Produkcja mikromacierzy tkankowych, barwienie immunohistochemiczne i digitalizacja w atlasie białek ludzkich
31 maja 2012
Mikromacierze tkankowe pozwalają na efektywne uzyskiwanie jednoczesnych informacji z wielu tkanek. Reprezentatywne części tkanek są łączone w jeden blok parafinowy. Wycinki z bloku służą do immunohistochemii i analizy wzorców ekspresji białek. Skanowanie cyfrowe generuje odpowiednie obrazy do dystrybucji danych.
Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie wydajnej metody uzyskiwania jednoczesnych informacji z wielu tkanek w celu ekspresji białek w projekcie o wysokiej przepustowości, takim jak atlas białek ludzkich. Osiąga się to poprzez wybór najpierw reprezentatywnych obszarów formalnych i utrwalonych tkanek zatopionych w parafinie. Następnie zaznaczone obszary są dziurkowane, a wybrane rdzenie są łączone w pojedynczy blok parafinowy, mikromacierz tkankową.
Następnie wycina się skrawki z TMA i wykonuje się immunohistochemię. Na koniec analizowany jest wzorzec ekspresji białek, a dane są publikowane w atlasie białek ludzkich. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują ekspresję białek w tkankach i komórkach za pomocą mikromacierzy tkankowych i immunohistochemii.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przeprowadzanie immunohistochemii z pojedynczych bloków tkankowych, jest to, że można zaoszczędzić cenny materiał biologiczny, a eksperymenty są bardziej powtarzalne. Kolejną zaletą tej techniki jest to, że można obniżyć koszty laryngologów, a także czas przetwarzania laboratoryjnego. Tę procedurę zademonstruje Ian call Bay, technik laboratoryjny z mojego laboratorium w celu uzyskania znormalizowanej długości rdzeni tkankowych.
Zaznacz stylik. Zaleca się pozostawienie marginesów od 2,5 do 3,0 milimetrów z każdej strony bloku parafiny, aby uniknąć pękania parafiny w celu zamontowania odpowiednich stempli. Poluzuj z sześciokątnym, które utrzymują stempel na miejscu i ustaw stempel tak, aby rowek w piaście stempla był mocno przylegający do metalowego pręta w plastikowym bloku V.
Dokręć, upewniając się, że krawędź metalowego klipsa jest pozioma. Włóż dziurkacz dawcy po lewej stronie, a dziurkacz dawcy po prawej. Użyj pokręteł regulacyjnych XY i ich cyfrowych odczytów mikrometrycznych, aby przesunąć stemple wzdłuż osi X i Y.
Aby zresetować urządzenie, naciśnij przycisk zero a BS, aby przełączać się między calami i milimetrami, naciśnij przycisk milimetra calowego. W przypadku używania jednomilimetrowego stempla do szablonu dziewięć na osiem, przestrzeń między otworami powinna wynosić dwa milimetry mierzone między środkami otworów, aby zapobiec zbyt głębokiemu wepchnięciu stempla odbiorcy w dół i uszkodzeniu stempla, ustaw maksymalną głębokość pchania stempla, umieszczając pustą kasetę w uchwycie i używając ogranicznika głębokości w lewym górnym rogu prowadnicy Z, Ustaw dolną pozycję stempla odbiorcy na jeden milimetr powyżej dolnej krawędzi kasety. Po wybraniu i zaznaczeniu odpowiedniego obszaru na wycinku tkanki oraz zaprojektowaniu szablonu do produkcji mikromacierzy tkankowej, umieść blok biorczy w uchwycie i użyj najmniejszego śrubokręta do dokręcenia.
Unikaj zbyt mocnego dokręcania, aby zapobiec oderwaniu się parafiny od kasety. Wepchnij stempel odbiorcy w dół o około pięć milimetrów w blok odbiorcy i użyj uchwytu na stempla, aby obrócić stempel do przodu iz powrotem. Raz powoli zmniejsz nacisk pchający w dół, aby sprężyny mogły przesunąć stempel w górę.
Użyj stylu, aby opróżnić stempel i wyrzucić rdzeń parafinowy. Następnie przesuń wieżyczkę, aby przełączyć się na stempel dawcy. Następnie umieść mostek bloku dawcy z blokiem dawcy nad uchwytem bloku biorcy.
Użyj odpowiedniego szkiełka do barwienia hematyną i eozyną, w którym zaznaczono obszar zainteresowania, aby zlokalizować tkankę, która ma zostać pobrana: Ręcznie przytrzymaj blok dawcy na miejscu lewą ręką i popchnij stempel prawą ręką. Nie naciskać na sztyft. Ogranicznik głębokości nie blokuje ruchu stempla w odpowiedniej pozycji dla bloku dawczego, dlatego ważne jest, aby przestać pchać, gdy drugi znak jest widoczny na sztyfcie.
Obróć powoli uchwyt stempla raz powoli. Zwolnij nacisk w dół, nadal trzymając blok dawcy na mostku bloku dawcy. Usuń mostek i blok dawczy.
