Metody badania morfogenezy neuronalnej: Elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy
18 maja 2012
W celu przeprowadzenia szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgu opisujemy metody obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów koekspresujących inhibicyjne RNA (RNAi) i GFP w zarodkowej korze mysiej. Protokół ten nadaje się do badania różnych aspektów neurorozwoju, takich jak neurogeneza, migracja neuronów oraz morfogeneza neuronów, w tym wzrost dendrytów i aksonów.
Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przeprowadzenie szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgowej z wykorzystaniem skib organotypowych. Osiąga się to poprzez wprowadzenie do kory mózgowej myszy plazmidów wykazujących koekspresję hamującego RNA oraz markera GFP. Do mózgu przykłada się krótkie impulsy elektryczne, co umożliwia transfekcję komórek progenitorowych neuronów za pomocą plazmidowego DNA.
Następnie mózgi są preparowane, zatapiane i cięte w celu uzyskania plastrów organotypowych, w których może zachodzić morfogeneza neuronalna ex vivo. W plastrach organotypowych można poszukiwać subpopulacji neuronów korowych z defektami migracyjnymi lub morfologicznymi poprzez bezpośrednią obserwację komórek znakowanych białkiem GFP. Dzień dobry, witajcie w moim laboratorium na Uniwersytecie Brown w departamencie biologii molekularnej; dzisiaj dr Liza oraz dwoje studentów, Kat Zer i Mark Seba, zaprezentują technikę elektroporacji ex vivo oraz hodowlę plastrów organotypowych, która jest bardzo użyteczną metodą w badaniach nad rozwojem neurologicznym.
Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w różnych aspektach neurorozwoju, w tym w procesach neurogenezy, migracji neuronalnej oraz morfogenezy neuronalnej. Ponieważ analiza ta jest przeprowadzana w warunkach zbliżonych do środowiska IBU, stanowi ona niskokosztową i szybką alternatywę dla tworzenia zwierząt transgenicznych lub nokautowych w przypadku genów o nieznanej funkcji. Wreszcie, w porównaniu z technologią elektroporacji in vivo, sukces tych eksperymentów z elektroporacją nie zależy od biegłości w przeprowadzaniu zabiegów chirurgicznych czy długotrwałego doskonalenia umiejętności, a może być wykonany przy krótszym czasie szkolenia i mniejszych wymaganiach technicznych.
Po uśmierceniu ciężarnej myszy samicy, wypreparuj zarodki do lodowatego, pełnego roztworu HBSS, utrzymując je w ich indywidualnych pęcherzykach pępowinowych. Następnie, w zimnym roztworze HBSS, uwolnij zarodek z pęcherzyka i odetnij głowę za pierwszym kręgiem w celu wykonania iniekcji; umieść głowę na kawałku papieru paraformowego na dnie szalki Petriego, używając specjalnie wykonanej strzykawki Hamiltona. Wstrzyknij od 6 do 8 µL mieszaniny DNA fast green przez trzecią komorę mózgu.
Stamtąd mieszanina wypełni oba komory boczne w pęcherzykach korowych. Do elektroporacji wykorzystuje się platynowe elektrody pęsetowe BTX. Umieść elektrodę dodatnią po stronie kory, która ma zostać poddana elektroporacji.
Na przykład w przypadku kory grzbietowej elektroda powinna znajdować się na górnej części głowy. Aby uzyskać wysoką wydajność transfekcji, zawsze należy dostosować stężenie DNA do 1 µg/µL i używać DNA wyizolowanego za pomocą preparatyki Maxi. Jeśli jest to konieczne, należy użyć zestawu do usuwania endotoksyn w celu oczyszczenia DNA po elektroporacji.
Przed przeprowadzeniem sekcji inkubuj głowę na lodzie przez co najmniej pięć minut. Podczas elektroporacji niezwykle ważne jest zastosowanie odpowiedniej liczby impulsów elektrycznych i natężenia prądu, aby uniknąć uszkodzenia młodych mózgów embrionalnych. Po elektroporacji tkanka staje się bardzo krucha.
Ważne jest, aby przeprowadzić sekcję bardzo ostrożnie, ponieważ skóra i czaszka mogą naciągać oponę mózgową pęcherzyków korowych, co może doprowadzić do ich uszkodzenia podczas usuwania z czaszki. Po pięciu minutach wypreparuj mózg w zimnym HBSS, zaczynając od wykonania małego nacięcia z boku głowy i odsunięcia skóry z boków głowy.
Następnie, za pomocą precyzyjnej pęsety, delikatnie oddziel oponę miękką od mózgu. Wyjmij nienaruszony mózg z czaszki. Po zakończeniu czynności przechowuj mózg w lodowatym roztworze HBSS i przygotuj się do zatopienia tkanki.
Zacznij wypełniać formy 3% niskotopliwą agarozą. Umieść formy na lodzie, aby agaroza zestaliła się przy dnie formy, upewniając się najpierw, że mózgi pozostają podparte i wycentrowane.
Teraz za pomocą precyzyjnej pęsety ostrożnie wyjmij mózg z HBSS, odsącz nadmiar buforu za pomocą chusteczki Kimwipe lub papieru filtracyjnego i umieść mózg w niskotopiącym agarozie. Następnie za pomocą końcówki pipety delikatnie obróć mózg wewnątrz formy, aby zmaksymalizować kontakt agarozy z tkanką. Po przeniesieniu wszystkich mózgów, ustaw każdy z nich w zbliżonej orientacji i na podobnej głębokości w obrębie swojej formy.
Agaros utwardzi się w ciągu około pięciu minut, dlatego należy pracować szybko. Pozostaw agarosy do całkowitego utwardzenia, inkubując je przez dodatkowe pięć minut na lodzie.
Przed zamocowaniem bloków przytnij nadmiar agarozy. Następnie połącz bloki agarozy ze sobą, używając szybko wiążącego kleju do tworzyw sztucznych; każdy mózg w stosie powinien być ułożony cebulkami węchowymi do góry. Po połączeniu bloków przytnij agarozę, aby upewnić się, że każdy mózg zostanie przekrojony przez wibrotom.
Następnie natychmiast zanurz je w lodowatym roztworze HBSS. Aby wykonać skrawki z bloków, ustaw prędkość wibratomu na niską, około połowę prędkości maksymalnej, a częstotliwość drgań ostrza na najwyższą. Następnie przygotuj koronalne skrawki o grubości 250 micron, pobierz je za pomocą wygiętej cienkiej szpatułki i przenieś do dołków z tkanką, używając cienkiego pędzla lub pęsety.
Jeśli tkanka wypadnie z agrosy, co oznacza, że kontakt tkanki z agrosą nie został wystarczająco uformowany w komorze do hodowli tkankowej, przygotuj płytkę 6-dołkową z 1,8 ml pożywki do hodowli skrawków na każdy dołek i umieść w każdym z nich wkładki organotypowe pokryte lamininą i polilizyną. Do górnej części organotypowych wkładek do skrawków dodaj 500 µL pożywki do hodowli skrawków. Następnie przenieś do każdej wkładki do pięciu skrawków.
Następnie usuń nadmiar pożywki z powierzchni skrawków, aby zapewnić jak największe zachowanie ich morfologii i zminimalizować śmierć komórek. Ważne jest utrzymanie prawidłowego interfejsu ciecz-powietrze, tak aby skrawki nie pływały w pożywce. Na koniec inkubuj skrawki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem.
Co drugi dzień wymieniaj połowę objętości pożywki znajdującej się pod membraną. Plasterki nie powinny pływać w pożywce. Neurony wykazujące ekspresję konstruktów wprowadzonych drogą elektroporacji można wizualizować już osiem godzin po elektroporacji. Po pożądanej liczbie dni hodowli utrwal plasterki na membranie w celu przeprowadzenia analizy.
