Name: Ex vivo Organotypowy model rogówki ostrego nabłonkowego zakażenia wirusem opryszczki pospolitej typu I (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj model ex vivo rogówki króliczej i ludzkiej do badania zakażenia wirusem HSV-1. Ta metoda łączy zalety kultur in vitro i modeli in vivo, oferując dokładniejsze wnioski fizjologiczne przy niższych kosztach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie Lions Eye Bank of Delaware Valley było nieocenione dla realizacji tej pracy. Pierwotne przeciwciało monoklonalne mysie przeciwko ICP8 było uprzejmym darem od dr. Davida Knipe'a (Harvard Medical School). Dziękujemy również dr. Stephenowi Jenningsowi (Drexel University College of Medicine) oraz dr. Peterowi Laibsonowi (Wills Eye Institute) za pomocne dyskusje i wiedzę ekspercką.

Wszystkie odczynniki i sprzęt zostały zakupione w formie sterylnej lub wysterylizowane przed przystąpieniem do procedury. Niniejszy artykuł opisuje etapy przygotowania modelu ex vivo, zaczynając od oczyszczonego z tkanek okołogałkowych oka. W naszych eksperymentach wykorzystujemy świeże całe gałki oczne młodych (8-12 tyg.) królików albinosów (Pel-Freez Biologicals, Rogers, AR). Ponadto stosujemy rogówki ludzkie pozyskane z lokalnego banku tkanek oka. W przypadku samodzielnego wykonywania enukleacji należy zadbać o to, aby podczas procedury nie uszkodzić rogówki ani limbusa. Protokoły enukleacji u królików można znaleźć w innej literaturze 2.
Część 1: Wycięcie guzika rogówkowo-twardówkowego
<ol>
 <li> Namocz wąski pasek gazy w PBS i owiń go wokół gałki ocznej, aby ułatwić jej trzymanie podczas procedury. </li>
 <li> Za pomocą ostrego skalpela wykonaj nacięcie styczne w twardówce, około 0.5 cm od limbusa. </li>
 <li> Użyj ostrych nożyczek, aby poszerzyć nacięcie i całkowicie wyciąć fragment rogówki i twardówki (tzw. guzik rogówkowo-twardówkowy). </li>
 <li> Po wyizolowaniu fragmentu rogówki i twardówki, delikatnie oddziel tęczówkę, trzymając krawędź twardówki pęsetą. Należy unikać uszkodzenia śródbłonka oraz wywierania nadmiernego nacisku na rogówkę. </li>
</ol>
Część 2: Wprowadzenie rogówki do hodowli organotypowej
<ol>
 <li>Wypreparowane rogówki hoduje się w podłożu Minimum Essential Medium (MEM) uzupełnionym o niezbędne aminokwasy (Non-Essential Amino Acids) (1X), L-glutaminę (2 mM), penicylinę (200 U/ml) oraz streptomycynę (200 μg/ml). W razie potrzeby można dodać środek przeciwgrzybiczy, np. amfoterycynę.</li>
 <li>Przygotować 1% roztwór agarozy w podłożu hodowlanym i utrzymywać go w temperaturze 55 °C.</li>
 <li>Dokładnie wypłukać rogówkę w sterylnym PBS zawierającym penicylinę (200 U/ml) i streptomycynę (200 μg/ml).</li>
 <li>Umieścić rogówkę stroną nabłonkową do dołu w dołku sterylnej płytki z dołkami.</li>
 <li>Dodać podłoże z agarozą do wklęsłości śródbłonkowej rogówki w ilości wystarczającej do jej całkowitego wypełnienia. Odczekać ok. 1 min, aż agaroza stężeje.</li>
 <li>Umieścić rogówkę wraz z podtrzymującym ją rusztowaniem żelowym stroną nabłonkową do góry w 35 mm naczyniu do hodowli tkanek i dodać podłoże hodowlane tak, aby pokryło powierzchnię nabłonkową.</li>
 <li>Rogówkę można w ten sposób hodować przez ponad tydzień, wymieniając podłoże co 48 hr.</li>
</ol>
Część 3: Zakażenie HSV-1 i leczenie eksperymentalnymi lekami
<ol>
 <li> Do szalki hodowlanej o średnicy 35 mm dodać 1 ml pożywki zawierającej pożądaną ilość wirusa. Zazwyczaj przeprowadzamy infekcję dawką 1x104 PFU szczepu KOS HSV-1 na rogówkę. Miana naszych zapasów są określane poprzez wykonanie testów plackowych na monowarstwach komórek CV-1. </li>
 <li> Umieścić rogówkę wraz z rusztowaniem agarozowym stroną nabłonkową do dołu w pożywce zawierającej wirusa. </li>
 <li> Umieścić rogówkę w inkubatorze do hodowli tkanek w celu infekcji przez 1 hr, wykonując okresowe kołysanie co 10-15 min. </li>
 <li> Po 1 hr odessać pożywkę zawierającą wirusa i przepłukać 2-3 razy PBS w celu usunięcia pozostałych cząsteczek wirusa. </li>
 <li> Umieścić rogówkę z powrotem w poprzedniej pozycji i dodać świeżą pożywkę hodowlaną, aby pokryć powierzchnię nabłonka. </li>
 <li> Zabiegi eksperymentalne można rozpocząć przed lub po infekcji, w zależności od charakteru eksperymentu. </li>
 <li> Pożywkę hodowlaną wymieniać co 48 hr. </li>
</ol>
Część 4: Pobieranie próbek
<ol class="lalpha">
 <li> Pożywka do analizy testu plackowego. Dokładnie wymieszać pożywkę i użyć jej natychmiast do testu plackowego lub przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego zastosowania w przypadku pobierania próbek w różnych punktach czasowych.</li>
 <li> DNA, RNA, białka lub komórki z nabłonka rogówki 
 <ol>
 <li> Usunąć rusztowanie agarowe i dokładnie wypłukać rogówkę za pomocą PBS. </li>
 <li> Wyciąć pierścień tkanki twardówki z rogówki, aby upewnić się, że pobrany zostanie wyłącznie materiał z nabłonka rogówki. </li>
 <li> Za pomocą skalpela zeskrobać komórki nabłonka rogówki do odpowiedniego buforu, zależnie od rodzaju izolowanego materiału. Do izolacji DNA i RNA stosujemy odpowiednio zestaw DNeasy Blood &amp; Tissue Kit oraz RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Niemcy). Do zbierania lizatów białkowych stosujemy bufor Laemmli. Do analizy cytometrycznej komórek nabłonka rogówki wstępnie inkubujemy rogówki w niewielkiej ilości trypsyny w celu poluzowania komórek, a następnie oddzielamy je skalpelem do trypsyny. Ponieważ skrobactwo nabłonka rogówki nie daje jednakowej ilości tkanki, ważne jest uwzględnienie odpowiednich kontroli podczas analizy próbek. W badaniach qRT-PCR jako transkrypty referencyjne wykorzystujemy 18S rRNA, w qPCR gen GAPDH jako gen referencyjny, a w analizach Western blot nukleolinę jako kontrolę ilościową (loading control). </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Próbki tkankowe do immunohistochemii lub immunofluorescencji
 
