naciskać, gdy na stylecie pojawi się drugi znacznik.</li>
 <li> Obróć uchwyt wycinaka raz (Rysunek 3). Powoli zdejmij nacisk w dół, nadal trzymając blok dawczy na mostku bloku dawczego.</li>
 <li> Tkanka dawcza powinna być najlepiej wycięta o 0,5 mm krócej niż rdzeń odbiorczy. Proces ten zapewni możliwość regulacji wyrównania rdzeni na powierzchni bloku odbiorczego, zapobiegając utracie cennej reprezentatywnej tkanki.</li>
 </ol>
</li>
<li>Zdejmij mostek i blok dawczy. Upewnij się, że wycinak dawczy jest wyrównany z otworem wykonanym wcześniej (punkt 4). Jeśli wycinak dawczy i otwór w bloku odbiorczym nie są wyrównane, należy skorygować pozycję wycinaka za pomocą śrub regulacyjnych. </li>
<li>Ostrożnie wciśnij wycinak w dół, aż jego końcówka dotknie góry otworu w bloku odbiorczym. Utrzymując tę pozycję, użyj styletu, aby wprowadzić rdzeń tkankowy do otworu. Powierzchnia rdzenia powinna być wyrównana z powierzchnią bloku. </li>
<li>Przesuń wieżyczkę z powrotem na wycinak odbiorczy. </li>
<li>Przejdź do następnej pozycji za pomocą pokręteł regulacyjnych XY. </li>
<li>Powtarzaj czynności od punktu 4c powyżej, aż macierz zostanie ukończona. </li>
<li>Po zakończeniu pracy nad całym blokiem odbiorczym poluzuj śruby w uchwycie bloku odbiorczego. Podgrzewaj blok w temperaturze 42 °C przez 40 minut. Połóż blok obszarem do cięcia skierowanym w dół na szkiełko przedmiotowe. Umieść szkiełko z blokiem na statywie do probówek (lub innej odpowiedniej konstrukcji) i włóż do piekarnika. Po podgrzaniu wyjmij statyw z piekarnika i wyrównaj powierzchnię bloku, delikatnie pocierając szkiełko przedmiotowe. </li>
<li>Umieść blok wraz ze szkiełkiem na płycie chłodzącej na 10 minut.
 
