Metody badania morfogenezy neuronów: elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej mysiej korze mózgowej
May 18th, 2012
Aby przeprowadzić szybką ocenę funkcji genów w rozwoju kory mózgowej, opisujemy metody polegające na elektroporacji ex vivo plazmidów koeksprymujących hamujące RNA (RNAi) i GFP w mysiej korze embrionalnej. Protokół ten jest podatny na badanie różnych aspektów rozwoju neurologicznego, takich jak neurogeneza, migracja neuronów i morfogeneza neuronów, w tym rozrost dendrytów i aksonów.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przeprowadzenie szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgowej przy użyciu wycinków organotypowych. Osiąga się to poprzez wprowadzenie plazmidów, koex, ekspresji i hamowania RNA oraz markera GFP do kory mózgowej murn. Krótkie impulsy elektryczne są stosowane do mózgu, umożliwiając plazmidowemu DNA transfekcję neuronalnych komórek progenitorowych.
Następnie mózgi są preparowane, osadzane i dzielone na sekcje w celu wytworzenia wycinków organotypowych, które mogą ulegać morfogenezie neuronów ex vivo. Wycinki organotypowe można przeszukiwać pod kątem subpopulacji neuronów korowych z defektami migracyjnymi lub morfologicznymi, bezpośrednio obserwując komórki znakowane GFP. Cześć, witam dziś w moim laboratorium na Uniwersytecie Browna na wydziale biologii molekularnej, dr Liza i dwoje studentów, Kat Zer i Mark Seba, zademonstrują technikę elektroporacji ex vivo i organotypową hodowlę plastrów, która jest bardzo przydatną techniką w badaniach neurorozwojowych.
Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w różnych aspektach neurorozwoju, w tym neurogenezy, migracji neuronów i morfogenezy neuronów. Ponieważ analiza ta jest przeprowadzana w sposób zbliżony do środowiska IBU, stanowi ona tanią i szybką alternatywę dla generowania zwierząt transgenicznych lub nokautujących dla genów o nieznanej funkcji. Wreszcie, w porównaniu z technologią operacji elektrycznych in vivo, sukces tych eksperymentów z operacjami elektrochirurgii in vivo nie zależy od biegłej chirurgii, rozwoju umiejętności i może być wykonany przy krótszym czasie szkolenia i umiejętnościach.
Po eutanazji ciężarnej samicy myszy, należy wypreparować zarodki na lodowato, kompletny HBSS, trzymając je w indywidualnych workach łożyskowych. Następnie w zimnym roztworze HBSS uwolnij zarodek z worka i odetnij mu głowę po pierwszym kręgu do wstrzyknięcia, umieść głowę na kawałku papieru paraform na szalce Petriego za pomocą specjalnie wykonanej strzykawki Hamiltona. Wstrzyknij sześć do ośmiu mikrolitrów szybkiej zielonej mieszanki DNA przez trzecią komorę.
Stamtąd mieszanka wypełni obie boczne komory w pęcherzykach korowych. Do elektroporacji wykorzystywane są platynowe elektrody pęsety BTX. Umieść elektrodę dodatnią w kierunku strony kory, która będzie elektroporowana.
Na przykład elektroda powinna znajdować się na czubku głowy w przypadku kory grzbietowej. Aby uzyskać wysoką wydajność transfekcji, zawsze dostosowuj stężenie DNA do jednego mikrograma na mikrolitr i używaj DNA wyizolowanego z preparatu Maxi. W razie potrzeby użyj zestawu bez endotoksyn, aby oczyścić DNA po elektroporacji.
Inkubuj głowę na lodzie przez co najmniej pięć minut przed jej rozcięciem. Bardzo ważne jest, aby podczas elektroporacji używać odpowiedniej ilości impulsów elektrycznych i prądu, aby uniknąć uszkodzenia młodszych mózgów embrionalnych. Po elektroporacji tkanka staje się bardzo delikatna.
Ważne jest, aby wykonywać sekcje bardzo ostrożnie, ponieważ skóra i szkoła mogą ciągnąć za opony mózgowe pęcherzyków korowych, co może uszkodzić pęcherzyki korowe po usunięciu z czaszki. Po pięciu minutach wypreparuj mózg na zimno. HBSS rozpoczyna się od wykonania małego nacięcia z boku głowy i złuszczenia skóry z boków głowy.
Następnie cienkimi kleszczami delikatnie oderwij pia od mózgu. Usuń nienaruszony mózg z czaszki. Po zakończeniu utrzymuj mózg w lodowatym HBSS i przygotuj się do osadzenia tkanki.
Rozpocznij napełnianie form od 3% niskiej temperatury topnienia. Agros. Umieść foremki na lodzie, aby agros zestalił się w pobliżu dna formy. Po pierwsze, upewnienie się, że mózgi pozostają podparte i wyśrodkowane.
