Name: Metody in vitro Montaż półsztucznej maszyny molekularnej i jej wykorzystanie do wykrywania uszkodzeń DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj montaż półsztucznej maszyny molekularnej do wykrywania uszkodzeń DNA w tkankach. Ta metoda wykorzystuje topoisomerazę i fluorescencyjne znakowanie do wizualizacji dwóch typów złamań DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były wspierane przez grant R01NS062842 z National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health (V.V.D.) oraz przez granty R21 NS064403 z National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health za pośrednictwem ARRA (V.V.D.) oraz R21 EB006301 z National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health (V.V.D.).

Sekcje do detekcji opartej na maszynach molekularnych należy przygotować w pierwszej kolejności, ponieważ ich przygotowanie zajmuje więcej czasu niż montaż urządzenia molekularnego. Układ ten działa prawidłowo przy użyciu skrawków o grubości 5-6μm, wyciętych z bloków tkankowych utrwalonych w paraformaldehydzie i zatopionych w parafinie. Należy stosować marki szkiełek, które dobrze utrzymują skrawki, takie jak szkiełka ProbeOn Plus charged and precleaned (Fisher Scientific) lub podobne. Na początku zalecamy użycie tkanki o znanym wzorcu uszkodzeń DNA, zawierającej pęknięcia typu DNase I oraz DNase II, np. apoptotycznego grasicy szczura traktowanej deksametazonem 13,14.
1. Przygotowanie skrawków
<ol>
	<li>Umieścić skrawki w statywie do szkiełek i odparafynizować w ksylenie przez 15 min, a następnie przenieść do świeżej kąpieli z ksylenem na kolejne 5 minut.</li>
	<li>Rehydratyzować, przepuszczając przez szereg stężeń etanolu: 96% Ethanol - 2x5 min; 80% Ethanol - 5 min; woda - 2x5 min.</li>
	<li>Poddać skrawki trawieniu Proteinazą K. Zużyć 100μL roztworu o stężeniu 50μg/mL na jeden skrawek. Inkubować przez 15' w temperaturze pokojowej (23° C) w komorze wilgotnej. Czas inkubacji może wymagać dostosowania w zależności od rodzaju tkanki. Tkanki twarde mogą wymagać dłuższego trawienia; zazwyczaj stosuje się czas od 15 do 25 min. Niedostateczne trawienie może skutkować słabszym sygnałem, natomiast zbyt intensywne trawienie prowadzi do zaniku sygnału i uszkodzenia skrawka.</li>
	<li>Płukać w wodzie destylowanej przez 2x10 min.</li>
	<li>Nanieść 100 μL 2% BSA na skrawek w celu wstępnego blokowania. Inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej (23° C). W tym czasie przygotować zestaw do analizy molekularnej.</li>
</ol>
2. Montaż maszyn molekularnych
Wszystkie odczynniki zostały odmierzone dla całkowitej objętości 25 μL, co jest wystarczające do pojedynczej detekcji w preparacie tkankowym o przeciętnej wielkości (10x10mm). Objętość można zwiększyć w zależności od potrzeb.
<ol>
	<li>Połączyć w małej plastikowej probówce w następującej kolejności:</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			<ol>
				<li>Woda bidestylowana;</li>
				<li>15% glikol polietylenowy-8000;</li>
				<li>Roztwór 66 mM-Tris HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0.1 mM ditiotreitol, 1 mM ATP (tj. standardowy bufor ligazy DNA T4);</li>
				<li>70 pmoli Oligonukleotydu 1,</li>
				<li>215 pmoli (1.76 - 7.1 μg) VACC TOPO</li>
				<li>10 jednostek ligazy DNA T4 (500 U/mL)</li>
			</ol>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="2">
	<li>Wymieszać delikatnie poprzez pipetowanie. Konstrukt molekularny niemal natychmiast ulega samozłożeniu w tym roztworze i może być użyty niezwłocznie w temperaturze pokojowej (23° C). Podniesienie temperatury do 37° C blokuje komponent znakowania oparty na T4 DNA ligazie.</li>
</ol>
3. Wykorzystanie maszyn molekularnych w przekrojach tkanek do podwójnego znakowania pęknięć DNA z końcami 5'OH i 5'PO4
<ol>