 Aby zapewnić reprezentatywną tkankę w całym TMA, przeprowadza się kontrolę jakości każdego 50tego przekroju.</li>
</ol>
3. Jak przygotować skrawki z TMAs (Animacja 2)
<ol>
 <li>Wyciąć skrawki o grubości 4 μm przy użyciu mikrotomu z systemem transferu skrawków (HM 355S, Microm). System ten można stosować ze wszystkimi obecnymi mikrotomami obrotowymi. System składa się z uchwytu noża z zintegrowanym mostkiem transferowym, podgrzewanej kąpieli wodnej i jednostki sterującej. Z noża skrawki przesuwają się po mokrej powierzchni transferowej poprzez mostek transferowy do kąpieli wodnej.</li>
 <li>Skrawki należy wyjmować z kąpieli wodnej natychmiast po ich rozprostowaniu, aby uniknąć stopienia wrażliwych obszarów tkanki (np. tkanek bogatych w lipidy, takich jak pierś i mózg). Umieścić skrawki na szkiełku typu superfrost. Czas, przez jaki skrawki mogą pozostawać w wodzie, zależy od rodzaju zastosowanej parafiny oraz temperatury wody. W naszym laboratorium stosujemy parafinę firmy HistoLab Products AB, która ma temperaturę topnienia 56-58 °C, i zalecamy temperaturę kąpieli wodnej 37-39 °C.</li>
 <li>Umieścić szkiełka w statywie do szkiełek w celu wysuszenia w temperaturze pokojowej (RT) przez noc.</li>
 <li>Szkiełka należy poddać wypalaniu w temperaturze 50 °C przez 12-24 godziny. Przy użyciu mikrotomu bez STS należy transportować skrawki z noża do kąpieli wodnej ręcznie, np. za pomocą pędzelka.</li>
</ol>
4. Procedura testowa i miareczkowania dla immunohistochemii (Animacja 3)
Każde przeciwciało poddaje się standaryzowanej procedurze testowej z wykorzystaniem specjalnie zaprojektowanych macierzy tkankowych (TMA), zawierających mieszankę tkanek i różnych typów komórek. Celem jest opracowanie indywidualnego i zoptymalizowanego protokołu immunobarwienia dla każdego przeciwciała. Początkowo testowane jest jedno rozcieńczenie, określone na podstawie stężenia roztworu zakładowego przeciwciała pierwotnego. Wynik tego barwienia testowego służy do wyznaczenia kolejnych rozcieńczeń i optymalizacji protokołu.
<ol>
 <li>Przed immunobarwieniem przeprowadza się deparafiniзацию i rehydratację w ksylenie oraz w serii roztworów etanolu o malejącej stężeniu, aż do wody destylowanej.</li>
 <li>Krok blokowania w celu wygaszenia endogennej peroksydazy wykonuje się w 0,3 % H2O2 w 95% etanolu przez 5 minut.</li>
 <li>Odzyskiwanie epitopów indukowane ciepłem (HIER) przeprowadza się w buforze do odzyskiwania o pH 6, wykorzystując autoklaw (Decloaking chamber, Biocare Medical) jako źródło ciepła przez 4 minuty w temperaturze 125 °C. Po zakończeniu gotowania preparaty pozostają w autoklawie i stygną do 90 °C. Całkowity czas procesu HIER wynosi około 45 minut.</li>
 <li>Jeśli w początkowym teście nie uzyskano rozstrzygającego wyniku, przeprowadza się dalsze próby w zależności od obserwowanego wzorca barwienia 5 6. Badanie pilotażowe w ramach wysokoprzepustowego systemu HPA wykazało, że najskuteczniejszym odzyskiwaniem antygenów było HIER przy pH 6, jednak można oczywiście stosować inne metody odzyskiwania, takie jak preinkubacja z proteinazą, mikrofalowanie oraz gotowanie w buforach o wyższym lub niższym pH. Poprzez modyfikację warunków IHC, np. zmianę czasu inkubacji przeciwciał, ich rozcieńczeń oraz czasu inkubacji z diaminobenzydyną (DAB), można uzyskać bardziej jednoznaczne wyniki barwienia.</li>
</ol>
5. Program barwienia, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific)
Wszystkie inkubacje przeprowadzono w temperaturze RT; protokół ten można również zastosować w konfiguracji manualnej z użyciem tych samych odczynników.
<ol>
 <li>Płukanie w buforze do mycia.</li>
 <li>Inkubacja z Ultra V block przez 5 minut.</li>
 <li>Płukanie w buforze do mycia.</li>
 <li>Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym przez 30 minut.</li>
 <li>Płukanie w buforze do mycia (2x).</li>
 <li>Inkubacja z znakowanym polimerem peroksydazy chrzanowej przez 30 minut.</li>
 <li>Płukanie w buforze do mycia (2x).</li>
 <li>Wywoływanie w roztworze DAB przez 10 minut.</li>
 <li>Płukanie w buforze do mycia (2x).</li>
 <li>Kontrastowanie w hematoksylinie Mayera przez 5 minut*. Przy zastosowaniu metody barwienia progresywnego (np. hematoksylina Mayera) intensywność zależy od czasu i nie jest wymagana dyferencjacja. Metoda barwienia regresywnego, np. hematoksylina Harrisa, wymaga dyferencjacji w celu usunięcia nadmiaru barwnika z tkanek, aby uwydatnić strukturę.</li>
 <li>Płukanie w wodzie z kranu*.</li>
 <li>Płukanie w wodzie z węglanem litu, rozcieńczonej 1:5 z roztworu nasyconego, przez 1 minutę*.</li>
 <li>Płukanie w wodzie z kranu przez 5 minut*.</li>
 <li>Odwodnienie preparatów w szeregu stężeń etanolu i przykrycie szkiełek cover-slipem (PERTEX, Histolab).</li>
</ol>
Wszystkie odczynniki nanosi się w objętości 300 μl na każdy preparat. 
* Kroki 10-14 wykonuje się w urządzeniu do barwienia histologicznego (Autostainer XL, Leica), a nakładanie szkiełek zakrywających wykonuje się dodatkowo w systemie do nakładania szkiełek (Automated glass coverslipper CV5030, Leica).
6. Jak skanować preparat
Metoda skanowania preparatów zależy od wykorzystywanego skanera cyfrowego; niniejszy protokół określa jedynie sposób skanowania preparatu przy użyciu zautomatyzowanego systemu skanującego Aperio XT (Aperio Technologies). W konfiguracji Human Protein Atlas stosuje się powiększenie 20x dla tkanek i 40x dla komórek. Skanowanie zautomatyzowane może napotkać problemy z ostrością ze względu na heterogeniczność tkanki oraz liczbę różnych tkanek zawartych w TMA.
<ol>
 <li>Oczyść szkiełko przedmiotowe z zabrudzeń i kleju oraz sprawdź, czy między szkiełkiem nakrywką a skrawkiem nie znajdują się pęcherzyki powietrza. W przypadku obecności pęcherzyków powietrza ponownie zamontuj preparat na szkiełku.</li>
 <li>Włóż szkiełko do statywu, a następnie umieść statyw w skanerze cyfrowym. Czas skanowania TMA przy powiększeniu 20x wynosi około 6 minut. Do wyboru obszaru zainteresowania wykorzystywane jest oprogramowanie firmy Aperio. Wybór punktów ostrości odbywa się automatycznie w ramach oprogramowania. Możliwy jest również ręczny wybór obszaru skanowania i punktów ostrości.</li>
 <li>Po wygenerowaniu obrazu można go wykorzystać do oceny i adnotacji barwienia IHC. Obrazy pozostają jako plik wynikowy eksperymentu i mogą być przesyłane do współpracowników w celu dyskusji oraz wykorzystane do publikacji danych. Obrazy można przeglądać w bezpłatnie dostępnym oprogramowaniu firmy Aperio.</li>
</ol>
7. Jak wyszukiwać ulubione białko w bazie Human Protein Atlas
<ol>
 <li>Przejdź do strony <a href="http://www.proteinatlas.org." target="_blank">www.proteinatlas.org.</a></li>
 <li>Wprowadź nazwę wybranego białka, identyfikator Ensembl, numer akcesyjny UniProt lub nazwę HGNC, np. insulinę.</li>
 <li>Otwórz stronę podsumowania i przewiń w dół do sekcji podsumowania dla normalnych tkanek i narządów. Przegląd pokazuje ekspresję białka w trzustce.</li>
 <li>Kliknij „more tissue data”. Przejdziesz do widoku tkanek prawidłowych, gdzie zobaczysz wszystkie uwzględnione tkanki posortowane według narządów.</li>
 <li>Kliknij trzustkę, aby wyświetlić wyniki IHC dla 3 przeciwciał skierowanych przeciwko temu samemu białku. Aby zobaczyć obraz trzustki w wysokiej rozdzielczości, kliknij w zdjęcie.</li>
 <li>Dodatkowe informacje na temat ekspresji białek w tkankach nowotworowych, komórkach oraz dalsze dane walidacyjne w ramach Human Protein Atlas można znaleźć, przeglądając stronę internetową Human Protein Atlas.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki
Animacja 1. Sposób przygotowania tkanek do produkcji mikromacierzy tkankowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_1_Web.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić Animację 1</a>.
Animacja 2. Jak wykonywać skrawanie TMAs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_2_Web.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić Animację 2</a>.
Animacja 3. Opisano technikę immunohistochemii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_3_Web.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić Animację 3</a>.
<img alt="Schemat procesu macierzy tkanek, cyfrowa analiza preparatów, barwienie przeciwciałami z wykorzystaniem Human Protein Atlas." src="/files/ftp_upload/3620/3620fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Ogólny schemat procesu w ramach projektu Human Protein Atlas w Uppsali.
<img alt="Równowaga statyczna; mosiężny element wahadła; zaznaczona długość; schemat; eksperyment fizyczny." src="/files/ftp_upload/3620/3620fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Styla donorowy z zaznaczoną ustandaryzowaną długością rdzeni tkankowych, np. 4,5 mm.
<img alt="Schemat przygotowania mikroarray tkankowego z punktami dawczymi i biorczymi do analizy próbek." src="/files/ftp_upload/3620/3620fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Ręczny aparat do mikroarray tkankowych.
<img alt="Wyniki analizy dot blot; detekcja białek; trzy próbki membran wykazujące różne wzorce wiązania." src="/files/ftp_upload/3620/3620fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Przykłady różnej jakości wykonanych TMA. (A) Prosta i prawidłowo wyrównana TMA z odpowiednimi odstępami między rzędami i kolumnami, a także od krawędzi parafiny. (B) TMA, w której niektóre rdzenie znajdują się zbyt blisko krawędzi, co prawdopodobnie spowoduje trudności podczas skrawania. (C) TMA, która była wypiekana zbyt długo, co doprowadziło do zapadnięcia się bloku TMA i utraty prawidłowego wzorca.
<img alt="Wyniki analizy dot blot, przedstawiające detekcję białek na membranach, oznaczone jako A, B, C." src="/files/ftp_upload/3620/3620fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. TMAs barwione hematoksyliną i eozyną. (A) Prawidłowo wycięty przekrój z prostymi i wyrównanymi kolumnami oraz rzędami. Użycie zużytego lub zanieczyszczonego ostrza może prowadzić do rozwarstwienia (B) lub zgniatania przekrojów (C).
<img alt="Analiza immunohistochemiczna; porównanie ekspresji białek w przekrojach tkanek, zawiera schemat metody." src="/files/ftp_upload/3620/3620fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Miareczkowanie przeciwciał. (A) Komórki centrum reakcyjnego w węźle chłonnym wykazują optymalnie zmiareczkowane przeciwciało, co skutkuje specyficznym barwieniem cytoplazmy (pokazanym na brązowo) bez tła. (B) Przekrój tkanki wykazuje słabe barwienie. Barwienie negatywne lub słabe występuje, gdy stężenie przeciwciała pierwszorzędowego jest zbyt niskie lub gdy białko docelowe nie występuje w tkankach poddanych immunohistochemii. (C) Przekrój tkanki jest przebarwiony z powodu zastosowania zbyt wysokiego stężenia przeciwciała pierwszorzędowego. Ciemny kolor powoduje trudności w określeniu lokalizacji subkomórkowej ze względu na rozlewanie się barwnika, reakcje krzyżowe i fałszywie dodatnie wyniki.

