Name: Izolacja i ekspansja ludzkich komórek nowotworowych glejaka wielopostaciowego za pomocą testu neurosfery (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Naucz się izolować i rozszerzać komórki macierzyste z ludzkiego glejaka wielopostaciowego za pomocą testu neurosfery. Ta metoda umożliwia badanie biologii nowotworowej i identyfikację celów terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana z grantów przyznanych przez Florida Centre for Brain Tumor Research oraz Preston A. Wells Jr. Center for Brain Tumor Therapy.

1. Pobieranie pierwotnej tkanki GBM
<ol>
	<li>Guz glejaka wielopostaciowego (GBM) jest pobierany od pacjenta zdiagnozowanego w kierunku tego nowotworu i przechodzącego operację. </li>
	<li>Należy ustalić szczegóły z zespołem neurochirurgicznym. Neurochirurg umieści wycięty guz GBM w probówce o odpowiedniej wielkości zawierającej pożywkę podstawową dla neuralnych komórek macierzystych (NSC) uzupełnioną o 10-15% antybiotyków (penicylina/streptomycyna). Laboratorium musi dostarczyć zimną pożywkę na salę operacyjną. Alternatywnie, w tym celu można również zastosować zimną minimalną pożywkę niezbędną buforowaną HEPES (HEM) lub roztwór soli fizjologicznej (PBS) z wysokim stężeniem antybiotyków.</li>
	<li>Wycięta tkanka guza jest dostarczana do laboratorium w lodzie i umieszczana w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
</ol>
2. Dysocjacja guza pierwotnego do zawiesiny pojedynczych komórek
<ol>
	<li>Nadmiar oryginalnego medium/PBS usuwa się z probówki Falcon, a próbkę przemywa 2-3 razy 5-10ml PBS/podstawowego medium NSC, aby usunąć krew i zanieczyszczenia. PBS/medium usuwa się, a tkankę guza GBM przenosi do szalki Petriego.</li>
	<li>Tkankę tnie się na małe fragmenty, a następnie rozdrabnia za pomocą ostrza skalpela nr 10 na bardzo małe kawałki, aby zwiększyć powierzchnię kontaktu dla procesu trypsynizacji. Rozdrabnianie może trwać od 1 do 3 minut, w zależności od wielkości guza.</li>
	<li>Rozdrobnioną tkankę poddaje się trypsynizacji w 3-5ml uprzednio ogrzanej 0,05% trypsyny-EDTA przez 10-15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Do przeniesienia małych fragmentów guza wraz z trypsyną do probówki Falcon 15ml używa się pipety elektronicznej.</li>
	<li>Po okresie inkubacji dodaje się równą objętość inhibitora trypsyny z soi, aby zatrzymać enzymatyczną reakcję trypsyny.</li>
	<li>Inaktywację trypsyny zapewnia się poprzez kilkukrotne pipetowanie zawiesiny w górę i w dół. Następnie zawiesinę pelletuje się poprzez wirowanie przy 800rpm (110g) przez 5min.</li>
	<li>Nadpłyn odrzuca się, a fragmenty tkanki resuspenduje w 1ml sterylnego podstawowego medium NSC. Agregaty rozdziela się poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół (3-7 razy), aż do uzyskania gładkiej, mlecznej zawiesiny pojedynczych komórek. Liczba cykli pipetowania zależy bezpośrednio od wielkości cząstek w rozdrobnionej tkance. Należy unikać długotrwałej i gwałtownej dysocjacji mechanicznej, ponieważ może ona prowadzić do śmierci komórek i zmniejszenia liczby tworzonych sfer.</li>
	<li>Aby usunąć niedysocjowane fragmenty i zanieczyszczenia, do probówki dodaje się 10-15 ml medium podstawowego, a zawiesinę komórkową filtruje przez sitko komórkowe 40 mikronów do probówki 50ml.</li>
	<li>Przefiltrowaną zawiesinę wiruje się przy 800rpm (110g) przez 5min. Następnie odrzuca się nadpłyn.</li>
	<li>Pellet komórek resuspenduje się w 1-2ml pełnego medium NSC w celu policzenia komórek.</li>
</ol>
3. Liczenie i wysiew komórek
<ol>
	<li>Do probówki eppendorfa o pojemności 1 ml dodaje się 10 μL zawiesiny komórkowej do 90 μL 0,04% błękitu trypanu. 
	Uwaga: można stosować również inne odpowiednie rozcieńczenia komórek.</li>
	<li>Zawiesinę miesza się, pipetując ją w górę i w dół. Następnie 10 μL mieszaniny komórek z błękitem trypanu przenosi się do hemocytometru w celu oznaczenia gęstości komórek.</li>