	<li>Odssać roztwór blokujący i nanieść 25μL pełnej mieszaniny reakcyjnej zawierającej 70 pmoli Oligonukleotydu 1, 53 - 215 pmoli (1,76 - 7,1 μg) VACC TOPO oraz 10 jednostek ligazy T4 DNA (500 U/mL) w roztworze 66 mM-Tris HCl, pH 7,5, 5mM MgCl2, 0,1 mM ditiotreitolu, 1 mM ATP oraz 15% glikolu polietylenowego-8000. Do detekcji pojedynczego typu pęknięć DNA można zamiast tego użyć oligonukleotydu o tej samej sekwencji z pojedynczą etykietą FITC, Oligonukleotydu 2. W takim przypadku należy pominąć ligazę w reakcji znakowania. W tej sytuacji zamiast buforu ligazy T4 DNA można również zastosować roztwór 50mM Tris-HCL, pH 7,4, 15% PEG-8000.</li>
	<li>Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej (23° C) w wilgotnej komorze z plastikową laminką. Chronić przed światłem. Obniżenie temperatury do 16° C redukuje sygnał zależny od ligazy; zwiększenie temperatury do 37° C całkowicie eliminuje sygnał zależny od ligazy. W mieszaninie reakcyjnej czasami występuje częściowa inhibicja ligazy, prawdopodobnie z powodu zanieczyszczeń wprowadzonych wraz z preparatami topoizomerazy. Dlatego może być wymagana dłuższa inkubacja (2-4 godziny), szczególnie gdy obecna jest znaczna liczba pęknięć znakowanych ligazą. Chociaż na tym etapie można obserwować zarówno sygnały ligazy, jak i topoizomerazy, w wielu przypadkach sygnał ligazy można dodatkowo wzmocnić poprzez ponowne naniesienie mieszaniny reakcyjnej bez VACC TOPO i podwójnie znakowanego oligonukleotydu, ale zawierającej oligonukleotyd w kształcie spinki do włosów (Oligonukleotyd 3) (35 mg/mL) i ligazę T4 DNA (250 U/mL). Aby wzmocnić sygnał, należy przejść do kroku 3, aby zobaczyć reakcję bez wzmocnienia, należy przejść do kroku 5.</li>
	<li>Usunąć laminki, delikatnie zanurzając preparaty pionowo w naczyniu Coplina zawierającym wodę w temperaturze pokojowej. Odssać nadmiar wody.</li>
	<li>Wzmocnić sygnał ligazy, nakładając 25 μL mieszaniny reakcyjnej bez VACC TOPO i Oligonukleotydu 1, ale zawierającej Oligonukleotyd 3: 66 mM-Tris HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,1 mM ditiotreitolu, 1 mM ATP oraz 15% glikolu polietylenowego-8000, 5 jednostek ligazy T4 DNA, 35 mg/mL Oligonukleotydu 3 (tępo zakończona spinka do włosów). Całkowitą objętość roztworu znakującego można zwiększyć, aby dostosować ją do większych skrawków. Inkubować przez 18 h (całą noc) w temperaturze pokojowej (23° C) w wilgotnej komorze z plastikową laminką.</li>
	<li>Usunąć laminki, delikatnie zanurzając preparaty pionowo w naczyniu Coplina zawierającym wodę w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć skrawek 3x10 min w wodzie destylowanej.</li>
	<li>Przepłukać buforem wodorowęglanu sodu. Płukanie roztworem zasadowym wzmacnia fluorescencję FITC, która jest wrażliwa na pH i ulega znacznemu zmniejszeniu poniżej pH 7.</li>
	<li>Przykryć skrawek roztworem zapobiegającym blaknięciu (Vectashield z DAPI), laminką i przeanalizować sygnał za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Pęknięcia dwuniciowe DNA z końcem 5'OH będą fluorescencyjne na zielono, a pęknięcia 5'PO4 – na czerwono (Rysunek 2).</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
<img alt="Schemat procesu znakowania DNA przez maszynę molekularną: samomontaż, aktywacja, detekcja pęknięć DNA." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2."> 
Rycina 1. Półsztuczna maszyna molekularna wykrywa dwa rodzaje uszkodzeń DNA in situ. Fluorescencyjna maszyna ulega samomontażowi, gdy VACC TOPO wiąże się z 32-merem o strukturze podwójnej spinki do włosów. Maszyna rozpoczyna pracę, dzieląc się na dwie jednostki detekcyjne poprzez cięcie wykonane przez topoizomerazę na końcu 3' sekwencji rozpoznawczej. Prowadzi to do procesu cyklicznego, w którym jednostka znakowana FITC stale oddziela się i ponownie liguje do jednostki znakowanej rodaminą. Proces ten trwa do momentu napotkania wykrywalnego pęknięcia DNA. Gdy w skrawku tkanki obecny jest taki alternatywny akceptor (pęknięcie DNA z tępym końcem 5'OH), część FITC liguje się do niego. Pozostała część z rodaminą przyłącza się do tępych końców pęknięć DNA z 5' PO4 przy pomocy ligazy DNA T4. W konsekwencji oba rodzaje pęknięć DNA są wykrywane jednocześnie.
<img alt="Obraz mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający strukturę komórkową; pasek skali 50 µm." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1.">
 
