Name: Metody badania morfogenezy neuronów: elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej mysiej korze mózgowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji ex vivo do badania funkcji genów w rozwoju kory mózgowej myszy. Technika ta umożliwia szybką analizę neurogenezy, migracji neuronów i morfogenezy w układach organotypowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Shirin Bonni za udostępnienie konstruktu pSil-GFP, dr Alper Uzun za ilustrację do Rysunku 1 oraz ośrodkowi Leduc Bioimaging za przeprowadzenie mikroskopii konfokalnej. EMM jest wspierany przez Career Award for Medical Science z funduszu Burroughs Wellcome Fund, NARSAD Young Investigators Award oraz NIH NCRR COBRE P20 RR018728-01. SBL jest wspierany przez NIH NCRR COBRE P20 RR018728-01 i otrzymał wsparcie z PHS NRSA 5T32MH019118-20.

1. Przygotowanie roztworów hodowlanych i pożywek (brak w wideo)
<ol>
 <li>Przygotować 1 litr kompletnego zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) zawierającego 1x HBSS, 2,5 mM Hepes (pH7,4), 30 mM D-glukozy, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 oraz 4 mM NaHCO3. Dopełnić wodą podwójnie destylowaną (ddH2O). Sterylizować poprzez filtrację przez filtr 0,2-μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Przygotować pożywkę do hodowli skrawków, używając 35 mL pożywki Basal Medium Eagle, 12,9 mL kompletnego HBSS, 20 mM D-glukozy (1,35 mL roztworu 1 M), 1 mM Glutamax (0,25 mL roztworu 200 mM) oraz 0,5 ml stoku penicyliny-streptomycyny 100x. Sterylizować poprzez filtrację przez filtr 0,2-μm, a następnie dodać inaktywowaną ciepłem surowicę konia do stężenia końcowego 5%.</li>
 <li>Przygotować roztwór roboczy lamininy, sporządzając stoki lamininy o stężeniu 1 mg/mL w sterylnej destylowanej wodzie dejonizowanej. Przygotować alikwoty po 100 μL w probówkach eppendorfowskich 0,5 mL i zamrozić w temperaturze -80 °C.</li>
 <li>Przygotować roztwór roboczy poli-L-lizyny, dodając 5 mL sterylnej H2O do 5 mg poli-L-lizyny, aby uzyskać roztwór stokowy o stężeniu 1 mg/mL. Przygotować alikwoty po 1 mL i zamrozić w temperaturze -20 °C.</li>
 <li>Przygotować roztwór do powlekania, rozcieńczając 1 mL poli-L-lizyny i 100 μL lamininy do końcowej objętości 12 mL sterylną wodą. Roztwór ten należy przygotowywać świeżo przed każdym użyciem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie wkładów z plastrów organotypowych (brak w materiale wideo)
<ol>
 <li>Przygotować dwie płytki 6-dołkowe, umieszczając w każdej dołku jeden wkład kulturacyjny za pomocą sterylnej pęsety. Pod wkłady kulturacyjne dodać 2 mL sterylnej ddH2O.</li>
 <li>Na powierzchnię membrany nanieść 1 mL roztworu powlekającego, uważając, aby nie przebić membrany. Inkubować przez noc w humidyfikowanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.</li>
 <li>Usunąć medium powlekające i trzykrotnie przemyć membranę sterylną H20. Pozostawić wkłady do wyschnięcia przed użyciem. Dodać 1,8 mL pożywki do hodowli skrawków i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Nieużywane płytki owinąć Parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 4 tygodnie.</li>
</ol>

