Name: Wampiryczna izolacja płynu zewnątrzkomórkowego z Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj metodę izolacji płynu zewnątrzkomórkowego z Caenorhabditis elegans przy użyciu mikroiniekcji. Technika ta umożliwia badanie składu płynu pseudocoelomicznego oraz mechanizmów sygnałowania RNAi w organizmie modelowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować za współpracę z laboratorium Huntera oraz za pomocne dyskusje i wsparcie, które umożliwiły opracowanie tej techniki i sprawiły, że proces ten był przyjemnością. Dziękujemy Nigelowi Delaneyowi oraz Caenorhabditis Genetics Center za udostępnienie szczepów nicieni i bakterii. Praca ta była finansowana przez National Institutes of Health w ramach grantu GM089795 przyznanego CPH.

<ol><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).</li>
<li>Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+controls+body+size+and+lifespan+in+C+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans.</a> Development. 130, 1089-1099 (2003).</li>
<li>Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+cell+lineage+following+laser+ablation+of+cells+in+the+somatic+gonad+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).</li>
<li>Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+equivalence+principle+for+the+incorporation+of+favorable+mutations+in+asexual+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations.</a> Science. 311, 1615-1617 (2006).</li>
<li>Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+is+a+model+host+for+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium.</a> Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome. Biol. 2, (2001).</li>
<li>Min, K., Kang, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+feeding+RNAi+method+for+simultaneous+knock-down+of+more+than+one+gene+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechniques. 48, 229-232 (2010).</li>
<li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+Enhanced+RNAi+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants.</a> Genetics. 188 (1), 235-237 (2011).</li>
<li>Way, J. C., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mec-3%2C+a+homeobox-containing+gene+that+specifies+differentiation+of+the+touch+receptor+neurons+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans.</a> Cell. 54, 5-16 (1988).</li>
<li>Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e, Moreno, S., Sohrmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
<li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+RNAi+in+C.+elegans+requires+the+putative+transmembrane+protein+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1.</a> Science. 295, 2456-2459 (2002).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiliśmy tutaj nowatorską metodę umożliwiającą izolację i charakterystykę płynu zewnątrzkomórkowego z organizmu modelowego C. elegans. Technika ta rozpoczyna się od genetycznej lub fizycznej manipulacji nicieniami dawcami w celu zwiększenia całkowitej objętości ich płynu zewnątrzkomórkowego. Następnie płyn zewnątrzkomórkowy jest izolowany przy użyciu zmodyfikowanej techniki mikroiniekcji. Nicienie są montowane do mikroiniekcji przy użyciu suchych podkładek agarozowych, aby unieruchomić je podczas procedur...

wampiryczna izolacja płynu zewnątrzkomórkowego z caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Genetycznie podatny organizm modelowy C. elegans dostarczył odpowiedzi na niezliczone pytania biologiczne, co było możliwe dzięki jego krótkiemu czasowi generacji, łatwości hodowli i niewielkim rozmiarom. Ten niewielki rozmiar uniemożliwił jednak zastosowanie wielu podejść technicznych spotykanych w innych systemach modelowych. Na przykład przetaczanie krwi w systemach ssaków oraz techniki szczepienia roślin pozwalają na badanie składu i sygnalizacji układu krwionośnego. Układ krwionośny nicieni, czyli pseudocoelom, do niedawna był niemożliwy do bezpośredniej analizy. Aby odpowiedzieć na pytania dotyczące sygnalizacji międzykomórkowej i składu układu krwionośnego, badacze C. elegans tradycyjnie polegali na analizie genetycznej, swoistej dla komórek/tkanek rekonstytucji funkcji oraz analizie mozaikowej. Techniki te pozwalają wnioskować o procesach zachodzących między komórkami, ale nie są uniwersalnie stosowalne w identyfikacji i charakterystyce cząsteczek zewnątrzkomórkowych. Przedstawiamy tutaj nowo opracowaną technikę bezpośredniej analizy płynu pseudocoelomicznego C. elegans. Technika ta rozpoczyna się od manipulacji genetycznej lub fizycznej w celu zwiększenia objętości płynu zewnątrzkomórkowego. Następnie zwierzęta poddawane są technice wampirycznej odwrotnej mikroiniekcji z wykorzystaniem zestawu do mikroiniekcji, który umożliwia precyzyjną kontrolę ciśnienia równowagi. Po wyizolowaniu płynu zewnątrzkomórkowego, zebrały materiał można analizować poprzez przeniesienie go do innych osobników lub za pomocą metod molekularnych. Aby zademonstrować skuteczność tej techniki, przedstawiamy szczegółowe podejście do analizy konkretnego przykładu cząsteczek sygnalizacyjnych zewnątrzkomórkowych – długich dsRNA podczas systemowej odpowiedzi RNAi. Choć charakterystyka systemowego RNAi służy jako przykład dowodu koncepcji, uważamy, że technika ta może być adaptowana do odpowiedzi na szereg pytań dotyczących składu i sygnalizacji układu krwionośnego.