Rycina 2. Maszyna molekularna podwójnie znakuje dwa typy pęknięć DNA w przekroju tkanki grasicy traktowanej deksametazonem. Pęknięcia DNA o tępych końcach typu DNase I i DNase II są wykrywane w obszarach kory grasicy podlegających apoptozie. Zielona fluorescencja cytoplazmatyczna (pęknięcia DNA 5'OH) znakuje makrofagi korowe trawiące materiał jądrowy apoptotycznych tymocytów. Sygnał ten jest generowany przez VACC TOPO i lokalizuje się w fagolizosomach zawierających DNA z pęknięciami dwuniciowymi 5'OH 11,12. Czerwona fluorescencja (pęknięcia 5'PO4) znakuje jądra apoptotycznych tymocytów, które nie zostały pochłonięte przez makrofagi. Masowe liczby tymocytów jednocześnie przechodzą apoptozę, której towarzyszy powstawanie pęknięć dwuniciowych 5'PO4, wizualizowanych za pomocą znakowania opartego na ligazie. Pęknięcia te znajdują się na obwodzie jądra, tworząc wzory w kształcie pierścienia. Wszystkie jądra komórkowe są wizualizowane poprzez przeciwbarwienie DAPI (fluorescencja niebieska).

<ol><li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li>
<li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Pol+expeditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li>
<li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+machines%3A+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li>
<li>Schneider, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+molecular+machines+I.+Channel+capacity+of+molecular+machines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines.</a> J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).</li>
<li>McClare, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+machines%2C+Maxwell%27s+demon+and+living+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms.</a> J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).</li>
<li>Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+as+a+molecular+machine%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Ribosome as a molecular machine.</a> FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).</li>
<li>Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-emitting+molecular+machines%3A+pH-induced+intramolecular+motions+in+a+fluorescent+nickel%28II%29+scorpionate+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex.</a> Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).</li>
<li>Drexler, K. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDrexler%2C+KE+%22Nanosystems%3A+Molecular+Machinery%2C+Manufacturing+and+Computation%22">Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation</a>. , Wiley. New York. (1992).</li>
<li>Freitas, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreitas%2C+RA+%22Nanomedicine%3A+basic+capabilities%22">Nanomedicine: basic capabilities</a>. , Landes Bioscience. Austin. (1999).</li>
<li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+probes+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+%28FRET%29%3A+designs+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications.</a> BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).</li>
<li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis%3A+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16, 4599-4614 (2011).</li>
<li>Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-artificial+fluorescent+molecular+machine+for+DNA+damage+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nano.+Letters%22%5BJournal%5D)">Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection.</a> Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).</li>
<li>Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+double-strand+breaks+with+single-base+3%27+overhangs+in+cells+undergoing+apoptosis+but+not+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis.</a> J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).</li>
<li>Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li>
<li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJones%2C+RAL+%22Soft+Machines%3A+Nanotechnology+and+life%22">Soft Machines: Nanotechnology and life</a>. , Oxford University Press. USA. (2007).</li>
<li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trashing+the+genome%3A+Role+of+nucleases+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W tym filmie demonstrujemy, jak składać i wykorzystywać dwuetykietowy czujnik uszkodzeń DNA. Czujnik ten jest maszyną molekularną napędzaną przez biomolekularny silnik – białko VACC TOPO kodowane przez wirusa, połączone z komponentami sztucznymi. Przedstawiona konstrukcja egzemplifikuje podejście biologiczne, które opowiada się za adaptowaniem struktur biologicznych, architektur oraz faktycznych części i komponentów komórek do projektowania nietoksycznych urządzeń w skali molekularnej 12,15. Podejście to rozwi...