Każdy organiczny wkład typiczny należy przemyć ciepłym PBS przez pięć minut. Wykonać łącznie trzy płukania w PBS, a następnie utrwalić tkankę w 4% paraformaldehydzie przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po utrwaleniu tkanki można analizować za pomocą markerów komórkowych lub po prostu barwić barwnikiem Hooksa. Po godzinie przemyć skrawki, wykonując trzy 10-minutowe płukania w 1xPBS.
Następnie inkubować przekroje przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w 10% roztworze serum koziego w 1x PBS przy łagodnym mieszaniu. Następnie barwić tkanki przeciwciałami przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu. Usunąć barwnik, wykonując trzy 10-minutowe płukania w 1x PBS przy łagodnym mieszaniu.
Umieścić matowe szkiełka przedmiotowe w komorze z wodą, która jest wystarczająco głęboka, aby całkowicie przykryć tkanki po ich przełożeniu na szkiełka. Aby zamocować skrawki, należy najpierw odciąć błonę za pomocą skalpela.
Po drugie, za pomocą precyzyjnej pęsety przenieść do pięciu skrawków związanych z błoną na każdy szkiełko zanurzone w wodzie. Po trzecie, usunąć nadmiar wody z każdego szkiełka. Po czwarte, nanieść kroplę medium montażowego na każdy skrawka mózgu.
I na koniec delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na skrawki i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza. Skrawki są następnie gotowe do badania mikroskopowego, w zależności od ilości elektroporowanego DNA oraz stadium embrionalnego. Stwierdzono, że wydajność transfekcji podczas elektroporacji była zróżnicowana.
Osiem godzin po transfekcji wektorem GFP z wyciszaczem P, komórki zaczęły ekspresować GFP. Podczas dłuższego okresu hodowli komórki przechodzą przez normalną sekwencję zdarzeń neurogennych, w tym proliferację, migrację i wczesną różnicowanie neuronalne. Skrawki te zachowały swoją morfologię przez pięć dni, pod warunkiem zachowania odpowiedniego interfejsu medium-powietrze podczas wykonywania tej procedury.
Ważne jest, aby cały eksperyment – od momentu uśmiercenia zwierzęcia do chwili umieszczenia skrawków w insertach membranowych – przeprowadzić w czasie krótszym niż dwie godziny, aby zminimalizować obumieranie komórek po tej procedurze. Można również wprowadzić inne modyfikacje, takie jak dodanie egzogennych czynników do hodowli organotypowej, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące np. roli różnych czynników wzrostu lub środków farmakologicznych w różnych mechanizmach neurorozwojowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgu za pomocą elektroporacji ex vivo. Dzięki zastosowaniu plazmidów współwyrażających inhibicyjne RNA oraz GFP, badacze mogą analizować procesy neurorozwojowe, takie jak neurogeneza i migracja neuronalna.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Neurorozwój
- Genetyka
Wstęp
- Kora mózgowa jest kluczowa dla wielu funkcji mózgu.
- Zrozumienie funkcji genów jest niezbędne do zgłębienia procesów neurorozwojowych.
- Techniki ex vivo umożliwiają szczegółowe badanie zachowania neuronów.
- Elektroporacja jest metodą stosowaną do wprowadzania DNA do komórek.
Cel badania
- Aby szybko ocenić funkcję genów w rozwoju kory mózgowej.
- Aby zbadać neurogenezę, migrację neuronalną i morfogenezę.
- Aby wykorzystać skrawki organotypowe do obserwacji zmian neuronalnych.
Zastosowane metody
- Elektroporacja plazmidów ex vivo w korze zarodkowej myszy.
- Zastosowanie krótkich impulsów elektrycznych w celu ułatwienia transfekcji.
- Disekcja i zatapianie mózgów w celu przygotowania skrawków organotypowych.
- Obserwacja komórek znakowanych GFP w celu identyfikacji defektów neuronalnych.
Główne wyniki
- Skuteczna transfekcja plazmidami komórek progenitorowych neuronów.
- Identyfikacja subpopulacji neuronów korowych z defektami.
- Wykazanie użyteczności technik ex vivo w badaniach nad rozwojem układu nerwowego.