3. Przygotowanie do elektroporacji (brak w filmie)
<ol>
 <li>Przygotować konstrukty RNAi do elektroporacji. Dwuniciowe wstawki RNA w formie spinki (hairpin) sklonowano do wektora pSilencer. Plazmid zawiera: 1) promotor U6 sterujący generowaniem dwuniciowego RNA oraz 2) kasetę ekspresyjną GFP sterowaną przez promotor CMV8,9. Plazmid ten został wcześniej opisany przez Konishiego i współpracowników9 oraz innych autorów7,8. Plazmidy oczyszcza się za pomocą zestawu Qiagen maxi-prep i stosuje w stężeniu 1 mg/mL.</li>
 <li>W celu wizualizacji DNA podczas wstrzykiwania, przygotować 0,5% roztwór barwnika fast green i stosować go w proporcji 1:20 w stosunku do wstrzykiwanego DNA (zazwyczaj 20 μL DNA i 1 μL fast green). Pozostałą mieszaninę DNA z barwnikiem fast green można przechowywać w temperaturze -20 °C do tygodnia.</li>
 <li>Oczyścić obszar sekcji, narzędzia sekcyjne oraz naczynie wibrotomu 70% etanolem. Schłodzić kompletny HBSS do temperatury lodowej. Schłodzić naczynie wibrotomu, obkładając je lodem wewnątrz wibrotomu z dodatkiem niewielkiej ilości wody w celu szybkiego chłodzenia. Przygotować 3% agarozę o niskiej temperaturze topnienia, wykorzystując kompletny HBSS. Podgrzewać w kuchence mikrofalowej przez 1 min. Unikać zagotowania. Przechowywać w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C do momentu użycia.</li>
 <li>Parametry elektroporacji ustawić w następujący sposób. Dla zarodka E15 zastosować 35 V, 5 impulsów, czas trwania 100 ms, odstęp między impulsami 900 ms. W przypadku starszych zwierząt, aby zapewnić skuteczność elektroporacji, należy zastosować wyższe napięcie do 50 V lub zwiększyć liczbę impulsów do 8. Aby zapobiec uszkodzeniu tkanki u młodszych zwierząt, należy zastosować mniejszą liczbę impulsów (do 2 impulsów) oraz niższe napięcie do 25 V. Parametry te mogą być modyfikowane i ustalane empirycznie w zależności od wieku zwierzęcia.</li>
</ol>
4. Disekcja i elektroporacja (w materiale wideo)
<ol>
 <li>Po uśmierceniu ciężarnej samicy, wypreparuj zarodki do lodowatego, kompletnego roztworu HBSS. Pozostaw każdy zarodek w jego indywidualnym worku łożyskowym.</li>
 <li>Wyjmij zarodek i odetnij głowę za pierwszym kręgiem. Przechowuj w lodowatym, kompletnym roztworze HBSS.</li>
 <li>Do wstrzykiwania umieść głowę na kawałku Parafilmu na płytce Petriego. Używając specjalnie wykonanej strzykawki Hamiltona (patrz Tabela I), wstrzyknij około 6 do 8 μL mieszaniny DNA i barwnika fast green przez trzecią komorę, aby wypełnić obie komory boczne w pęcherzykach korowych. Alternatywnie wstrzykiwanie można przeprowadzić bezpośrednio do każdej z komór bocznych.</li>
 <li>Do elektroporacji ex vivo użyj platynowych elektrod BTX-tweezer. Umieść elektrodę dodatnią po stronie kory, którą chcesz poddać elektroporacji, np. na szczycie głowy dla kory grzbietowej.</li>
 <li>Po elektroporacji inkubuj głowy na lodzie przez co najmniej 5 min przed preparowaniem.</li>
 <li>Wypreparuj mózgi w lodowatym HBSS, wykonując niewielkie nacięcie po bokach głowy i zdejmując skórę z boków głowy. Następnie, za pomocą precyzyjnych pęset, delikatnie oddziel oponę miękką od mózgu. Usuń nienaruszony mózg z czaszki, dbając o to, aby nie uszkodzić kory.</li>
</ol>
5. Zatapianie i krojenie elektroporowanych kory mózgowych (w wideo)
<ol>
 <li>Przenieś 3% agarozę o niskiej temperaturze topnienia do dużej formy umieszczonej na lodzie. Dno formy zacznie zestalać się szybciej, co zapobiegnie opadaniu mózgów na dno. Delikatnie przenieś mózgi jeden po drugim za pomocą precyzyjnej pęsety, po uprzednim usunięciu nadmiaru buforu za pomocą chusteczki Kimwipe lub papieru filtracyjnego. Użyj końcówki do pipety 10 μL, aby zakręcić mózgami wewnątrz formy, zapewniając maksymalny kontakt między agarozą a tkanką mózgową.</li>
 <li>Ustaw mózgi tak, aby wszystkie znajdowały się w tej samej orientacji i na zbliżonym poziomie w agarozie. Pozostaw agarozę do zastygnięcia na około 5 min. Użyj kleju błyskawicznego, aby przymocować bloki agarozy tak, by opary węchowe były skierowane do góry. Po przymocowaniu bloków natychmiast dodaj lodowaty HBSS i przytnij agarozę, aby zapewnić uzyskanie pojedynczych przekrojów dla każdego mózgu.</li>
 <li>Aby wykonać cięcia bloków, ustaw prędkość wibratomu na niską (około połowy maksymalnej), a częstotliwość wibracji ostrza na najwyższą. Wykonaj przekroje koronalne o grubości 250 μm. Pobierz przekroje za pomocą wygiętej precyzyjnej szpatułki i przenieś je do dołków z tkanką za pomocą precyzyjnego pędzla lub pęsety.</li>
 <li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza przenieś przekroje do powlekanych insertów. Do każdego insertu dodaj 500 μL pożywki do hodowli przekrojów, aby ułatwić transfer. W jednym insercie można umieścić do 5 przekrojów. Usuń nadmiar pożywki z powierzchni przekrojów i inkubuj w 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem.</li>
</ol>
6. Hodowla i analiza skrawków organotypowych (w wideo)
<ol>
 <li>Aby utrzymać plastry w dobrym stanie, należy co najmniej co drugi dzień dodawać świeże medium pod membranę, wymieniając przy tym połowę medium.</li>