	<li>Komórki wysiewa się do odpowiednich naczyń hodowlanych w pełnej pożywce NSC (mieszanina podstawowej pożywki NSC i suplementu proliferacyjnego NSC w stosunku 9:1) uzupełnionej o 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml bFGF oraz 1 μl/ml 0,2% heparyny (2 μg/ml). Dla kolb T25, T80 i T175 stosuje się odpowiednio 5, 20 i 40 ml pożywki. Aby zmniejszyć ryzyko kontaminacji, do pożywki można dodać antybiotyki w stężeniu 1:100.</li>
	<li>Kolbę umieszcza się w inkubatorze ustawionym na 37°C i 5% CO2.</li>
</ol>
4. Pasażowanie i ekspansja sfer pochodzących z GBM:
<ol>
	<li>Gdy neurosfery osiągną średnicę średnio 150-200 μm, hodowla jest gotowa do pasażowania. Zawartość każdej kolby należy przenieść do sterylnej probówki do hodowli tkanek o odpowiedniej wielkości i odwirować przy 800 rpm (110 g) przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Należy usunąć nadsącz, a osad resuspenderować w 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Aby uzyskać optymalną trypsynizację, zawiesinę komórkową inkubuje się w łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez 2-3 min. Aby zatrzymać działanie trypsyny, do zawiesiny komórkowej dodaje się taką samą objętość inhibitora trypsyny sojowej, a następnie zawiesinę delikatnie pipetuje się w górę i w dół.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową wiruje się przy 800 rpm (110g) przez 5 min. Następnie usuwa się nadsącz, a komórki resuspenderuje w 1 ml pożywki NSC.</li>
	<li>Liczbę komórek ocenia się zgodnie z opisem powyżej.</li>
	<li>Komórki wysiewa się w stężeniu 5x104 komórek/ml w pełnej pożywce NSC uzupełnionej o czynniki wzrostu, wykorzystując naczynia do hodowli tkanek o odpowiedniej wielkości, zgodnie z opisem w poprzedniej części.</li>
	<li>Wtórne neurosfery tworzą się w ciągu 7-10 dni podczas inkubacji w temperaturze 37°C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Po wysianiu pojedynczych komórek pozyskanych z tkanki guza GBM, nowotworowe komórki macierzystopodobne proliferują i w ciągu 3-4 dni tworzą niewielkie skupiska złożone z kilku komórek (patrz wideo i Rysunek 1). Wraz ze wzrostem skupiska te przyjmują bardziej sferyczny kształt, tak że po 7-8 dniach tworzą się prawidłowe sfery widoczne w kontraście fazowym o średnicy średnio 150-200 mikronów (patrz wideo i Rysunek 2). Przy większym powiększeniu zdrowe sfery zazwyczaj wykazują obecność mikrokolców na obwodzie. Pojawienie się dużych skupisk przypominających sfery w ciągu 1-2 dni po rozpoczęciu hodowli wynika z obecności niezdysocjowanych agregatów na początku hodowli i nie powinno być mylone z prawdziwymi sferami. Ilość zanieczyszczeń w pierwotnej hodowli sfer nowotworowych różni się w zależności od początkowego źródła tkanki oraz tego, czy obejmuje ona otaczającą tkankę mózgową. Prawidłowe techniki przygotowania tkanki, w tym dysocjacja enzymatyczna i mechaniczna oraz późniejsza filtracja próbki z odpowiednią ilością pożywki, mogą skutkować mniejszą ilością zanieczyszczeń w hodowli.
<img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig1.jpg" alt="Proces podziału komórki na obrazach mikroskopowych, przedstawiający różne stadia mitozy komórkowej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Pierwotna hodowla sfer GBM 4 dni po wysianiu. Macierzystopodobne komórki nowotworowe proliferują i tworzą małe skupiska komórek w ciągu 3-4 dni. Powiększenie pierwotne; 20x.
<img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig2.jpg" alt="Tworzenie sferoidów, obraz mikroskopowy, technika hodowli komórkowej, model 3D in vitro, badania nad rakiem." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Hodowla sfer GBM z pierwszego pasażu 8 dni po wysianiu. Powiększenie oryginalne; 20x.