<ol><li>Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multitumor+%28sausage%29+tissue+block%3A+novel+method+for+immunohistochemical+antibody+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing.</a> Lab Invest. 55, 244-244 (1986).</li>
<li>Kononen, J., Bubendorf, L., Kallioniemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat. Med. 4, 844-844 (1998).</li>
<li>Berglund, L., Bjorling, E., Oksvold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genecentric+Human+Protein+Atlas+for+expression+profiles+based+on+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based on antibodies.</a> Mol. Cell Proteomics. 7, 2019(2008).</li>
<li>Uhlen, M., Bjorling, E., Agaton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+protein+atlas+for+normal+and+cancer+tissues+based+on+antibody+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics.</a> Mol. Cell Proteomics. 4, 1920(2005).</li>
<li>Paavilainen, L., Edvinsson, A., Asplund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+tissue+fixatives+on+morphology+and+antibody-based+protein+profiling+in+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The impact of tissue fixatives on morphology and antibody-based protein profiling in tissues and cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 58, 237-237 (2010).</li>
<li>Paavilainen, L., Wernerus, H., Nilsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+monospecific+antibodies%3A+a+comparison+study+with+commercial+analogs+using+immunohistochemistry+on+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Immunohistochem.+Mol.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of monospecific antibodies: a comparison study with commercial analogs using immunohistochemistry on tissue microarrays.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 16, 493-493 (2008).</li>
<li>Kampf, C., Andersson, A. C., Wester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+tissue+profiling+as+a+tool+for+clinical+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody-based tissue profiling as a tool for clinical proteomics.</a> Clinical Proteomics. 1, 285-285 (2004).</li>
<li>Ponten, F., Jirstrom, K., Uhlen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Protein+Atlas+-+a+tool+for+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The Human Protein Atlas - a tool for pathology.</a> J. Pathol. 216, 387-387 (2008).</li>
<li>Andersson, A. C., Stromberg, S., Backvall, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+expression+in+cell+microarrays%3A+a+tool+for+antibody-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein expression in cell microarrays: a tool for antibody-based proteomics.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 1413-14 (2006).</li>
<li>Stromberg, S., Bjorklund, M. G., Asplund, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+strategy+for+protein+profiling+in+cell+microarrays+using+automated+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A high-throughput strategy for protein profiling in cell microarrays using automated image analysis.</a> Proteomics. 7, 2142(2007).</li>
<li>Jogi, A., Brennan, D. J., Ryden, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+expression+of+the+RNA-binding+protein+RBM3+is+associated+with+an+improved+clinical+outcome+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mod.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Nuclear expression of the RNA-binding protein RBM3 is associated with an improved clinical outcome in breast cancer.</a> Mod. Pathol. 22, 1564(2009).</li>
<li>Magnusson, K., De Wit, M., Brennan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SATB2+in+combination+with+cytokeratin+20+identifies+over+95%25+of+all+colorectal+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">SATB2 in combination with cytokeratin 20 identifies over 95% of all colorectal carcinomas.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35, 937(2011).</li>
<li>Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays+%28TMAs%29+for+high-throughput+molecular+pathology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research.</a> Int. J. Cancer. 94, 1(2001).</li>
<li>Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarray%3A+a+new+technology+for+amplification+of+tissue+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+J%22%5BJournal%5D)">Tissue microarray: a new technology for amplification of tissue resources.</a> Cancer J. 7, 24(2001).</li>
<li>Catchpoole, D., Mackie, N., McIver, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape+transfer+sectioning+of+tissue+microarrays+introduces+nonspecific+immunohistochemical+staining+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Tape transfer sectioning of tissue microarrays introduces nonspecific immunohistochemical staining artifacts.</a> Biotech. Histochem. , (2010).</li>
<li>UniProt. Nucleic acids research. 39, D214(2011).</li>
<li>Uhlen, M., Oksvold, P., Fagerberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+knowledge-based+Human+Protein+Atlas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Towards a knowledge-based Human Protein Atlas.</a> Nature Biotechnol. 28, 1248(2010).</li>
<li>Leong, A. S., Leong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+in+immunohistology%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Standardization in immunohistology.</a> Method Mol. Cell Biol. 724, 37(2011).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Immunohistochemia jest zdecydowanie najczęstszym zastosowaniem macierzy tkankowych (TMA). Połączenie IHC i TMA może być wykorzystywane w różnych warunkach, np. podczas wysokoprzepustowego przesiewowego badania wzorców ekspresji białek w tkankach 7 8 i komórkach 9 10, w badaniach nad odkrywaniem biomarkerów opartych na próbkach tkanek z dużych kohort pacjentów 11 12 oraz w bardziej podstawowych badaniach biologii nowotworów, obejmujących różne fenotypy/genotypy, stadia różnicowania, progresję i przerzuty 13. Jedną z zalet stosowania TMA jest możliwość jednoczesnej analizy materiału z dużych kohort, co pozwala zarówno na oszczędność cennego materiału biologicznego, jak i zapewnienie większej powtarzalności eksperymentów. Ponadto zastosowanie technologii TMA pozwala zredukować koszty odczynników oraz czas przetwarzania laboratoryjnego. Ponieważ TMA zawiera ograniczoną ilość tkanki, problemem może być heterogenność tkankowa. W zależności od rodzaju tkanki i stawianych pytań badawczych, z jednego preparatu może być konieczne pobranie kilku próbek. W przypadku tkanek nowotworowych zaleca się pobranie od dwóch do czterech rdzeni z każdego preparatu, ponieważ wykazano, że zapewnia to wysoki stopień dokładności w reprezentowaniu całych przekrojów tkanki 13 14. W zależności od składu tkanki można dostosować średnicę wycinaków (w zakresie od 0,6 mm do 2 mm). Tkanki są złożone i składają się z wielu różnych typów komórek, struktur oraz macierzy zewnątrzkomórkowej. Skład każdego rodzaju tkanki, zawierający zmienną ilość tłuszczu, naczyń krwionośnych, tkanki łącznej, chrząstki itp., będzie wpływać na nacisk potrzebny do wycięcia i zebrania poszczególnych rdzeni. Dlatego ważne jest, aby przećwiczyć wszystkie kroki procedury na materiale nieposiadającym wartości badawczej przed przygotowaniem TMA z określonych tkanek do planowanych eksperymentów.
