Jednoczesny zapis sygnałów wapniowych ze zidentyfikowanych neuronów i zachowań żywieniowych Drosophila melanogaster
April 26th, 2012
Muszka owocowa, Drosophila melanogaster, rozciąga swoją trąbkę do żerowania, reagując na bodziec cukrowy z jej trąbki lub stępu. Połączyłem obserwacje odpowiedzi na wydłużenie trąbki (PER) z techniką obrazowania wapnia, co pozwala nam monitorować aktywność neuronów w mózgu, jednocześnie z obserwacją behawioralną.
Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie aktywności neuronalnej poprzez obrazowanie wapnia jednocześnie z obserwacją zachowań żywieniowych. Osiąga się to poprzez uprzednie włożenie muchy do aparatu muchowego. Następnie głowa muchy jest preparowana w celu odsłonięcia mózgu.
Aparat muchy z wypreparowaną muchą jest następnie umieszczany na stoliku mikroskopowym. Ostatnim etapem zabiegu jest stymulacja pro Bois za pomocą cukrowego. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują aktywację zidentyfikowanego neuronu poprzez obrazowanie wapnia skorelowaną z rozszerzeniem Probusa poprzez filmowanie zachowania.
Pierwszy raz pomysł na tę metodę zrodził się w głowie, gdy pomyślałem o oczach bijących się piw, które pływają po powierzchni wody. My, piwosze, mamy rozdwojone oczy i potrafimy widzieć zarówno nad, jak i pod powierzchnią wody. Trudną kwestią w moim eksperymencie jest to, że mózg i SCU są blisko siebie, ale jeśli są ładnie oddzielone jak oczy nas, piw, możemy utrzymać SCU w suchości, podczas gdy mózg jest odsłonięty w satelicie.
To zrobiłem bardzo prostą przegrodę tuż nad SCU, aby oddzielić suchą powierzchnię od miejsca szerokości, ukształtować platformę z pokrywy 35-milimetrowej naczynia sokoła, topiąc ścianę boczną i rzeźbiąc ją, aby uzyskać odpowiedni kąt i grubość. Wywierć otwór w platformie, aby pomieścić głowicę muchy, tak aby części ustne były swobodnie wystawione na zewnątrz komory. Przytnij koniec końcówki pipety na tyle szeroko, aby objąć ciało muchy, a następnie przyklej końcówkę do platformy.
Po głodzeniu dorosłej muchy przez 24 godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Znieczul muchę, umieszczając ją w 15-mililitrowej plastikowej tubie, stojąc na lodzie za pomocą kleszczy. Włóż muchę do komory much i delikatnie wepchnij muchę, aż nie będzie w stanie się poruszać.
Uszczelnij otaczające części proksymalnej trąby lub mównicy do wewnętrznej krawędzi otworu, nakładając niewielką ilość kleju utwardzanego światłem po bokach i nad mównicą, używając rzęsy lub podobnego narzędzia, aby ostrożnie rozprowadzić klej. Nałóż również klej od wewnętrznej strony much na przestrzeń między grzbietową częścią głowy a wewnętrzną krawędzią otworu. Na koniec utwardź klej przy najsłabszym oświetleniu niebieskiego światła, wystarczającym do utwardzenia, aby uniknąć uszkodzenia muchy.
Aby ustabilizować głowę muchy i odsłonić brzuszną część SOG, przymocuj nić, aby utrzymać częściowo uniesioną mównicę. Z muchą na miejscu wypełnij powierzchnię platformy solą fizjologiczną bez sacharozy. Otwórz kapsułę na głowę, aby odsłonić SOG za pomocą wolframowego ostrza i kleszczy z zaostrzonymi końcówkami, które nazywamy zaostrzonymi kleszczami.
Zamki błyskawiczne Scis. To jest demonstracja zamków błyskawicznych scis, wycinających włókno z chusteczki Kim dla porównania. Wykonuje się to najpierw nożyczkami do tęczówki w polu widzenia, a następnie przed linijką z podziałką o jeden milimetr.
Najpierw za pomocą wolframowego ostrza wykonaj nacięcie przez tylną krawędź. Następnie przeciąć bok i przednie krawędzie za pomocą zaostrzonych kleszczy. Podnieś odcięty kawałek skórki za pomocą kleszczyków i usuń go.
Przetnij czułki i nerwy czułkowe za pomocą kleszczy. Następnie selektywnie usuń worki powietrzne między SOG a naskórkiem, aby ustabilizować mózg i zapobiec artefaktom ruchowym. Następnie przetnij przełyk na końcu w kierunku gardła, a na końcu przechodząc do SOG, aby usunąć połączenie między gardłem a mózgiem.
Następnie, po zidentyfikowaniu i wyciągnięciu mięśnia 16, odłącz tchawicę łączącą mózg i naskórek. Umieść muchy na stoliku mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem i przełącz się na soczewkę zanurzeniową w wodzie w celu obrazowania. Następnie wykonaj pojedynczy przekrój optyczny z częstotliwością czterech Hz z czasem naświetlania 122 milisekund, używając lasera wzbudzającego o długości 491 nanometrów, skupiając się na obszarze zainteresowania.
Użyj igły strzykawkowej z małym z języka japońskiego. Czy papier wystawał z końcówki, żeby podać muchy sacharozę? Wylej niewielką kroplę roztworu sacharozy na, a następnie zassaj ją za pomocą wtryskiwacza podłączonego do igły przez elastyczną rurkę za pomocą manipulatora joysticka do przytrzymania igły.
Przyłóż nasączony mętny papierowy do końcówki sond, ale tylko na chwilę. Aby uniknąć sytości. Monitoruj odpowiedź rozszerzenia PROBUS lub zachowanie PER za pomocą kamery CCD podłączonej do mikroskopu preparacyjnego jednocześnie z obrazowaniem wapnia i upewnij się, że zbierzesz dane w ciągu jednej godziny od sekcji.
Pokazana tutaj jest typowa prob rozszerzona odpowiedź Bois na stymulację za pomocą WIC zawierającego 100 milimolową sacharozę. Roztwór wodny zobrazowany za pomocą lasera o długości fali 491 nm do fluorescencji G CAMP. Równoczesne obrazowanie wapnia podczas zachowania odpowiedzi na wydłużenie prosa, pokazane tutaj najpierw przed, a następnie po stymulacji, pozwala na wizualizację odpowiedzi GAMP 3.0 indukowanych sacharozą w neuronach ruchowych dla kątomierza mięśnia mównicy.
Kwantyfikacja stanu w gwieździe stanu odpowiedzi GAMP 3.0 indukowanej sacharozą pokazuje, że neurony ruchowe reagują na bodziec sacharozowy gwałtownym wzrostem fluorescencji, po którym następuje faza przywracania trwająca kilka sekund do linii podstawowej. Platforma pozwala na zastosowanie innych metod, takich jak elektrofizjologia, optogenetyka, psychogenetyka, aktywacja chemiczna neuronów lub obrazowanie laboratoryjne TimeLapse struktur znakowanych GFP, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak korelacja między plastycznością synaptyczną a pamięcią.
Przegląd
To badanie bada aktywność neuronalną Drosophila melanogaster podczas zachowania żerowania za pomocą technik obrazowania wapnia. Obserwując reakcję na rozciąganie trąbki (PER) na stymulacje cukrem, naukowcy mogą skorelować aktywację neuronalną z reakcjami behawioralnymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia behawioralna
- Obrazowanie wapnia
Tło
- Drosophila melanogaster jest organizmem modelowym do badania funkcji neuronalnych.
- Reakcja na rozciąganie trąbki (PER) jest dobrze udokumentowaną reakcją żerowania.
- Obrazowanie wapnia pozwala na obserwację aktywności neuronalnej w czasie rzeczywistym.
- Zrozumienie reakcji neuronalnych może dostarczyć wglądu w mechanizmy żerowania.
Cel badania
- Monitorowanie aktywności neuronalnej podczas zachowania żerowania u muszek owocowych.
- Korelację aktywacji neuronalnej z reakcją na rozciąganie trąbki.
- Rozwój metody jednoczesnej obserwacji behawioralnej i obrazowania.
Stosowane metody
- Sekcja muchy w celu ekspozycji mózgu.
- Obrazowanie wapnia za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującą szklaną płytką.
- Stymulowanie trąbki roztworem cukru.
- Nagrywanie wideo zachowania w celu analizy reakcji na rozciąganie trąbki.
Główne wyniki
- Obrazowanie wapnia ujawniło aktywację neuronalną w odpowiedzi na stymulacje cukrem.
- Zachowanie na rozciąganie trąbki zostało pomyślnie monitorowane wraz z aktywnością neuronalną.
- Wyniki wykazały gwałtowny wzrost fluorescencji w neuronach ruchowych podczas PER.
- Metoda umożliwia dalsze badania nad plastycznością synaptyczną i pamięcią.
Konkluzje
- Badanie zapewnia nowatorskie podejście do badania aktywności neuronalnej podczas zachowania żerowania.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów neuronowych leżących u podstaw reakcji żerowania.
- Metoda może być dostosowana do innych technik eksperymentalnych w neuronaukach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This methodology enables direct correlation of neuronal activity with quantifiable behavioral outputs in a genetically tractable model, supporting target validation through functional interrogation of neural circuits. By linking calcium signaling dynamics to proboscis extension response—a measurable phenotypic readout—the approach provides mechanistic de-risking for neuroactive compound screening. It establishes a disease-relevant system for studying feeding behavior regulation, offering predictive confidence in target engagement and pathway modulation early in discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by monitoring real-time neuronal activation in identified feeding center neurons during behavior.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous imaging and behavioral observation, clarifying pathway involvement in PER.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating target modulation with behavioral output, reducing mechanistic ambiguity in neurotarget selection.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems (SOG neurons) for downstream compound screening with quantifiable calcium flux readouts.
- Reproducibility: Standardizes neuronal activity measurement via GCaMP fluorescence, enabling reliable compound evaluation across experiments.
- Scalability: Platform design (FLIES) allows reuse for electrophysiology, optogenetics, or time-lapse imaging, supporting multi-modal assay integration.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models feeding behavior regulation, a conserved process relevant to metabolic disorder target identification.
- Translational Continuity: Bridges discovery (neuronal activity) to preclinical validation by linking synaptic plasticity and memory processes to behavioral output.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by demonstrating target-behavior coupling, reducing late-stage biological risk in CNS programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven interrogation of neuronal networks, with outputs informing lead identification through functional target-behavior correlation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing sucrose-induced calcium responses in motor neurons during PER.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative, real-time neuronal activity measurements compatible with compound library screening.
- Analytics: Generates fluorescence-based readouts and behavioral video data enabling correlation analysis between neural activation and PER magnitude.
- Translational Research: Connects to preclinical work by probing synaptic plasticity and memory mechanisms underlying sustained behavioral responses.
- Enterprise Reuse: FLIES platform serves as a reusable capability for live brain imaging across neuropharmacology, genetics, and circuit mapping initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through direct observation of neuronal-behavioral coupling in a genetically accessible system.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via immobilized fly preparation and controlled stimulus delivery, minimizing variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by reducing mechanistic uncertainty in neurotarget engagement and pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets demonstrating strong correlation between neuronal activity and feeding behavior phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, microsurgery, and calcium imaging techniques for SOG targeting.
- Dependent on spinning disc confocal microscopy with water immersion lens and GCaMP-compatible excitation (491 nm).
- Necessitates cross-team standardization for stimulus delivery (sucrose wick) and behavioral scoring (PER videotaping) to ensure data consistency.
- Adaptation considerations include modifying the FLIES platform for different neuronal targets or behavioral assays beyond proboscis extension.
- Practical limitations include dissection time constraints (data collection within one hour) and potential movement artifacts despite stabilization efforts.
