In vitro montaż półsztucznej maszyny molekularnej i jej zastosowanie w detekcji uszkodzeń DNA

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie sposobu montażu i zastosowania podwójnie znakowanego sensora uszkodzeń DNA, który znakuje dwa główne rodzaje pęknięć DNA w przekrojach tkanek. Sensor składa się z 30-nukleotydowego oligonukleotydu DNA, podwójnie znakowanego ZI i luminą, oraz enzymu – wakcynowej topoizomerazy I (vac topo), który ulega samomontażu. W momencie związania VAC topo z 30-merem rozpoczyna się działanie mechanizmu, w którym topoizomeraza przecina oligonukleotyd na końcu 3' sekwencji rozpoznawania, w wyniku czego powstaje aktywowana jednostka vac topo znakowana fitzy oraz wolna spinka znakowana aminą.

Dzięki końcowemu hydroxylu 3', jednostki te są krótkotrwałe i szybko ponownie łączą się w pierwotny konstrukt, który następnie ulega rozszczepieniu. W przypadku braku dodatkowych pęknięć DNA w cząsteczce, dwie te jednostki nieustannie rozdzielają się i ponownie łączą w sposób cykliczny. Po zastosowaniu czujnika molekularnego do skrawków tkanek z uszkodzeniami DNA, jednostka detekcyjna znakowana Fitz selektywnie przyłącza się do tępich końców pęknięć DNA z hydroxylem 5'.

Jednostka detekcyjna znakowana domeną R liguje się do tępokrawędzistego pęknięcia z fosforanem na końcu 5'. W obecności ligazy DNA T4 uzyskuje się wyniki wykazujące obecność i rozmieszczenie pęknięć DNA typu jeden i dwa w komórkach na podstawie mikroskopii fluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami detekcji HESI, takimi jak TUNEL, jest jej większa swoistość oraz dostarczenie dodatkowych informacji poprzez znakowanie zarówno fazy autonomicznej, jak i fagocytycznej apoptozy.

Z perspektywy nanotechnologii czujnik ten stanowi przykład podejścia biologicznie wspomaganego, które adaptuje rzeczywiste struktury i architektury biologiczne do konstrukcji nietoksycznych urządzeń w skali molekularnej. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności, ponieważ jej powodzenie zależy od zastosowania wysoce aktywnego preparatu Toro SOM oraz prawidłowego przetwarzania przekrojów, aby uniknąć nadmiernego trawienia przez proteinazę K. Przekroje tkanek do tej procedury powinny zostać przygotowane przed montażem urządzenia molekularnego. Przekroje o grubości od pięciu do sześciu mikronów powinny zostać wycięte z paraldehydu.

Zaleca się stosowanie bloków tkankowych utrwalonych w parafinie. Umieść slajd z przekrojem tkanki w kasecie do slajdów i usuwaj wosk w ksylenie przez 15 minut. Po 15 minutach przenieś slajd do świeżej kąpieli w ksylenie na dodatkowe pięć minut.

Rehydratyzuj przekrój, przepuszczając preparat przez następujące stężenia etanolu: 96% etanol dwukrotnie po pięć minut, następnie 80% etanol przez pięć minut i na koniec wodę.

Dwa razy po pięć minut. Po rehydratacji poddać przekrój trawieniu proteinazą K. Zużywając 100 µL roztworu o stężeniu 50 µg/mL na przekrój, inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w komorze nawilżonej. W zależności od rodzaju tkanki czas trawienia może wymagać korekty, jednak należy uważać, aby nie doprowadzić do nadmiernego trawienia, ponieważ powoduje ono zanik sygnału i uszkodzenie przekroju po zakończeniu procesu.

Przepłucz preparat dwa razy w wodzie destylowanej przez 10 minut za każdym razem. Nałóż 2% BSA w celu wstępnego blokowania i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej w komorze nawilżonej. W tym czasie złóż maszynę molekularną, zgodnie z instrukcją pokazaną dalej w tym filmie.

Wszystkie odczynniki do montażu maszyny molekularnej są odmierzone dla całkowitej objętości 25 µL, co jest wystarczające do pojedynczego wykrywania w przekroju tkanki o przeciętnej wielkości. Objętość można zwiększyć w razie potrzeby w małej plastikowej probówce. Połączyć następujące odczynniki w podanej kolejności, używając wody destylowanej.