Podczas skrawania różnych rodzajów tkanek w obrębie jednego bloku TMA, skład bloku może wpływać na możliwość uzyskania przekrojów wysokiej jakości. Niektóre tkanki, np. skóra, szpik kostny, tkanka tłuszczowa, mózg i pierś, utrudniają skrawanie bloku TMA ze względu na różnice w teksturze, które wpływają na to, jak przekroje rozprostowują się w kąpieli wodnej oraz jak różna twardość jest cięta przez ostrze itp. Dlatego zaleca się, jeśli to możliwe, grupowanie tkanek o podobnych cechach, np. tkanek bogatych w lipidy, w jednym bloku TMA. Większość tkanek nowotworowych jest w tym sensie jednorodna, co ułatwia skrawanie TMA z nowotworami. W przypadku pracy z TMA zawierającym heterogeniczne typy tkanek można zastosować alternatywną metodę skrawania w celu stabilizacji rdzeni mikroarray. Użycie taśmy klejącej może pomóc w zapobieganiu utracie rdzeni i ich wypadaniu z przekrojonego TMA. Z taśmy klejącej należy korzystać ostrożnie, ponieważ może ona wpływać na grubość skrawanych rdzeni, a w konsekwencji również na wynik barwienia IHC 15. W konfiguracji Human Protein Atlas stosowany jest szablon TMA o rozmiarze 9x8 rdzeni (wyłączając markery). Istotne jest uzyskanie maksymalnej liczby przekrojów i zachowanie reprezentatywności wszystkich tkanek w całym bloku. Aby zaoszczędzić odczynniki i czas skanowania, dwa przekroje umieszcza się na jednym szkiełku przedmiotowym, co umożliwia zastosowanie maksymalnego szablonu 9x8.
Główny repozytorium informacji o białkach, Universal Protein Resource 16, zawiera około 20 300 zweryfikowanych wpisów dotyczących ludzkich białek, z czego tylko około 66% posiada dowody na poziomie białka. Ponadto dla większości genów, dla których istnieją dowody na obecność na poziomie białka, informacje o funkcji białka i rozkładzie jego ekspresji są szczupłe lub nie istnieją. Ważnym wyzwaniem na przyszłość jest analiza wzorca rozkładu i względnej liczebności tych nieznanych białek w różnych typach ludzkich tkanek. Informacje z baz danych takich jak Uniprot, ENSEMBL oraz opublikowane dane z PubMed mogą służyć jako wskazówka do ustalenia, czy wzorce barwienia immunohistochemicznego z użyciem przeciwciał skierowanych przeciwko nieznanym białkom reprezentują rzeczywiste profile białkowe docelowego białka. Ponadto konieczne jest zastosowanie kilku innych strategii walidacji w celu zapewnienia funkcjonalności przeciwciał, na przykład oceny funkcjonalności przeciwciał w macierzach białkowych, w metodzie Western blot, immunofluorescencji, immunoprecypitacji oraz w eksperymentach pull-down. Być może najważniejszym narzędziem walidacji funkcjonalności przeciwciał jest zastosowanie przeciwciał sparowanych, tj. dwóch różnych przeciwciał wytworzonych przeciwko oddzielnym, niepokrywającym się epitopom tego samego białka docelowego, aby porównać wyniki specyficzne dla danego testu 17.
Na podstawie zebranych informacji przeciwciała są testowane i mianowane zgodnie ze standardami IHC oraz doświadczeniem zdobytym podczas testowania i walidacji ponad 35 000 przeciwciał w projekcie Human Protein Atlas. W przypadku ponad 20% wszystkich genów z profilami białkowymi wykorzystano dane z par przeciwciał (2 lub więcej przeciwciał skierowanych przeciwko niepokrywającym się epitopom tego samego białka), aby określić najlepszą szacunkową wartość wzorca ekspresji odpowiedniego białka. Pary przeciwciał stanowią doskonałą strategię walidacji specyficznych wzorców ekspresji białek opartych na immunohistochemii. Strategia ta jest cenna, ponieważ duża liczba różnych tkanek ujętych w podstawowym przesiewie zwiększa ryzyko reaktywności krzyżowej. Należy również zauważyć, że niektóre tkanki są ogólnie bardziej podatne na barwienie tła, np. makrofagi, mięśnie gładkie, cewki dystalne w nerkach i hepatocyty w wątrobie. Dodatkowe kwestie do rozważenia obejmują różnice w technikach przetwarzania tkanek na przestrzeni czasu w przypadku materiałów archiwalnych, co może prowadzić do fałszywie ujemnych lub niewłaściwych dodatnich wzorców barwienia IHC. Zjawisko to występuje również w analizie dużych przekrojów. Zarówno kontrole negatywne, jak i pozytywne są kluczowe i powinny być stosowane wszędzie tam, gdzie jest to możliwe. W przypadku bardziej szczegółowych badań, w tym analiz funkcjonalnych, do stworzenia kontroli można wykorzystać linie komórkowe z wymuszoną ekspresją oraz specyficznym wyciszeniem odpowiednich transkrypcji (technologia siRNA). Aby uzyskać optymalne wyniki w IHC, ważne jest testowanie i stosowanie systemów odzyskiwania antygenu, ponieważ fiksacja formaliną indukuje różne modyfikacje chemiczne, np. sieciowanie, hydrolizę zasad Schiffa maskujących antygen 18.
Podsumowując, proteomika oparta na przeciwciałach z wykorzystaniem technologii TMA i IHC stanowi potężną strategię generowania danych o ekspresji białek na szeroką skalę. Projekt Human Protein Atlas został powołany w celu stworzenia mapy ekspresji białek ludzkich w prawidłowych tkankach oraz w nowotworach. Celem tego projektu jest przedstawienie pierwszej wersji kompleksowego atlasu białek ludzkich do 2015 roku. Oprócz dostarczenia profili białkowych w prawidłowych organach i tkankach, przedsięwzięcie to stanowi również punkt wyjścia dla projektów badawczych z zakresu biomedycyny, w tym dla wysiłków zmierzających do odkrycia klinicznych biomarkerów. Ostatecznym celem jest dodanie kolejnej warstwy informacji nad sekwencją ludzkiego genomu, co będzie miało kluczowe znaczenie dla głębszego zrozumienia biologii leżącej u podstaw różnych stanów chorobowych oraz dostarczy podstaw do opracowania nowych narzędzi diagnostycznych i terapeutycznych.

