Jednoczesna rejestracja sygnałów wapniowych z zidentyfikowanych neuronów i zachowań żerowania Drosophila melanogaster

Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie aktywności neuronów za pomocą obrazowania wapnia jednocześnie z obserwacją zachowań żywieniowych. Jest to realizowane poprzez wprowadzenie muchy do aparatu dla much, a następnie przeprowadzenie dyssekcji głowy muchy w celu odsłonięcia mózgu.

Aparat z rozsekowaną muchą zostaje następnie umieszczony na stoliku mikroskopu. Ostatnim krokiem procedury jest stymulacja proboscis za pomocą knotka z cukrem. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące aktywację zidentyfikowanego neuronu poprzez obrazowanie wapniowe, skorelowane z wysunięciem proboscis zarejestrowanym na nagraniu wideo zachowania.

Pomysł na tę metodę pojawił się u mnie, gdy myślałem o oczach pływających bobrów, które znajdują się na powierzchni wody. Bobry mają podzielone pole widzenia i mogą widzieć jednocześnie nad i pod powierzchnią wody. Trudnym punktem mojego eksperymentu jest fakt, że mózg i SCUs znajdują się blisko siebie, ale jeśli zostaną one oddzielone w sposób podobny do oczu bobrów, możemy utrzymać SCUs w suchości, podczas gdy mózg pozostanie wystawiony w satelicie.

W tym celu wykonano bardzo prostą przegrodę bezpośrednio nad SCU, aby oddzielić suchą stronę od miejsca szerokiego. Platformę uformowano z pokrywki 35 milimetrowego naczynia typu falcon, topiąc ścianki boczne i wyrzeźbiвjąc je tak, aby uzyskać odpowiedni kąt i grubość. W platformie nawiercono otwór na głowę muchy, tak aby części gębowe były swobodnie wystawione na zewnątrz komory. Końcówkę tipa do pipety odcięto na szerokość wystarczającą do przyjęcia ciała muchy, a następnie przyklejono tip do platformy.

Po 24-godzinnym głodzeniu dorosłej muchy w temperaturze 25 °C, znieczul muchę, umieszczając ją za pomocą pęsety w plastikowej probówce o pojemności 15 ml stojącej na lodzie. Wprowadź muchę do komory dla much i delikatnie wsuń ją do momentu, aż nie będzie mogła się poruszać.

Uszczelnij obszary wokół proksymalnej części trąbki lub rostrum przy wewnętrznej krawędzi otworu, nakładając niewielką ilość kleju utwardzanego światłem na boki oraz nad rostrum, używając do ostrożnego rozprowadzenia kleju pęsety do rzęs lub podobnego narzędzia. Nałóż również klej od wewnątrz ciała muchy w przestrzeń między grzbietową częścią głowy a wewnętrzną krawędzią otworu. Na koniec utwardź klej, stosując najsłabsze natężenie światła niebieskiego wystarczające do polimeryzacji, aby uniknąć uszkodzenia muchy.

Aby ustabilizować głowę muchy i odsłonić brzuszna część SOG, przymocuj nitkę, która utrzyma rostrum w części uniesionym. Po umieszczeniu muchy wypełnij powierzchnię platformy roztworem soli fizjologicznej bez sacharozy. Otwórz kapsułę głowy, aby odsłonić SOG, używając ostrza wolframowego oraz pęsety z zaostrzonymi końcówkami, którą nazywamy pęsetą ostrą.

Nożyczki chirurgiczne (scis zips). Jest to demonstracja użycia nożyczek chirurgicznych, polegająca na odcięciu włókna z chusteczki Kim wipe w celu porównania. Czynność ta jest najpierw wykonywana nożyczkami irydologicznymi w polu widzenia, a następnie przed podziałką linijki milimetrowej.

W pierwszej kolejności, używając ostrza wolframowego, wykonaj nacięcie wzdłuż tylnej krawędzi. Następnie przetnij krawędzie boczne oraz przednią, używając ostrych pęset. Podnieś wycięty fragment skórki za pomocą pęsety i usuń go.

Odetnij czułki i nerwy czuciowe za pomocą pęsety. Następnie selektywnie usuń worki powietrzne między SOG a kutykulą, aby ustabilizować mózg i zapobiec artefaktom ruchowym. W kolejnym kroku przetnij przełyk na końcu w kierunku gardła oraz na końcu wchodzącym do SOG, aby usunąć połączenie między gardłem a mózgiem.

Następnie po zidentyfikowaniu i wypreparowaniu mięśnia 16, oddziel jakiekolwiek tchawki łączące mózg z kutykulą. Umieść muchy na stoliku konfokalnego mikroskopu dyskowego i przełącz się na obiektyw z imersją wodną do obrazowania. Następnie wykonaj pojedynczy przekrój optyczny z częstotliwością 4 Hz i czasem ekspozycji 122 ms, używając lasera wzbudzającego o długości fali 491 nm, skupiając się na obszarze zainteresowania.

Użyj igły strzykawki z niewielkim knotem z papieru japońskiego wystającym z końcówki, aby podać sacharozę musze. Nanieś małą kroplę roztworu sacharozy na knot, a następnie wciągnij ją za pomocą injektora połączonego z igłą przez elastyczną rurkę, używając manipulatora z joystickiem do przytrzymania igły.

Przyłożyć namoczony knot z papieru filtracyjnego do końcówki proboscidii, lecz tylko na chwilę, aby uniknąć nasycenia. Monitorować odpowiedź rozciągania PROBUS lub zachowanie PER za pomocą kamery CCD przymocowanej do mikroskopu sekcyjnego równocześnie z obrazowaniem wapnia, dbając o to, aby zebrać dane w ciągu godziny od przeprowadzenia sekcji.

Przedstawiono tutaj typową odpowiedź wydłużania proboscidis na stymulację WIC zawierającym 100 mM sacharozy. Roztwór wodny obrazowano przy użyciu lasera o długości fali 491 nm w celu detekcji fluorescencji G CaMP. Jednoczesne obrazowanie wapnia podczas zachowania odpowiedzi wydłużania proboscidis, pokazane tutaj najpierw przed, a następnie po stymulacji, umożliwia wizualizację odpowiedzi GAMP 3.0 indukowanych przez sacharozę w neuronie ruchowym mięśnia protraktora rostrum.

W analizie stanu ilościowego odpowiedzi GAMP 3.0 indukowanej sacharozą widać, że neurony ruchowe reagują na bodziec w postaci sacharozy gwałtownym wzrostem fluorescencji, po którym następuje trwająca kilka sekund faza powrotu do poziomu bazowego. Platforma ta umożliwia zastosowanie innych metod, takich jak elektrofizjologia, optogenetyka, psychogenetyka lub chemiczna aktywacja neuronów, a także obrazowanie struktur znakowanych GFP w systemie TimeLapse lab, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące korelacji między plastycznością synaptyczną a pamięcią.