- Wizualne potwierdzenie morfogenezy neuronalnej poprzez znakowanie GFP.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia szybkie podejście do badania funkcji genów.
- Elektroporacja ex vivo jest skuteczna w badaniach nad rozwojem neurologicznym.
- Uzyskane informacje mogą przyczynić się do zrozumienia rozwoju kory mózgowej.
Najczęściej Zadawane Pytania
Zastosowanie w przemyśle
Szybka elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy umożliwia funkcjonalną analizę genów kandydackich zaangażowanych w morfogenezę i migrację neuronów. Podejście to stanowi skalowalną i niskokosztową alternatywę dla tworzenia modeli transgenicznych lub knockoutowych, przyspieszając wczesne odkrycia i walidację celów w badaniach nad rozwojem neurologicznym. Zdolność do analizy mozaikowej zwiększa pewność predykcyjną w ocenie funkcji genów, co ułatwia selekcję portfolio oraz optymalizację działań w oparciu o analizę ryzyka.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia szybki screening funkcjonalny genów kandydackich w niemal fizjologicznym kontekście tkankowym.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez wyjaśnienie roli genów w morfogenezie i migracji neuronów.
- Zwiększa pewność predykcyjną w wyborze celów terapeutycznych dla zaburzeń neurorozwojowych.
- Pozwala na analizę mozaikową w celu odróżnienia efektów autonomicznych komórkowo od szerszych odpowiedzi tkankowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy organotypowych skrawków do dalszych etapów przepływu pracy w badaniach przesiewowych fenotypowych.
- Zapewnia powtarzalne i ilościowe wyniki dzięki znakowaniu GFP przetransfekowanych populacji neuronów.
- Umożliwia standaryzację i skalowalność testów w badaniach nad funkcją genów.
- Wspiera wiarygodną ocenę wpływu wyciszania genów na morfologię neuronów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgadza się z mechanizmami neurorozwojowymi istotnymi dla przebiegu choroby dzięki zachowaniu architektury tkanki.
- Zapewnia ciągłość od odkrycia genu do walidacji przedklinicznej w złożonych środowiskach tkankowych.
- Zmniejsza zależność od modeli całego zwierzęcia w początkowej ocenie funkcjonalnej.
- Umożliwia mechaniczną redukcję ryzyka w przypadku genów o nieznanej funkcji korowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda elektroporacji RNAi ex vivo znajduje zastosowanie na etapie przejścia od wczesnego odkrywania do identyfikacji wiodących kandydatów, stanowiąc pomost pomiędzy badaniami funkcji genów in vitro a walidacją in vivo. Usprawnia ona testowanie hipotez i wspiera szybką iterację w procesach poszukiwania celów terapeutycznych w rozwoju neurologicznym.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących funkcji genów w morfogenezie i migracji neuronów.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy skrawki organotypowe z ilościowymi, powtarzalnymi wynikami.
- Analityka: Wspiera bezpośredni pomiar fenotypów morfologicznych i migracyjnych w neuronach znakowanych GFP.
- Badania translacyjne: Zachowuje kontekst tkankowy w celu dostosowania do procesów neurorozwojowych istotnych w przebiegu chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do szybkiej oceny funkcji genów dla wielu kandydatów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad funkcją genów neurorozwojowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne przepływy pracy dla analizy wyciszania genów.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i poprawia efektywność kapitałową poprzez zmniejszenie zależności od modeli transgenicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów neurorozwojowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu sekcji embrionalnego mózgu oraz organotypowej hodowli skrawków tkankowych.
- Wymagany jest dostęp do sprzętu do elektroporacji oraz mikroskopii fluorescencyjnej w celu detekcji GFP.
- W celu zapewnienia powtarzalności niezbędna jest staranna standaryzacja stężenia DNA oraz parametrów elektroporacji.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych konstruktów genowych i stadiów embrionalnych, jednak krytyczne znaczenie mają kruchość tkanki oraz czas przeprowadzania procedury.
- Metoda jest ograniczona do wczesnych okien rozwojowych po urodzeniu i może nie uchwycić fenotypów długoterminowych.