<table><tbody><tr><td>Bufor do płukania</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TA-999-TT</td><td></td></tr><tr><td>Bufor cytrynianowy pH6</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TA-250-Pm1X</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik do przeciwciał</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TA-125-UD</td><td></td></tr><tr><td>Polimer HRP UltraVision LP</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TL-125-HL</td><td></td></tr><tr><td>System substratu DAB plus</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TA-125-HDX</td><td></td></tr><tr><td>Ultra V Block</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TA-125-UB</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz przeciwciał pierwszorzędowych</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TL-125-PB</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina Mayera</td><td>Histolab</td><td>01820</td><td></td></tr><tr><td>PERTEX</td><td>Histolab</td><td>00871.0500</td><td></td></tr><tr><td>Ręczny przyrząd do tworzenia macierzy tkankowych</td><td>Estigen, Beecher Instrument</td><td>MTA-1</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom kaskadowy</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Microm HM 355S</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny skaner obrazów</td><td>Aperio Technologies</td><td>XT</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny system barwienia preparatów</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Autostainer 480S-2D</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny system barwienia preparatów do deparafinacji i odwadniania</td><td>Leica Microsystems</td><td>Autostainer XL</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczna zaklejarka szkiełek</td><td>Leica Microsystems</td><td>CV5030</td><td></td></tr><tr><td>Komora do zdemaskowania antygenów</td><td>Biocare Medical</td><td>DC2008INTEL</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja macierzy mikrotkankowych, barwienie immunohistochemiczne i digitalizacja w ramach projektu human protein atlas