Organizm modelowy C. elegans wykorzystuje płyn pseudocelomiczny jako pasywny układ krążenia. Bezpośrednia analiza tego płynu nie była wcześniej możliwa. Przedstawiamy tutaj nową technikę bezpośredniego badania przestrzeni zewnątrzkomórkowej, wykorzystując systemowe sygnały wyciszania podczas odpowiedzi RNAi jako przykład potwierdzający zasadność tej metody.

Wampiryczna izolacja płynu zewnątrzkomórkowego z Caenorhabditis elegans

Genetycznie przystępny organizm modelowy *C. elegans* pozwolił na zgłębienie wielu kwestii biologicznych dzięki krótkiemu czasowi generacji, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja płynu zewnątrzkomórkowego w celu udzielenia odpowiedzi na pytania dotyczące składu i funkcji pseudopłynu, w tym kwestii związanych z sygnalizacją RNAi. Osiąga się to poprzez uprzednie karmienie nicieni bakteriami wykazującymi ekspresję dsRNA, co prowadzi do powstania łatwego do oceny fenotypu RNAi. Następnie pozwala się nicieniom na rozprzestrzenienie sygnałów wyciszania RNAi w całym organizmie.Następnie zwiększa się całkowitą objętość dostępnego płynu pozakomórkowego. Na koniec, za pomocą igły do mikroiniekcji, pobiera się płyn pozakomórkowy i wstrzykuje go do nicienia, który nie został poddany procedurze RNAi. Ostatecznie obecność sygnałów wyciszania RNAi można wykazać poprzez ocenę potomstwa wstrzykniętych nicieni.Dzięki tej metodzie możemy analizować skład płynu pozakomórkowego, aby uzyskać wgląd nie tylko w systemowe RNAi, ale także w szereg międzykomórkowych szlaków sygnalizacyjnych. Zazwyczaj osoby początkujące w tej technice napotykają trudności ze względu na tempo, w jakim należy pracować. Aby przygotować nicienie donora, należy przy użyciu pętli wysiać bakterie ekspresyjne dsRNA w celu uzyskania pojedynczych kolonii na płyt

vampiric-isolation-of-extracellular-fluid-from-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja wampirzycza płynu pozakomórkowego z Caenorhabditis elegans

Ten film opisuje metodę dysocjacji całych robaków do jednokomórkowej zawiesiny odpowiedniej dla FACS lub immunoprecypitacji nienaruszonych komórek.

Dysocjacja pojedynczych komórek Caenorhabditis elegans: metoda izolowania żywych komórek

Źródło: Petersen, C. i in., Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje izolację i hodowlę gatunków bakterii związanych z Caenorhabditis elegans. Liza C. elegans oparta na koralikach, a następnie selektywna hodowla, umożliwia izolację różnorodnych szczepów mikroorganizmów do dalszej analizy.