 <ol>
 <li> Usunąć rusztowanie agarowe i dokładnie wypłukać rogówkę za pomocą PBS. </li>
 <li> W zależności od celu eksperymentalnego, wykorzystać rogówkę do przygotowania bloku tkanki w parafinie lub bloku tkanki mrożonej, zgodnie z instrukcją w filmie. Przy przygotowywaniu przekrojów tkanki rogówki stosujemy standardowe procedury.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
Większość metod dostępnych do badania komórek w hodowlach tkankowych można łatwo dostosować do użytku w rogówkach zainfekowanych HSV-1 ex vivo. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki dla kilku najczęstszych technik stosowanych w badaniu infekcji HSV-1 – qPCR (Rysunek 1D), qRT-PCR (Rysunek 1B), Western blot (Rysunek 1F), test plackowy (Rysunek 1C) oraz immunofluorescencję tkankową (Rysunek 1E). 
<img src="/files/ftp_upload/3631/3631fig1.jpg" alt="Analiza wirusa opryszczki prostego: schemat infekcji rogówki, wykres transkrypcji wirusa, test plackowy, barwienie ICP8." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Analiza rogówek zainfekowanych HSV-1 ex vivo. (A) Schematyczny opis modelu ex vivo ostrej infekcji nabłonka rogówki HSV-1. (B-F) Analiza rogówek zainfekowanych metodą opisaną w niniejszym artykule wideo. Wypreparowane rogówki królicze zainfekowano dawką 1x104 PFU/rogówkę szczepu KOS HSV-1 i hodowano w obecności (PAA) lub w przypadku kontroli (Mock) wobec braku kwasu fosfonooctowego (400 μg/ml), znanego inhibitora replikacji HSV. (B) Całkowite RNA pobrano w określonych punktach czasowych, a transkrypcję wirusową oceniono metodą qRT-PCR z użyciem starterów dla polimerazy HSV-1. Jako referencję zastosowano startery przeciwko 18S rRNA. n=3. Słupki błędów oznaczają ± SEM. (C) Po 48 hpi pobrano pożywkę hodowlaną, a produkcję cząsteczek zakaźnych oceniono za pomocą testu plackowego na monowarstwach CV-1. (D) Po 48 hpi pobrano całkowite DNA, a replikację genomu wirusa oceniono w teście qPCR z użyciem starterów dla genomu HSV-1. Jako referencję zastosowano startery przeciwko GAPDH. n=3. Słupki błędów oznaczają ± SEM. (E) Rogówki z grupy kontrolnej (Mock) zamrożono gwałtownie po 48 hpi, wykonano ich przekroje i przeanalizowano metodą pośredniej immunofluorescencji pod kątem obecności wczesnego białka wirusowego (ICP8) w zainfekowanym nabłonku. Jądra komórkowe wybarwiono Höchst 33258. (F) Lizaty białkowe pobrano po 48 hpi, a ekspresję białka wirusowego (ICP0) oceniono za pomocą metody Western blot. Do zapewnienia równego obciążenia próbek wykorzystano test BCA. hpi = godziny po infekcji.