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Technologia macierzy tkankowej (TMA) umożliwia wysokoprzepustową analizę wielu tkanek i komórek. Technika ta jest wykorzystywana w projekcie Human Protein Atlas do globalnej analizy wzorców ekspresji białek w prawidłowych tkankach ludzkich, nowotworach oraz liniach komórkowych. Przedstawiamy tutaj proces składania rdzeni o średnicy 1 mm, pobranych z mikroskopowo wybranych reprezentatywnych tkanek, w jeden odbiorczy blok TMA. Liczba i rozmiar rdzeni w bloku TMA mogą się różnić, od około czterdziestu rdzeni o średnicy 2 mm do setek rdzeni o średnicy 0,6 mm. Przewagą zastosowania technologii TMA jest możliwość szybkiego uzyskania dużej ilości danych przy użyciu jednego protokołu immunostainingu, co pozwala uniknąć zmienności eksperymentalnej. Co istotne, wymagana jest jedynie niewielka ilość rzadkich tkanek, co umożliwia analizę dużych kohort pacjentów 1 2. Z bloku TMA można wyciąć około 250 kolejnych przekrojów (o grubości 4 μm), które można wykorzystać do barwienia immunohistochemicznego w celu określenia specyficznych wzorców ekspresji białek dla 250 różnych przeciwciał. W projekcie Human Protein Atlas generowane są przeciwciała przeciwko wszystkim ludzkim białkom, które służą do pozyskania odpowiednich profili białkowych zarówno w prawidłowych tkankach ludzkich od 144 osób, jak i w tkankach nowotworowych od 216 różnych pacjentów, reprezentujących 20 najczęstszych postaci nowotworów u ludzi. Immunohistochemicznie barwione przekroje TMA na szkiełkach przedmiotowych są skanowane w celu stworzenia obrazów o wysokiej rozdzielczości, na podstawie których patolodzy mogą interpretować i opisywać wyniki immunohistochemii. Obrazy wraz z odpowiadającymi im danymi adnotacji patologicznych są udostępniane publicznie społeczności badawczej poprzez portal Human Protein Atlas (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Rycina 1) 3 4. Human Protein Atlas dostarcza mapę pokazującą rozmieszczenie i względną obfitość białek w ludzkim organizmie. Obecna wersja zawiera ponad 11 milionów obrazów z danymi o ekspresji białek dla 12 238 unikalnych białek, co odpowiada ponad 61% wszystkich białek kodowanych przez ludzki genom.

Mikromacierze tkankowe stanowią efektywną metodę jednoczesnego pozyskiwania informacji z wielu tkanek. Reprezentatywne fragmenty tkanek są łączone w jednym bloku parafiny. Przekroje z bloku wykorzystuje się do immunohistochemii oraz analizy wzorców ekspresji białek. Skanowanie cyfrowe pozwala na wygenerowanie odpowiadających im obrazów w celu dystrybucji danych.

Produkcja macierzy mikrotkankowych, barwienie immunohistochemiczne i digitalizacja w ramach projektu Human Protein Atlas

Technologia mikromacierzy tkankowych (TMA) umożliwia wysokoprzepustową analizę wielu tkanek i komórek. Technika ta jest wykorzystywana w ramach...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie wydajnej metody pozyskiwania jednoczesnych informacji o ekspresji białek z wielu tkanek w ramach projektu o wysokiej przepustowości, takiego jak Human Protein Atlas. Cel ten osiąga się poprzez wybór reprezentatywnych obszarów tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie. Następnie z zaznaczonych obszarów wycinane są rdzenie, które są następnie łączone w jednym bloku parafiny, tworząc macierz tkankową (TMA).Następnie z TMA wycina się sekcje i przeprowadza immunohistochemię. Na koniec analizowany jest wzorzec ekspresji białek, a dane są publikowane w Human Protein Atlas. W rezultacie można uzyskać wyniki obrazujące ekspresję białek w tkankach i komórkach za pomocą mikrotablic tkankowych oraz immunohistochemii.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykonywanie immunohistochemii z pojedynczych bloków tkanki miąższowej, jest możliwość oszczędzenia cennego materiału biologicznego oraz większa powtarzalność eksperymentów. Inną zaletą tej techniki jest możliwość obniżenia kosztów ENT, a także skrócenie czasu obróbki laboratoryjnej. Procedurę tę, mającą na celu uzyskanie zunifikowanej długości rdzeni tkankowych, zaprezentuje Ian call Bay, technik laboratoryjny z mojego laboratorium.Zaznacz stilet. Zaleca się pozostawienie marginesów od 2,5 do 3,0 milimetra po każdej stronie bloku parafinowego, aby uniknąć pęknięcia parafiny podczas montażu odpowiednich wycinaków. Poluź śruby z imbusową głowicą utrzymujące wycinak na miejscu i ustaw go tak, aby rowek w piastie wycinaka ściśle przylegał do metalowego pręta w plastikowym bloku V.Dokręć śruby, upewniając się, że krawędź metalowego klipsa jest pozioma. Wsuń wybijak biorcy po lewej stronie oraz wybijak dawcy po prawej stronie. Użyj pokręteł regulacji XY oraz ich cyfrowych odczytów mikrometrycznych, aby przesuwać wybijaki wzdłuż osi X i Y.Aby zresetować urządzenie, naciśnij przycisk zero a BS, aby przełączać się między calami a milimetrami, naciskając przycisk inch millimeter. Przy użyciu przebijaka o średnicy 1 mm dla szablonu 9x8, odstęp między otworami powinien wynosić 2 mm, mierzony pomiędzy środkami otworów, aby zapobiec zbyt głębokiemu wciśnięciu przebijaka odbiorczego i jego uszkodzeniu. Ustaw maksymalną głębokość wciskania przebijaka, umieszczając pustą kasetę w uchwycie i korzystając ze śruby ograniczającej głębokość w lewym górnym rogu prowadnicy Z; ustaw pozycję dolną przebijaka odbiorczego na 1 mm powyżej dna kasety. Po wybraniu i oznaczeniu odpowiedniego obszaru na przekroju tkankowym oraz zaprojektowaniu szablonu do produkcji macierzy tkankowej (TMA), umieść blok odbiorczy w uchwycie i za pomocą najmniejszego śrubokręta dokręć śruby.Należy unikać zbyt mocnego dokręcania śrub, aby zapobiec poluzowaniu się parafiny w kasecie. Przesunąć wybijak biorcy w dół na około pięć milimetrów w głąb bloku biorcy, a następnie za pomocą uchwytu wybijaka obracać go w przód i w tył. Następnie powoli zmniejszyć nacisk w dół, aby sprężyny mogły przesunąć wybijak do góry.Użyj stylu, aby opróżnić stemplownik i usunąć rdzeń parafinowy. Następnie przemieść obrotowy uchwyt, aby przełączyć na stemplownik dawcy. Następnie umieść mostek bloku dawcy z blokiem dawcy nad uchwytem bloku biorcy.Użyj odpowiedniego preparatu barwionego hematoksyliną i eozyną, na którym zaznaczono obszar zainteresowania, aby zlokalizować tkankę przeznaczoną do pobrania. Przytrzymaj ręcznie blok dawcy w pozycji lewą ręką i wciśnij stempel prawą ręką. Nie naciskaj na prowadnik. Ogranicznik głębokości nie blokuje ruchu stempla w odpowiedniej pozycji dla bloku dawcy, dlatego ważne jest przerwanie naciskania w momencie, gdy na prowadniku pojawi się druga oznaka.Powoli obróć raz rączkę wybijaka. Zwolnij nacisk w dół, wciąż trzymając blok donora na mostku dla bloku donora. Wyjmij mostek oraz blok donora.Należy upewnić się, że wycinak donora jest wyrównany z otworem wykonanym wcześniej. Pozycję wycinaka należy dostosować za pomocą śrub ustalających. Jeśli wycinak donora i otwór w bloku biorcy nie są wyrównane, należy ostrożnie pchnąć wycinak w dół, aż jego końcówka dotknie górnej krawędzi otworu w bloku biorcy.Utrzymując tę pozycję, należy za pomocą zgłębika opróżnić rdzeń tkanki do otworu. Powierzchnia rdzenia powinna znajdować się na jednym poziomie z powierzchnią bloku. Przesunąć obrotnicę z powrotem do wycinaka odbiorczego.Przesuń do następnej pozycji za pomocą pokręteł regulacji XY i powtórz proces pobierania próbki z bloku odbiorczego, aż do czasu utworzenia pełnej macierzy. Aby wyjąć blok odbiorczy, poluzuj śruby w uchwycie. Połóż blok stroną do dołu na szkiełku przedmiotowym umieszczonym na odpowiedniej statywie i poddaj blok działaniu temperatury 42 °C przez 40 minut.Wyjmij preparat i bloczek z pieca, a następnie wyrównaj powierzchnię bloczka, delikatnie przesuwając szkiełko przedmiotowe. Umieść bloczek wraz ze szkiełkiem na płytce chłodzącej na 10 minut. Zdejmij szkiełko przedmiotowe z bloczka.Blok jest teraz gotowy do cięcia. Po wykonaniu serii cięć, przeprowadź barwienie oraz digitalizację macierzy tkankowej (TMA) z użyciem przeciwciała przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania. Wyszukaj to białko w bazie Human Protein Atlas, odwiedzając stronę internetową www.proteinatlas.org.Wprowadź nazwę białka, identyfikator zespołu (ensemble id), numer dostępu UniProt lub nazwę HGNC, na przykład insulinę. Kliknij wybrane białko i przewiń w dół do sekcji podsumowania tkanek i organów prawidłowych. Przegląd przedstawia ekspresję białka w trzustce.Kliknij kartę. Więcej danych o tkankach. Pojawi się widok tkanek prawidłowych uporządkowany według organów.Kliknij trzustkę, aby wyświetlić wyniki IHC dla trzech przeciwciał skierowanych przeciwko temu samemu białku. Kliknij obraz, aby wyświetlić obraz trzustki w wysokiej rozdzielczości. Na tej ilustracji przedstawiono przykłady jakości macierzy tkankowych: prostą i prawidłowo wyrównaną macierz z wystarczającą przestrzenią między rzędami i kolumnami a krawędzią parafiny. Tutaj niektóre rdzenie znajdują się zbyt blisko krawędzi, co prawdopodobnie spowoduje problemy podczas krojenia sekcji.Ta matryca tkanek (TMA) była suszona zbyt długo i uległa zapadnięciu z powodu braku odpowiedniego szablonu. Tutaj prawidłowo wycięty przekrój z prostymi i wyrównanymi kolumnami został zabarwiony hematoksyliną i eozyną. Zużyte lub zanieczyszczone ostrze może spowodować rozwarstwienie, jak pokazano tutaj, lub powstanie sprasowanych przekrojów, takich jak ten.Komórki ośrodków zarodkowych w węzłach chłonnych wykazują optymalnie mianowane przeciwciało, co skutkuje specyficznym barwieniem cytoplazmatycznym bez tła, jak widoczne tutaj. Barwienie negatywne lub słabe występuje, gdy stężenie przeciwciała pierwszorzędowego jest zbyt niskie lub gdy białko docelowe nie występuje w tkankach poddanych immunobarwieniu. Ten przekrój tkanki jest przebarwiony z powodu zbyt wysokiego stężenia przeciwciała pierwszorzędowego.Ciemny kolor powoduje trudności w określaniu lokalizacji subkomórkowej ze względu na prześwit sygnału (spillover), reaktywność krzyżową i fałszywie dodatnie wyniki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przygotować macierz markerów tkankowych oraz jak wykorzystać ją podczas analizy ekspresji białek z wykorzystaniem immunohistochemii. Powinni Państwo również wiedzieć, jak korzystać z Human Protein Atlas w celu analizy ekspresji białek w ludzkich tkankach i komórkach.