Upewnij się, że stempel dawcy jest wyrównany z otworem, który został wykonany wcześniej. Wyreguluj pozycję stempla za pomocą ustalających. Jeśli dziurkacz dawcy i otwór w bloku biorcy nie są wyrównane, ostrożnie popchnij stempel w dół, aż jego końcówka dotrze do górnej części otworu w bloku biorcy.
Utrzymując tę pozycję, użyj trzpienia, aby opróżnić rdzeń tkanki do otworu. Powierzchnia rdzenia powinna być wyrównana z powierzchnią bloku. Przesuń wieżyczkę z powrotem do stempla odbiorcy.
Przejdź do następnej pozycji za pomocą pokręteł regulacyjnych XY i powtórz proces ponownie, wykrawając próbkę z bloku odbiorcy, aż matryca będzie kompletna. Aby wyjąć blok odbiorcy, poluzuj w uchwycie. Połóż blok stroną zadrukowaną do dołu na szkiełku podstawowym, umieść na odpowiednim ruszcie i piecz blok w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 40 minut.
Wyjmij szkiełko i blok z piekarnika i spłaszcz powierzchnię bloku, delikatnie głaszcząc szklane szkiełko. Umieść blok ze szkiełkiem na płycie chłodzącej na 10 minut. Zdejmij szklane szkiełko z bloku.
Blok jest teraz gotowy i gotowy do cięcia. Po przecięciu, barwieniu i digitalizacji mikromacierzy tkankowej za pomocą przeciwciała przeciwko białemu będącemu przedmiotem zainteresowania. Wyszukaj białko w atlasie białek ludzkich, przechodząc do strony internetowej www.proteinatlas.org.
Wprowadź nazwę białka będącego przedmiotem zainteresowania identyfikator zespołu, numer dostępu do uni prote lub nazwę HGNC, na przykład insulina. Kliknij interesujące Cię białko i przewiń w dół do podsumowania normalnych tkanek i narządów. Przegląd pokazuje ekspresję białek w trzustce.
Kliknij na zakładkę. Więcej danych tkankowych. Pojawi się widok normalnych tkanek posortowanych według narządów.
Kliknij na trzustkę, aby wyświetlić wyniki IHC dla trzech przeciwciał skierowanych przeciwko temu samemu białku. Kliknij na obraz, aby wyświetlić obraz trzustki w wysokiej rozdzielczości Na tym rysunku pokazano przykłady jakości mikromacierzy tkankowych, prosty i prawidłowo wyrównany układ z wystarczającą przestrzenią między rzędami i kolumnami a krawędzią parafiny. W tym przypadku niektóre rdzenie znajdują się zbyt blisko krawędzi, co prawdopodobnie powoduje problemy podczas sekcji.
Ta mikromatryca tkankowa była pieczona zbyt długo i zapadła się bez odpowiedniego szablonu. Tutaj prawidłowo przycięty odcinek z prostymi i wyrównanymi kolumnami jest poplamiony hematem, toinem i eozyną. Złe lub brudne ostrze może spowodować pękanie, jak pokazano tutaj, lub ściśnięte sekcje, takie jak ta.
Komórki centrum rozrodczego w węzłach chłonnych wykazują optymalnie dobrane przeciwciało, co skutkuje specyficznym barwieniem cytoplazmatycznym bez tła, jak pokazano tutaj. Barwienie ujemne lub słabe występuje wtedy, gdy stężenie przeciwciała pierwszorzędowego jest zbyt niskie lub jeśli białko docelowe nie jest obecne w tkankach barwionych immunologicznie. Ten wycinek tkanki jest nadmiernie wybarwiony zbyt wysokim stężeniem przeciwciała pierwotnego.
Ciemny kolor powoduje trudności w określeniu lokalizacji subkomórkowej z powodu rozlewania się, reaktywności krzyżowej i fałszywie dodatniej pozytywności. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytworzyć tablicę markerów tkankowych i jak jej używać podczas analizy ekspresji białek wykonujących immunohistochemię. Powinieneś również dobrze wiedzieć, jak przeglądać atlas białek ludzkich pod kątem ekspresji białek w ludzkich tkankach i komórkach.
Przegląd
Mikromacierze tkankowe stanowią wydajną metodę jednoczesnego gromadzenia informacji z wielu tkanek w celu analizy ekspresji białek. Technika ta polega na zgromadzeniu reprezentatywnych próbek tkanek w jednym bloku parafiny, który następnie jest cięty w celu przeprowadzenia immunohistochemii i obrazowania cyfrowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia
- Histologia
Wstęp
- Mikromacierze tkankowe umożliwiają wysokoprzepustową analizę ekspresji białek.
- Metoda ta pozwala na oszczędność materiału biologicznego w porównaniu z tradycyjnymi metodami opartymi na pojedynczych blokach tkankowych.
- Zwiększa ona powtarzalność oraz redukuje koszty i czas przetwarzania.
- Wygenerowane dane mogą zostać zintegrowane z zasobami takimi jak Human Protein Atlas.
Cel badania
- W celu zademonstrowania procedury tworzenia mikromacierzy tkankowych.