<ol><li>Kaye, S., Choudhary, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex keratitis.</a> Prog. Retin. Eye Res. 25, 355-380 (2006).</li>
<li>Holmberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enucleation+of+exotic+pets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Exotic+Pet+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enucleation of exotic pets.</a> Journal of Exotic Pet Medicine. 16, 88-94 (2007).</li>
<li>Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+herpes+simplex+virus+keratitis%3A+the+pathogenesis+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul.+Immunol.+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited.</a> Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).</li>
<li>Foreman, D. M., Pancholi, S., Jarvis-Evans, J., McLeod, D., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+organ+culture+model+for+assessing+the+effects+of+growth+factors+on+corneal+re-epithelialization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A simple organ culture model for assessing the effects of growth factors on corneal re-epithelialization.</a> Exp. Eye Res. 62, 555-564 (1996).</li>
<li>Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+organ+culture+model+for+assessing+epithelial+responses+to+surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants.</a> Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).</li>
<li>Klausner, E. A., Peer, D., Chapman, R. L., Multack, R. F., Andurkar, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Corneal gene therapy.</a> J. Control Release. 124, 107-133 (2007).</li>
<li>Halford, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICP0+antagonizes+Stat+1-dependent+repression+of+herpes+simplex+virus%3A+implications+for+the+regulation+of+viral+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">ICP0 antagonizes Stat 1-dependent repression of herpes simplex virus: implications for the regulation of viral latency.</a> Virol. J. 3, 44(2006).</li>
<li>Bhattacharjee, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+treatment+of+ocular+HSK+with+a+human+apolipoprotein+E+mimetic+peptide+in+a+mouse+eye+model%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effective treatment of ocular HSK with a human apolipoprotein E mimetic peptide in a mouse eye model.</a> Invest Ophthalmol Vis. Sci. 49, 4263-4268 (2008).</li>
<li>Novitskaya, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difficulties+imaging+herpes+simplex+keratitis+with+fluorescein+isothiocynate-labeled+anti-HSV-1+antibodies+in+an+ex+vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Difficulties imaging herpes simplex keratitis with fluorescein isothiocynate-labeled anti-HSV-1 antibodies in an ex vivo model.</a> Cornea. 28, 421-425 (2009).</li>
<li>Sharma, A., Shimeld, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+immunofluorescence+to+diagnose+herpes+simplex+virus+keratitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">In vivo immunofluorescence to diagnose herpes simplex virus keratitis in mice.</a> Br. J. Ophthalmol. 81, 785-788 (1997).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym artykule wideo opisujemy metodę badania ostrej infekcji nabłonka rogówki przez HSV-1 w modelu ex vivo. Model ten stanowi przydatny etap pośredni między modelami in vitro a in vivo, ponieważ umożliwia fizjologicznie dokładną walidację wyników uzyskanych w hodowlach komórkowych, a tym samym ogranicza liczbę koniecznych eksperymentów na zwierzętach. Ponadto model ex vivo stwarza wyjątkową i nieocenioną okazję do badania infekcji herpesem nabłonka w nienaruszonych rogówkach <e...

<table><tbody><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy niekluczowe (roztwór 100x)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sód penicyliny G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowo-solny (PBS)</td><td>Przygotowano w laboratorium</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA (1x)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp;amp; Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Laemmliego</td><td>Przygotowano w laboratorium</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Całe oczy królika (młode)</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>41211-2</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie rogówki i całe oczy</td><td>Lokalny dostawca</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Porcelanowa płytka do nakraplania 12-dołkowa</td><td>Avogadro&amp;rsquo;s Lab Supply</td><td>1877</td><td></td></tr><tr><td>Szalka do hodowli tkanek 35 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórek</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Krioforma (Cryomold) Intermediate</td><td>Tissue-Tek</td><td>4566</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo organotypowy model rogówki w ostrym zakażeniu nabłonka wirusem opryszczki prostym typu i

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

Zapalenie rogówki wywołane wirusem opryszczki jest jedną z najcięższych patologii związanych z wirusem opryszczki prostego typu 1 (HSV-1). Obecnie zapalenie rogówki wywołane opryszczką jest główną przyczyną ślepoty pochodzenia rogówkowego oraz ślepoty związanej z infekcjami w krajach rozwiniętych. Typowy obraz zapalenia rogówki wywołanego opryszczką obejmuje infekcję nabłonka rogówki, a niekiedy głębszych warstw zrazika i śródbłonka rogówki, co prowadzi do trwałych patologii rogówki, takich jak bliznowacenie, ścieńczenie i zmętnienie 1.
Zakażenia rogówki wirusem HSV-1 bada się tradycyjnie w dwóch typach modeli eksperymentalnych. Model in vitro, w którym hodowane monowarstwy komórek nabłonka rogówki są zakażane w szalce Petriego, zapewnia prostotę, wysoki stopień powtarzalności, krótki czas trwania eksperymentów oraz stosunkowo niskie koszty. Z kolei model in vivo, w którym zwierzęta, takie jak króliki lub myszy, są inokulowane bezpośrednio do rogówki, oferuje wysoce zaawansowany system fizjologiczny, ale wiąże się z wyższymi kosztami, dłuższym czasem trwania badań, koniecznością opieki nad zwierzętami oraz większym stopniem zmienności.
W niniejszym artykule wideo przedstawiamy szczegółową demonstrację nowego modelu ex vivo infekcji nabłonka rogówki wirusem HSV-1, który łączy zalety modeli in vitro oraz in vivo. Model ex vivo wykorzystuje nienaruszone rogówki utrzymywane w kulturze organotypowej i zainfekowane HSV-1. Zastosowanie modelu ex vivo pozwala na wyciąganie wniosków o wysokim stopniu zgodności fizjologicznej, a jednocześnie jest on stosunkowo tani i wymaga nakładów czasu porównywalnych z modelem in vitro.

W niniejszym artykule wideo opisujemy zastosowanie nowego modelu ex vivo ostrej infekcji nabłonka rogówki wirusem prostego typu I.