in vitro montaż półsztucznej maszyny molekularnej i jej zastosowanie w detekcji uszkodzeń dna

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Naturalne biomolekularne maszyny działają w każdej żywej komórce i wykazują różnorodność konstrukcji 1-6. Jednak rozwój sztucznych maszyn molekularnych koncentruje się na urządzeniach zdolnych do ruchu kierunkowego, tzn. motorach molekularnych, oraz na ich zminiaturyzowanych częściach mechanicznych (kołach, osiach, zawieszkach itp.) 7-9. Jest to naśladownictwo makro-maszyn, mimo że właściwości fizyczne kluczowe dla tych urządzeń, takie jak bezwładność i zachowanie pędu, nie mają zastosowania w środowiskach nanoskali 10. Alternatywne konstrukcje, które nie opierają się na schematach mechanicznych makro-maszyn i wykorzystują mechanizmy wypracowane w toku ewolucji cząsteczek biologicznych, mogą wykorzystać specyficzne warunki nanoskali. Ponadto adaptacja rzeczywistych cząsteczek biologicznych do celów nanoprojektowania zmniejsza potencjalne zagrożenia, jakie mogą stwarzać produkty nanotechnologii. Prezentujemy tutaj montaż i zastosowanie jednej z takich konstrukcji opartych na biologii – półsztucznego urządzenia molekularnego, które łączy naturalnie występującą maszynę molekularną z komponentami sztucznymi. Z punktu widzenia enzymologii nasza konstrukcja jest zaprojektowanym fluorescencyjnym kompleksem enzym-substrat, stworzonym w celu pełnienia konkretnej, użytecznej funkcji. Zespół ten jest z definicji maszyną molekularną, ponieważ zawiera jedną taką jednostkę 12. Jednak jego integracja z częścią zaprojektowaną – fluorescencyjną podwójną spinką (hairpin) – przekierowuje go do nowego zadania, jakim jest znakowanie uszkodzeń DNA12.
Nasza konstrukcja składa się z 32-merowego DNA oraz enzymu topoizomerazy I szczepu vaccinia (VACC TOPO). Następnie układ ten wykorzystuje własny materiał do wytworzenia dwóch znakowanych fluorescencyjnie jednostek detekcyjnych (Rysunek 1). Jedna z jednostek (fluorescencja zielona) posiada kowalencyjnie przyłączoną do końca 3' VACC TOPO, a druga jednostka (fluorescencja czerwona) jest wolną spinką z terminalnym 3'OH. Jednostki te są krótkotrwałe i szybko ponownie łączą się w pierwotną konstrukcję, która następnie ulega ponownemu rozcięciu. W przypadku braku pęknięć DNA dwie te jednostki nieustannie rozdzielają się i ligują w sposób cykliczny. W przekrojach tkankowych z uszkodzeniami DNA jednostka detekcyjna zawierająca topoizomerazę selektywnie przyłącza się do tępich pęknięć DNA z końcem 5'OH (pęknięcia typu DNase II)11,12, znakując je fluorescencyjnie. Druga spinka pozbawiona enzymu, powstała po rozcięciu oligonukleotydu, liguje się do tępego pęknięcia z końcem 5'PO4 (pęknięcia typu DNase I)11,12, jeżeli w roztworze obecna jest ligaza DNA T4 13,14. Po dodaniu ligazy DNA T4 do przekroju tkankowego lub roztworu zawierającego DNA z tępymi pęknięciami 5'PO4, ligaza reaguje z końcami DNA 5'PO4, tworząc półstabilne kompleksy enzym-DNA. Tępe spinki oddziałują z tymi kompleksami, uwalniając ligazę i kowalencyjnie łącząc spinki z DNA, co prowadzi do znakowania tępych pęknięć DNA z końcem 5'PO4.
Opracowanie to stanowi przykład nowego praktycznego podejścia do projektowania maszyn molekularnych i dostarcza użytecznego sensora do wykrywania apoptozy oraz uszkodzeń DNA w utrwalonych komórkach i tkankach.