 <li>W celu analizy plastrów po pożąganej liczbie dni hodowli, należy je utrwalić w membranie. Przemyć trzy razy buforem fosforanowym (PBS) 1x w temperaturze 37 °C, po 10 min każde płukanie. Następnie utrwalić w 4% Paraformaldehydzie (PFA) przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 1 h w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Plastry można analizować z użyciem różnych markerów komórkowych lub barwić samym Hoechstem w celu wizualizacji komórek elektroporowanych i nieelektroporowanych. Przeprowadzić permeabilizację i blokowanie plastrów przez 2 h w temperaturze pokojowej w 10% surowicy koziej i 0,1% tritonu w PBS 1x przy delikatnym wstrząsaniu.</li>
 <li>Barwić Hoechstem przez 1 h w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć 3 razy w PBS 1x przez 10 min każde płukanie przy delikatnym wstrząsaniu.</li>
 <li>Aby zamontować plastry, należy wyciąć membranę skalpelem, a następnie za pomocą precyzyjnej pęsety przenieść membranę z plastrami na matowe szkiełko obiektowe w komorze z wodą. Na jednym szkiełku można umieścić do 5 plastrów. Usunąć nadmiar wody i dodać kroplę roztworu Flourmount na każdy plaster mózgu. Delikatnie położyć szkiełko nakrywkę na plastrach mózgu i usunąć pęcherzyki powietrza. Przeanalizować plastry za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
</ol>
7. Alternatywne zatapianie w parafinie skrawków organotypowych (brak w materiale wideo)
<ol>
 <li>Przekroje organotypowe można również zalać parafiną w celu przeprowadzenia dokładniejszej analizy morfologicznej; w tym celu membranę zawierającą przekroje organotypowe można utrwalić w 4% PFA, zgodnie z powyższym opisem.</li>
 <li>Utrwalone przekroje zalewa się 1% agaroza (wstępnie podgrzaną do 37 °C) i zestyla w lodzie przez 30 min. Następnie bloki agarozy można poddać potrwalaniu w 4% PFA w temperaturze 4 °C przez 30 min.</li>
 <li>Blok agarozy zawierający przekrój organotypowy zostanie następnie zalany parafiną i poddany procedurze immunofluorescencji zgodnie z wcześniejszym opisem10.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki
Schematyczne przedstawienie elektroporacji kory mysiej oraz hodowli plastrów organotypowych pokazano na Rysunku 1. Metoda ta stanowi przydatną strategię do szybkiej oceny funkcji genów zaangażowanych w rozwój neuronalny11. Efektywność transfekcji będzie zależeć od ilości elektroporowanego DNA oraz stadium embrionalnego w momencie przeprowadzania procedury. Plastry zaczną wykazywać ekspresję GFP co najmniej 8 godzin po elektroporacji, a komórki przejdą normalną sekwencję zdarzeń neurogennych (proliferację, migrację i wczesne różnicowanie neuronalne) w hodowli. Rysunek 2 przedstawia elektroporowany plaster mózgu wykazujący ekspresję kontrolnego wektora pSilencer-GFP, w którym można zaobserwować progenitorów neuronalnych, migrujące neurony oraz neurony zróżnicowane. Plastry organotypowe zachowują swoją morfologię tak długo, jak są utrzymywane w prawidłowym interfejsie medium-powietrze na membranach, i mogą być wykorzystywane w hodowli przez co najmniej 5 dni.
<img alt="Schemat procesu elektroporacji RNAi; wybór embrionów, wstrzykiwanie DNA, cięcie wibratomem." src="/files/ftp_upload/3621/3621fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Ilustracja elektroporacji ex vivo oraz testu hodowli organotypowych skrawków. Embriony E14.5 są wyjmowane, a następnie poszczególne z nich są wstrzykiwane DNA zmieszanym z barwnikiem fast green w celu wizualizacji miejsca wstrzyknięcia. DNA można wstrzykiwać zarówno do komór bocznych, jak przedstawiono na ilustracji, jak i do komory trzeciej w celu wypełnienia komór bocznych. Po wstrzyknięciu mózgi są poddawane elektroporacji za pomocą elektroporatora z falą prostokątną, przy czym elektrodę dodatnią umieszcza się po pożądanej stronie mózgu. Mózgi są zatapiane w 3% agarozie o niskiej temperaturze topnienia i cięte za pomocą wibratomu. Skrawki mózgu o grubości 250 μm są umieszczane na insertach 0,4 μm i hodowane do tygodnia. GFP można zaobserwować 8 godzin po transfekcji.
<img alt="Neurony znakowane GFP w korze mysiej, wynik mikroskopii fluorescencyjnej, analiza migracji komórek." src="/files/ftp_upload/3621/3621fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Analiza elektroporowanych skrawków mózgu. Elektroporowane skrawki mózgu barwiono barwnikiem Hoechst. W korze grzbietowej widoczne są elektroporowane progenitory neuronalne w strefie komorowej (vz). Neurony w płytce korowej (cp) są ograniczone strefą marginalną (mz). Białe strzałki wskazują migrujące neurony. W tym przypadku iniekcje do mózgów wykonano w dniu E15.5, a następnie przeprowadzono elektroporację z użyciem wektora kontrolnego pSilencer GFP. Przekroje przedstawiają eksplantaty korowe 4 dni po elektroporacji. Pasek skali 100 μm.
Rozwiązywanie problemów:
<ol>
 <li>Niska wydajność transfekcji: Dostosuj stężenie użytego DNA do poziomu co najmniej 1 μg/μL. Zawsze używaj bardzo czystego DNA z preparacji maxi; w razie potrzeby zastosuj zestaw Quiagen endo-free do oczyszczania DNA.</li>
 <li>Komórki przetransfekowane w innym obszarze mózgu niż zamierzony: Upewnij się, że elektrody są ustawione prawidłowo, z elektrodą dodatnią skierowaną w stronę strony mózgu, która ma zostać poddana elektroporacji.</li>
 <li>Prążki organotypowe tracą morfologię: Wymieniaj pożywkę codziennie i upewnij się, że prążki nie pływają w pożywce.</li>
 <li>Prążki odklejają się od agarozy podczas cięcia w wibratomie: Upewnij się, że podczas zatapiania mózgów w agarozie o niskiej temperaturze topnienia uzyskano dobrą powierzchnię styku.</li>
</ol>