Ex Vivo organotypowy model rogówki w ostrym zakażeniu nabłonka wirusem opryszczki prostym typu I

Zapalenie rogówki wywołane przez wirusa opryszczki jest jedną z najcięższych patologii związanych z wirusem prostego opryczka typu 1 (HSV-1). Zapalenie rogówki wywołane przez wirusa opryszczki jest obecnie główną ...

Jestem Jane Clifford. Jestem profesorem i kierownikiem katedry biochemii i biologii molekularnej w Drexel University College of Medicine, a ja nazywam się Ola Iv i jestem studentką w programie MD-PhD w laboratorium dr Clifford. Film, który przygotowaliśmy wraz z Olą, demonstruje hodowlę ex vivo rogówek pobranych od królików oraz ludzkich dawców.Wykorzystaliśmy te rogówki do badania infekcji wirusem opryszczki; są one oczywiście przydatne również w badaniu innych chorób rogówki i stanowią szczególnie istotny model ex vivo w porównaniu z monokulturami komórkowymi. Zapalenie rogówki wywołane przez wirusa opryszczki jest jedną z najcięższych patologii związanych z wirusem prostego opryczkowania typu 1. Obecnie jest ono główną przyczyną ślepoty pochodzenia rogówkowej i związanej z infekcjami w krajach rozwiniętych.Zapalenie rogówki wywołane przez wirusa opryszczki jest tradycyjnie badane w dwóch typach modeli eksperymentalnych. Model in vitro, w którym hodowane monowarstwy komórek nabłonka rogówki są infekowane w szalce Petriego, oferuje prostotę, wysoki poziom powtarzalności, szybkość przeprowadzania eksperymentów oraz stosunkowo niskie koszty. Z drugiej strony, model in vivo zapalenia rogówki, w którym zwierzęta, takie jak króliki lub myszy, są inokulowane bezpośrednio w rogówkę, zapewnia wysoce zaawansowany system fizjologiczny, lecz wiąże się z wyższymi kosztami, dłuższym czasem trwania eksperymentów, koniecznością opieki nad zwierzętami oraz większym stopniem zmienności.W niniejszym artykule wideo przedstawiamy szczegółową demonstrację nowego modelu ex vivo ostrego zakażenia nabłonka rogówki wirusem HSV-1, który łączy zalety modeli in vitro oraz in vivo. Model ex vivo wykorzystuje nienaruszone rogówki, które są zazwyczaj utrzymywane w hodowli i zakażane HSV. Zastosowanie modelu ex vivo pozwala na wyciąganie wniosków w dużym stopniu opartych na fizjologii, a jednocześnie jest on stosunkowo niedrogi i wymaga nakładów pracy porównywalnych z modelem in vitro.Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować następujące elementy: szalkę Petriego z solą fizjologiczną fosforanową (PBS), podłoże do hodowli rogówki i rusztowania, płytkę do nakładania próbek, pasek gazy, świeże gałkę oczną, skalpel, pęsetę oraz ostre nożyczki. Namoczyć wąski pasek gazy w PBS i owinąć nim gałkę oczną, aby stabilnie ją unieruchomić.Podczas procedury należy użyć ostrego skalpela, aby wykonać nacięcie styczne w twardówce w odległości około połowy centymetra od rogówki. Za pomocą nożyczek należy całkowicie wyciąć guzik rogówkowo-twardówkowy. W miarę rozszerzania nacięcia ciśnienie wewnątrz gałki ocznej będzie spadać, co utrudni utrzymanie i manipulację tkanką.Z tego powodu na tym etapie zalecamy użycie naostrzonej, niezawodnej pary nożyczek. Po wyizolowaniu przycisku rogówkowo-twardówkowego, delikatnie odsuń tęczówkę, trzymając brzeg twardówki pęsetą. Należy unikać uszkodzenia śródbłony lub wywierania nadmiernego nacisku na rogówkę.Przygotuj 1% roztwór agarozy w medium i zachowaj go w gotowości. W temperaturze 55 °C dokładnie wypłucz rogówkę w sterylnym PBS zawierającym penicylinę i streptomycynę. Umieść rogówkę stroną nabłonkową do dołu w studzience sterylnego urządzenia Spotlight.Dodaj agar zawierający pożywkę do wklęsłości śródbłonka rogówki. Ilość powinna być wystarczająca, aby całkowicie ją wypełnić. Odczekaj około jednej minuty, aż agar stężeje.Umieść rogówkę z podtrzymującym rusztowaniem agros stroną nabłonkową do góry w naczyniu hodowlanym i dodaj uzupełnione pożywkę MEM, aby pokryła powierzchnię nabłonka. Rogówkę można hodować w ten sposób przez ponad tydzień, zmieniając pożywkę co 48 godzin. Dodaj do naczynia hodowlanego jeden mililitr pożywki zawierającej pożądaną ilość wirusa.Umieść rogówkę z rusztowaniem agro stroną nabłonkową do dołu w medium zawierającym wirusa. Umieść rogówkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w celu przeprowadzenia infekcji przez jedną godzinę, wykonując okresowe kołysanie co 10 do 15 minut. Po upływie jednej godziny odessań medium zawierające wirusa i przemyj dwie do trzech razy PBS, aby usunąć pozostałe cząsteczki wirusa.Podczas płukania w PBS należy uważać, aby nie oddzielić rogówki od rusztowania agro. Należy dodać świeżą pożywkę, aby pokryła powierzchnię nabłonkową. Zabiegi eksperymentalne można rozpocząć przed lub po zakażeniu, w zależności od charakteru eksperymentu.Pożywkę hodowlaną wymienia się co 48 godzin. Pożywkę należy dobrze wymieszać i niezwłocznie wykorzystać do testu plackowego. Alternatywnie można ją przechowywać w temperaturze -80°C do późniejszego użycia. W przypadku pobierania próbek w różnych punktach czasowych, rogówkę należy dokładnie przepłukać PBS.Usuń rusztowanie agro, a następnie oddziel pierścień tkanki twardówki od rogówki, aby upewnić się, że pobrany zostanie wyłącznie materiał z nabłonka rogówki. Za pomocą skalpela zeskrob komórki nabłonka rogówki do odpowiedniego buforu, w zależności od rodzaju izolowanego materiału. Usunięcie brzegu twardówki pozwala na szybkie napęcznienie rogówki poprzez wchłanianie wody.Ponieważ obrzęk może utrudniać skrobanie, zaleca się szybkie wykonanie tego kroku oraz przepłukanie szalki Petriego, aby upewnić się, że zebrano całą próbkę. Usunąć rusztowanie hydrożelowe i dokładnie wypłukać rogówkę w PBS.W zależności od celu eksperymentalnego, przygotuj z rogówki blok tkanki parafiny lub blok tkanki mrożonej, zgodnie z przedstawioną tutaj procedurą. Osadź rogówkę w medium OCT (Optimal Cutting Temperature) w formie do próbek. Szybko zamroź rogówkę w kąpieli z etanolu i suchego lodu. W niniejszym filmie przedstawiono przygotowanie rogówek, ich dysekcję, umieszczenie w kulturze ex vivo oraz zakażanie rogówek wirusem opryszczki.Przedstawiona została technika opracowania modelu, który okazał się bardzo przydatny w naszych badaniach nad zakażeniem wirusem opryszczki ex vivo; mamy nadzieję, że okaże się on pomocny dla innych badaczy w eksperymentach z komórkami rogówki.

ex-vivo-organotypic-corneal-model-acute-epithelial-herpes-simplex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ex Vivo organotypowy model rogówki ostrej zakaźnej infekcji wirusem opryszczki pospolitej typu I

Większość badań nad opryszczkowym zapaleniem rogówki wykorzystuje model infekcji pierwotnej. Jednakże infekcja pierwotna HSV-1 zazwyczaj nie prowadzi do rozwoju choroby u ludzi. W niniejszej pracy opisujemy model nawrotowy opryszczkowej choroby rogówki, który dokładniej naśladuje przebieg choroby u ludzi.

Nawracające opłykowe zapalenie stromy rogówki u myszy jako model do badania ludzkiego HSK

Ten film opisuje protokół tworzenia modelu ex vivo dla bakteryjnego zapalenia rogówki za pomocą guzika korneo-twardówkowego wypreparowanego z oka świni. Zaszczepione bakterie przechodzą przez nacięcia nabłonka rogówki, aby zaatakować leżące poniżej zrąb i wywołać infekcję w tkankach rogówki, która naśladuje infekcję in vivo.

Model rogówki ex vivo świńskiego bakteryjnego zapalenia rogówki: technika ustalania infekcji bakteryjnej w komórkach nabłonka rogówki

Ten film demonstruje metodę przeprowadzania testu płytki nazębnej przy użyciu wirusa uzyskanego z zakażonej rogówki świni. Rogówka świni służy do testowania skuteczności przeciwwirusowej leków eksperymentalnych.

Określanie skuteczności przeciwwirusowej leków eksperymentalnych za pomocą testu płytki nazębnej

Ustaliliśmy protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania trwałego genomu wirusa DNA w sekcjach tkanek modeli zwierzęcych. Protokół ten umożliwia badanie procesu infekcji poprzez kodetekcję genomu wirusa, jego produktów RNA oraz białek wirusowych lub komórkowych w obrębie pojedynczych komórek.

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Skóra jest jednym z celów ludzkiego patogenu wirusa opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1). Aby zbadać drogę inwazji HSV-1 do tkanki, ustaliliśmy model infekcji ex vivo mysich arkuszy naskórka, które reprezentują najbardziej zewnętrzną warstwę skóry.

Ex vivo Zakażenie mysiego naskórka wirusem opryszczki pospolitej typu 1

Opisano protokół dla modelu hodowli narządów rogówki ex vivo, przydatnego do badań nad gojeniem się ran. Ten system modelowy może być używany do oceny działania środków wspomagających regeneracyjne gojenie lub toksyczność leków w zorganizowanym środowisku wielokomórkowym 3D.

Model hodowli narządów rogówki ex vivo do badań nad gojeniem się ran

Ten artykuł opisuje krok po kroku procedurę tworzenia modelu ex vivo świńskiego zapalenia bakteryjnego rogówki. Pseudomonas aeruginosa jest używany jako organizm prototypowy. Ten innowacyjny model naśladuje infekcję in vivo, ponieważ namnażanie się bakterii zależy od zdolności bakterii do uszkadzania tkanki rogówki.

Ustanowienie modelu rogówki ex vivo świni do badania leczenia farmakologicznego przeciwko bakteryjnemu zapaleniu rogówki

Opisujemy użycie rogówki świni do testowania skuteczności przeciwwirusowej eksperymentalnych leków.

Eksplant tkanki rogówki świni w celu zbadania skuteczności leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi opryszczki pospolitej-1

Tutaj opisany jest protokół tworzenia centralnej rany po otarciu nabłonka rogówki u myszy za pomocą trepanacji i kija golfowego. Ten model gojenia się ran rogówki jest wysoce powtarzalny i jest obecnie wykorzystywany do oceny upośledzonego gojenia się ran rogówki w kontekście chorób.

Model ścierania nabłonka do badania gojenia się ran rogówki

Tutaj tworzone są modele zwierzęce oparte na myszach i królikach do mechanicznego i chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki, aby przebadać nowe terapie i leżący u ich podstaw mechanizm.

Modele zwierzęce ex vivo i in vivo do mechanicznych i chemicznych urazów nabłonka rogówki

Opracowaliśmy szczurzy model ciężkiego zapalenia rogówki poprzez łyżeczkowanie nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi. W badaniu oceniano wzorce zapalenia rogówki, proliferację nabłonka i zmiany w rąbkowych komórkach macierzystych w stanach zapalnych.

Ustalenie modelu ciężkiego zapalenia rogówki u szczurów na podstawie łyżeczkowania nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi

Poznaj model ex vivo rogówki króliczej i ludzkiej do badania zakażenia wirusem HSV-1. Ta metoda łączy zalety kultur in vitro i modeli in vivo, oferując dokładniejsze wnioski fizjologiczne przy niższych kosztach.

Ex Vivo organotypowy model rogówki w ostrym zakażeniu nabłonka wirusem opryszczki prostym typu I

Przeglądaj więcej filmów