Prezentujemy montaż i zastosowanie urządzenia w skali molekularnej zasilanego białkiem topoizomerazą. Konstrukcja ta stanowi biomolekularny czujnik, który znakuje dwa główne rodzaje pęknięć DNA w przekrojach tkanek poprzez przyłączenie dwóch różnych fluoroforów do ich końców.

In vitro montaż półsztucznej maszyny molekularnej i jej zastosowanie w detekcji uszkodzeń DNA

Naturalnie występujące maszyny biomolekularne działają w każdej żywej komórce i wykazują różnorodność konstrukcji 1-6. Jednak opracowanie sztucznych molekularnych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie sposobu montażu i zastosowania sensora uszkodzeń DNA z podwójnym znakowaniem, który znakuje dwa główne typy pęknięć DNA w przekrojach tkanek. Sensor składa się z 30-merowego oligonukleotydu DNA z podwójnym znakowaniem ZI i rumiem oraz enzymu wakcynowej topoizomerazy I (vac topo), który ulega samoorganizacji. Gdy VAC topo wiąże się z 30-merem, rozpoczyna się proces działania, w którym topo przecina oligonukleotyd na końcu 3' sekwencji rozpoznawania, w wyniku czego powstaje aktywowana jednostka vac topo znakowana fitzy oraz wolna spinka znakowana aminą.Dzięki terminalnej grupie hydroksylowej na końcu 3', jednostki są krótkotrwałe i szybko składają się z powrotem w pierwotny konstrukt, który następnie ulega rozszczepieniu. W przypadku braku dodatkowych pęknięć DNA w cząsteczce, dwie te jednostki nieustannie rozdzielają się i łączą w sposób cykliczny. Po zastosowaniu sensora molekularnego do przekrojów tkanek z uszkodzeniami DNA, jednostka detekcyjna znakowana Fitz selektywnie przyłącza się do tępokońcowych pęknięć DNA z grupą hydroksylową na końcu 5'.Znakowana jednostka detekcyjna R domine liguje się do tępokrawędzistego pęknięcia z fosforanem na końcu 5'. W obecności ligazy DNA T four uzyskuje się wyniki obrazujące obecność oraz rozkład pęknięć DNA typu one oraz D'S two w komórkach na podstawie mikroskopii fluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod wykrywania HESIs, takich jak tunnel, jest jej większa specyficzność oraz dostarczenie dodatkowych informacji poprzez znakowanie zarówno fazy autonomicznej, jak i fagocytycznej apoptozy.Z perspektywy nanotechnologii czujnik ten stanowi przykład podejścia opartego na biologii, które adaptuje rzeczywiste struktury i architektury biologiczne do konstrukcji nietoksycznych urządzeń w skali molekularnej. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ jej sukces zależy od zastosowania wysoce aktywnego preparatu Toro SOM oraz prawidłowego przetwarzania skrawków w celu uniknięcia nadmiernego trawienia przez proteinazę K. Skrawki tkanek do tej procedury powinny zostać przygotowane przed montażem urządzenia molekularnego. Są to skrawki o grubości od pięciu do sześciu mikronów, wycinane z paraldehydu.Zaleca się stosowanie bloków tkankowych utrwalonych w parafinie. Umieść szkiełko z przekrojem tkanki w statywie do szkiełek i usuń wosk w ksylenie przez 15 minut. Po 15 minutach przenieś preparat do świeżej kąpieli w ksylenie na dodatkowe pięć minut.Rehydratuj preparat, przeprowadzając slajd przez następujące stężenia etanolu. 96% etanol dwukrotnie przez pięć minut każde. 80% etanol przez pięć minut, a następnie woda.Dwa razy po pięć minut. Po rehydratacji poddać przekrój trawieniu proteinazą K. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze, używając 100 µL roztworu o stężeniu 50 µg/mL na każdy przekrój. W zależności od rodzaju tkanki czas trawienia może wymagać korekty, należy jednak uważać, aby uniknąć nadmiernego trawienia, ponieważ prowadzi ono do zaniku sygnału i uszkodzenia przekroju po zakończeniu procesu trawienia.Przepłucz preparat na szkiełku dwa razy w wodzie destylowanej, po 10 minut za każdym razem. Nałóż 2% BSA w celu wstępnego blokowania i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej. W tym czasie złóż maszynę molekularną, zgodnie z instrukcją przedstawioną dalej w tym filmie.Wszystkie odczynniki do montażu maszyny molekularnej są odmierzone dla całkowitej objętości 25 µL, co jest wystarczające do pojedynczej detekcji w przekroju tkanki o przeciętnej wielkości. Objętość można zwiększyć w razie potrzeby w małej plastikowej probówce. Połączyć następujące odczynniki w podanej kolejności, używając wody destylowanej.15% glikolu polietylenowego 8 000 T, buforu ligazy DNA T4, dwuznaczonego oligonukleotydu, topoisomerazy I vaccinia oraz ligazy DNA T4 zmieszać delikatnie poprzez pipetowanie. Konstrukt molekularny niemal natychmiast ulegnie samorzece w tym roztworze i może być użyty niezwłocznie w temperaturze pokojowej. Aby rozpocząć procedurę znakowania pęknięć DNA, odessać roztwór blokujący z preparatu.Nanieś 25 µL pełnej mieszaniny reakcyjnej na każdą sekcję. Przykryj sekcję plastikowym szkiełkiem podstawowym i umieść preparat w komorze z wysoką wilgotnością. Chroń przed światłem, owijając komorę folią aluminiową, i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Chociaż sygnały ligazy i topo można zaobserwować po godzinnej inkubacji, w wielu przypadkach sygnał ligazy można dodatkowo wzmocnić. Aby wzmocnić sygnał, ponownie nanieść mieszaninę reakcyjną bez vac topo i oligonukleotydu jeden, ale z oligonukleotydem trzy i T four DNA Ligase, nałożyć plastikową lamellkę na przekrój i inkubować w komorze nawilżonej przez 18 godzin. Następnego dnia, w temperaturze pokojowej, delikatnie zanurzyć slajd pionowo w naczyniu Coplan zawierającym wodę w temperaturze pokojowej, aby usunąć lamellkę.Następnie przemyj preparat w wodzie destylowanej trzy razy po 10 minut. Opłucz preparat buforem z wodorowęglanu sodu. Płukanie tym roztworem zasadowym wzmacnia fluorescencję fitzy, która jest wrażliwa na pH i ulega znacznemu zmniejszeniu przy pH poniżej siedmiu.Na koniec pokryj przekrój roztworem zapobiegającym blaknięciu, który zawiera również DPI do liczników i barwienia jąder, a następnie nałóż szkiełko zakrywowe. Przekroje są teraz gotowe do mikroskopii fluorescencyjnej. Na tej rycinie przedstawiono przekrój tkanki grasicy traktowanej deksametazonem, w której maszyna molekularna wykryła pęknięcia DNA o tępych końcach typu DNAs one i DNAs two w obszarach korowych grasicy podlegających apoptozie; zielona fluorescencja cytoplazmatyczna wskazująca na pęknięcia typu DNA's two oznacza makrofagi korowe trawiące materiał jądrowy apoptotycznych tymocytów.Sygnał ten jest wytwarzany przez vac topo i lokalizuje się w lysosomach FGA z DNA zawierającym grupę hydroksylową na końcu 5'. Pęknięcia dwuniciowe w postaci czerwonej fluorescencji wskazują na etykiety jednego typu pęknięć DNA, jądra apoptotycznych tymocytów niepochłoniętych przez makrofagi. Masowe liczby tymocytów jednocześnie ulegają apoptozie.Towarzyszy temu powstawanie pięciu pęknięć obu nici z końcami fosforanowymi, wizualizowanych za pomocą znakowania opartego na ligazie. Pęknięcia te znajdują się na obwodzie jądra i tworzą wzory w kształcie pierścieni. Wszystkie jądra komórkowe są zabarwione na niebiesko dzięki przeciwbarwieniu dpi.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie dopuścić do wyschnięcia skrawków pomiędzy kolejnymi etapami dodawania różnych roztworów. Ponadto wszystkie preparaty enzymatyczne należy przechowywać w lodzie przed dodaniem ich do skrawków, a sondy fluorescencyjne chronić przed światłem podczas reakcji znakowania oraz po jej zakończeniu. Technika ta umożliwiła wizualizację wszystkich faz rozpadu heterochromatyny w komórkach.Niniejszy czujnik sam w sobie stanowi przykład podejścia zielonej nanotechnologii do projektowania nanocząstek, sond i maszyn w skali nano. Podejście to łączy komponenty sztuczne z naturalnie występującymi elementami maszyn molekularnych. Celem jest wyeliminowanie toksyczności oraz niekorzystnej reaktywności biologicznej tych silnie dyspersyjnych nanomateriałów.

in-vitro-assembly-semi-artificial-molecular-machine-its-use-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

In vitro montaż półsztucznej maszyny molekularnej i jej zastosowanie do wykrywania uszkodzeń DNA

Opisujemy metodę obserwacji replikacji pojedynczych cząsteczek DNA w czasie rzeczywistym, pośredniczonej przez białka systemu replikacyjnego bakteriofaga.

Bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących DNA z wykorzystaniem testu rozciągania pojedynczej cząsteczki DNA

Obrazowanie spektroskopowe elektronów może obrazować i odróżniać kwas nukleinowy od białka z rozdzielczością nanometrów. Można go połączyć z systemem miniSOG, który jest w stanie specyficznie znakować znakowane białka w próbkach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowanie tych technologii ilustrujemy na przykładzie dwuniciowych ognisk naprawy pęknięć.

Wizualizacja białek naprawczych DNA oznaczonych tagami miniSOG w połączeniu z obrazowaniem spektroskopowym elektronów (ESI)

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Nieoznakowana, nieradio-izotopowa metoda korekty polimerazy DNA i testu naprawy DNA została opracowana przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF o wysokiej rozdzielczości i strategii przedłużania pojedynczego nukleotydu. Test okazał się bardzo specyficzny, prosty, szybki i łatwy do wykonania w przypadku korekty i naprawy łatek krótszych niż 9-nukleotydy.

Korekta i test naprawy DNA przy użyciu przedłużenia pojedynczego nukleotydu i analizy spektrometrii mas MALDI-TOF

Ten artykuł przedstawia podstawowe etapy immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny. Protokoły te są powszechnie stosowane do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA.

Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

Metodologia pomaga w analizie zmienności dynamiki replikacji DNA w obecności nanocząstek. Można przyjąć różne metodologie w zależności od poziomu cytotoksyczności materiału będącego przedmiotem zainteresowania. Dodatkowo zamieszczono opis analizy obrazu, który ma pomóc w analizie włókien DNA.

Demonstracja testu włókien DNA do badania uszkodzeń DNA i dynamiki naprawy indukowanych przez nanocząstki

Poniższy protokół przedstawia wykrywanie jednoniciowych ognisk DNA w fazie G1 cyklu komórkowego za pomocą synchronizacji cyklu komórkowego, a następnie barwienia immunofluorescencyjnego RPA2.

Wizualizacja ognisk jednoniciowego DNA w fazie G1 cyklu komórkowego

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Zgłaszamy test hybrydowy i jednocząsteczkowy, aby bezpośrednio zobrazować i określić ilościowo ruch fluorescencyjnie znakowanej, w pełni zrekonstytuowanej helikazy Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) na liniowych cząsteczkach DNA utrzymywanych w miejscu w pułapce optycznej.

Zestaw hybrydowy i test jednocząsteczkowy do obrazowania ruchu w pełni odtworzonego CMG

Poznaj montaż półsztucznej maszyny molekularnej do wykrywania uszkodzeń DNA w tkankach. Ta metoda wykorzystuje topoisomerazę i fluorescencyjne znakowanie do wizualizacji dwóch typów złamań DNA.

In vitro montaż półsztucznej maszyny molekularnej i jej zastosowanie w detekcji uszkodzeń DNA

Przeglądaj więcej filmów