<ol><li>Angevine, J. B. Jr, Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoradiographic+study+of+cell+migration+during+histogenesis+of+cerebral+cortex+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse.</a> Nature. 192, 766-766 (1961).</li>
<li>Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+neuronal+migration+in+the+embryonic+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex.</a> Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).</li>
<li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).</li>
<li>Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures+for+analysis+of+proliferation%2C+cell+death%2C+and+migration+in+the+embryonic+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).</li>
<li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slice+overlay+assay%3A+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+STKE%22%5BJournal%5D)">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal.</a> Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).</li>
<li>Guerrier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+F-BAR+domain+of+srGAP2+induces+membrane+protrusions+required+for+neuronal+migration+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis.</a> Cell. 138, 990-990 (2009).</li>
<li>Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-intrinsic+regulation+of+axonal+morphogenesis+by+the+Cdh1-APC+target+SnoN%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN.</a> Neuron. 50, 389-389 (2006).</li>
<li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li>
<li>Konishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdh1-APC+controls+axonal+growth+and+patterning+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain.</a> Science. 303, 1026-1026 (2004).</li>
<li>Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+and+paraffin-embedding+of+mouse+tissues+for+GFP+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).</li>
<li>Hand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-45 (2005).</li>
<li>Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Utero+Electroporation+as+a+Tool+for+Genetic+Manipulation+in+Vivo+to+Study+Psychiatric+Disorders%3A+From+Genes+to+Circuits+and+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors.</a> Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Metody te, obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów kodujących dwuniciowe RNA w formie spinek (hairpins)8 oraz hodowlę skrawków organotypowych4, zapewniają kilka istotnych zalet. Po pierwsze, metody te pozwalają na szybką ocenę fenotypów pochodnych RNAi. Włączenie kasety ekspresyjnej kodującej GFP do tego samego wektora pSilencer, który zawiera promotor U6 sterujący dwuniciową spinką RNA, umożliwia szybką identyfikację i charakterystykę komórek poddanych elektroporacji wektorem RNAi. Opr...

