Izolacja i ekspansja komórek nowotworowych glejaka wielopostaciowego człowieka z wykorzystaniem testu neurosferycznego

Celem niniejszego protokołu jest izolacja i ekspansja komórek nowotworu glejaka wielopostaciowego człowieka z wykorzystaniem metody neurosfer. Osiąga się to poprzez najpierw rozdrobnienie pobranej tkanki nowotworowej, następnie mechaniczną dysocjację, a na koniec wysianie otrzymanych komórek w celu hodowli w formie neurosfer. W tym filmie pokażemy, jak izolować i namnażać komórki macierzyste z tkanki nowotworowej glejaka wielopostaciowego człowieka przy użyciu metody hodowli neurosfer.

Niniejszą metodę można wykorzystać również do hodowli komórek z innych guzów mózgu, a także z guzów litych, takich jak guzy piersi, prostaty, wątroby i płuc. Przejdźmy do procedury. Po otrzymaniu wyciętego podczas operacji fragmentu tkanki guza GBM, usuwa się medium.

Guz przemywa się dwa lub trzy razy sterylnym PBS, aby usunąć zanieczyszczenia, takie jak krew i szczątki tkankowe. Po przemyciu wycięty guz umieszcza się w sterylnej czarce Petriego. Najpierw należy podzielić guz na mniejsze części, następnie przenieść fragment tkanki guza do oddzielnej czarki Petriego i posiekać tkankę na bardzo małe kawałki za pomocą skalpela nr 10.

Zwiększy to powierzchnię dostępną dla dysocjacji enzymatycznej. Rozdrabnianie może trwać od jednej do trzech minut, w zależności od wielkości guza. Następnie dodaj od 3 do 5 ml uprzednio podgrzanej trypsyny do rozdrobnionej tkanki i przenieś ją do 15 ml sterylnej probówki typu Falcon.

Umieść probówkę 15 ml w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C na 10 do 15 minut. Wstrząsaj probówką co pięć minut. Aby zapewnić lepsze trawienie tkanki, dodaj równą objętość inhibitora trypsyny w celu zatrzymania reakcji.

Aktywację trypsyny zapewnia kilkukrotne pipetowanie zawiesiny w górę i w dół. Odwiruj zawiesinę przy 800 RRP M lub 110 G przez pięć minut. Usuń nadsącz, a następnie resuspenderuj osad w 1 ml podstawowej pożywki dla neuronalnych komórek macierzystych, przykładając końcówkę pipety do dna probówki.

Pipetuj ciecz w górę i w dół od trzech do siedmiu razy, aby rozbić grudki i uzyskać mleczną zawiesinę; nadmierne pipetowanie może doprowadzić do śmierci komórek. Umieść filtr 40 µm na probówce 50 ml. Następnie dodaj 10-15 ml pożywki podstawowej do zawiesiny komórkowej i delikatnie wymieszaj, po czym przepuść zawiesinę komórkową przez filtr 40 µm w celu usunięcia resztek i niepołączonych grudek.

Odwirować komórki i odessać supernat. Resuspendować komórki w 1–2 ml pełnej pożywki. Następnie delikatnie pipetować zawiesinę w górę i w dół w celu jej homogenizacji.

Wymieszaj 10 µL zawiesiny komórkowej z 90 µL błękitu trypanowego. Dokładnie wymieszaj zawiesinę, a następnie przenieś 10 µL do hemo.Cytometer. Wykonaj zliczenie komórek zgodnie z przedstawioną procedurą.

Aby uzyskać dokładny wynik zliczenia komórek, wymagana jest zawiesina pojedynczych komórek bez aglomeratów. Nie należy uwzględniać komórek wybarwiających się na niebiesko w próbie z błękitem trypanowym. Należy zliczyć komórki przed ich wysianiem do kolby T 80.

Do probówki o pojemności 50 ml dodać 20 ml kompletnej pożywki dla neuronalnych komórek macierzystych. Dodać odpowiednią ilość zawiesiny komórkowej, aby uzyskać gęstość 200 000 komórek na ml. Następnie dodać EGF, aby osiągnąć końcowe stężenie 20 nanogram na ml.

Dodać 0,2% heparyny w stężeniu 1 µL/ml. Na koniec dodać BFGF, aby uzyskać stężenie końcowe 10 ng/ml. Wymieszać komórki w pełnej pożywce uzupełnionej o czynniki wzrostu.

Następnie przenieś zawiesinę do kolby T 80 z etykietą. Kolbę przenieś do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na okres od siedmiu do 10 dni. Po ośmiu dniach hodowli sfery są w pełni wyrośnięte i gotowe do pasażowania.

Zebrać zawartość kolby i przenieść do probówki do wirowania o pojemności 50 ml. Wirować komórki przy 800 RPM przez pięć minut. Odessać nadmiar supernatantu, a następnie resuspender osad w 1 ml uprzednio ogrzanej trypsyny.

Inkubuj komórki w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez dwie minuty. Dodaj równą ilość inhibitora trypsyny i wymieszaj dokładnie, aby zapewnić aktywację. Następnie odwiruj komórki, aby uzyskać osad.

Usunąć supernatant i resuspender komórki w 1 ml pożywki kompletnej, delikatnie pipetując w górę i w dół w celu ujednorodnienia zawiesiny komórkowej. Przeprowadzić zliczenie komórek zgodnie z wcześniejszym opisem, aby zasiać komórki w kolbie T 80 w 20 ml pożywki kompletnej w probówce 50 ml. Dodać odpowiednią ilość zawiesiny komórkowej, aby osiągnąć gęstość 50 000 komórek na ml.

Teraz należy dodać czynniki wzrostu, w tym E-G-F-B-F-G-F, oraz heparynę w stężeniu opisanym wcześniej. Delikatnie wymieszaj powstałą zawiesinę komórkową, a następnie przenieś ją do kolby T 80 i umieść w inkubatorze na okres od siedmiu do 10 dni. Oto przykład pierwotnej hodowli GBM.

Po czterech dniach na tym etapie można zauważyć, że komórki proliferują i zaczynają tworzyć sferoidy. Na tym etapie nie powinny być widoczne duże sferyczne skupiska komórek. Ich obecność byłaby wynikiem niewłaściwego przygotowania tkanki.

Po siedmiu do 10 dniach hodowli uformowały się sfery o różnej wielkości. Gdy sfery osiągną średnicę średnią od 150 do 200 mikronów, są gotowe do pasażowania. Jest to przykład pasażowania hodowli GBM po ośmiu dniach. Ponownie można zauważyć sfery o różnych rozmiarach; zdrowe sfery wykazują obecność mikrokolców na ich obwodzie.

Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek jest kwestią kluczową w każdej hodowli sferycznej. W przeciwnym razie można zaobserwować agregaty komórkowe nawet dzień po wysianiu komórek. Agregaty te mogą zostać uznane za sfery, należy jednak zaznaczyć, że sferoidy powstające z rozdzielonych komórek formują się w ciągu co najmniej tygodnia.

Ilość zanieczyszczeń w pierwotnej hodowli sfer nowotworowych różni się w zależności od wielu czynników, takich jak źródło tkanki, precyzja pobrania tkanki oraz zastosowana technika przetwarzania tkanki. Mamy nadzieję, że ten film okaże się pomocny, i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.