Izolacja i hodowla bakterii związanych z Caenorhabditis elegans

Ten film pokazuje izolację fluorescencyjnie znakowanych neuronów od Caenorhabditis elegans. Zawiesinę komórkową uzyskuje się z transgenicznych robaków zaprojektowanych do ekspresji fluorescencyjnych, połączonych z białkiem transbłonowym transporterów pęcherzykowych w neuronach cholinergicznych. Znakowane fluorescencyjnie neurony są następnie izolowane za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) i utrzymywane w hodowli.

Izolacja neuronów z Caenorhabditis elegans poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją

Tutaj prezentujemy protokół prostej izolacji określonych grup żywych komórek neuronalnych wyrażających zielone białko fluorescencyjne z transgenicznych linii Caenorhabditis elegans. Metoda ta umożliwia różnorodne badania ex vivo skoncentrowane na konkretnych neuronach i ma zdolność izolowania komórek do dalszej krótkoterminowej hodowli.

Izolacja określonych populacji neuronów od glisty Caenorhabditis elegans

Ten artykuł przedstawia metody generowania, oczyszczania i ilościowego oznaczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Caenorhabditis elegans.

Oczyszczanie i analiza pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Caenorhabditis elegans

Protokół opisuje prosty mikroprzepływowy układ scalony i metodologię mikroprodukcji używaną do hodowli C. elegans w obecności ciągłego dostarczania pożywienia przez okres do 36 godzin. Urządzenie do wzrostu i obrazowania umożliwia również przerywane, długotrwałe obrazowanie procesów komórkowych i subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju przez kilka dni.

Prosty chip mikroprzepływowy do długoterminowego wzrostu i obrazowania Caenorhabditis elegans

Zakażenie Caenorhabditis elegans pasożytem mikrosporydów Nematocida parisii umożliwia robakom wytwarzanie potomstwa, które jest wysoce odporne na ten sam patogen. Jest to przykład odporności dziedzicznej, słabo poznanego zjawiska epigenetycznego. Niniejszy protokół opisuje badanie odporności dziedzicznej w genetycznie podatnym modelu robaka.

Badanie odporności dziedzicznej w modelu zakażenia mikrosporydiami Caenorhabditis elegans

Prezentowany tutaj jest opis prostej i stosunkowo szybkiej izolacji genomowego DNA Caenorhabditis elegans od jednego lub kilku zwierząt przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu tkanek. Otrzymany preparat gDNA jest odpowiednią matrycą do PCR.

Ekstrakcja genomowego DNA Caenorhabditis elegans na małą skalę

Caenorhabditis elegans jest jednym z głównych gatunków modelowych w biologii, jednak prawie wszystkie badania są prowadzone pod nieobecność naturalnie związanych z nim mikrobów. Opisane tutaj metody pomogą lepiej zrozumieć różnorodność powiązanych mikroorganizmów jako podstawę przyszłych badań funkcjonalnych nad C. elegans.

Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans

W protokole tym opisano test do ilościowego określenia szybkości karmienia Caenorhabditis elegans w oparciu o pomiar klirensu bakterii w płynnej kulturze.

Kwantyfikacja spożycia pokarmu w Caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego

Tutaj opisujemy warunki hodowli in vitro, izolację i zwiększoną generację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Echinococcus granulosus. Małe pojazdy elektryczne charakteryzowały się dynamicznym rozpraszaniem światła i transmisyjną mikroskopią elektronową. Wychwyt przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego i ich modulację fenotypową badano za pomocą mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Izolacja i wychwyt komórek dendrytycznych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Echinococcus granulosus

Poznaj metodę izolacji płynu zewnątrzkomórkowego z Caenorhabditis elegans przy użyciu mikroiniekcji. Technika ta umożliwia badanie składu płynu pseudocoelomicznego oraz mechanizmów sygnałowania RNAi w organizmie modelowym.

Wampiryczna izolacja płynu zewnątrzkomórkowego z Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów