Name: Proste i niezawodne podejście in vivo i in vitro do badania tworzenia się wirusów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Poznaj metodę badania złożenia wirusa BMV in vivo i in vitro przy użyciu agroinfiltracji roślin. Technika ta umożliwia tworzenie optycznych duchów wirusowych z potencjałem biomedycznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować kilku członkom laboratorium za cenne sugestie przy opracowywaniu metod agroinfiltracji oraz testów montażu in vitro. Praca ta została sfinansowana z grantu University of California. Badanie to było częściowo wspierane z grantu National Science Foundation (CBET-1144237).

1. Materiał roślinny
<ol>
	<li>Rośliny Nicotiana benthamiana wykorzystywane w teście enkapsydacji powinny znajdować się w stadium 4 liści (rośliny w wieku około 3-4 tygodni).</li>
</ol>
2. Dostarczanie i ekspresja funkcjonalnych komponentów genomu wirusa do komórek roślinnych za pomocą agroinfiltracji
<ol>
	<li>Dzień 1: Szczepy Agrobacterium (np. EH 105 lub GV 3101) zawierające pCass- BMV RNA 1, BMV RNA 2 oraz BMV RNA 31,2 hoduje się na płytkach z agarem LB uzupełnionym o 50 mg/ml kanamycyny (selekcja wektora pCASS) i 100 mg/ml rifampicyny (selekcja Agrobacterium). Inkubację prowadzi się w temperaturze 28 °C przez dwa dni.</li>
	<li>Dzień 3: Pojedynczą kolonię z płytki z agarem LB przenosi się do 2 ml bulionu LB zawierającego 50 mg/ml kanamycyny i 100 mg/ml rifampicyny i inkubuje przez 1 dzień w temperaturze 28 °C w inkubatorze wytrząsowym przy 250 RPM.</li>
	<li>Dzień 4: 50 ml bulionu LB uzupełnionego o 50 mg/ml kanamycyny, 100 mg/ml rifampicyny, 10 mM MES pH 5.6 oraz 100 mM acetosyringonu inokuluje się za pomocą 1 ml kultury w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml i inkubuje przez 16 godzin w temperaturze 28 °C w inkubatorze wytrząsowym przy 250 RPM.</li>
	<li>Dzień 5: Kulturę (po osiągnięciu OD600 na poziomie 1.0) przenosi się do probówki Oak Ridge lub sterylnej probówki Falcon i wiruje przez 10 minut przy 5000 rpm w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Osad rozpuszcza się w 10 ml 10 mM MgCl2 i wiruje przez 10 minut przy 5000 RPM w temperaturze 4 °C. Krok ten powtarza się drugi raz, aby zapewnić całkowite usunięcie antybiotyku.</li>
	<li>Osad resuspensuje się w 10 ml buforu zawierającego 10 mM MgCl2 i 10 mM MES (pH 5.6).</li>
	<li>Pomiar OD600 przeprowadza się dla każdej z kultur BMV RNA 1, RNA 2 i RNA 3, a następnie dostosowuje wartość do 0.1 OD600 za pomocą 10 mM MgCl2 i 10 mM MES (pH 5.6).</li>
	<li>Miesza się po 1 ml każdej z trzech zawiesin kultur o OD600 0.1.</li>
	<li>Dodaje się 100 mM acetosyringonu, miesza delikatnie i pozostawia mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.</li>
	<li>Zawiesinę kultury pobiera się do strzykawki 1 ml bez igły.</li>
	<li>Powyższą zawiesinę kultury infiltruje się w stronę abaksjalną 2-3 w pełni rozwiniętych liści N. benthamiana (rośliny 3-4 tygodniowe, w stadium 5 liści), delikatnie dociskając strzykawkę do połowy powierzchni abaksjalnej liścia.</li>
	<li>Procedurę infiltracji powtarza się na pozostałych liściach.</li>
	<li>Infiltrowane rośliny przechowuje się w szklarni w temperaturze 24 °C.</li>
	<li>Infiltrowane liście zbiera się od 3 do 4 dni po infiltracji (dpi).</li>
</ol>
3. Oczyszczanie wirionów BMV
<ol>
	<li>Zebrać liście N. benthamiana po agroinfiltracji mieszaniną zawierającą wszystkie trzy agrotransformanty BMV typu dzikiego.</li>
	<li>Rozetrzeć liście w sterylnym moździerzu z tłuczkiem z równą objętością (w/v) buforu do ekstrakcji BMV (0,5 M NaAc; 0,08 M MgAc, pH 4,5 oraz 1/100 objętości β-merkaptoetanolu, który należy dodać bezpośrednio przed użyciem)3. Aby zmaksymalizować wydajność wirusa, zaleca się dodanie piasku płukanego kwasem (~0,5-1 g), co ułatwia rozcieranie i efektywną dezintegrację komórek.</li>
	<li>Przefiltrować ekstrakt z liści przez 2-3 warstwy tkaniny muślinowej i zebrać frakcję stałą.</li>
	<li>Ponownie rozetrzeć część zatrzymaną na tkaninie muślinowej z objętością buforu do ekstrakcji BMV równą początkowej masie materiału liściowego.</li>
	<li>Powtórzyć procedurę filtracji przy użyciu tkaniny muślinowej. Kroki te powinny być wykonywane w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść roztwór filtratu do probówki do wirowania, dodać równą objętość schłodzonego chloroformu i mieszać w vortexie (lub wstrząsać) przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aż zawiesina zmieni kolor na jasnozielony.</li>
	<li>Wirować zemulgowany roztwór przez 15 minut przy 12 000 RPM w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać fazę wodną i mieszać przez 30 minut na mieszadle magnetycznym, aby usunąć resztki chloroformu.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę do sterylnej probówki do ultrawirowania.</li>
	<li>Na dno nalać 1 ml 10% sacharozy (przygotowanej w buforze do ekstrakcji wirusa) w celu stworzenia poduszki3.</li>
	<li>Wirować przy 30 000 rpm przez 3 godziny w ultrawirowarce Beckman w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odlać nadsącz i zawiesić osad w pożądanej objętości buforu do zawiesin BMV (aby przygotować bufor do zawiesin, należy rozcieńczyć bufor do ekstrakcji BMV 1/10 sterylną wodą destylowaną).</li>
	<li>Częściowo oczyszczony preparat wirionów z powyższego etapu poddać wirowaniu w gradiencie gęstości sacharozy 10-40% przez 150 min przy 28 000 rpm w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać prążek wirusa ręcznie lub za pomocą frakcjonatora. Prążek wirusa będzie widoczny jako niebieski przy oświetleniu białym światłem.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór sacharozy zawierający próbkę wirusa co najmniej 50% buforem do zawiesin wirusowych.</li>
	<li>Wirować rozcieńczony roztwór sacharozy zawierający wirusa przez 3 godziny przy 30 000 rpm w ultrawirowarce Beckman w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Na koniec zawiesić wysoko oczyszczony osad wirusa w pożądanej objętości buforu do zawiesin wirusowych.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie wirionów (mg/ml) za pomocą spektrofotometru przy OD260.</li>
</ol>
<img alt="Wzór na stężenie wirionów BMV; OD przy 260 nm; czynnik rozcieńczenia; współczynnik ekstynkcji." src="/files/ftp_upload/3645/3645eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1">
Uwaga: W oparciu o zawartość RNA, współczynnik ekstynkcji dla BMV wynosi 54.
<ol start="19">
	<li>Zweryfikować czystość wirionów, obserwując je pod TEM (Ryc. A)</li>
</ol>
4. Przygotowanie podjednostek białka kapsydu do montażu in vitro
<ol>
	<li>Przygotować 1 Liter 1x buforu do dysocjacji wirusa (0.5 M CaCl2; 50 mM Tris HCl, pH 7.5; 1.0 mM EDTA; 1.0 mM DTT oraz 0.5 mM PMSF)5.</li>
	<li>Przygotować membranę dializacyjną zgodnie z procedurą Sambrook et al 6.</li>
	<li>Przenieść oczyszczony wirus o wymaganym stężeniu do worka dializacyjnego.</li>
	<li>Umieścić worek dializacyjny zawierający wirusa w zlewce z 1x buforem do dysocjacji wirusa.</li>
	<li>Dializować przez 24 godziny w temperaturze 4°C przy ciągłym mieszaniu.</li>
	<li>Po 24 godzinach zebrać roztwór z worka dializacyjnego i wirować przy 12,000x g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Pozwoli to na oddzielenie RNA BMV od zdysocjowanych wirionów.</li>
	<li>Zebrać nadsącz i wirować przy 35,000 rpm w wirówce Beckman przez 3 godziny w temperaturze 4°C, aby osadzić wszelkie niezdysocjowane cząsteczki wirusa.</li>
	<li>Zebrać nadsącz.</li>
	<li>Na tym etapie konieczne jest usunięcie zanieczyszczającego RNA wirionów z zdysocjowanych podjednostek białka kapsydu. W tym celu nadsącz z kroku 8 należy poddać kolejnej rundzie nocnej reasemblacji podjednostek białka kapsydu bez dodawania RNA (w RNA 1x buforze do montażu, patrz poniżej), a następnie wirowaniu przy wysokiej prędkości (30,000 rpm przez 3 h w 4 °C), aby osadzić wszelkie zmontowane wiriony. Po tym etapie reasemblacji nadsącz zawierający podjednostki białka otoczki powinien być wolny od resztkowego zanieczyszczającego RNA. Aby jednak mieć to pewności, zaleca się przeprowadzenie dodatkowej reasemblacji in vitro z samymi podjednostkami białka otoczki przy użyciu RNA 1x buforu do montażu. Po nocnej reasemblacji preparat musi być wolny od zmontowanych wirionów (potwierdzić za pomocą TEM). </li>
	<li>Oznaczyć stężenie podjednostek białka kapsydu, mierząc absorbancję przy OD 254 i 280 nm lub innymi metodami, takimi jak test Bradforda.</li>
	<li>Przeprowadzić 12-15% SDS-PAGE, a następnie western blot, aby ocenić integralność zdysocjowanych podjednostek białka kapsydu.</li>
</ol>
5. Montaż wirionów zawierających RNA in vitro
<ol>
	<li>Przygotować transkrypty RNA do ponownego montażu w wiriony i obliczyć ich stężenie7.</li>
	<li>Wymieszać podjednostki białek kapsydu i transkrypty RNA w stosunku 1:5 (masowych)5.</li>
	<li>Przenieść powyższą mieszaninę do worka dializacyjnego i odpowiednio zabezpieczyć, aby uniknąć wycieków.</li>
	<li>Przygotować 1 000 ml 1x buforu do montażu RNA (50 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7.2; 10 mM KCl; 5 mM MgCl2, 1,0 mM DTT)5.</li>
	<li>Umieścić worek dializacyjny zawierający mieszaninę reakcyjną w zlewce z 1x buforem do montażu i mieszać.</li>
	<li>Prowadzić dializę reakcji ponownego montażu w temperaturze 4 °C przez 24 godziny przy łagodnym mieszaniu.</li>
	<li>Zebrać mieszaninę z worka dializacyjnego po 24 godzinach i dodać 1,5 ml buforu do montażu RNA.</li>
	<li>Przepuścić tę mieszaninę przez kolumnę Centricon-100, wirując z niską prędkością (2 000x g) przez 30 minut.</li>
	<li>Przemyć kolumnę raz 1,5 ml buforu do montażu w 4 °C przez 30 min.</li>
	<li>Powtórzyć powyższy etap przemywania dwukrotnie.</li>
	<li>Na koniec eluować ponownie zmontowane wiriony poprzez wirowanie przy 10 000g w 4 °C przez 5 min.</li>
	<li>Oszacować stężenie wirionów przy OD 260 nm.</li>
</ol>
6. Fabrykacja optycznych wydmuszek wirusowych (OVGs)
<ol>
	<li>Dodać zieleń indocyjaninową (ICG)8 do oczyszczonego białka kapsydu w pożądanym stosunku stężeń (stosunek wagowy zieleni indocyjaninowej do białka kapsydu zastosowany w niniejszym raporcie wyniósł 1:10) i wymieszać dokładnie za pomocą pipety.</li>
	<li>Dializować roztwór białka kapsydu i ICG przeciwko buforowi montażowemu OVG (1 M NaCl; 50 mM NaAc; 1 mM EDTA; oraz 1 mM DTT, pH 4,8) w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Po 24 godzinach zebrać roztwór z worka dializacyjnego (rozmiar porów 12 kDa) i wirować przy 90 000 rpm przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C (Ryc. B).</li>
	<li>Usunąć nadsącz i zawiesić osad w buforze suspensyjnym BMV poprzez mieszanie w wortexie lub pozostawiając go do samoistnego zawieszenia w buforze suspensyjnym BMV przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zweryfikować morfologię OVG za pomocą TEM (Ryc. C).</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję w zakresie od 240 nm do 950 nm przy użyciu spektrofotometru (Cary 50, Varian Inc.); obecność ICG potwierdza się charakterystycznymi pikami absorbancji w okolicach 700 nm i 790 nm8. (Ryc. D)</li>
	<li>Typowe piki fluorescencji ICG przy ~700 nm i ~800 nm można zaobserwować po wzbudzeniu roztworu OVG przy 620 nm (Ryc. D) przy użyciu spektrofluorometru (Fluorolog 3, Jobin-Yvon).</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
<img alt="Obraz z mikroskopii elektronowej, rozkład cząstek wirusowych, pokazujący szczegółową morfologię strukturalną." src="/files/ftp_upload/3645/3645figA.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina A"> 
Rycina A. Obraz TEM wirionów BMV barwionych negatywnie, oczyszczonych z roślin N. benthamiana poddanych agroinfiltracji mieszaniną trzech agrokonstruktów BMV typu dzikiego (pasek skali = 100 nm).
<img alt="Metoda chromatografii, zielona substancja w probówce, schemat procesu rozdziału." src="/files/ftp_upload/3645/3645figB.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek B"> 
Rysunek B. Osad zmontowanego in vitro ICG zawierającego OVGs po wirowaniu przy wysokiej prędkości.
<img alt="Obraz z mikroskopii elektronowej przedstawiający cząsteczki wirusa, wykorzystywany do analizy strukturalnej w badaniach wirusologicznych." src="/files/ftp_upload/3645/3645figC.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek C"> 
Rysunek C. Obraz TEM z negatywnym barwieniem ICG zawierającego OVGs (pasek skali = 100 nm).
<img alt="Widma optycznych widm wirusowych (OVG); wykresy absorbancji i fluorescencji; analiza długości fali." src="/files/ftp_upload/3645/3645figD.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina D"> 
Rycina D. Widma absorbancji (góra) i fluorescencji (dół) OVG. Długość fali wzbudzenia użyta do emisji OVG wynosiła 620 nm.

<ol><li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-independent+expression+of+genome+components+and+capsid+protein+of+brome+mosaic+virus+in+planta%3A+a+functional+role+for+viral+replicase+in+RNA+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging.</a> Virology. 338, 96-111 (2005).</li>
<li>Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+packaging+mechanism+in+positive-strand+RNA+viruses%3A+synchronized+coexpression+of+functional+multigenome+RNA+components+of+an+animal+and+a+plant+virus+in+Nicotiana+benthamiana+cells+by+agroinfiltration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration.</a> J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).</li>
<li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnnamalai%2C+P+%22Plant+Virology+Protocols%22">Plant Virology Protocols</a>. Foster, N., Johansen, H. 451, Humana Press. 251-264 (2008).</li>
<li>Lane, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bromoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">The bromoviruses.</a> Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).</li>
<li>Choi, Y. G., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+studies+on+bromovirus+capsid+protein.+VII.+Selective+packaging+on+BMV+RNA4+by+specific+N-terminal+arginine+residuals%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals.</a> Virology. 275, 207-217 (2000).</li>
<li>Sambrrok, J., Russel, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrrok%2C+J+%22Molecular+Cloning.+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning. A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+in+vivo+of+mutant+brome+mosaic+virus+RNAs+defective+in+aminoacylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation.</a> J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).</li>
<li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+nano-constructs+composed+of+genome-depleted+brome+mosaic+virus+doped+with+a+near+infrared+chromophore+for+potential+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22A.C.S.+Nano%22%5BJournal%5D)">Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications.</a> A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).</li>
<li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103, 157-167 (2000).</li>
<li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce%2C+tomato+and+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Przedstawiona tutaj metoda agroinfiltracji może mieć szerokie zastosowanie w odniesieniu do wielu wirusów roślin. Kluczową cechą tego podejścia jest zsynchronizowane dostarczenie wielu agrokonstruktów do tej samej komórki, co stanowi główną wadę powszechnie stosowanej rutynowej inokulacji mechanicznej wirusów roślin. Badania nad montażem wirionów in vivo i in vitro z wykorzystaniem wirusa mozaiki jęczmienia (BMV) jako modelu można przeprowadzić efektywnie, stosując się do kilku wskazówek: (i) aby uzyska...

<table><tbody><tr><td>Sole MES sodowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2993</td><td></td></tr><tr><td>Zieleń indocyjaninowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2633</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka Beckman</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Model: L8-70M</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Centricon-100</td><td>EMD Millipore</td><td>YM-100</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Varian, Inc.</td><td>Numer części 10068900</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofluorometr</td><td>Fluorolog 3, Jobin-Yvon.</td><td>Numer części FL3-21</td><td></td></tr></tbody></table>

prosta i niezawodna metoda in vivo oraz in vitro do badania składania wirusów

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

W przypadku wirusów o genomach RNA o polarności dodatniej, które są patogenne dla ludzi, zwierząt i roślin, enkapsydacja potomstwa do dojrzałych i stabilnych wirionów jest kluczową fazą w procesie ustanawiania infekcji u danego gospodarza. W konsekwencji badanie enkapsydacji pozwala na odczytanie informacji dotyczących mechanizmu regulującego składanie wirusa w celu tworzenia zakaźnych wirionów. Informacje te są niezbędne przy opracowywaniu nowych metod ograniczania rozprzestrzeniania się wirusów oraz kontroli chorób. Enkapsydację wirusów można badać in vivo i in vitroEnkapsydacja genomu in vivo jest wysoce regulowanym, selektywnym procesem obejmującym oddziaływania makromolekularne oraz kompartmentyzację wewnątrzkomórkową. Dlatego też badania zmierzające do przeanalizowania zdarzeń obejmujących enkapsydację wirusa in vivo zapewni podstawową wiedzę niezbędną do zrozumienia, w jaki sposób wirusy namnażają się i składają. Ostatnio in vitro enkapsydację wykorzystano w badaniach w obszarze obrazowania biomedycznego oraz zastosowań terapeutycznych. Nieotoczkowe wirusy roślinne zajmują wiodącą pozycję w przedsięwzięciach dotyczących in vitro enkapsydacja ujemnie naładowanego materiału obcego. Wirus mozaiki bromii (BMV), nieotoczkowy wieloskładnikowy wirus RNA patogenny dla roślin, był wykorzystywany jako modelowy system do badania pakowania genomu in vivo i in vitroDo testów enkapsydacji w *Nicotiana benthamiana* rośliny, Agrobacterium transjientna ekspresja pośredniczona przez Agrobacterium, określana jako agroinfiltracja, jest wydajną i niezawodną techniką zsynchronizowanego dostarczania i ekspresji wielu komponentów do tej samej komórki. W tej metodzie zawiesina z Agrobacterium tumefaciens komórki zawierające binarne wektory plazmidowe z cDNA pożądanych wirusowych mRNA są infiltrowane do przestrzeni międzykomórkowych wewnątrz liścia przy użyciu jedynie jednorazowej strzykawki o objętości 1 ml (bez igły). Proces ten prowadzi do transferu insertu DNA do komórek roślinnych; insert T-DNA pozostaje przejściowo w jądrze, gdzie jest transkrybowany przez polimerazę II gospodarza, co prowadzi do ekspresji przejściowej. Powstały transkrypty mRNA (z czapką i ogonem poli(A)) są następnie transportowane do cytoplazmy w celu translacji. Po około 24 do 48 godzinach inkubacji fragmenty infiltrowanych liści mogą zostać pobrane do analiz mikroskopowych lub biochemicznych. Agroinfiltracja pozwala na jednoczesną transfekcję bardzo dużej liczby (od setek do tysięcy) komórek. W celu enkapsydacji in vitro oczyszczone wiriony BMV są dysocjowane do białek kapsydu poprzez dializę przeciwko buforowi dysocjującemu zawierającemu chlorek wapnia, a następnie RNA oraz niedysocjowane wiriony są usuwane poprzez wirowanie. Subjednostki białek kapsydu pozbawione genomu są następnie ponownie składane z pożądanymi komponentami genomu wirusowego lub komponentami niewirusowymi, takimi jak barwnik indocyjaninowy.

Opisano prosty, wydajny i niezawodny sposób synchronizacji dostarczania wielu komponentów wirusowych do komórek roślinnych za pomocą przejściowej ekspresji pośredniczonej przez Agrobacterium. Podejście to umożliwia badanie replikacji i enkapsydacji, a następnie ponowne składanie komponentów niewirusowych in vitro w pozbawione genomu optyczne „duchy” wirusowe (viral ghosts), odpowiednie do zastosowań biomedycznych.

Prosta i niezawodna metoda in vivo oraz in vitro do badania składania wirusów

W wirusach o genomach RNA o dodatniej polarności, patogennych dla ludzi, zwierząt i roślin, enkapsydacja potomstwa w dojrzałe i stabilne wiriony jest kluczowym...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie składania wirusów in vivo oraz in vitro. Osiąga się to poprzez najpierw ekspresję RNA wirusa mozaiki bro w bakteriach, a następnie wprowadzenie ich do komórek roślinnych za pomocą agroinfiltracji. Następnie wiriony BMV są oczyszczane z infiltrowanych liści.Następnie przygotowuje się podjednostki białka kapsydu do montażu in vitro. Na koniec wiriony BMV Varians są składane in vitro przy użyciu białka kapsydu i barwnika indocyjaniny zielonej. Ostatecznie wyniki wykazują montaż in vitro bro mosaic varians poprzez tworzenie tzw. „optických duchów” (optical ghosts), co można określić za pomocą absorbancji i emisji fluorescencji.Dzisiaj zaprezentujemy technikę nazywaną filtracją, która jest przydatna do dostarczania komponentów wirusowych do roślin. Główną zaletą tej techniki jest wyeliminowanie konieczności tworzenia transkrypcji in vitro, a jednocześnie pozwala ona na dostarczenie wielu komponentów do tej samej komórki, co umożliwia zsynchronizowaną infekcję. Prace, które obecnie prowadzimy, dotyczą wykorzystania wirusa mozaiki bro w połączeniu z zatwierdzonym przez FDA chromoforem cyjanowym w celu wytworzenia nowego typu nanocząsteczek do zastosowań biomedycznych.Naszą szczególną intencją jest wykorzystanie tych konstruktów, które nazywamy optycznymi „widmami” drutów lub OB-gs, w modalnościach obrazowania optycznego, w tym w obrazowaniu fluorescencyjnym i fotoakustycznym, a także jako nośnik w terapii laserowej. Konkretnym zastosowaniem klinicznym, nad którym obecnie pracujemy, jest wykorzystanie tych konstruktów do obrazowania raka jajnika w połączeniu z procedurami śródoperacyjnymi. Zamysł polega na tym, że możemy funkcjonalizować te konstrukty.OBG z konkretnym motywem celującym, który potrafi rozpoznawać resztkowe komórki nowotworowe, które w przypadku raka jajnika mogą znajdować się szczególnie w jamie otrzewnowej. Z płytki z wcześniej przygotowaną agrobacterium zawierającą RNA wirusa mozaiki brązowej typu jeden, dwa lub trzy, wybierz pojedynczą kolonię, aby zaszczepić 2 mL LB zawierającego 50 µg/mL kanamycyny i 100 µg/mL rifampicyny. Inkubuj kulturę przez jeden dzień w temperaturze 28 °C w wytrząsarce orbitalnej przy 250 RPM. Następnego dnia zaszczep 50 mL LB w kolbie Erlenmeyera o pojemności 500 mL za pomocą 1 mL kultury i inkubuj przez 16 godzin w temperaturze 28 °C w wytrząsarce orbitalnej przy 250 RPM. Gdy kultury osiągną OD 600 wynoszącą 1,0, przenieś je do sterylnych probówek o pojemności 30 mL i wiruj przez 10 minut.Przy 5 000 RPM i temperaturze czterech stopni Celsjusza rozpuścić osady w 10 mililitrach 10 milimolowego chlorku magnezu, a następnie wirować przez 10 minut przy 5 000 RPM i temperaturze czterech stopni Celsjusza. Powtórzyć ten krok jeszcze raz, aby zapewnić całkowite usunięcie antybiotyku. Następnie zawiesić osady w 10 mililitrach buforu zawierającego 10 milimolowy MES i 10 milimolowy chlorek magnezu.Zmierz OD 600 dla każdej kultury i dostosuj do wartości OD 600 wynoszącej 0,1, używając 10 millimolarnego chlorku magnezu i 10 millimolarnego MES. Następnie połącz po 10 mililitrów każdej z trzech zawiesin kultur o OD 600 równym 0,1. Dodaj acetofenon do stężenia końcowego 100 millimolarnego.Wymieszać delikatnie i pozostawić mieszaninę bezyruchu w temperaturze pokojowej przez trzy godziny. Po inkubacji naciągnąć kulturę do strzykawki o pojemności 1 ml bez igły. Infiltrować zawiesinę kultury do strony abaksjalnej dwóch do trzech dobrze rozwiniętych liści N hamana, delikatnie dociskając strzykawkę do połowy powierzchni abaksjalnej każdego liścia.Infiltrowane rośliny należy przechowywać w szklarni w temperaturze 24 °C przez trzy do czterech dni przed zbiorem liści. Po oczyszczeniu wirionów BMV należy przygotować jeden litr buforu do dysocjacji wirusa 1x. Następnie należy przygotować membranę dializacyjną.Zgodnie z metodą Sambrooka i wsp., należy odmierzyć od 5 do 10 mg/ml oczyszczonego wirusa do worka dializacyjnego, a następnie umieścić worek w kolbie zawierającej 1x bufor dysocjacyjny wirusa. Dializę wirusa należy prowadzić przez 24 godziny w temperaturze 4 °C przy ciągłym mieszaniu.Zebrać roztwór z worka dializacyjnego i odwirować przy 30 000 RPM przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby wytrącić niepowiązane cząsteczki wirusa. Nadfiltr odwirować przy 30 000 RPM przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po przygotowaniu transkrypcji RNA do ponownego złożenia w wiriony, zmieszać podjednostki białka kapsydu i transkrypcje RNA w stosunku jeden do pięciu.Przenieś mieszaninę do worka dializacyjnego i odpowiednio go zabezpiecz, aby uniknąć wycieków. Po przygotowaniu jednego litra buforu do montażu RNA 1X, dializuj mieszaninę reakcyjną w buforze w temperaturze 4°C przez 24 godziny. Następnego dnia wyjmij mieszaninę z worka dializacyjnego i dodaj 1,5 ml buforu do montażu RNA, a następnie ponownie odwirowuj przy 30 000 RPM przez trzy godziny w temperaturze 4°C. Następnie usuń nadsącz i resuspenduj osad.Następnie oszacuj stężenie wirionów przy OD 260 nanometrów. Potem określ stężenie podjednostek białek kapsydu przy OD 280 nanometrów lub za pomocą innych metod, takich jak test Bradforda, aby ocenić integralność dysocjowanych podjednostek białek kapsydu. Przeprowadź elektroforezę SDS-PAGE w zakresie 12-15% z następującym western blottingiem. Na koniec postępuj zgodnie z procedurą opisaną w protokole pisemnym, aby wytworzyć optyczne widma wirusowe (viral ghosts) lub ov cheese.Przedstawiony tutaj obraz z transmisyjnego mikroskopu elektronowego ukazuje negatywnie barwione wariony BMV oczyszczone z roślin end hamana, które zostały poddane agroinfiltracji mieszaniną wszystkich trzech konstruktów agri BMV typu dzikiego. Ten obraz TEM przedstawia negatywnie barwione optyczne duchy wirusowe zawierające zieleń indocyjaninową. Poniżej przedstawiono widma absorbancji i fluorescencji dla optycznych duchów wirusowych po ich uzyskaniu.Technikę tę można przeprowadzić w czasie pięciu minut na jedną próbkę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób kapsydacji komponentów wirusowych lub niewirusowych w podjednostki białka kapsydu.

simple-robust-vivo-vitro-approach-for-studying-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Prosty i niezawodny in vivo oraz in vitro podejście do badania procesu składania wirusów

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Tutaj opisujemy procedurę obrazowania kompleksów wirusowych w cieczy w rozdzielczości nanometrowej za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

In situ TEM zespołów biologicznych w cieczy

Dołączanie wirionów do powierzchni jest wymogiem do obrazowania pojedynczego wirionu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości lub mikroskopii sił atomowych (AFM). W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania próbki do kontrolowanej adhezji wirionów do powierzchni szklanych, odpowiednią do stosowania w obrazowaniu AFM i fluorescencji o wysokiej rozdzielczości.

Przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych pojedynczego wirionu i obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości

Ten artykuł opisuje metodologię mikroskopii krioelektronowej, która jest używana do uzyskiwania wysokiej jakości mikroskopowych obrazów makrocząsteczek w ich stanie zbliżonym do natywnego. Metoda ta pozwala uzyskać obrazy nadające się do dalszego przetwarzania komputerowego przy użyciu podejścia pojedynczej cząstki, opracowanego w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D makrocząsteczki.

Co robić, a czego nie robić w mikroskopii krioelektronowej: podstawa przygotowania próbek i gromadzenia wysokiej jakości danych do makromolekularnej rekonstrukcji 3D

Rutynowe metody wykrywania wykorzystujące amplifikację genomu wirusa są ograniczone przez ich niezdolność do odróżnienia cząsteczek zakaźnych od niezakaźnych. Celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowych protokołów alternatywnych metod wspomagających dyskryminację zakaźnych cząstek norowirusa za pomocą wiązania aptamerów, dynamicznego rozpraszania światła i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Alternatywne metody in vitro do oznaczania integralności strukturalnej kapsydu wirusa

Metoda korelacyjnej mikroskopii elektronów świetlnych (CLEM) jest stosowana do obrazowania indukowanych wirusem struktur wewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) w komórkach, które zostały wcześniej wybrane przez mikroskopię świetlną (LM). LM i EM są łączone jako hybrydowe podejście do obrazowania w celu uzyskania zintegrowanego obrazu interakcji wirus-gospodarz.

Korelacyjna mikroskopia świetlno-elektronowa (CLEM) do śledzenia i obrazowania struktur związanych z białkami wirusowymi w komórkach unieruchomionych kriogenicznie

Dla dogłębnej analizy mechanistycznej syntezy RNA syncytialnego wirusa oddechowego (RSV), przedstawiamy protokół wykorzystania fosfoproteiny opiekuńczej (P) do koekspresji nukleoproteiny wolnej od RNA (N0) do późniejszego składania in vitro specyficznych dla wirusa nukleokapsydów (NC).

Wytwarzanie i składanie specyficznych dla wirusa nukleokapsydów syncytialnego wirusa oddechowego

Tutaj opisane są protokoły przygotowania zestawów wirusów odpowiednich do analizy ciekłego EM i krio-EM w nanoskali przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Postęp w obrazowaniu w wysokiej rozdzielczości zespołów wirusów w cieczach i lodzie

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej Epon po osadzeniu przy użyciu białka fluorescencyjnego o nazwie mScarlet. Ta metoda może jednocześnie utrzymać fluorescencję i ultrastrukturę. Ta technika jest podatna na szeroką gamę zastosowań biologicznych.

Epon Post Osadzanie korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Poznaj metodę badania złożenia wirusa BMV in vivo i in vitro przy użyciu agroinfiltracji roślin. Technika ta umożliwia tworzenie optycznych duchów wirusowych z potencjałem biomedycznym.

Prosta i niezawodna metoda in vivo oraz in vitro do badania składania wirusów

Przeglądaj więcej filmów