- W celu analizy wzorców ekspresji białek w różnych tkankach.
- W celu przedstawienia zestandaryzowanej metody wysokoprzepustowej analizy tkanek.
Zastosowane metody
- Wybór i zaznaczenie reprezentatywnych obszarów w tkankach zatopionych w parafinie.
- Wykrawanie rdzeni tkankowych i składanie ich w blok mikroarray tkankowej.
- Przeprowadzenie immunohistochemii na skrawkach z mikroarray.
- Analiza wzorców ekspresji białek i publikacja wyników.
Główne wyniki
- Skuteczny montaż matryc tkankowych (TMA) do analizy białek.
- Wykazanie powtarzalności i wydajności w badaniach ekspresji białek.
- Integracja wyników z bazą Human Protein Atlas.
- Wizualna reprezentacja wzorców ekspresji białek za pomocą obrazowania cyfrowego.
Wnioski
- Mikromacierze tkankowe są cennym narzędziem do wysokoprzepustowej analizy ekspresji białek.
- Metoda ta zwiększa wydajność i pozwala na oszczędność próbek biologicznych.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia rozmieszczenia białek w tkankach.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Technologia mikromacierzy tkankowych umożliwia wysokoprzepustową analizę ekspresji białek przy jednoczesnym oszczędzaniu rzadkiego materiału biologicznego, co wspiera szeroko zakrojone wysiłki w zakresie walidacji celów terapeutycznych w procesie odkrywania leków. Poprzez integrację danych z publicznymi zasobami, takimi jak Human Protein Atlas, dostarcza ona skalowalnych podstaw do ograniczania ryzyka mechanistycznego oraz identyfikacji biomarkerów translacyjnych w różnych obszarach chorobowych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania poprzez generowanie powtarzalnych, ilościowych profili ekspresji białek z ograniczonej liczby próbek pacjentów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w tkankach zdrowych i chorobowych w celu wyjaśnienia wzorców ekspresji celu.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza zużycie próbek biologicznych, zwiększając jednocześnie przepustowość kampanii przesiewowych przeciwciał lub celów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję portfolio poprzez dostarczanie wczesnych dowodów na specyficzność celu oraz jego rozkład tkankowy.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie standaryzowanych, ilościowych wyników immunohistochemii w celu oceny specyficzności odczynników w setkach rdzeni tkankowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia zapewnienie powtarzalnych warunków analizy przy użyciu jednego protokołu barwienia, co minimalizuje zmienność eksperymentalną w przesiewach na dużą skalę.
- Wartość platformy: Umożliwia tworzenie wielokrotnego użytku bloków mikroarray do podłużnego profilowania paneli białkowych w kohortach chorobowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Jest zgodna z systemami istotnymi dla przebiegu choroby poprzez profilowanie ekspresji białek w tkankach nowotworowych pochodzących z dobrze opisanych kohort pacjentów.
- Wartość operacyjna: Ułatwia walidację biomarkerów dzięki spójnemu cięciu i obrazowaniu cyfrowemu preparatów TMA.
- Wartość translacyjna: Wspiera postęp w badaniach z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez powiązanie ekspresji celu z danymi patologii klinicznej w publicznych bazach danych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Produkcja matryc tkankowych (Tissue microarray) wpisuje się w kontinuum odkryć, od identyfikacji celu po walidację przedkliniczną, umożliwiając wydajne profilowanie ekspresji białek na szeroką skalę.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez umożliwienie jednoczesnej analizy ekspresji białek w wielu typach tkanek i stanach chorobowych.
- Screening: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne skrawki tkanek, odpowiednie do wysokoprzepustowych kampanii screeningu immunohistochemicznego.
- Analityka: Generuje mierzalne dane dotyczące ekspresji białek za pomocą cyfrowej analizy obrazu, co umożliwia porównawczą ocenę warunków.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z ciągłością przedkliniczną za pomocą map ekspresji białek powiązanych z adnotowanymi próbkami pacjentów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy zstandaryzowaną, skalowalną platformę do wielokrotnego użytku w wielu projektach walidacji przeciwciał i charakterystyki celów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki multipleksowej analizie tkanek.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację między laboratoriami poprzez minimalizację zmienności między preparatami.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez maksymalizację uzysku danych z ograniczonych próbek klinicznych lub przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów w oparciu o ryzyko na podstawie kompleksowego profilowania ekspresji w tkankach zdrowych i chorobowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu histologii, obchodzenia się z tkankami oraz technik składania macierzy tkankowych (tissue microarray).
- Jest uzależnione od precyzyjnej aparatury do wycinania rdzeni, ich wyrównywania i sekcjonowania.
- Wymaga ustandaryzowanych protokołów barwienia, obrazowania i adnotacji danych w celu zapewnienia porównywalności między badaniami.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metod przy zastosowaniu w różnych systemach modelowych lub tkankach niepochodzących od ludzi.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne związane z wyrównaniem rdzeni, integralnością przekrojów i optymalizacją barwienia, zgodnie z opisami w demonstracjach proceduralnych.