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).</li>
<li>Eramo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).</li>
<li>Patrawala, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+purified+CD44%2B+prostate+cancer+cells+from+xenograft+human+tumors+are+enriched+in+tumorigenic+and+metastatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells.</a> Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).</li>
<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).</li>
<li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li>
<li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134, 1331-1343 (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W celu izolacji neuralnych komórek macierzystych i progenitorowych z normalnych mózgów dorosłych i płodowych1, 2, 3, 4, a także komórek nowotworowych o charakterze macierzystym z tkanek rakowych, takich jak płuca5, prostata6, pierś7 i mózg8, 9, często stosowanym rozwiązaniem jest test neurosfer. Dzięki temu prostemu i powtarzalnemu badaniu można wygenerować nieokreśloną liczbę komórek z wyciętą tkanki nowotworowej, które wykazują cechy podobne do somatycznych komórek macierzystych: wielopotencjalność ex vivo, zdolność do tworzenia nowych guzów po implantacji oraz zdolność do samoodnawiania. Komórki te mogą być wykorzystane do badania podstawowej biologii komórek nowotworowych, w tym oddziaływań międzykomórkowych, różnicowania, migracji, inwazji i śmierci komórkowej. Ponadto izolowane komórki nowotworowe o charakterze macierzystym stanowią niezwykle cenne narzędzie do badania sposobów powstawania, progresji i nawrotów nowotworów, a także do odkrywania leżących u ich podstaw mechanizmów komórkowych, co w przyszłości może dostarczyć informacji na temat opcji terapeutycznych.

<table><tbody><tr><td>Podłoże podstawowe NeuroCult NSC (ludzkie)</td><td>Podłoże</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05750</td><td></td></tr><tr><td>Suplementy do proliferacji NeuroCult NSC (ludzkie)</td><td>Suplement do podłoża</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05753</td><td></td></tr><tr><td>%0,05 trypsyny-EDTA</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>*MEM</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>41500-018</td><td>składnik HEM</td></tr><tr><td>*HEPES</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>składnik HEM</td></tr><tr><td>*Woda destylowana</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15230-147</td><td></td></tr><tr><td>**DNaza I</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>104159</td><td></td></tr><tr><td>**Inhibitor trypsyny z soi</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela nr 10</td><td>Narzędzie chirurgiczne</td><td>BD Biosciences</td><td>371610</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Naczynie hodowlane</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Mała pęseta</td><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Sito do komórek</td><td>Sito</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Kolba T25</td><td>Naczynie hodowlane</td><td>Nalge Nunc international</td><td>136196</td><td></td></tr><tr><td>Kolba T80</td><td>Naczynie hodowlane</td><td>Nalge Nunc international</td><td>178905</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>Naczynie hodowlane</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 50 ml</td><td>Naczynie hodowlane</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Czynnik wzrostu</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2028-EG</td><td></td></tr><tr><td>b-FGF</td><td>Czynnik wzrostu</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3139-FB</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Czynnik wzrostu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784</td><td>Rekonstytuowana w PBS</td></tr><tr><td colspan="5">* Aby przygotować HEM, zmieszać pakiet MEM 1x10L i 160 ml 1M HEPES, a następnie dopełnić objętość do 8,75 L wodą destylowaną. Ustawić końcowe pH na 7,4 i przechowywać w temperaturze 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td colspan="5">** Aby przygotować roztwór inhibitora trypsyny, najpierw przygotować 10 ml roztworu DNazy I (100 mg DNazy rozpuszczonej w 100 ml HEM), a następnie dodać 0,14 g inhibitora trypsyny do roztworu DNazy i na koniec dopełnić objętość do 1 litra za pomocą HEM. Alikwoty produktu końcowego przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20&amp;#x00B0;C.</td></tr></tbody></table>

izolacja i ekspansja komórek nowotworowych glejaka wielopostaciowego człowieka z wykorzystaniem testu neurosferycznego

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Komórki macierzystopodobne zostały wyizolowane z takich nowotworów jak rak piersi, płuca, jelita grubego, prostaty oraz mózgu. Krytyczną kwestią we wszystkich tych nowotworach, zwłaszcza w przypadku wielopostaciowego glejaka (GBM), jest identyfikacja i izolacja populacji komórek inicjujących nowotwór w celu zbadania ich roli w powstawaniu, progresji i nawrotach choroby. Zrozumienie populacji komórek inicjujących nowotwór dostarczy wskazówek do znalezienia skutecznych metod terapeutycznych dla tych typów nowotworów. Test neurosfer (NSA), ze względu na swoją prostotę i powtarzalność, jest preferowaną metodą izolacji i propagacji wielu z tych komórek nowotworowych. Niniejszy protokół przedstawia metodę hodowli neurosfer w celu izolacji i namnażania komórek macierzystopodobnych z chirurgicznie wyresekowanej tkanki ludzkiego nowotworu GBM. Procedury obejmują wstępne trawienie chemiczne i mechaniczną dysocjację tkanki nowotworowej, a następnie wysianie otrzymanej zawiesiny pojedynczych komórek w kulturze NSA. Po 7–10 dniach można zaobserwować pierwotne neurosfery o średnicy 150–200 μm, które są gotowe do dalszego pasażowania i namnażania.

Niniejszy protokół wideo demonstruje izolację i ekspansję komórek macierzystych z chirurgicznie wyciętej tkanki guza glejaka wielopostaciowego (GBM) u człowieka przy użyciu metody hodowli neurosfer.

Izolacja i ekspansja komórek nowotworowych glejaka wielopostaciowego człowieka z wykorzystaniem testu neurosferycznego

W nowotworach takich jak rak piersi, płuc, jelita grubego, prostaty oraz mózgu wyizolowano komórki o charakterze macierzystym. Kluczową kwestią we wszystkich tych nowotworach, szczególnie w...

Celem niniejszego protokołu jest izolacja i ekspansja komórek nowotworu glejaka wielopostaciowego człowieka z wykorzystaniem metody neurosfer. Osiąga się to poprzez najpierw rozdrobnienie pobranej tkanki nowotworowej, następnie mechaniczną dysocjację, a na koniec wysianie otrzymanych komórek w celu hodowli w formie neurosfer. W tym filmie pokażemy, jak izolować i namnażać komórki macierzyste z tkanki nowotworowej glejaka wielopostaciowego człowieka przy użyciu metody hodowli neurosfer.Niniejszą metodę można wykorzystać również do hodowli komórek z innych guzów mózgu, a także z guzów litych, takich jak guzy piersi, prostaty, wątroby i płuc. Przejdźmy do procedury. Po otrzymaniu wyciętego podczas operacji fragmentu tkanki guza GBM, usuwa się medium.Guz przemywa się dwa lub trzy razy sterylnym PBS, aby usunąć zanieczyszczenia, takie jak krew i szczątki tkankowe. Po przemyciu wycięty guz umieszcza się w sterylnej czarce Petriego. Najpierw należy podzielić guz na mniejsze części, następnie przenieść fragment tkanki guza do oddzielnej czarki Petriego i posiekać tkankę na bardzo małe kawałki za pomocą skalpela nr 10.Zwiększy to powierzchnię dostępną dla dysocjacji enzymatycznej. Rozdrabnianie może trwać od jednej do trzech minut, w zależności od wielkości guza. Następnie dodaj od 3 do 5 ml uprzednio podgrzanej trypsyny do rozdrobnionej tkanki i przenieś ją do 15 ml sterylnej probówki typu Falcon.Umieść probówkę 15 ml w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C na 10 do 15 minut. Wstrząsaj probówką co pięć minut. Aby zapewnić lepsze trawienie tkanki, dodaj równą objętość inhibitora trypsyny w celu zatrzymania reakcji.Aktywację trypsyny zapewnia kilkukrotne pipetowanie zawiesiny w górę i w dół. Odwiruj zawiesinę przy 800 RRP M lub 110 G przez pięć minut. Usuń nadsącz, a następnie resuspenderuj osad w 1 ml podstawowej pożywki dla neuronalnych komórek macierzystych, przykładając końcówkę pipety do dna probówki.Pipetuj ciecz w górę i w dół od trzech do siedmiu razy, aby rozbić grudki i uzyskać mleczną zawiesinę; nadmierne pipetowanie może doprowadzić do śmierci komórek. Umieść filtr 40 µm na probówce 50 ml. Następnie dodaj 10-15 ml pożywki podstawowej do zawiesiny komórkowej i delikatnie wymieszaj, po czym przepuść zawiesinę komórkową przez filtr 40 µm w celu usunięcia resztek i niepołączonych grudek.Odwirować komórki i odessać supernat. Resuspendować komórki w 1–2 ml pełnej pożywki. Następnie delikatnie pipetować zawiesinę w górę i w dół w celu jej homogenizacji.Wymieszaj 10 µL zawiesiny komórkowej z 90 µL błękitu trypanowego. Dokładnie wymieszaj zawiesinę, a następnie przenieś 10 µL do hemo.Cytometer. Wykonaj zliczenie komórek zgodnie z przedstawioną procedurą.Aby uzyskać dokładny wynik zliczenia komórek, wymagana jest zawiesina pojedynczych komórek bez aglomeratów. Nie należy uwzględniać komórek wybarwiających się na niebiesko w próbie z błękitem trypanowym. Należy zliczyć komórki przed ich wysianiem do kolby T 80.Do probówki o pojemności 50 ml dodać 20 ml kompletnej pożywki dla neuronalnych komórek macierzystych. Dodać odpowiednią ilość zawiesiny komórkowej, aby uzyskać gęstość 200 000 komórek na ml. Następnie dodać EGF, aby osiągnąć końcowe stężenie 20 nanogram na ml.Dodać 0,2% heparyny w stężeniu 1 µL/ml. Na koniec dodać BFGF, aby uzyskać stężenie końcowe 10 ng/ml. Wymieszać komórki w pełnej pożywce uzupełnionej o czynniki wzrostu.Następnie przenieś zawiesinę do kolby T 80 z etykietą. Kolbę przenieś do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na okres od siedmiu do 10 dni. Po ośmiu dniach hodowli sfery są w pełni wyrośnięte i gotowe do pasażowania.Zebrać zawartość kolby i przenieść do probówki do wirowania o pojemności 50 ml. Wirować komórki przy 800 RPM przez pięć minut. Odessać nadmiar supernatantu, a następnie resuspender osad w 1 ml uprzednio ogrzanej trypsyny.Inkubuj komórki w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez dwie minuty. Dodaj równą ilość inhibitora trypsyny i wymieszaj dokładnie, aby zapewnić aktywację. Następnie odwiruj komórki, aby uzyskać osad.Usunąć supernatant i resuspender komórki w 1 ml pożywki kompletnej, delikatnie pipetując w górę i w dół w celu ujednorodnienia zawiesiny komórkowej. Przeprowadzić zliczenie komórek zgodnie z wcześniejszym opisem, aby zasiać komórki w kolbie T 80 w 20 ml pożywki kompletnej w probówce 50 ml. Dodać odpowiednią ilość zawiesiny komórkowej, aby osiągnąć gęstość 50 000 komórek na ml.Teraz należy dodać czynniki wzrostu, w tym E-G-F-B-F-G-F, oraz heparynę w stężeniu opisanym wcześniej. Delikatnie wymieszaj powstałą zawiesinę komórkową, a następnie przenieś ją do kolby T 80 i umieść w inkubatorze na okres od siedmiu do 10 dni. Oto przykład pierwotnej hodowli GBM.Po czterech dniach na tym etapie można zauważyć, że komórki proliferują i zaczynają tworzyć sferoidy. Na tym etapie nie powinny być widoczne duże sferyczne skupiska komórek. Ich obecność byłaby wynikiem niewłaściwego przygotowania tkanki.Po siedmiu do 10 dniach hodowli uformowały się sfery o różnej wielkości. Gdy sfery osiągną średnicę średnią od 150 do 200 mikronów, są gotowe do pasażowania. Jest to przykład pasażowania hodowli GBM po ośmiu dniach. Ponownie można zauważyć sfery o różnych rozmiarach; zdrowe sfery wykazują obecność mikrokolców na ich obwodzie.Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek jest kwestią kluczową w każdej hodowli sferycznej. W przeciwnym razie można zaobserwować agregaty komórkowe nawet dzień po wysianiu komórek. Agregaty te mogą zostać uznane za sfery, należy jednak zaznaczyć, że sferoidy powstające z rozdzielonych komórek formują się w ciągu co najmniej tygodnia.Ilość zanieczyszczeń w pierwotnej hodowli sfer nowotworowych różni się w zależności od wielu czynników, takich jak źródło tkanki, precyzja pobrania tkanki oraz zastosowana technika przetwarzania tkanki. Mamy nadzieję, że ten film okaże się pomocny, i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

isolation-expansion-human-glioblastoma-multiforme-tumor-cells-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Izolacja i ekspansja ludzkich komórek guzowych wieloformowych glioblastoma przy użyciu testu neurosferowego

Niniejszy protokół wideo demonstruje metodę testu neurosfer w celu generowania i namnażania neuralnych komórek macierzystych z obszaru okołokomorowego dorosłej myszy oraz dostarcza wskazówek technicznych pozwalających na uzyskanie powtarzalnych kultur neurosfer.