<table><tbody><tr><td>Strzykawka Hamiltona</td><td>Hamilton Co</td><td>80008</td><td>rozmiar igły 31 G, długość 0,5 cala, PT-4 (stopień ścięcia końcówki), objętość 10&amp;#x03BC;l</td></tr><tr><td>Platynowe elektrody pęsetowe</td><td>BTX Technologies</td><td>45-0489</td><td>rozmiar 5 mm</td></tr><tr><td>Elektroporator ECM830</td><td>BTX Technologies</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Wyzwalacz nożny BTX</td><td>BTX Technologies</td><td>45-0208</td><td>Do użytku z elektroporatorem ECM830</td></tr><tr><td>Mikrotom z wibrującym ostrzem</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa do stosowania z wkładkami</td><td>Falcon BD</td><td>353502</td><td>Zawiera wycięcia dopasowane do wkładek</td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli tkankowych</td><td>Falcon BD</td><td>353090</td><td>0,4 mikrometra</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td>klasa DNA</td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowa pożywka Eagle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-1522</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x bez Ca i Mg</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>Kwas HEPES (bez HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr></tbody></table>

metody badania morfogenezy neuronalnej: elektroporacja rnai ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Kora mózgu steruje wyższymi funkcjami poznawczymi. Ta sześciowarstwowa struktura powstaje w sposób „od wewnątrz do zewnątrz”, w którym neurony powstałe jako pierwsze pozostają bliżej komory, natomiast neurony powstałe później migrują obok nich w kierunku powierzchni mózgu1. Oprócz migracji neuronalnej2, kluczowym procesem dla prawidłowego funkcjonowania kory jest regulacja morfogenezy neuronalnej3. Chociaż morfogenezę neuronalną można badać in vitro w kulturach pierwotnych, wiele można dowiedzieć się z tego, jak procesy te są regulowane w środowisku tkankowym.
Opisujemy techniki analizy migracji neuronalnej i/lub morfogenezy w organotypowych skrawkach kory mózgowej4,6. Wykorzystany zostaje zmodyfikowany wektor pSilencer, który zawiera zarówno promotor U6 sterujący dwuniciowym RNA w formie spinki (hairpin RNA), jak i oddzielną kasetę ekspresyjną kodującą białko GFP pod kontrolą promotora CMV7-9. Nasze podejście pozwala na szybką ocenę defektów wzrostu neurytów po specyficznym wyciszeniu genów kandydackich i zostało z powodzeniem zastosowane w screeningu regulatorów wzrostu neurytów8. Ponieważ tylko część komórek będzie ekspresować konstrukty RNAi, skrawki organotypowe umożliwiają analizę mozaikową potencjalnych fenotypów. Co więcej, ponieważ analiza ta jest przeprowadzana w środowisku zbliżonym do warunków in vivo, stanowi ona niskokosztową i szybką alternatywę dla generowania zwierząt transgenicznych lub knockoutowych w przypadku genów o nieznanej funkcji korowej. Wreszcie, w porównaniu z technologią elektroporacji in vivo, sukces eksperymentów z elektroporacją ex vivo nie zależy od wysokiego stopnia rozwoju umiejętności chirurgicznych i może być przeprowadzony przy krótszym czasie szkolenia i mniejszym zaawansowaniu technicznym.

W celu przeprowadzenia szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgu opisujemy metody obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów koekspresujących inhibicyjne RNA (RNAi) i GFP w zarodkowej korze mysiej. Protokół ten nadaje się do badania różnych aspektów neurorozwoju, takich jak neurogeneza, migracja neuronów oraz morfogeneza neuronów, w tym wzrost dendrytów i aksonów.