15% glikolu polietylenowego 8 000 T, buforu ligazy DNA T4, podwójnie znakowanego oligonukleotydu, toksolomerazy vaccinia typu I oraz ligazy DNA T4 zmieszać delikatnie poprzez pipetowanie. Konstrukt molekularny niemal natychmiast ulegnie samoporządkowaniu w tym roztworze i może być użyty niezwłocznie w temperaturze pokojowej. Aby rozpocząć procedurę znakowania pęknięć DNA, odessać roztwór blokujący z preparatu.

Nanieś 25 µL pełnej mieszaniny reakcyjnej na każdą sekcję. Na sekcję nałóż plastikowe szkiełko nakrywkę, a następnie umieść preparat w komorze nawilżonej. Chroniąc przed światłem, owiń komorę folią aluminiową i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Choć sygnały ligazy i topo można zaobserwować po jednej godzinie inkubacji, w wielu przypadkach sygnał ligazy można dodatkowo wzmocnić. Aby wzmocnić sygnał, ponownie nałóż mieszaninę reakcyjną bez vac topo i oligonukleotydu one, ale z oligonukleotydem three i T four DNA Ligase, nałóż plastikową lamellkę na skrawka i inkubuj w komorze wilgotnościowej przez 18 godzin. Następnego dnia, w temperaturze pokojowej, ostrożnie zanurz przedmiot szkiełko pionowo w naczyniu Coplan zawierającym wodę w temperaturze pokojowej, aby usunąć lamellkę.

Następnie przemyj przekrój w wodzie destylowanej trzykrotnie, przez 10 minut za każdym razem. Opłucz przekrój buforem z wodorowęglanu sodu. To płukanie roztworem alkalicznym wzmacnia fluorescencję fitzy, która jest wrażliwa na pH i ulega znacznemu zmniejszeniu przy pH poniżej siedmiu.

Na koniec pokryj przekrój roztworem przeciw wyblakaniu, który zawiera również DPI do liczników i barwienia jąder, a następnie nałóż szkiełko nakrywki. Przekroje są teraz gotowe do mikroskopii fluorescencyjnej. Na tej rycinie przedstawiono przekrój tkanki grasicy traktowanejy deksametazonem, w której urządzenie molekularne wykryło pęknięcia DNA typu tępo zakończonego (DNA1 i DNA2) w obszarach kory grasicy podlegających apoptozie; zielona fluorescencja cytoplazmatyczna wskazuje na pęknięcia typu DNA2, znakując makrofagi korowe trawiące materiał jądrowy apoptotycznych tymocytów.

Sygnał ten jest generowany przez vac topo i lokalizuje się w lizosomach FGA z DNA zawierającym grupę hydroksylową przy końcu 5'. Pęknięcia dwuniciowe oznaczono fluorescencją czerwoną, co wskazuje na jeden typ pęknięć DNA, w jądrach apoptotycznych tymocytów, które nie zostały pochłonięte przez makrofagi. Masowe liczby tymocytów jednocześnie ulegają apoptozie.

Zjawisko to towarzyszy powstawaniu pięciu pęknięć obu nici DNA w obrębie wiązań fosfodiestrowych, zwizualizowanych za pomocą znakowania z użyciem ligazy. Pęknięcia te znajdują się na obrzeżach jądra i tworzą wzory w kształcie pierścienia. Wszystkie jądra komórkowe są widoczne w kolorze niebieskim dzięki barwieniu kontrastowemu dpi.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie dopuścić do wyschnięcia skrawków pomiędzy dodawaniem poszczególnych roztworów. Ponadto wszystkie preparaty enzymatyczne należy przechowywać w lodzie przed nałożeniem ich na skrawki, a sondy fluorescencyjne chronić przed światłem podczas reakcji znakowania oraz po jej zakończeniu. Technika ta pozwoliła na wizualizację wszystkich faz demontażu hetozy.

Ten czujnik sam w sobie jest przykładem podejścia zielonej nanotechnologii do projektowania nanocząstek, sond i maszyn w skali nano. Podejście to łączy komponenty sztuczne z naturalnie występującymi elementami maszyn molekularnych. Celem jest wyeliminowanie toksyczności i niepożądanej reaktywności biologicznej tych silnie dyspersyjnych nanomateriałów.