Izolacja i ekspansja dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Ten film demonstruje test in vitro inwazji komórek macierzystych guza mózgu (BTSC) w celu określenia wpływu leczenia farmakologicznego na zdolność inwazji BTSC z neurosfery za pomocą techniki obrazowania żywych komórek.

Test inwazji neurosfery komórek macierzystych guza mózgu (BTSC): Test in vitro do analizy wpływu leczenia farmakologicznego na inwazję BTSC z neurosfery

Protokół rozmnażania zdysocjowanych próbek chirurgicznych glejaka wysokiego stopnia w pożywce neurosfery wolnej od surowicy do selekcji komórek o fenotypie rakowych komórek macierzystych. W przypadku próbek, które nie rosną jako neurosfery, sugerowany jest alternatywny protokół. Opisano technikę zatapiania parafiny w celu utrzymania architektury neurosfery 3D dla immunocytochemii.

Optymalizacja hodowli komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości z próbek chirurgicznych do zastosowania w klinicznie istotnych modelach zwierzęcych i immunochemii 3D

Tutaj opisujemy techniki obrazowania żywych komórek, aby ilościowo zmierzyć migrację i inwazję komórek macierzystych glejaka mózgu w czasie i w wielu warunkach leczenia.

Testy obrazowania żywych komórek w celu zbadania migracji i inwazji komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego guza mózgu

Neurosfery wyhodowane jako kultury 3D stanowią potężne narzędzie do badania biologii glejaka. W tym miejscu przedstawiamy protokół przeprowadzania immunohistochemii przy zachowaniu struktury 3D neurosfer glejaka poprzez zatapianie parafiny. Metoda ta umożliwia scharakteryzowanie właściwości neurosfery glejaka, takich jak łodyga i różnicowanie neuronalne.

Ocena biomarkerów w glejaku za pomocą immunohistochemii na kulturach neurosfery 3D glejaka zatopionych w parafinie

Tutaj prezentujemy system mieszanych hodowli jednowarstwowych ex-vivo do badania migracji ludzkich komórek glejaka (hGC) w czasie rzeczywistym. Model ten zapewnia możliwość obserwowania interakcji między hGC a aksonami mielinizowanymi i niemielinizowanymi w obrębie komory z przedziałami.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym migracji komórek ludzkiego glejaka w kokulturach aksonów i oligodendrocytów w zwoju korzenia grzbietowego

W tym artykule szczegółowo opisujemy protokół generowania kultur neurosfery z pourodzeniowych mysich nerwowych komórek macierzystych pochodzących z głównych nisz neurogennych myszy. Neurosfery służą do identyfikacji nerwowych komórek macierzystych z tkanki mózgowej, co pozwala na oszacowanie liczby komórek prekursorowych. Co więcej, te struktury 3D mogą być powlekane w warunkach różnicowania, dając początek neuronom, oligodendrocytom i astrocytom, umożliwiając badanie losu komórek.

Izolacja i ekspansja neurosfer z postnatalnych (P1−3) mysich nisz neurogennych

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Tutaj opisujemy łatwy w użyciu test na inwazję glejaka. Ten test jest odpowiedni dla komórek macierzystych podobnych do glejaka. Opisano również makro Fidżi do łatwego ilościowego określania inwazji, migracji i proliferacji.

Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego

Przedstawiamy trójwymiarowy model migracji glejaka glejaka wykorzystującego magnetyczne gliomasfery pochodzące od pacjentów, generowane z nowo zdiagnozowanych i nawracających guzów. Platforma ta umożliwia wizualizację specyficznych dla pacjenta dynamiki migracji oraz ocenę skuteczności terapeutycznej. Test może być multipleksowany po migracji, aby ocenić lokalizację i wzorce ekspresji białek.

Powtarzalny 3D test migracji glejaka z magnetyczną lokalizacją sferoidów za pośrednictwem nanocząstek magnetycznych w warunkach hipoksycznych

Naucz się izolować i rozszerzać komórki macierzyste z ludzkiego glejaka wielopostaciowego za pomocą testu neurosfery. Ta metoda umożliwia badanie biologii nowotworowej i identyfikację celów terapeutycznych.

Izolacja i ekspansja komórek nowotworowych glejaka wielopostaciowego człowieka z wykorzystaniem testu neurosferycznego

Przeglądaj więcej filmów