Prosta i niezawodna metoda in vivo oraz in vitro do badania składania wirusów

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie składania wirusów in vivo oraz in vitro. Osiąga się to poprzez najpierw ekspresję RNA wirusa mozaiki bro w bakteriach, a następnie wprowadzenie ich do komórek roślinnych za pomocą agroinfiltracji. Następnie wiriony BMV są oczyszczane z infiltrowanych liści.

Następnie przygotowuje się podjednostki białka kapsydu do montażu in vitro. Na koniec wiriony BMV Varians są składane in vitro przy użyciu białka kapsydu i barwnika indocyjaniny zielonej. Ostatecznie wyniki wykazują montaż in vitro bro mosaic varians poprzez tworzenie tzw. „optických duchów” (optical ghosts), co można określić za pomocą absorbancji i emisji fluorescencji.

Dzisiaj zaprezentujemy technikę nazywaną filtracją, która jest przydatna do dostarczania komponentów wirusowych do roślin. Główną zaletą tej techniki jest wyeliminowanie konieczności tworzenia transkrypcji in vitro, a jednocześnie pozwala ona na dostarczenie wielu komponentów do tej samej komórki, co umożliwia zsynchronizowaną infekcję. Prace, które obecnie prowadzimy, dotyczą wykorzystania wirusa mozaiki bro w połączeniu z zatwierdzonym przez FDA chromoforem cyjanowym w celu wytworzenia nowego typu nanocząsteczek do zastosowań biomedycznych.

Naszą szczególną intencją jest wykorzystanie tych konstruktów, które nazywamy optycznymi „widmami” drutów lub OB-gs, w modalnościach obrazowania optycznego, w tym w obrazowaniu fluorescencyjnym i fotoakustycznym, a także jako nośnik w terapii laserowej. Konkretnym zastosowaniem klinicznym, nad którym obecnie pracujemy, jest wykorzystanie tych konstruktów do obrazowania raka jajnika w połączeniu z procedurami śródoperacyjnymi. Zamysł polega na tym, że możemy funkcjonalizować te konstrukty.

OBG z konkretnym motywem celującym, który potrafi rozpoznawać resztkowe komórki nowotworowe, które w przypadku raka jajnika mogą znajdować się szczególnie w jamie otrzewnowej. Z płytki z wcześniej przygotowaną agrobacterium zawierającą RNA wirusa mozaiki brązowej typu jeden, dwa lub trzy, wybierz pojedynczą kolonię, aby zaszczepić 2 mL LB zawierającego 50 µg/mL kanamycyny i 100 µg/mL rifampicyny. Inkubuj kulturę przez jeden dzień w temperaturze 28 °C w wytrząsarce orbitalnej przy 250 RPM. Następnego dnia zaszczep 50 mL LB w kolbie Erlenmeyera o pojemności 500 mL za pomocą 1 mL kultury i inkubuj przez 16 godzin w temperaturze 28 °C w wytrząsarce orbitalnej przy 250 RPM. Gdy kultury osiągną OD 600 wynoszącą 1,0, przenieś je do sterylnych probówek o pojemności 30 mL i wiruj przez 10 minut.

Przy 5 000 RPM i temperaturze czterech stopni Celsjusza rozpuścić osady w 10 mililitrach 10 milimolowego chlorku magnezu, a następnie wirować przez 10 minut przy 5 000 RPM i temperaturze czterech stopni Celsjusza. Powtórzyć ten krok jeszcze raz, aby zapewnić całkowite usunięcie antybiotyku. Następnie zawiesić osady w 10 mililitrach buforu zawierającego 10 milimolowy MES i 10 milimolowy chlorek magnezu.

Zmierz OD 600 dla każdej kultury i dostosuj do wartości OD 600 wynoszącej 0,1, używając 10 millimolarnego chlorku magnezu i 10 millimolarnego MES. Następnie połącz po 10 mililitrów każdej z trzech zawiesin kultur o OD 600 równym 0,1. Dodaj acetofenon do stężenia końcowego 100 millimolarnego.

Wymieszać delikatnie i pozostawić mieszaninę bezyruchu w temperaturze pokojowej przez trzy godziny. Po inkubacji naciągnąć kulturę do strzykawki o pojemności 1 ml bez igły. Infiltrować zawiesinę kultury do strony abaksjalnej dwóch do trzech dobrze rozwiniętych liści N hamana, delikatnie dociskając strzykawkę do połowy powierzchni abaksjalnej każdego liścia.

Infiltrowane rośliny należy przechowywać w szklarni w temperaturze 24 °C przez trzy do czterech dni przed zbiorem liści. Po oczyszczeniu wirionów BMV należy przygotować jeden litr buforu do dysocjacji wirusa 1x. Następnie należy przygotować membranę dializacyjną.

Zgodnie z metodą Sambrooka i wsp., należy odmierzyć od 5 do 10 mg/ml oczyszczonego wirusa do worka dializacyjnego, a następnie umieścić worek w kolbie zawierającej 1x bufor dysocjacyjny wirusa. Dializę wirusa należy prowadzić przez 24 godziny w temperaturze 4 °C przy ciągłym mieszaniu.

Zebrać roztwór z worka dializacyjnego i odwirować przy 30 000 RPM przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby wytrącić niepowiązane cząsteczki wirusa. Nadfiltr odwirować przy 30 000 RPM przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po przygotowaniu transkrypcji RNA do ponownego złożenia w wiriony, zmieszać podjednostki białka kapsydu i transkrypcje RNA w stosunku jeden do pięciu.

Przenieś mieszaninę do worka dializacyjnego i odpowiednio go zabezpiecz, aby uniknąć wycieków. Po przygotowaniu jednego litra buforu do montażu RNA 1X, dializuj mieszaninę reakcyjną w buforze w temperaturze 4°C przez 24 godziny. Następnego dnia wyjmij mieszaninę z worka dializacyjnego i dodaj 1,5 ml buforu do montażu RNA, a następnie ponownie odwirowuj przy 30 000 RPM przez trzy godziny w temperaturze 4°C. Następnie usuń nadsącz i resuspenduj osad.

Następnie oszacuj stężenie wirionów przy OD 260 nanometrów. Potem określ stężenie podjednostek białek kapsydu przy OD 280 nanometrów lub za pomocą innych metod, takich jak test Bradforda, aby ocenić integralność dysocjowanych podjednostek białek kapsydu. Przeprowadź elektroforezę SDS-PAGE w zakresie 12-15% z następującym western blottingiem. Na koniec postępuj zgodnie z procedurą opisaną w protokole pisemnym, aby wytworzyć optyczne widma wirusowe (viral ghosts) lub ov cheese.

Przedstawiony tutaj obraz z transmisyjnego mikroskopu elektronowego ukazuje negatywnie barwione wariony BMV oczyszczone z roślin end hamana, które zostały poddane agroinfiltracji mieszaniną wszystkich trzech konstruktów agri BMV typu dzikiego. Ten obraz TEM przedstawia negatywnie barwione optyczne duchy wirusowe zawierające zieleń indocyjaninową. Poniżej przedstawiono widma absorbancji i fluorescencji dla optycznych duchów wirusowych po ich uzyskaniu.

Technikę tę można przeprowadzić w czasie pięciu minut na jedną próbkę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób kapsydacji komponentów wirusowych lub niewirusowych w podjednostki białka kapsydu.