Metody badania morfogenezy neuronalnej: Elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy

Kora mózgowa kieruje wyższymi funkcjami poznawczymi. Ta sześciowarstwowa struktura powstaje w sposób sekwencyjny (od wewnątrz na zewnątrz), w którym ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przeprowadzenie szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgowej z wykorzystaniem skib organotypowych. Osiąga się to poprzez wprowadzenie do kory mózgowej myszy plazmidów wykazujących koekspresję hamującego RNA oraz markera GFP. Do mózgu przykłada się krótkie impulsy elektryczne, co umożliwia transfekcję komórek progenitorowych neuronów za pomocą plazmidowego DNA.Następnie mózgi są preparowane, zatapiane i cięte w celu uzyskania plastrów organotypowych, w których może zachodzić morfogeneza neuronalna ex vivo. W plastrach organotypowych można poszukiwać subpopulacji neuronów korowych z defektami migracyjnymi lub morfologicznymi poprzez bezpośrednią obserwację komórek znakowanych białkiem GFP. Dzień dobry, witajcie w moim laboratorium na Uniwersytecie Brown w departamencie biologii molekularnej; dzisiaj dr Liza oraz dwoje studentów, Kat Zer i Mark Seba, zaprezentują technikę elektroporacji ex vivo oraz hodowlę plastrów organotypowych, która jest bardzo użyteczną metodą w badaniach nad rozwojem neurologicznym.Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w różnych aspektach neurorozwoju, w tym w procesach neurogenezy, migracji neuronalnej oraz morfogenezy neuronalnej. Ponieważ analiza ta jest przeprowadzana w warunkach zbliżonych do środowiska IBU, stanowi ona niskokosztową i szybką alternatywę dla tworzenia zwierząt transgenicznych lub nokautowych w przypadku genów o nieznanej funkcji. Wreszcie, w porównaniu z technologią elektroporacji in vivo, sukces tych eksperymentów z elektroporacją nie zależy od biegłości w przeprowadzaniu zabiegów chirurgicznych czy długotrwałego doskonalenia umiejętności, a może być wykonany przy krótszym czasie szkolenia i mniejszych wymaganiach technicznych.Po uśmierceniu ciężarnej myszy samicy, wypreparuj zarodki do lodowatego, pełnego roztworu HBSS, utrzymując je w ich indywidualnych pęcherzykach pępowinowych. Następnie, w zimnym roztworze HBSS, uwolnij zarodek z pęcherzyka i odetnij głowę za pierwszym kręgiem w celu wykonania iniekcji; umieść głowę na kawałku papieru paraformowego na dnie szalki Petriego, używając specjalnie wykonanej strzykawki Hamiltona. Wstrzyknij od 6 do 8 µL mieszaniny DNA fast green przez trzecią komorę mózgu.Stamtąd mieszanina wypełni oba komory boczne w pęcherzykach korowych. Do elektroporacji wykorzystuje się platynowe elektrody pęsetowe BTX. Umieść elektrodę dodatnią po stronie kory, która ma zostać poddana elektroporacji.Na przykład w przypadku kory grzbietowej elektroda powinna znajdować się na górnej części głowy. Aby uzyskać wysoką wydajność transfekcji, zawsze należy dostosować stężenie DNA do 1 µg/µL i używać DNA wyizolowanego za pomocą preparatyki Maxi. Jeśli jest to konieczne, należy użyć zestawu do usuwania endotoksyn w celu oczyszczenia DNA po elektroporacji.Przed przeprowadzeniem sekcji inkubuj głowę na lodzie przez co najmniej pięć minut. Podczas elektroporacji niezwykle ważne jest zastosowanie odpowiedniej liczby impulsów elektrycznych i natężenia prądu, aby uniknąć uszkodzenia młodych mózgów embrionalnych. Po elektroporacji tkanka staje się bardzo krucha.Ważne jest, aby przeprowadzić sekcję bardzo ostrożnie, ponieważ skóra i czaszka mogą naciągać oponę mózgową pęcherzyków korowych, co może doprowadzić do ich uszkodzenia podczas usuwania z czaszki. Po pięciu minutach wypreparuj mózg w zimnym HBSS, zaczynając od wykonania małego nacięcia z boku głowy i odsunięcia skóry z boków głowy.Następnie, za pomocą precyzyjnej pęsety, delikatnie oddziel oponę miękką od mózgu. Wyjmij nienaruszony mózg z czaszki. Po zakończeniu czynności przechowuj mózg w lodowatym roztworze HBSS i przygotuj się do zatopienia tkanki.Zacznij wypełniać formy 3% niskotopliwą agarozą. Umieść formy na lodzie, aby agaroza zestaliła się przy dnie formy, upewniając się najpierw, że mózgi pozostają podparte i wycentrowane.Teraz za pomocą precyzyjnej pęsety ostrożnie wyjmij mózg z HBSS, odsącz nadmiar buforu za pomocą chusteczki Kimwipe lub papieru filtracyjnego i umieść mózg w niskotopiącym agarozie. Następnie za pomocą końcówki pipety delikatnie obróć mózg wewnątrz formy, aby zmaksymalizować kontakt agarozy z tkanką. Po przeniesieniu wszystkich mózgów, ustaw każdy z nich w zbliżonej orientacji