production-tissue-microarrays-immunohistochemistry-staining

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Produkcja mikroarrayów tkankowych, barwienie immunochemiczne i digitalizacja w Atlasie Białek Człowieka

Protokół ma na celu optymalizację konstrukcji i jakości mikromacierzy tkankowych do badań nad biomarkerami. Obejmuje aspekty planowania i projektowania, patologii cyfrowej, wirtualnych adnotacji do slajdów i automatycznego układania tkanek.

Protokół mikromacierzy tkankowej nowej generacji (ngTMA) do badań biomarkerów

Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Szczegółowy protokół dla sześciomarkerowego multipleksowego panelu immunofluorescencyjnego jest zoptymalizowany i wykonany, przy użyciu automatycznego barwnika dla bardziej spójnych wyników i krótszego czasu zabiegu. Podejście to może być bezpośrednio zaadaptowane przez dowolne laboratorium do badań immunoonkologicznych.

Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną

Białko oddziałujące ZW10 (ZWINT) uczestniczy w punkcie kontrolnym wrzeciona mitotycznego i patogenezie raka. W tym miejscu przedstawiamy metodologię barwienia immunologicznego ZWINT w tkankach ludzkiego raka płuca, a następnie cyfrowe skanowanie całych preparatów i analizę obrazu. Ta metodologia może zapewnić wysokiej jakości obrazy cyfrowe i wiarygodne wyniki.

Cyfrowa analiza barwienia immunologicznego białka oddziałującego ZW10 w tkankach płuc człowieka

Tutaj opisujemy prostą i przystępną strategię wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w utrwalonych w formalinie odcinkach tkanki nowotworowej zatopionej w parafinie. Metodologia ta łączy istniejące techniki obrazowania i analizy cyfrowej w celu rozszerzenia możliwości multipleksowania i analizy wieloparametrowej testów obrazowania.

Wizualizacja, kwantyfikacja i mapowanie populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Tutaj opisujemy protokół dostrajania regionów zainteresowania (ROI) dla technologii Przestrzennej Omiki, aby lepiej scharakteryzować mikrośrodowisko guza i zidentyfikować określone populacje komórek. W przypadku testów proteomicznych zautomatyzowane, dostosowane protokoły mogą kierować wyborem ROI, podczas gdy testy transkryptomiczne można precyzyjnie dostroić przy użyciu ROI tak małych jak 50 μm.

Profilowanie przestrzenne ekspresji białek i RNA w tkance: podejście do precyzyjnego dostrajania wirtualnej mikrodysekcji

Ten protokół opisuje metodę taśmy, jak ręcznie konstruować mikromacierz tkankową przy użyciu bloków donorowych FFPE o różnych głębokościach.

Ręczna budowa mikromacierzy tkankowej metodą taśmową i ręcznym mikromacierzem

W erze immunoterapii nowotworów, zainteresowanie wyjaśnieniem dynamiki mikrośrodowiska guza znacznie wzrosło. Protokół ten szczegółowo opisuje technikę obrazowania spektrometrii mas w odniesieniu do etapów barwienia i obrazowania, które pozwalają na wysoce zmultipleksowaną analizę przestrzenną.

Poszerzanie wiedzy na temat mikrośrodowiska guza za pomocą obrazowania spektrometrią mas próbek tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie

W tym artykule opisany jest protokół ręcznego wzmacniania sygnału tyramidowego (TSA) multipleksowego immunofluorescencji (mIF) połączonego z analizą obrazu i analizą przestrzenną. Protokół ten może być stosowany z sekcjami zatopionymi w parafinie (FFPE) utrwalonymi w formalinie do barwienia od dwóch do sześciu antygenów na szkiełko, w zależności od skanera do szkiełek dostępnego w laboratorium.

Multipleksowa immunofluorescencja połączona z przestrzenną analizą obrazu w celu klinicznej i biologicznej oceny mikrośrodowiska guza

Multipleksowa immunofluorescencja umożliwia sekwencyjne oznaczyć wiele markerów przeciwciał w obrębie pojedynczej sekcji tkanki, aby wspierać przestrzenną analizę architektury tkanki i populacji komórek. Tutaj przedstawiono przepływ pracy dla wielokrotnego wykrywania markerów związanych z starzeniem się, strukturalnych i immunologicznych, łącznie z manualną i zautomatyzowaną przygotowaniem szkieł i iteracyjnym obrazowaniem oraz analizą pojedynczych komórek za pomocą oprogramowania do cyfrowej...

Wielobarwne badanie immunofluorescencyjne do przestrzennej oceny markerów starzenia in vivo

Poznaj produkcję mikromacierzy tkankowych i barwienie immunohistochemiczne do analizy ekspresji białek w ludzkich tkankach. Ta metoda umożliwia wysokoprzepustowe badania zachowując cenny materiał biologiczny.

Produkcja macierzy mikrotkankowych, barwienie immunohistochemiczne i digitalizacja w ramach projektu Human Protein Atlas

Przeglądaj więcej filmów