Teraz za pomocą cienkich kleszczy delikatnie wyjmij mózg z HBSS, wchłoń nadmiar buforu chusteczką lub bibułą filtracyjną i ustaw mózg na niską temperaturę topnienia. Agros. Następnie użyj końcówki pipety, aby zawirować mózg wewnątrz formy, aby zmaksymalizować kontakt między agros a tkanką. Po przeniesieniu wszystkich mózgów umieść każdy mózg w mniej więcej tej samej orientacji i głębokości w swojej formie.
aros zestali się po około pięciu minutach. Więc pracuj szybko. Pozwól aros całkowicie zestalić się, inkubując dodatkowe pięć minut na lodzie.
Przytnij nadmiar aros przed zamontowaniem bloków. Następnie przymocuj klocki agros do siebie za pomocą szybko wiążącego kleju z tworzywa sztucznego, każdy mózg w stosie powinien być ustawiony z opuszkami węchowymi skierowanymi do góry. Po przymocowaniu klocków przytnij aros, aby upewnić się, że każdy mózg zostanie pocięty przez vibrato.
Następnie natychmiast zanurz je w lodowatym HBSS. Aby pokroić bloki, ustaw prędkość wibratos na niską prędkość, około połowy maksymalnej, i ustaw częstotliwość wibracji ostrza na najwyższe ustawienie. Następnie wygeneruj plastry koronalne o grubości 250 mikronów, odzyskaj plasterki za pomocą wygiętej cienkiej szpatułki i przenieś je do dołków tkankowych za pomocą cienkiej szczoteczki lub kleszczy.
Jeśli tkanka wypadnie z agros, kontakt z tkanką agros nie został wystarczająco uformowany w kapturze do hodowli tkankowej, przygotuj sześciodołkową płytkę z 1,8 mililitra pożywki do hodowli warstw na dołek i umieść w każdym z nich kod wkładek organotypowych lizyny polityki lamininy. Dobrze dodaj 500 mikrolitrów pożywki do hodowli plastrów na wierzch organotypowych wkładek plastrów. Następnie przenieś do pięciu plasterków do każdej wkładki.
Następnie usuń nadmiar pożywki z górnej części plasterków, aby upewnić się, że plasterki zachowują swoją morfologię w jak największym stopniu i mają minimalną śmierć komórki. Ważne jest, aby utrzymać zdrowy interfejs ciekłego powietrza, a plastry nie unosiły się w podłożu. Na koniec inkubuj plastry w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze.
Wymieniaj połowę objętości podłoża pod membraną co drugi dzień. Plastry nie powinny unosić się na nośniku, neurony wyrażające elektroporowane konstrukty można wizualizować już osiem godzin po elektroporacji po pożądanych dniach hodowli. Zamocuj plastry w membranie do analizy.
Umyj każdą organiczną typową wkładkę ciepłym PBS przez pięć minut. Wykonaj w sumie trzy płukania PBS, a następnie utrwal tkankę 4% aldehydem paraform przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po utrwaleniu tkanki można analizować za pomocą markerów komórkowych lub po prostu barwić barwnikami haczykowymi Po godzinie umyj plastry trzema 10-minutowymi praniami w jednym XPBS.
Następnie przepuszczalne plastry przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w 10% roztworze surowicy koziej w jednym XPBS z delikatnym wstrząsaniem. Następnie barwić chusteczki haczykami przez godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie potrząsając. Usuń plamę za pomocą trzech 10-minutowych prań w jednym XPBS, delikatnie potrząsając podczas oczekiwania.
Umieść szkiełka z matowego szkła w komorze wodnej, która jest wystarczająco głęboka, aby wykąpać chusteczki po umieszczeniu ich na szkiełkach. Aby zamontować plastry. Najpierw odetnij membranę skalpelem.
Po drugie, za pomocą cienkich kleszczy, przenieś do pięciu plastrów związanych błoną na każde szkiełko zanurzone w wodzie. Po trzecie, usuń nadmiar wody z każdego szkiełka. Po czwarte, nałóż kroplę roztworu do montażu na podłodze na każdy plasterek mózgu.
Na koniec delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe na plastrach i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza. Plastry są następnie gotowe do mikroskopii w zależności od ilości elektroporowanego DNA i stadium embrionalnego. Podczas elektroporacji stwierdzono, że wydajność transfekcji jest różna.
Osiem godzin po transfekcji z tłumikiem P, komórki wektorowe GFP zaczęły wyrażać GFP. Podczas dłuższego okresu hodowli komórki przechodzą normalną sekwencję zdarzeń neurogennych, w tym proliferację, migrację i wczesne różnicowanie neuronów. Wycinki te zachowywały swoją morfologię przez pięć dni, pod warunkiem, że interfejs powietrza do podłoża był dobrze utrzymany podczas próby tej procedury.
Ważne jest, aby przeprowadzić cały eksperyment od momentu eutanazji zwierzęcia do momentu umieszczenia plastrów we wkładkach membranowych w ciągu dwóch godzin, aby zminimalizować śmierć komórki po tej procedurze. Inne podobne dodawanie czynników egzogennych do lizy organotypowej można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na pytania takie jak: jaka jest rola różnych czynników wzrostu lub środków farmakologicznych w różnych mechanizmach neurorozwojowych?
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia metodę oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgowej poprzez elektroporację ex vivo. Korzystając z plazmidów, które współwyrażają inhibitory RNA i GFP, naukowcy mogą badać procesy neurorozwojowe takie jak neurogeneza i migracja neuronów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Neurorozwój
- Genetyka
Tło
- Kora mózgowa jest kluczowa dla różnych funkcji mózgu.
- Zrozumienie funkcji genów jest niezbędne dla wnikliwej znajomości neurorozwoju.
- Techniki ex vivo pozwalają na szczegółowe badanie zachowania neuronów.
- Elektroporacja jest metodą stosowaną do wprowadzania DNA do komórek.
Cel badania
- Aby szybko ocenić funkcję genów w rozwoju kory mózgowej.
- Aby zbadać neurogenezę, migrację neuronów i morfogenezę.
- Aby wykorzystać plasterki organotypowe do obserwacji zmian neuronalnych.
Stosowane metody
- Ex vivo elektroporacja plazmidów w mózgowym korze embrionalnym myszy.
- Zastosowanie krótkich impulsów elektrycznych do ułatwienia transfekcji.
- Rozcinanie i osadzanie mózgu w celu stworzenia plasterków organotypowych.
- Obserwacja komórek znakowanych GFP w celu identyfikacji defektów neuronalnych.
Główne wyniki
- Udana transfekcja komórek progenitorowych neuronów za pomocą plazmidów.
- Identyfikacja subpopulacji neuronów korowych z defektami.
- Demonstracja użyteczności technik ex vivo w badaniach neurorozwojowych.
- Wizualne potwierdzenie morfogenezy neuronów poprzez znaczenie GFP.
Wnioski
- Metoda zapewnia szybkie podejście do badania funkcji genów.
- Ex vivo elektroporacja jest skuteczna w badaniach neurorozwojowych.
- Zdobyte wglądy mogą poprawić zrozumienie rozwoju kory.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid ex vivo RNAi electroporation in embryonic murine cerebral cortex enables functional interrogation of gene candidates implicated in neuronal morphogenesis and migration. This approach provides a scalable, low-cost alternative to generating transgenic or knockout models, accelerating early discovery and target validation in neurodevelopmental research. Its mosaic analysis capability supports predictive confidence in gene function assessment, informing portfolio triage and risk-adjusted advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid functional screening of candidate genes in a near-physiological tissue context.
- Supports biological de-risking by clarifying gene roles in neuronal morphogenesis and migration.
- Facilitates predictive confidence in target selection for neurodevelopmental disorders.
- Allows mosaic analysis to distinguish cell-autonomous effects from broader tissue responses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated organotypic slice systems for downstream phenotypic screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative readouts via GFP labeling of transfected neuronal populations.
- Enables assay standardization and scalability for gene function studies.
- Supports reliable evaluation of gene knockdown effects on neuronal morphology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant neurodevelopmental mechanisms by preserving tissue architecture.
- Provides continuity from gene discovery to preclinical validation in complex tissue environments.
- Reduces reliance on whole-animal models for initial functional assessment.
- Offers mechanistic de-risking for genes of unknown cortical function.
Pipeline & Workflow Integration
This ex vivo RNAi electroporation method fits at the interface of early discovery and lead identification, bridging in vitro gene function studies and in vivo validation. It streamlines hypothesis testing and supports rapid iteration in neurodevelopmental target pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven interrogation of gene function in neuronal morphogenesis and migration.
- Screening: Provides assay-ready organotypic slices with quantitative, reproducible outputs.
- Analytics: Supports direct measurement of morphological and migratory phenotypes in GFP-labeled neurons.
- Translational Research: Maintains tissue context for alignment with disease-relevant neurodevelopmental processes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for rapid gene function assessment across multiple candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental gene function studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for gene knockdown analysis.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency by reducing reliance on transgenic models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodevelopmental targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic brain dissection and organotypic slice culture.
- Needs access to electroporation equipment and fluorescence microscopy for GFP detection.
- Demands careful standardization of DNA concentration and electroporation parameters for reproducibility.
- Adaptable to various gene constructs and embryonic stages, but tissue fragility and timing are critical.
- Limited to early postnatal developmental windows and may not capture long-term phenotypes.