i na podobnej głębokości w obrębie swojej formy.Agaros utwardzi się w ciągu około pięciu minut, dlatego należy pracować szybko. Pozostaw agarosy do całkowitego utwardzenia, inkubując je przez dodatkowe pięć minut na lodzie.Przed zamocowaniem bloków przytnij nadmiar agarozy. Następnie połącz bloki agarozy ze sobą, używając szybko wiążącego kleju do tworzyw sztucznych; każdy mózg w stosie powinien być ułożony cebulkami węchowymi do góry. Po połączeniu bloków przytnij agarozę, aby upewnić się, że każdy mózg zostanie przekrojony przez wibrotom.Następnie natychmiast zanurz je w lodowatym roztworze HBSS. Aby wykonać skrawki z bloków, ustaw prędkość wibratomu na niską, około połowę prędkości maksymalnej, a częstotliwość drgań ostrza na najwyższą. Następnie przygotuj koronalne skrawki o grubości 250 micron, pobierz je za pomocą wygiętej cienkiej szpatułki i przenieś do dołków z tkanką, używając cienkiego pędzla lub pęsety.Jeśli tkanka wypadnie z agrosy, co oznacza, że kontakt tkanki z agrosą nie został wystarczająco uformowany w komorze do hodowli tkankowej, przygotuj płytkę 6-dołkową z 1,8 ml pożywki do hodowli skrawków na każdy dołek i umieść w każdym z nich wkładki organotypowe pokryte lamininą i polilizyną. Do górnej części organotypowych wkładek do skrawków dodaj 500 µL pożywki do hodowli skrawków. Następnie przenieś do każdej wkładki do pięciu skrawków.Następnie usuń nadmiar pożywki z powierzchni skrawków, aby zapewnić jak największe zachowanie ich morfologii i zminimalizować śmierć komórek. Ważne jest utrzymanie prawidłowego interfejsu ciecz-powietrze, tak aby skrawki nie pływały w pożywce. Na koniec inkubuj skrawki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem.Co drugi dzień wymieniaj połowę objętości pożywki znajdującej się pod membraną. Plasterki nie powinny pływać w pożywce. Neurony wykazujące ekspresję konstruktów wprowadzonych drogą elektroporacji można wizualizować już osiem godzin po elektroporacji. Po pożądanej liczbie dni hodowli utrwal plasterki na membranie w celu przeprowadzenia analizy.Każdy organiczny wkład typiczny należy przemyć ciepłym PBS przez pięć minut. Wykonać łącznie trzy płukania w PBS, a następnie utrwalić tkankę w 4% paraformaldehydzie przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po utrwaleniu tkanki można analizować za pomocą markerów komórkowych lub po prostu barwić barwnikiem Hooksa. Po godzinie przemyć skrawki, wykonując trzy 10-minutowe płukania w 1xPBS.Następnie inkubować przekroje przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w 10% roztworze serum koziego w 1x PBS przy łagodnym mieszaniu. Następnie barwić tkanki przeciwciałami przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu. Usunąć barwnik, wykonując trzy 10-minutowe płukania w 1x PBS przy łagodnym mieszaniu.Umieścić matowe szkiełka przedmiotowe w komorze z wodą, która jest wystarczająco głęboka, aby całkowicie przykryć tkanki po ich przełożeniu na szkiełka. Aby zamocować skrawki, należy najpierw odciąć błonę za pomocą skalpela.Po drugie, za pomocą precyzyjnej pęsety przenieść do pięciu skrawków związanych z błoną na każdy szkiełko zanurzone w wodzie. Po trzecie, usunąć nadmiar wody z każdego szkiełka. Po czwarte, nanieść kroplę medium montażowego na każdy skrawka mózgu.I na koniec delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na skrawki i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza. Skrawki są następnie gotowe do badania mikroskopowego, w zależności od ilości elektroporowanego DNA oraz stadium embrionalnego. Stwierdzono, że wydajność transfekcji podczas elektroporacji była zróżnicowana.Osiem godzin po transfekcji wektorem GFP z wyciszaczem P, komórki zaczęły ekspresować GFP. Podczas dłuższego okresu hodowli komórki przechodzą przez normalną sekwencję zdarzeń neurogennych, w tym proliferację, migrację i wczesną różnicowanie neuronalne. Skrawki te zachowały swoją morfologię przez pięć dni, pod warunkiem zachowania odpowiedniego interfejsu medium-powietrze podczas wykonywania tej procedury.Ważne jest, aby cały eksperyment – od momentu uśmiercenia zwierzęcia do chwili umieszczenia skrawków w insertach membranowych – przeprowadzić w czasie krótszym niż dwie godziny, aby zminimalizować obumieranie komórek po tej procedurze. Można również wprowadzić inne modyfikacje, takie jak dodanie egzogennych czynników do hodowli organotypowej, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące np. roli różnych czynników wzrostu lub środków farmakologicznych w różnych mechanizmach neurorozwojowych.

methods-for-study-neuronal-morphogenesis-ex-vivo-rnai-electroporation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Metody badania morfogenezy neuronów: Ex vivo elektroporacja RNAi w zarodkowym mózgowiu myszym

In utero elektroporacja jest cenną metodą transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych in vivo. W zależności od rozmieszczenia elektrod oraz momentu rozwojowego przeprowadzenia elektroporacji, można ukierunkować proces na określone podgrupy komórek kory mózgowej. Następnie komórki docelowe można analizować in vivo lub in vitro pod kątem efektów modyfikacji genetycznych.

Elektroporacja in utero z następującą po niej pierwotną hodowlą neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół elektroporacji in utero kory mózgowia oraz hipokampa u myszy w stadium E14.5. Wykazujemy również, że jest to cenna metoda badania dendrytów i kolców dendrytycznych w tych dwóch obszarach mózgu.

Wizualizacja i manipulacja genetyczna dendrytów i kolców w korze mózgu i hipokampie myszy z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Źródło: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineerical Interneuron Pregenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę wstrzykiwania wektora plazmidowego przenoszącego interesujący nas gen do progenitorów interneuronów w embrionalnym wycinku mózgu, a następnie elektroporacji w celu wejścia plazmidu i ekspresji genu. Te zmodyfikowane komórki progenitorowe mogą być później wykorzystane do leczenia zaburzeń mózgu.

Transfer genów wspomagany elektroporacją osadzony w agarozie w progenitorach interneuronów kory myszy

Ten protokół opisuje ulepszoną procedurę eksplantacji, która obejmuje elektroporację ex utero, sekcję i hodowlę całych półkul mózgowych od embrionalnej myszy. Preparat ułatwia badania farmakologiczne i testy funkcji genów we wczesnym okresie rozwoju kory mózgowej.

Ex utero Elektroporacja i eksplantaty całej półkuli: prosta metoda eksperymentalna do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej

Okołokomorowa heterotopia guzkowa (PNH) jest najczęstszą formą wady rozwojowej kory mózgowej (MCD) w wieku dorosłym, ale jej podłoże genetyczne pozostaje nieznane w większości sporadycznych przypadków. Niedawno opracowaliśmy strategię identyfikacji nowych genów kandydujących do MCD i bezpośredniego potwierdzenia ich przyczynowej roli in vivo.

Nowatorska strategia łącząca macierz CGH, sekwencjonowanie całego eksomu i elektroporację in utero u gryzoni w celu identyfikacji genów odpowiedzialnych za wady rozwojowe mózgu

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Tutaj prezentujemy protokół, zaprojektowany do wykorzystania narzędzi chemogenetycznych do manipulowania aktywnością komórek progenitorowych interneuronów korowych przeszczepionych do kory mózgowej myszy po urodzeniu.

Przeszczepienie chemogenetycznie zmodyfikowanych progenitorów interneuronów korowych do wczesnych postnatalnych mózgów myszy

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę elektroporacji ex vivo do badania funkcji genów w rozwoju kory mózgowej myszy. Technika ta umożliwia szybką analizę neurogenezy, migracji neuronów i morfogenezy w układach organotypowych.

Metody badania morfogenezy neuronalnej: Elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów