Name: Jednoczesny zapis sygnałów wapniowych ze zidentyfikowanych neuronów i zachowań żywieniowych Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnego obrazowania wapniowego aktywności neuronów i zachowań żywieniowych u Drosophila melanogaster. Technika ta pozwala korelować aktywację neuronów z reakcją wysunięcia trąbki na bodźce cukrowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękuję L. Watanabe, M. Gorczycy oraz pozostałym członkom laboratorium Yoshihary za pomocne uwagi i dyskusje. Dziękuję K. Scott i L. Looger za udostępnienie szczepów much, S. Yokoyamie za przeprowadzenie eksperymentów, Shinyę Iguchi za pomoc techniczną oraz Nobuko Yoshiharę za informacje o materiałach. Praca ta była wspierana przez granty National Institute of Mental Health MH85958 oraz przez Worcester Foundation dla M.Y.

1. Konstrukcja FLIES
<ol>
	<li>Uformuj platformę z pokrywki szalki Falcon 35 mm, topiąc ściankę boczną i wycinając ją tak, aby uzyskać odpowiedni kąt i grubość (Rysunek 1a; Rysunek 2). Wywierć w platformie otwór na głowę muchy (Rysunek 1a,b), w taki sposób, aby części gębowe były swobodnie wystawione na zewnątrz komory (Rysunek 1a). Odetnij koniec końcówki Pipetman, dobierając rozmiar odpowiednio do obserwowanej muchy. Przyklej końcówkę do platformy, jak pokazano na Rysunku 1a, aby ukończyć urządzenie FLIES (Rysunek 2).</li>
</ol>
2. Przygotowanie muchy do obserwacji
<ol>
	<li>Jeśli wymagane jest głodzenie, należy głodzić dorosłą muchę przez 24 godziny w temperaturze 25 °C przed eksperymentem, umieszczając ją w fiolce zawierającej jedynie wilgotny ręcznik papierowy.</li>
	<li>Należy znieczulić muchę, umieszczając ją w plastikowej probówce o pojemności 15ml stojącej na lodzie.</li>
	<li>Za pomocą pincety należy wsunąć muchę do komory urządzenia FLIES i delikatnie ją docisnąć, aż przestanie się poruszać. Następnie należy włożyć korek, aby utrzymać muchę na miejscu (Rysunek 1a,b).</li>
	<li>Należy uszczelnić części proksymalne trąbki (rostrum) przylegające do wewnętrznej krawędzi otworu; od zewnątrz należy nanieść niewielką ilość utwardzanego światłem kleju (Tetric EvoFlow) na boki oraz powyżej rostrum (strzałki na Rysunku 3). Klej należy nanieść również od wewnątrz urządzenia FLIES w przestrzeni między grzbietową częścią głowy a wewnętrzną krawędzią otworu (Rysunek 1b). Aby umożliwić swobodne poruszanie się rostrum, należy zachować ostrożność, aby klej nie dotknął rostrum, używając do jego rozprowadzenia rzęsy (lub czegoś podobnego). Na koniec należy utwardzić klej, stosując najsłabsze naświetlanie światłem niebieskim wystarczające do polimeryzacji, aby uniknąć uszkodzenia muchy w wyniku nadmiernego nagrzania. Następnie należy usunąć korek.</li>
	<li>W celu stabilizacji głowy muchy można zastosować nitkę do utrzymania rostrum w częściowo uniesionej pozycji (strzałka na Rysunku 3), co zapobiega uderzaniu części gardzielowej o SOG i odsłania brzuszną część SOG, szczególnie podczas obrazowania terminali presynaptycznych neuronów Gr5a8, które są przykryte częścią gardzieli przy całkowicie wciągniętej trąbce.</li>
	<li>Powierzchnię platformy należy wypełnić bezzcukrowym roztworem soli zawierającym (w mM): NaCl 140; KCl 2; MgCl2 4,5; CaCl2 1,5 oraz HEPES-NaOH 5 o pH 7,110. Ten roztwór soli pozbawiony sacharozy ma toniczność zbliżoną do powszechnie stosowanych roztworów zawierających sacharozę, takich jak HL3.111.</li>
	<li>Torebkę głowy należy otworzyć za pomocą ostrza wolframowego i pincety z zaostrzonymi końcówkami działającymi jak nożyczki, która jest urządzeniem wykonanym na zamówienie, pierwotnie zaprojektowanym przez dr. Kageyukiego Yamaokę z Japonii, służącym do odcinania kutykuli i tchawki w celu odsłonięcia SOG (Rysunek 4). Brzuszna krawędź kutykuli głowy powinna zostać wycięta jak najdalej brzusznie, podczas gdy cięcie krawędzi grzbietowej nie było tak krytyczne. Najpierw należy wykonać nacięcie przez krawędź tylną za pomocą ostrza wolframowego. Następnie należy przeciąć krawędzie boczne i przednie za pomocą zaostrzonej pincety. Wycięty fragment kutykuli należy unieść pincetą i usunąć. Czułki oraz nerwy czułkowe należy wyciąć zaostrzoną pincetą.</li>
	<li>Aby uniknąć artefaktów ruchowych podczas pomiarów, mózg musi zostać ustabilizowany poprzez usunięcie niektórych części muchy. Najpierw należy selektywnie usunąć worki powietrzne między SOG a kutykulą. Należy przeciąć przełyk na końcu w stronę gardzieli oraz na końcu wchodzącym do SOG, aby usunąć połączenie między gardzielą a mózgiem. Następnie należy wyciągnąć mięsień 1612, a na koniec oddzielić wszystkie tchawki łączące mózg z kutykulą.</li>
	<li>Urządzenie FLIES ustawiamy na stoliku mikroskopu Olympus BX51WI połączonego z konfokalnym systemem mikroskopowym z dyskiem obrotowym (Improvision w PerkinElmer) (Rysunek 5). Obiektyw imersyjny w wodzie, np. 40X/0.8 N.A, zanurza się w kąpieli (Rysunek 6).</li>
</ol>
3. Obrazowanie Ca2+ w mózgu
<ol>
	<li>Obrazowanie Ca2+ z wykorzystaniem GCaMP3.01, 9 przeprowadzono metodą opracowaną przez Marella et al.8 (Rysunek 6). Używając konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym (Improvision), wykonano pojedynczy przekrój optyczny z częstotliwością 4Hz i czasem ekspozycji 122ms przy użyciu lasera wzbudzającego o długości fali 491nm, skupiając się na obszarze zainteresowania (ciele neuronu ruchowego, neuronie pośredniczącym lub zakończeniach presynaptycznych neuronów sensorycznych smaku) za pomocą oprogramowania Velocity, wersja 4.3 (Improvision).</li>
</ol>
4. Stymulacja trąbki
<ol>
	<li>Naciągnij 100mM wodny roztwór sacharozy do igły hipodermicznej z małym knotem (wykonanym z japońskiego papieru Washi, patrz Tabela specyficznych odczynników) wystającym z końcówki (Rycina 7).</li>
	<li>Wypuść małą kroplę roztworu sacharozy na knot, a następnie ją wciągnij, bezpośrednio przed przyłożeniem nasączonego knotu z papieru Washi do końcówki trąbki. Knot z papieru Washi należy przyłożyć tylko na chwilę, aby uniknąć nasycenia (Rycina 8). Monitoruj zachowanie odruchu wysuwania trąbki (Proboscis Extension Response, PER) za pomocą kamery CCD przymocowanej do mikroskopu sekcyjnego (Rycina 5) równocześnie z obrazowaniem Ca2+. Dane należy zebrać w ciągu jednej godziny od rozpoczęcia sekcji, ponieważ w tych warunkach odruch PER nie utrzymuje się dłużej niż godzinę.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Zgłoszono, że motoneurony mięśni protraktorów rostrum – pary głównych mięśni odpowiedzialnych za unoszenie rostrum w celu wysunięcia trąbki – wykazują silne reakcje na bodźce słodkie13. Rysunek 9 przedstawia sygnały Ca2+ za pośrednictwem GCaMP3.01, 9 wyrażanego przez sterownik Gal 4, E4913, w ciele komórkowym motoneuronu. Jak pokazano na wideo, zaobserwowano silną PER synchronicznie ze wzrostem sygnału Ca2+.
<img alt="Schemat układu do sekcji muchy, widok z boku i z góry, kąty komory, usuwanie kutykuli, metoda eksperymentalna." src="/files/ftp_upload/3625/3625fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat platformy do obrazowania na żywo i elektrofizjologii mózgu muchy (FLIES). a, Platforma FLIES jest skonstruowana w taki sposób, aby kąt ścianki umożliwiał proste wysunięcie głowy muchy. Trzy segmenty trąbki muchy są oznaczone kolorami; rostrum jest magenta. Mucha jest wprowadzana do komory za pomocą pęsety, a odcięty fragment końcówki Pipetmana jest wkładany do tylnej części komory, aby zapobiec ucieczce muchy. b, Otwór jest wywiercony tak, aby dopasować go do głowy muchy. Pozostałe szczeliny są uszczelniane utwardzanym światłem klejem, zgodnie z oznaczeniem, aby zapewnić brak przecieków. Po utwardzeniu kleju fragment końcówki Pipetmana służący jako korek zostaje usunięty. Do układu FLIES wlewa się sól fizjologiczną w taki sposób, aby powierzchnia mózgu była całkowicie pokryta. Należy upewnić się, że sól fizjologiczna nie wycieka na przedni koniec głowy muchy. Zacieniowany obszar otoczony przerywaną linią na panelu b pokazuje część przeznaczoną do wycięcia podczas sekcji.
<img alt="Ustawienie komory dla much z klejową ścianką, eksperyment obserwacji behawioralnej, badania entomologiczne." src="/files/ftp_upload/3625/3625fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Fotografia MUCH. Ścianka z kleju (z pistoletu do kleju) w kształcie półksiężyca służy do kontrolowania przepływu roztworu soli fizjologicznej podczas perfuzji oraz do zmniejszenia ilości zużytego roztworu.
<img alt="Mocowanie głowy owada, użycie kleju, obraz mikroskopowy, badania entomologiczne, montaż preparatu." src="/files/ftp_upload/3625/3625fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Widok z przodu muchy zamontowanej w FLIES. Na tym obrazie przedstawiono sposób osadzenia muchy w urządzeniu FLIES oraz sposób aplikacji utwardzanego światłem kleju wokół głowy muchy (strzałki) w celu utworzenia szczelnej bariery odpornej na sól fizjologiczną. Jeśli jakakolwiek sól fizjologiczna przedostanie się do trąbki muchy, eksperyment zakończy się niepowodzeniem. Nitka (groty strzałek) przymocowana do stolika służy do utrzymania trąbki w odpowiedniej pozycji, aby nie została ona całkowicie wciągnięta. W przeciwnym razie blokowałaby ona bardziej brzuszna część SOG i powodowała artefakty ruchowe.
<img alt="Schemat anatomii głowy Drosophila; zaznaczony płat antenny, przełyk, SOG; do celów edukacyjnych." src="/files/ftp_upload/3625/3625fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Widok z góry na muchy z przeprowadzonym rozcięciem. Na obrazie przedstawiono odsłonięty SOG muchy po usunięciu kutykuli. Przełyk, mięsień 16 i tchawki połączone z mózgiem, a także wybrane pęcherzyki powietrzne zostały również usunięte, aby zapobiec przeszkadzaniu w badaniu mózgu, co mogłoby prowadzić do powstania artefaktów w sygnałach wapniowych.
<img alt="Układ mikroskopii konfokalnej ze stereomikroskopem i kamerą CCD do analizy PER i okazów much." src="/files/ftp_upload/3625/3625fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Aparatura monitorująca. Aparatura ta składa się z mikroskopu Olympus BX51WI połączonego z systemem konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym (Improvision) oraz zamontowanego z boku mikroskopu Nikon SMZ800. Taki układ umożliwia obrazowanie na żywo aktywności mózgu podczas zachowań PER.
<img alt="Układ mikroskopowy z obiektywem imersyjnym w wodzie 40X do badania komory z muchą w roztworze soli fizjologicznej." src="/files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Zdjęcia przedstawiające widok z boku FLIES. Cienka warstwa roztworu soli fizjologicznej znajduje się pomiędzy obiektywem imersyjnym w wodzie 40X a muchą.
<img alt="Schemat samoskładającego się paska polimerowego i obrazy mikroskopowe; stan suchy vs mokry, transformacja strukturalna." src="/files/ftp_upload/3625/3625fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Schemat wykonania knota z papieru Washi. Papier Gampi-Washi to tradycyjny japoński pergamin, który jest niezwykle cienki i gładki (Haibara, Japonia). Jest on również bardzo wytrzymały i może zatrzymać dużą ilość cieczy. Papier Washi należy wyciąć w kształt trapezu o bardzo konkretnych wymiarach: szerokości 0,3 mm i 0,7 mm oraz długości 4-5 mm (a). Trapez ten jest następnie wsuwany stroną 0,7 mm do końcówki igły hipodermicznej 23 G i może zostać ustabilizowany poprzez włożenie szpilki entomologicznej, zgiętej w kształt litery V (b). c, Papier Washi staje się przezroczysty po wystawieniu na działanie cieczy, co czyni go idealnym do tego eksperymentu.
<img alt="Układ mikroskopowy do analizy wzbudzenia i emisji optycznej w badaniach fotonicznych." src="/files/ftp_upload/3625/3625fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Stymulacja trąbki much na systemie FLIES za pomocą knotka z papieru Washi. Knotek z papieru Washi umieszczony na końcówce igły hipodermicznej jest przykładany na krótką chwilę przy użyciu manipulatora typu Joystick obsługiwanego jedną ręką. Igła jest połączona za pomocą elastycznej rurki z injektorem obsługiwanym drugą ręką, służącym do zasysania i podawania roztworu sacharozy.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna odpowiedzi komórkowej; panele pokazują stan przed/po stymulacji oraz wyniki na wykresie." src="/files/ftp_upload/3625/3625fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9. Reprezentatywne wyniki. a, zachowanie PER zarejestrowane za pomocą kamery CCD zainstalowanej na stereomikroskopie. Widoki frontalne głodnej muchy z wysuniętą proboscis (strzałki) przed stymulacją, w trakcie stymulacji oraz po stymulacji knotem zawierającym 100 mM wodny roztwór sacharozy (grot strzałki). Oświetlenie zapewnia laser 491 nm używany do fluorescencji GCaMP. b, odpowiedź GCaMP 3.0 indukowana sacharozą w neuronie ruchowym mięśnia protraktora rostrum w stanie głodu. Górny panel: przed stymulacją; dolny panel: bezpośrednio po stymulacji. Pasek skali: 10 μm. c, kwantyfikacja odpowiedzi GCaMP 3.0 indukowanej sacharozą. Neuron ruchowy reaguje na bodziec w postaci sacharozy gwałtownym wzrostem fluorescencji, po którym następuje trwająca kilka sekund faza powrotu do poziomu bazowego.

<ol><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li>
<li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121, 141-152 (2005).</li>
<li>Schroll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li>
<li>Hamada, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li>
<li>Peabody, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+decision+network+for+wing+expansion+in+Drosophila+using+targeted+expression+of+the+TRPM8+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the decision network for wing expansion in Drosophila using targeted expression of the TRPM8 channel.</a> J. Neurosci. 29, 3343-3353 (2009).</li>
<li>Dethier, V. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDethier%2C+VG+%22Hungry+Fly%22">Hungry Fly</a>. , Harvard University Press. (1976).</li>
<li>Shiraiwa, T., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proboscis+Extension+Response+%28PER%29+Assay+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (3), e193-e193 (2007).</li>
<li>Marella, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+taste+responses+in+the+fly+brain+reveals+a+functional+map+of+taste+category%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category.</a> 49, 285-295 (2006).</li>
<li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
<li>Yoshihara, M., Suzuki, K., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+independent+pathways+mediated+by+cAMP+and+protein+kinase+A+enhance+spontaneous+transmitter+release+at+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two independent pathways mediated by cAMP and protein kinase A enhance spontaneous transmitter release at Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 20, 8315-8322 (2000).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J. Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li>
<li>Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+A+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. M, D. emerecm , John Wiley & Sons. 420-534 (1950).</li>
<li>Gordon, M. D., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+control+in+a+Drosophila+taste+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Motor control in a Drosophila taste circuit.</a> Neuron. 61, 373-384 (2009).</li>
<li>Yoshihara, M., Adolfsen, B., Galle, K. T., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+signaling+by+Syt+4+induces+presynaptic+release+and+synapse-specific+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retrograde signaling by Syt 4 induces presynaptic release and synapse-specific growth.</a> Science. 310, 858-863 (2005).</li>
</ol>

Nie mam nic do ujawnienia.

Układ FLIES umożliwia jednoczesną rejestrację sygnałów Ca2+ oraz zachowania PER. Nawet przy mózgu eksponowanym na sól fizjologiczną obserwowano prawidłowe zachowanie PER. Zastosowanie knota z papieru Gampi-Washi zamiast knota z chusteczki Kimwipe, stosowanego w oryginalnej metodzie kapilarnej7, ułatwia uzyskanie wysoce powtarzalnego i stabilnego zachowania PER oraz eliminuje konieczność nabywania wprawy w tworzeniu i wyborze odpowiedniego knota z Kimwipe. Powyższe wskazówki eksperymentalne pozwoliły nam skutecznie uniknąć zakłóceń spowodowanych ruchami trąbki, co doprowadziło do bardzo stabilnej rejestracji sygnałów Ca2+ przy niskim poziomie szumów. Sporadycznie usuwanie tkanek było niewystarczające, aby odpowiednio odsłonić komórki lub stłumić ruchy, co prowadziło do słabych wyników. Jednak po nabyciu odpowiednich umiejętności, ponad 80 % preparatów dawało dobre wyniki. Metodologia ta nie służy wyłącznie do obrazowania Ca2+, ale może zostać dostosowana do każdego rodzaju obrazowania żywych komórek przy jednoczesnej obserwacji zachowania PER. Na przykład, możemy uzyskać dostęp do dowolnej komórki za pomocą elektrody w celu bezpośredniej rejestracji aktywności. W połączeniu z mikroskopią dwufotonową jesteśmy w stanie przeprowadzić obrazowanie poklatkowe struktury synaptycznej, którą można powiązać ze zmianami behawioralnymi. Zatem ta metoda obrazowania mózgu z obserwacją behawioralną jest cenna nie tylko dla funkcjonalnej analizy sieci neuronalnej, ale może służyć jako potężne narzędzie do korelacji plastyczności synaptycznej14 z mechanizmami leżącymi u podstaw pamięci.

<table><tbody><tr><td>Tetric EvoFlow</td><td>Ivoclar vivadent</td><td>M04115</td><td>Klej utwardzany światłem</td></tr><tr><td>Mikroskop BX51WI</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX51WI</td><td>Z obiektywem imersyjnym wodnym 40X (N.A. 0.8)</td></tr><tr><td>System konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td></td><td>Z laserem 491 nm</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ-800</td><td>Zamocowany do wysięgnika. Widok stereo dostępny podczas nagrywania wideo</td></tr><tr><td>Papier Gampi-Washi</td><td>Haibara, Japonia</td><td></td><td>Specjalny rodzaj tradycyjnego papieru japońskiego</td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Imaging Source</td><td>DFK41AU02</td><td>1/2&quot; 1080 &amp;#215; 960 pikseli SONY CCD</td></tr><tr><td>Manipulator z joystickiem</td><td>Narishige International</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Iniektor</td><td>Narishige International</td><td>IM-5B</td><td></td></tr></tbody></table>

jednoczesna rejestracja sygnałów wapniowych z zidentyfikowanych neuronów i zachowań żerowania drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Aby badać sieci neuronalne pod kątem ich funkcji w zachowaniu, musimy przeanalizować sposób działania neuronów podczas generowania każdego wzorca behawioralnego. Zatem jednoczesne rejestrowanie aktywności neuronalnej i zachowania jest niezbędne do skorelowania aktywności mózgu z zachowaniem. Do takich analiz behawioralnych muszka owocówka, Drosophila melanogaster, pozwala nam na wprowadzenie genetycznie kodowanych wskaźników wapnia, takich jak GCaMP1, w celu monitorowania aktywności neuronalnej, oraz na zastosowanie zaawansowanych manipulacji genetycznych w technikach optogenetycznych lub termogenetycznych, aby specyficznie aktywować zidentyfikowane neurony2-5. Zastosowanie techniki termogenetycznej pozwoliło nam zidentyfikować kluczowe neurony odpowiedzialne za zachowanie żerowania (Flood et al., w trakcie recenzji). Jako główny element zachowania żerowania, dorosła mucha Drosophila wysuwa trąbkę w celu pobrania pokarmu6 (reakcja wysuwania trąbki; PER), reagując na słodki bodziec z komórek sensorycznych znajdujących się na trąbce lub tarsach. Łącząc protokół dla PER7 z techniką obrazowania wapnia8 przy użyciu GCaMP3.01, 9, opracowałem system eksperymentalny, w którym możemy monitorować aktywność neuronów w centrum żerowania – zwoju pod przełykowym (SOG), jednocześnie prowadząc obserwację behawioralną trąbki. Zaprojektowałem urządzenie („Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage”: „FLIES”), które mieści dorosłą muchę Drosophila, umożliwiając swobodny ruch trąbki podczas gdy mózg jest wystawiony na kąpiel do obrazowania Ca2+ za pomocą obiektywu imersyjnego. System FLIES nadaje się również do wielu rodzajów eksperymentów na żywych mózgach much, takich jak rejestracja elektrofizjologiczna czy obrazowanie morfologii synaptycznej w trybie time-lapse. Ponieważ wyniki z obrazowania na żywo mogą być bezpośrednio skorelowane z jednoczesnym zachowaniem PER, metodologia ta może stanowić doskonały system eksperymentalny do badania przetwarzania informacji w sieciach neuronalnych oraz tego, jak ta aktywność komórkowa jest powiązana z procesami plastyczności i pamięcią.

Muszka owocówka, Drosophila melanogaster, wysuwa swój trąbek w celu żerowania w odpowiedzi na bodziec cukrowy działający na trąbek lub tarsus. Połączyłem obserwacje reakcji wysuwania trąbka (PER) z techniką obrazowania wapnia, co pozwala nam monitorować aktywność neuronów w mózgu równocześnie z obserwacją behawioralną.

Jednoczesna rejestracja sygnałów wapniowych z zidentyfikowanych neuronów i zachowań żerowania Drosophila melanogaster

Aby zbadać sieci neuronalne pod kątem ich funkcji w zachowaniu, musimy przeanalizować, w jaki sposób neurony funkcjonują podczas generowania każdego wzorca behawioralnego. Zatem...

Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie aktywności neuronów za pomocą obrazowania wapnia jednocześnie z obserwacją zachowań żywieniowych. Jest to realizowane poprzez wprowadzenie muchy do aparatu dla much, a następnie przeprowadzenie dyssekcji głowy muchy w celu odsłonięcia mózgu.Aparat z rozsekowaną muchą zostaje następnie umieszczony na stoliku mikroskopu. Ostatnim krokiem procedury jest stymulacja proboscis za pomocą knotka z cukrem. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące aktywację zidentyfikowanego neuronu poprzez obrazowanie wapniowe, skorelowane z wysunięciem proboscis zarejestrowanym na nagraniu wideo zachowania.Pomysł na tę metodę pojawił się u mnie, gdy myślałem o oczach pływających bobrów, które znajdują się na powierzchni wody. Bobry mają podzielone pole widzenia i mogą widzieć jednocześnie nad i pod powierzchnią wody. Trudnym punktem mojego eksperymentu jest fakt, że mózg i SCUs znajdują się blisko siebie, ale jeśli zostaną one oddzielone w sposób podobny do oczu bobrów, możemy utrzymać SCUs w suchości, podczas gdy mózg pozostanie wystawiony w satelicie.W tym celu wykonano bardzo prostą przegrodę bezpośrednio nad SCU, aby oddzielić suchą stronę od miejsca szerokiego. Platformę uformowano z pokrywki 35 milimetrowego naczynia typu falcon, topiąc ścianki boczne i wyrzeźbiвjąc je tak, aby uzyskać odpowiedni kąt i grubość. W platformie nawiercono otwór na głowę muchy, tak aby części gębowe były swobodnie wystawione na zewnątrz komory. Końcówkę tipa do pipety odcięto na szerokość wystarczającą do przyjęcia ciała muchy, a następnie przyklejono tip do platformy.Po 24-godzinnym głodzeniu dorosłej muchy w temperaturze 25 °C, znieczul muchę, umieszczając ją za pomocą pęsety w plastikowej probówce o pojemności 15 ml stojącej na lodzie. Wprowadź muchę do komory dla much i delikatnie wsuń ją do momentu, aż nie będzie mogła się poruszać.Uszczelnij obszary wokół proksymalnej części trąbki lub rostrum przy wewnętrznej krawędzi otworu, nakładając niewielką ilość kleju utwardzanego światłem na boki oraz nad rostrum, używając do ostrożnego rozprowadzenia kleju pęsety do rzęs lub podobnego narzędzia. Nałóż również klej od wewnątrz ciała muchy w przestrzeń między grzbietową częścią głowy a wewnętrzną krawędzią otworu. Na koniec utwardź klej, stosując najsłabsze natężenie światła niebieskiego wystarczające do polimeryzacji, aby uniknąć uszkodzenia muchy.Aby ustabilizować głowę muchy i odsłonić brzuszna część SOG, przymocuj nitkę, która utrzyma rostrum w części uniesionym. Po umieszczeniu muchy wypełnij powierzchnię platformy roztworem soli fizjologicznej bez sacharozy. Otwórz kapsułę głowy, aby odsłonić SOG, używając ostrza wolframowego oraz pęsety z zaostrzonymi końcówkami, którą nazywamy pęsetą ostrą.Nożyczki chirurgiczne (scis zips). Jest to demonstracja użycia nożyczek chirurgicznych, polegająca na odcięciu włókna z chusteczki Kim wipe w celu porównania. Czynność ta jest najpierw wykonywana nożyczkami irydologicznymi w polu widzenia, a następnie przed podziałką linijki milimetrowej.W pierwszej kolejności, używając ostrza wolframowego, wykonaj nacięcie wzdłuż tylnej krawędzi. Następnie przetnij krawędzie boczne oraz przednią, używając ostrych pęset. Podnieś wycięty fragment skórki za pomocą pęsety i usuń go.Odetnij czułki i nerwy czuciowe za pomocą pęsety. Następnie selektywnie usuń worki powietrzne między SOG a kutykulą, aby ustabilizować mózg i zapobiec artefaktom ruchowym. W kolejnym kroku przetnij przełyk na końcu w kierunku gardła oraz na końcu wchodzącym do SOG, aby usunąć połączenie między gardłem a mózgiem.Następnie po zidentyfikowaniu i wypreparowaniu mięśnia 16, oddziel jakiekolwiek tchawki łączące mózg z kutykulą. Umieść muchy na stoliku konfokalnego mikroskopu dyskowego i przełącz się na obiektyw z imersją wodną do obrazowania. Następnie wykonaj pojedynczy przekrój optyczny z częstotliwością 4 Hz i czasem ekspozycji 122 ms, używając lasera wzbudzającego o długości fali 491 nm, skupiając się na obszarze zainteresowania.Użyj igły strzykawki z niewielkim knotem z papieru japońskiego wystającym z końcówki, aby podać sacharozę musze. Nanieś małą kroplę roztworu sacharozy na knot, a następnie wciągnij ją za pomocą injektora połączonego z igłą przez elastyczną rurkę, używając manipulatora z joystickiem do przytrzymania igły.Przyłożyć namoczony knot z papieru filtracyjnego do końcówki proboscidii, lecz tylko na chwilę, aby uniknąć nasycenia. Monitorować odpowiedź rozciągania PROBUS lub zachowanie PER za pomocą kamery CCD przymocowanej do mikroskopu sekcyjnego równocześnie z obrazowaniem wapnia, dbając o to, aby zebrać dane w ciągu godziny od przeprowadzenia sekcji.Przedstawiono tutaj typową odpowiedź wydłużania proboscidis na stymulację WIC zawierającym 100 mM sacharozy. Roztwór wodny obrazowano przy użyciu lasera o długości fali 491 nm w celu detekcji fluorescencji G CaMP. Jednoczesne obrazowanie wapnia podczas zachowania odpowiedzi wydłużania proboscidis, pokazane tutaj najpierw przed, a następnie po stymulacji, umożliwia wizualizację odpowiedzi GAMP 3.0 indukowanych przez sacharozę w neuronie ruchowym mięśnia protraktora rostrum.W analizie stanu ilościowego odpowiedzi GAMP 3.0 indukowanej sacharozą widać, że neurony ruchowe reagują na bodziec w postaci sacharozy gwałtownym wzrostem fluorescencji, po którym następuje trwająca kilka sekund faza powrotu do poziomu bazowego. Platforma ta umożliwia zastosowanie innych metod, takich jak elektrofizjologia, optogenetyka, psychogenetyka lub chemiczna aktywacja neuronów, a także obrazowanie struktur znakowanych GFP w systemie TimeLapse lab, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące korelacji między plastycznością synaptyczną a pamięcią.

simultaneous-recording-calcium-signals-from-identified-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Jednoczesne rejestrowanie sygnałów wapniowych z zidentyfikowanych neuronów i zachowania żerujących Drosophila melanogaster

Opisujemy uznaną technikę pomiaru i analizy odpowiedzi wapniowych wywołanych zapachami w płacie antennym żywych Drosophila melanogaster.

Obrazowanie wapniowe odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennym Drosophila

Ten film opisuje obrazowanie in vivo wapnia w neuronach Drosophila za pomocą GCaMP. Prezentowany klip protokołu pokazuje, jak rejestrować zmiany we fluorescencji GCaMP z neuronów ciała grzyba podczas eksperymentu kondycjonowania węchowego.

Drosophila In Vivo (Drosophila) in vivo (Drosophila) Obrazowanie wapnia: metoda funkcjonalnego obrazowania aktywności neuronalnej

Ten film przedstawia koncepcje związane z obrazowaniem wapnia i zawiera przykładowy protokół obrazowania poklatkowego robaków znajdujących się w formowanych studzienkach agarozowych.

Obrazowanie wapnia: metoda wizualizacji aktywności neuronalnej u żywych C. elegans

Ten film demonstruje technikę obrazowania wapnia w pojedynczych neuronach zachowujących się Caenorhabditis elegans za pomocą genetycznie kodowanych fluorescencyjnych białek reporterowych. Przedstawiono w nim etapy związane z obrazowaniem ruchu robaków i pomiarem współczynników fluorescencji reporterowej z neuronów w celu skorelowania wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia z aktywnością neuronów i zmianami behawioralnymi podczas składania jaj.

Obrazowanie wapnia w poszczególnych neuronach regulujących składanie jaj u Caenorhabditis elegans

Ten film demonstruje metodę obrazowania wapnia in vivo za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u muszek. Przedstawia etapy przygotowania muszek do mikroskopii, przeprowadzania kondycjonowania węchowego i wizualizacji napływu wapnia wywołanego zapachem.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u Drosophila melanogaster

Źródło: Ishimoto, H. et. al.,, Obrazowanie wapnia ex vivo do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila. J. Vis. exp. (2018) Ten film przedstawia obrazowanie wapnia do badaniaDrosophila reakcje mózgu na neuropeptydy. Neurony wyrażające fluorescencyjny wskaźnik wapnia ujawniają wewnątrzkomórkową dynamikę wapnia i funkcjonalne odpowiedzi na cząsteczki sygnałowe.

Obrazowanie wapnia ex vivo w celu zbadania reakcji mózgu Drosophila na neuropeptydy

U pszczół miodnych ustalono jednoczesne zewnątrzkomórkowe długoterminowe zapisy z dwóch różnych neuropile mózgowych lub dwóch różnych dróg anatomicznych. Nagrania te pozwalają na badanie czasowych aspektów przetwarzania neuronalnego w różnych obszarach mózgu zarówno na poziomie pojedynczego neuronu, jak i na poziomie zespołu u zachowującego się zwierzęcia.

Jednoczesne długoterminowe zapisy na dwóch etapach przetwarzania neuronalnego u zachowujących się pszczół miodnych

Przednie nogi i trąbka Drosophila zawierają bogaty repertuar smakowych neuronów czuciowych. W tym artykule przedstawiono metodę wykorzystującą obrazowanie wapnia do pomiaru fizjologicznych odpowiedzi neuronów czuciowych w przedniej nodze i trąbce żywych much po egzogennym zastosowaniu feromonu smakowego.

Pomiar fizjologicznych reakcji neuronów czuciowych Drosophila na feromony lipidowe za pomocą obrazowania wapnia na żywo

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów Ca2+ do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej u zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans.

Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania ex vivo wapnia u dorosłych Drosophila wykazujących ekspresję GCaMP6 w celu monitorowania aktywności epileptiformalnej. Protokół stanowi cenne narzędzie do badania zdarzeń moczowych u dorosłych Drosophila poprzez obrazowanie wapnia ex vivo, co pozwala na zbadanie potencjalnych mechanizmów padaczki na poziomie komórkowym.

Ex vivo Obrazowanie wapnia w modelu padaczki Drosophila

Poznaj metodę jednoczesnego obrazowania wapniowego aktywności neuronów i zachowań żywieniowych u Drosophila melanogaster. Technika ta pozwala korelować aktywację neuronów z reakcją wysunięcia trąbki na bodźce cukrowe.

Jednoczesna rejestracja sygnałów wapniowych z zidentyfikowanych neuronów i zachowań żerowania Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów